CS262188B1 - Kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenuniCCM F-8012 - Google Patents

Abstract

Účelem řešení je získat kmen produkující penicilín ve vyšších koncentracích, než je dosahováno předchozími kmeny, který je odolnější na mechanické namáhání ve srovnání s předchozími kmeny. Penicilín syntetizuje mutant kmene Penicillium chrysogenum, získaný po působení vhodných mutagenů a pasivní selekci v médiu obsahujícím vhodný zdroj uhlíku, dusíku, síry, fosforu, prekurzoru, protipěnidla, stopových prvků a křídu při vysoké konverzi zdroje uhlíku za aerobních podmínek při 25 °C. V průběhu 168 hodin kultivace kmen vytváří za laboratorních podmínek 33 400 j/ /mi penicilinu V nebo 30 900 j/ml penicilinu G, v měřítku laboratorních fermentačních tanků vytváří 35 980 j/ml penicilinu V.

Description

Vynález se týká kmene mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM F-8012 a jeho selektátů (interní označení UV LXIII/70) produkujícího penicilín G a V.

Produkce penicilinu je dnes o tři řády vyšší, než byla před 40 lety, kdy začínala jeho výroba. Zásluhu o toto zvýšení má mimo rozvoj šlechtitelských metod, jejichž základem je využívání uměle navozované variability biologického materiálu.

Program zvyšování produkce kmenů se opírá o namátkovou selekci uměle Indukovaných mutantů pomocí vhodných mutagenů chemických či fyzikálních a testování mutagenizovaných kultur. Okruh použitelných mutagenů se řídí jejich účinky, neboť je třeba eliminovat hromadění nežádoucích odchylných vlastností, které se mohou progresivně kumulovat, může to být zhoršování růstových vlastností, sporulace, ztráta odolnosti na mechanické namáhání atd.

Kmen Penicillium chrysogenum CCM F8012, interního označení UV LXIII/70 byl získán působením mutagenů a pasivní selekcí z výchozího kmene CCM F-760, interního označení NMU 2/40. Postup šlechtění vyplývá z následujícího schématu, ve kterém je znázorněna genealogická linie vedoucí k novému kmenu.

Penicillium chrysogenum NMU 2/40 ť PS

NMU 2/40-4 1 UV

UV L/114 ť NMG

NMG 1/65 1 NMU

NMU XXIV/29 ť UV ' UV LIX B/40

UV

UV LXIII/70 1 PS

UV LXIII/70-selektáty Vysvětlení zkratek:

UV — působení UV-světla

NMG — působení nitrosometylguanidinu

NMU — působení nitrosometylurey

PS — pasivní selekce

Zdrojem UV-světla byla germicidní lampa Philips TVV 40 W s předřazeným stabilizátorem síťového napětí ST 250 o výkonu 250 V a citlivosti l°/o. Suspenze spor ve vodě byla ozařována v Petriho misce. Během ozařování byla suspenze míchána na elektromagnetickém míchadle. Vzdálenost misky od zdroje ozáření byla 20 cm, záření bylo ve vhodných časových intervalech přerušováno odebíráním vzorků, které byly dále ředěny a vysévány na Petriho misky se sporulační půdou.

Pro mutagenizaci nitrosometylguanidinem byla používána koncentrace mutagenu 2 mg/ /ml v konečné mutační směsi. Doba aplikace byla od 15 do 40 minut při míchání v uzavřených Erlenmayerových baňkách, pH mutační směsi bylo pufrováno citrofosfátovým pufrem o pH 6,0. V časových intervalech byly odebírány vzorky a ředěny až na neúčinnou koncentraci NMG a vysévány na Petriho misky se sporulační půdou.

Nitrosometylurea byla aplikována v konečné koncentraci 6 mg/ml. Sporová suspenze v citrofosfátovém pufru pH 6,0 byla míchána v uzavřených Erlenmayerových baňkách, po přidání mutagenu byly odebírány vzorky ve vhodných časových intervalech, ředěny a vysévány na Petriho misky se sporulační půdou.

Spory pro pasivní selekci byly suspendovány v destilované vodě nebo fyziologickém roztoku, ředěny a vysévány na Petriho misky se sporulační půdou.

Tímto způsobem aplikace mutagenů a pasivní selekcí byl získán izolát UV LXIII/70 a jeho selektáty.

Izoláty byly hodnoceny dle následujícího schématu:

izolované kolonie na Petriho misce šikmý agar t vegetativní inokulum i vlastní fermentace

Izoláty byly produkčně hodnoceny ve 2 pokusech, nejlepší byly zlyofilizovány nebo uloženy do kapalného dusíku, po vyočkování byly izoláty opětně hodnoceny ve třech pokusech. Konzervy slouží k dlouhodobému uchovávání kmenů a umožňují zachování získaných vlastností.

Stanovení účinnosti penicilinu bylo prováděno automatizovaným systémem při použití hydroxamátové kolorimetrické metody.

Tímto hodnotícím systémem byl získán kmen a jeho selektáty, na který je uplatňován patentový nárok.

Kolonie kmene při monosporickém rozsevu v průběhu 9 dnů dorůstají do velikosti cca 12 mm, střed kolonie je miskovitý, od válu k okraji jsou kolonie zvrásněné, barva spor je béžová. Kultura dobře a rychle sporuluje na různých typech sporulačních půd a na různých přírodních substrátech jako je rýže, kroupy, proso atd. Počet spor v 1 ml suspenze vzniklé smytím .spor z Endovy zkumavky 10 ml vody se pohybuje ko262188

Lem 3.10⁷ a počet spor v 1 ml suspenze vzniklé smytím spor ze 30 g krup 50 ml vody je 9 . 10⁷ spor v ml.

Vegetativní inokulum lze připravovat na půdách, obsahujících jako zdroj uhlíku glukózu noho sacharózu při dosažení shodných růstových hodnot. Vhodným zdrojem dusíku pro přípravu inokula je kukuřičný extrakt. Optimální stáří vegetativního mokni;? je 3tí až 43 hodin, optimální teplota 25 stupím Celsia.

Maximálních produkcí je s tímto kmenem dosahováno ve fermeníační půdě obsahující jako zdroj uhlíku laktózu či. sacharózu, nejvhodnějším zdrojem dusíku jo Pharmamedia v kombinaci s anorganickým zdrojem dusíku. Dále fermeníační půda musí obsahovat zdroj síry, fosforu, hořčík, uhličitan vápenatý, prekurzor postranního řetězce penicilinu a protipěnidlo. Optimální teplota pro biosyntézu penicilinu je 25 C.

Výběr kmenů byl prováděn i s ohledem na odolnost na mechanické namáhání.

Příklad 1

Vegetativní inokulum bylo připravováno submerzní kultivací v 500 ml varných baňkách se 4.0 ml inokulační půdy (zdroj uhlíku sacharóza, dusíku kukuřičný výluh, síran amonný a anorganické soli). Půda pro Tabulka kmen (interní označení)

NMU 2/40 UVLXIII/70 Příklad 2

Fermentační postup byl shodný s postupem uvedeným v příkladu 1 s tím rozdílem, že do části fermentačních baněk byl přidán buď keramický váleček délky 6 mm, šířky 4 mm, nebo skleněná kulička o průměru 4 mm. Keramické válečky byly 4. den ferpenicilín V j/ml

300

400 přípravu vegetativního inokula byla zaočkována kličkou spor za šikmého agaru se sporulační půdou nebo 2,5 ml sporové suspenze vzniklé smytím krup (30 g) 50ml destilované vody a inkubována na rotačním třepacím stroji 48 hodin.

Takto připraveným vegetativním inoikulem byly očkovány 10% fermentační baňky obsahu 500 ml se 40 ml fermentační půdy. Zdrojem uhlíku ve fermentační půdě byla laktóza v kombinaci se sacharózou, zdrojem dusíku Pharmamedia v kombinaci s dusičnanem amonným, dále půda obsahovala zdroj hořčíku, síry, fosforu, prekurzor postranního řetězce, uhličitan vápenatý a protipěnidlo. Při biosyntéze penicilinu G byl prekurzor přidáván v průběhu fermentace.

Příprava vegetativního inokula i vlastní fermentace probíhaly na rotačních třepacích strojích (230 obr./min., výstředník 25 mililitrů) při 25 ^rC.

Doba fermentace byla 8 dnů, vzorky na stanovení účinnosti penicilinu byly odebírány v 6., 7. a 8. dni fermentace. Maxima produkce bylo dosaženo v 7. dni fermentace.

Produkční srovnání výchozího kmene s kmenem, na který je uplatňován patentový nárok, je uvedeno v následující tabulce.

penicilín G j/ml

600 30 900 mentace sterilně z baněk odstraněny. Vzorky pro stanovení penicilinu byly odebírány počínaje 3. dnem ve 24hodinových intervalech do 8. dne fermentace. Přidávaná tělíska sloužila k detekci odolnosti mycelia na mechanické namáhání, jejich vliv na produkci penicilinu vyjádřený v j/ml vyplývá z následující tabulky.

T a b nika podmínky ve fermentační baňce dny standardní 1. ker, váleček -* 1 skleněná kulička

4. den odstraněn kmen

	NMU 2/40	UV LXIII/ /70	NMU 2/40	UV LXIII/ /70	NMU 2/40	UV LXIII/ /70
3.	5 500	1400	3 800	4 000	4 800	5 300
4.	11 300	15 600	2 200	3 500	4 800	8 900
5.	20 500	23 700	1 800	3 200	4 500	12 300
6.	28 000	33 400	1 800	12 300	8 800	19 300
7.	29 500	33 400	2 200	17 800	10 200	23 000
8.	32 200	30 600	2 600	25 300	13 100	26 600

282188

Kmen, na který je uplatňován patentový nárok, podléhá negativnímu vlivu mechanického namáhání minimálně a navíc má značné regenerační schopnosti, jak vyplývá z výsledků uvedených v předchozí tabulce.

Příklad 3

Fermentace penicilinu V byla uskutečněná v čtvrtprovozním měřítku v objemu 201itrových laboratorních fermentačních tanků (v dalším LFT).

Inokulum s kmenem UV LXIII/70 bylo připraveno z provozní ječmenné sporové konzervy též v LFT na standardní inokulační půdě za 32 hodin kultivace.

Fermentace penicilinu V na půdě s obsahem 4% sójové mouky, 1% CSL o sušině 60procentní, dále prekurzoru, vápence a dalších solí probíhala za obvyklých kultivačních a technologických podmínek za semikontinuálního přidávání dalších živin (sacharóza, síran amonný, sójový olej, fenoxyoctová kyselina) po dobu 211 hodin. Byla dosažena produkce penicilinu V stanovená jodometricky 35 980 mj/ml, což bylo 118,7 % oproti kontrolní .Eermentaci s kmenem NMU 2/40.

Claims (1)

1. pRedmEt vynalezu

   Kmen mikroorganismu Pcnicillium chrysogenum CCM F- 8012, produkující penicilín V a G.

   Saveroxrafla, n. p. závod 7, Moat