CZ282335B6 - Vysokoprodukční kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM 8197 - Google Patents

Abstract

Vysokoprodukční kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM 8197 (NMG FOOK 31). Kmen byl získaný selekcí mutantů vznikajících působením chemických mutagenů a působením zvýšené koncentrace kyseliny fenoxyoctové na spory při submersní kultivaci. Následující pasivní selekcí byl získaný kmen Penicillium chrysogenum CCM 8197 (NMG-FOOK 31) produkující víc než 35 000 IU PEN V/ml za 168 hod. kultivace v bankách při vzdušnění při 25 .sup.o.n.C.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká vysokoprodukčního kmenu mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM 8197 (MNG-FOOK 31) produkujícího penicilín V ve vyšších koncentracích než doposud používané kmeny.

Dosavadní stav techniky

Celosvětový objem výroby penicilínů se neustále zvyšuje, kromě jeho přímého využívání při léčbě se velká část produkce používá jako surovina pro výrobu 6-aminopenicilánové kyseliny a polosyntetických β-laktámových antibiotik. Zvýšení produktivity používaných produkčních kmenů je ekonomicky nejvýhodnější způsob zvyšování objemu výroby. Značnou zásluhu na zvýšení produkční schopnosti kmenů má rozvoj metod šlechtění, které se opírají o selekci náhodných mutantů, indukovaných pomocí vhodných získaných mutagenů. Okruh používaných mutagenů se vybírá podle jejich účinku tak, aby docházelo k zvyšování produkce a nedošlo přitom ke zhoršování životaschopnosti mikroorganismů.

Před uvedením současného vynálezu byly známé jiné kmeny produkující Penicilín VaG většinou na bázi Penicillium chrysogenum. Důležitou vlastností produkčního kmene je jeho produktivita a udržení produkční aktivity, pokud možno v co nejdelším kultivačním času. Produkční kmeny používané v současnosti produkují do fermentačního média přibližně do 60 000 IU/ml penicilínu při kultivační době kolem 120 až 200 hodin.

Je známý kmen Penicillium chrysogenum CCM F-558 popsaný v Čs. autorském osvědčení č. 187216 produkující PEN G a V za 120 hodin s výtěžností 19 000 IU/ml penicilínu na půdě se sacharózou a sójovou moukou.

Dále je známý kmen Penicillium chrysogenum CCM F-569 popsaný v Čs. autorském osvědčení č. 199 980 produkující 24 000 IU/ml PEN G a V za 175 hodin. Kultivace na půdě s pharmamedií a sacharózou. Charakteristickou vlastností tohoto kmene je jeho schopnost růstu a produkce i při vysoké koncentraci amoniakálních iontů, reprezentovaných v živných půdách dusíkatými látkami, například síranem amonným, močovinou a podobně. Je známa jeho schopnost dosahovat vysokých produkcí penicilinu i na depotním uhlíkatém zdroji v živné půdě, například na laktóze. Tímto bylo dosaženo zjednodušení řízení fermentačního procesu oproti technologii založené na nepřetržitém dávkování sacharózy jako uhlíkatého zdroje.

Dalším známým kmenem je kmen Penicillium chrysogenum CCM F 647 popsaný v Čs. autorském osvědčení č. 200944 produkuje 24 000 IU/ml za 164 hodin kultivace. Vlastností tohoto kmene je jeho vysoká stabilita, neztrácí produkční schopnost pasážováním na pevných půdách do IV. generace. Tento kmen produkuje ve zvý šené míře V, G penicilín a jeho předností je, že nemá specifické požadavky na zdroj uhlíku.

Kmen Penicillium chrysogenum Thom byl získaný dlouhodobým působením P-flourfenylalanínu a ozářením. Produkuje okolo 22 000 IU/ml za 164 hodin.

Podstata vynálezu

Uvedené nedostatky výše zmíněných dosud známých kmenů do značné míry odstraňuje vynález,

- 1 CZ 282335 B6 jímž je nový vysokoprodukční kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM 8197 (interní označení MNG-FOOK 31) produkující zvýšenou koncentraci penicilínu Vale i penicilínu G vybraných klonů tohoto kmene, uložený v Čs. sbírce mikroorganismů u Masarykovy university v Brně, Tvrdého 14 pod číslem CCM 8197.

Kmen Penicillium chrysogenum CCM 8197 (interní označení MNG-FOOK 31) byl získán působením chemických mutagenů a působením zvýšené koncentrace kyseliny fenoxyoctové na spory při submersní kultivaci z východního kmene CCM F-760. Následující pasivní selekcí byl získán kmen Penicillium chrysogenum CCM 8197 (NMG-FOOK 31) produkující 35 000 IU PEN V/ml. za 168 hodin. Kultivace probíhala v baňkách při provzdušňování při teplotě 25 °C.

Postup šlechtění je popsaný na následujícím schématu, na kterém je znázorněna genealogická linie vedoucí k novému produkčnímu kmenu:

Penicillium chrysogenum

CCM F-760

I

PS

CCM F-760-19

Φ

NMU

NMU XXII/39

NMG

NMG XXXI/42

FOOK

NMG FOOK-31

Vysvětlení zkratek:

PS - pasivní selekce

NMU - působení nitrozometylmočoviny

NMG - působení nitrozometylguanidínu

FOOK - působení kyseliny fenoxyoctové

Nitrozometylmočovina byla aplikovaná v konečné koncentraci 6 mg/ml. Sporová suspenze v citrofosfátovém pufru pH 6,0 byla míchána v uzavřených Erlenmayerových bankách. Po přidání mutagenů byly odebrané vzorky ve vhodných časových intervalech a to 30-60 min. a po příslušném ředění vyočkované na Petriho misky se sporulační půdou.

Při aplikaci nitrozometylguanidinu byla použitá koncentrace mutagenů 1 mg/ml v konečné mutační směsi. Doba aplikace byla od 15-60 min. zamíchání v uzavřených Erlenmayerových bankách, pH mutační směsi bylo pufrované citrofosfátovým pufrem o pH 6,0. V určitých časových intervalech byly odebrané vzorky a ředěné až na neúčinnou koncentraci NMG a vyočkované na Petriho misky se sporulační půdou.

Do 500 ml varné banky se přidá 40 ml živné půdy obsahující sacharózu, com-steep, síran amonný, dusičnan sodný, uhličitan vápenatý a soli anorganického dusíku, 0,25 % kyseliny fenoxyoctové. Po vysterilizování se půda naočkuje 2 ml suspenzí spor kmene Penicillium chrysogenum. Nechá se kultivovat na třepacím stroji při obrátkách 230/min. při teplotě 25 °C. Po 48 h kultivace se kultura vyočkuje na sporulační agarovou půdu v Petriho miskách a nechá se

-2CZ 282335 B6 kultivovat 8-10 dnů při teplotě 25 °C.

Spory pro pasivní selekci byly připraveny ředěním v sterilní destilované vodě a vyočkované na Petriho misce se sporulační půdou.

Tímto způsobem aplikací mutagenů působením kyseliny fenyloctové a pasivní selekce byl získán izolátNMG FOOK31.

Izoláty byly hodnoceny podle následujícího schématu:

izolovaná kolonie na Petriho misce šikmý agar vegetativní inokulum submersní kultivace

Izoláty byly hodnoceny ve dvou pokusech před zakonzervováním a ve třech pokusech po konzervaci. Konzervy slouží k dlouhodobému uchovávání sporového materiálu a umožňují zachování růstových a produkčních schopností.

Stanovení účinnosti penicilínu bylo vypracováno spektrofotometrickou imidazolovou metodou. Morfologická charakteristika

Kmen vytváří při monosporickém rozsevu na sporulační půdě typu glycerín-melasa kolonie ve velikosti cca 12 mm za dobu 9 dní kultivace při 25 °C. Ve středu kolonie se vytváří kruhovitý kráter, od tohoto středového kruhovitého kráteru do okraje je kolonie zvrásnéná. Barva spor je béžová. Kultura dobře a tychle sporuluje na různých typech sporulačních půd a i na přírodních substrátech, například ječmen, rýže a podobně. Počet spor v jednom ml suspenze, která se získá smytím Endovy zkumavky se šikmým agarem s 10 ml vody se pohybuje kolem 1,10⁷ . ml'¹. Kmen uschovávaný při teplotě +5 °C na agarových půdách je stabilní 5 až 6 týdnů, na přírodních substrátech několik měsíců minimálně však tři měsíce, v lyofilizovaném stavu cca pět roků a tekutém dusíku více jak pět let. Pro přípravu inokula se může použít půda obsahující sacharózu, glukózu jako zdroj uhlíku a kukuřiční extrakt jako zdroj organického dusíku. Růst inokula je cca 48 hodin při teplotě 25 °C. Maximální produkce s tímto kmenem se dosáhne na fermentační půdě obsahující laktózu anebo sacharózu a sójovou mouku, kukuřičný extrakt anebo pharmamedia, zdroj síry, anorganického dusíku a prekurzor. Kmen vykazuje dobrou odolnost vůči mechanickému namáhání, má poměrně vysoké nároky na přenos kyslíku aje citlivý na pokles rozpustného kyslíku v médiu pod 10% nasycení.

Fyziologická charakteristika

Optimální teplota 25 °C. Optimální pH 6,3 až 7,0 jedná se o aerobní mikroorganismus, který zkvašuje glukózu, fruktózu, sacharózu, laktózu. Dobře hydrolyzuje škrob i bílkoviny, dusičnany redukuje. K růstu vyžaduje biotin, z aminokyselin fenylalanín.

Výhody vysokoprodukčního kmene Penicillium chrysogenum CCM 8197 spočívají vtom, že dosahuje vyšší produkci oproti výchozímu kmenu. Je méně citlivý na změny koncentrace kyseliny fenoxyoctové v živné půdě a proto je výhodný pro biosyntézu penicilínu V v podmínkách průmyslové produkce, přičemž jeho hlavní výhodou je vyšší produkční schopnost, když za 168 hodin kultivace je možné dosáhnout výtěžnosti 35 000 IU/ml. Kmen není také

-3 CZ 282335 B6 enormně citlivý na mechanické namáhání, což je výhodné při průmyslovém využití, neboť nedochází k poškozování mycelia. Z těchto důvodů je vhodný pro použití v průmyslových fermentorech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad č. 1

Sacharózová inokulační půda v 500 ml varných bankách s náplní 60 ml se naočkuje sporovou suspenzí a kultivuje se při 25 °C na rotačním třepacím stroji 40 h. Narostlým vegetativním inokulem se naočkovaly a kultivovaly v rotačním třepacím stroji produkční banky se živnou půdou obsahující laktózu, pharmamedií, síran amonný, uhličitan vápenatý aprekurzor, kyselinu fenoxyoctovou.

Fermentace uvedeným způsobem trvala 8 dní. Maximální produkce byla dosažena v 7. dni fermentace. Produkční schopnost kmene, na který je uplatňovaný patentový nárok je následující:

kmen část kultivace PNC V PNC G interní označení_____j/ml j/ml

NMG FOOK 31 35 100 33 100

Průmyslová využitelnost

Nový vysokoprodukční kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM 8197 (NMG FOOK 31) je možné využít při průmyslové výrobě penicilínu G a V.

Claims (1)

1. Vysokoprodukční kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM 8197 produkující penicilín G a penicilín V.