CS262188B1 - Penicillium chrysogenuniCCM F-8012 strain - Google Patents

Penicillium chrysogenuniCCM F-8012 strain Download PDF

Info

Publication number
CS262188B1
CS262188B1 CS877167A CS716787A CS262188B1 CS 262188 B1 CS262188 B1 CS 262188B1 CS 877167 A CS877167 A CS 877167A CS 716787 A CS716787 A CS 716787A CS 262188 B1 CS262188 B1 CS 262188B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
penicillin
strain
fermentation
nmu
medium
Prior art date
Application number
CS877167A
Other languages
Czech (cs)
Other versions
CS716787A1 (en
Inventor
Vlasta Rndr Csc Matelova
Miroslava Ing Ulehlova
Petr Ing Csc Pilat
Karel Ing Bezdek
Boris Ing Okanik
Michal Ing Csc Bucko
Emil Ing Miklas
Original Assignee
Matelova Vlasta
Miroslava Ing Ulehlova
Pilat Petr
Bezdek Karel
Okanik Boris
Bucko Michal
Miklas Emil
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Matelova Vlasta, Miroslava Ing Ulehlova, Pilat Petr, Bezdek Karel, Okanik Boris, Bucko Michal, Miklas Emil filed Critical Matelova Vlasta
Priority to CS877167A priority Critical patent/CS262188B1/en
Publication of CS716787A1 publication Critical patent/CS716787A1/en
Publication of CS262188B1 publication Critical patent/CS262188B1/en

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Účelem řešení je získat kmen produkující penicilín ve vyšších koncentracích, než je dosahováno předchozími kmeny, který je odolnější na mechanické namáhání ve srovnání s předchozími kmeny. Penicilín syntetizuje mutant kmene Penicillium chrysogenum, získaný po působení vhodných mutagenů a pasivní selekci v médiu obsahujícím vhodný zdroj uhlíku, dusíku, síry, fosforu, prekurzoru, protipěnidla, stopových prvků a křídu při vysoké konverzi zdroje uhlíku za aerobních podmínek při 25 °C. V průběhu 168 hodin kultivace kmen vytváří za laboratorních podmínek 33 400 j/ /mi penicilinu V nebo 30 900 j/ml penicilinu G, v měřítku laboratorních fermentačních tanků vytváří 35 980 j/ml penicilinu V.The purpose of the solution is to obtain a strain producing penicillin in higher concentrations than achieved by previous strains, which is more resistant to mechanical stress compared to previous strains. Penicillin is synthesized by a mutant of the Penicillium chrysogenum strain, obtained after the action of suitable mutagens and passive selection in a medium containing a suitable source of carbon, nitrogen, sulfur, phosphorus, precursor, antifoam, trace elements and chalk at a high conversion of the carbon source under aerobic conditions at 25 °C. During 168 hours of cultivation, the strain produces 33,400 U/ml of penicillin V or 30,900 U/ml of penicillin G under laboratory conditions, and 35,980 U/ml of penicillin V on a laboratory fermentation tank scale.

Description

Vynález se týká kmene mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM F-8012 a jeho selektátů (interní označení UV LXIII/70) produkujícího penicilín G a V.The invention relates to the strain of the microorganism Penicillium chrysogenum CCM F-8012 and its selectants (internal designation UV LXIII/70) producing penicillin G and V.

Produkce penicilinu je dnes o tři řády vyšší, než byla před 40 lety, kdy začínala jeho výroba. Zásluhu o toto zvýšení má mimo rozvoj šlechtitelských metod, jejichž základem je využívání uměle navozované variability biologického materiálu.Penicillin production is now three orders of magnitude higher than it was 40 years ago, when it began. This increase is due in part to the development of breeding methods based on the use of artificially induced variability in biological material.

Program zvyšování produkce kmenů se opírá o namátkovou selekci uměle Indukovaných mutantů pomocí vhodných mutagenů chemických či fyzikálních a testování mutagenizovaných kultur. Okruh použitelných mutagenů se řídí jejich účinky, neboť je třeba eliminovat hromadění nežádoucích odchylných vlastností, které se mohou progresivně kumulovat, může to být zhoršování růstových vlastností, sporulace, ztráta odolnosti na mechanické namáhání atd.The program of increasing the production of strains is based on the random selection of artificially induced mutants using suitable chemical or physical mutagens and testing of mutagenized cultures. The range of usable mutagens is governed by their effects, since it is necessary to eliminate the accumulation of undesirable deviant properties that can progressively accumulate, such as deterioration of growth properties, sporulation, loss of resistance to mechanical stress, etc.

Kmen Penicillium chrysogenum CCM F8012, interního označení UV LXIII/70 byl získán působením mutagenů a pasivní selekcí z výchozího kmene CCM F-760, interního označení NMU 2/40. Postup šlechtění vyplývá z následujícího schématu, ve kterém je znázorněna genealogická linie vedoucí k novému kmenu.The Penicillium chrysogenum strain CCM F8012, internally designated UV LXIII/70, was obtained by mutagenization and passive selection from the parent strain CCM F-760, internally designated NMU 2/40. The breeding procedure is shown in the following diagram, which shows the genealogical line leading to the new strain.

Penicillium chrysogenum NMU 2/40 ť PSPenicillium chrysogenum NMU 2/40 PS

NMU 2/40-4 1 UVNMU 2/40-4 1 UV

UV L/114 ť NMGUV L/114 ў NMG

NMG 1/65 1 NMUNMG 1/65 1 NMU

NMU XXIV/29 ť UV ' UV LIX B/40NMU XXIV/29 ť UV 'UV LIX B/40

UVUV

UV LXIII/70 1 PSUV LXIII/70 1 PS

UV LXIII/70-selektáty Vysvětlení zkratek:UV LXIII/70-selectates Explanation of abbreviations:

UV — působení UV-světlaUV — exposure to UV light

NMG — působení nitrosometylguanidinuNMG — action of nitrosomethylguanidine

NMU — působení nitrosometylureyNMU — action of nitrosomethylurea

PS — pasivní selekcePS — passive selection

Zdrojem UV-světla byla germicidní lampa Philips TVV 40 W s předřazeným stabilizátorem síťového napětí ST 250 o výkonu 250 V a citlivosti l°/o. Suspenze spor ve vodě byla ozařována v Petriho misce. Během ozařování byla suspenze míchána na elektromagnetickém míchadle. Vzdálenost misky od zdroje ozáření byla 20 cm, záření bylo ve vhodných časových intervalech přerušováno odebíráním vzorků, které byly dále ředěny a vysévány na Petriho misky se sporulační půdou.The UV light source was a Philips TVV 40 W germicidal lamp with a mains voltage stabilizer ST 250 with a power of 250 V and a sensitivity of 1°/o. The spore suspension in water was irradiated in a Petri dish. During irradiation, the suspension was stirred on an electromagnetic stirrer. The distance of the dish from the irradiation source was 20 cm, the irradiation was interrupted at appropriate time intervals by taking samples, which were further diluted and sown on Petri dishes with sporulation soil.

Pro mutagenizaci nitrosometylguanidinem byla používána koncentrace mutagenu 2 mg/ /ml v konečné mutační směsi. Doba aplikace byla od 15 do 40 minut při míchání v uzavřených Erlenmayerových baňkách, pH mutační směsi bylo pufrováno citrofosfátovým pufrem o pH 6,0. V časových intervalech byly odebírány vzorky a ředěny až na neúčinnou koncentraci NMG a vysévány na Petriho misky se sporulační půdou.For mutagenization with nitrosomethylguanidine, a concentration of 2 mg/ml of the mutagen was used in the final mutation mixture. The application time was from 15 to 40 minutes with mixing in closed Erlenmeyer flasks, the pH of the mutation mixture was buffered with a citrate phosphate buffer of pH 6.0. At time intervals, samples were taken and diluted to an ineffective concentration of NMG and inoculated onto Petri dishes with sporulation medium.

Nitrosometylurea byla aplikována v konečné koncentraci 6 mg/ml. Sporová suspenze v citrofosfátovém pufru pH 6,0 byla míchána v uzavřených Erlenmayerových baňkách, po přidání mutagenu byly odebírány vzorky ve vhodných časových intervalech, ředěny a vysévány na Petriho misky se sporulační půdou.Nitrosometylurea was applied at a final concentration of 6 mg/ml. Spore suspension in citric acid phosphate buffer pH 6.0 was stirred in closed Erlenmeyer flasks, after addition of mutagen samples were taken at appropriate time intervals, diluted and inoculated onto Petri dishes with sporulation medium.

Spory pro pasivní selekci byly suspendovány v destilované vodě nebo fyziologickém roztoku, ředěny a vysévány na Petriho misky se sporulační půdou.Spores for passive selection were suspended in distilled water or saline, diluted, and plated on Petri dishes with sporulation medium.

Tímto způsobem aplikace mutagenů a pasivní selekcí byl získán izolát UV LXIII/70 a jeho selektáty.In this way, by applying mutagens and passive selection, the isolate UV LXIII/70 and its selectants were obtained.

Izoláty byly hodnoceny dle následujícího schématu:Isolates were evaluated according to the following scheme:

izolované kolonie na Petriho misce šikmý agar t vegetativní inokulum i vlastní fermentaceisolated colonies on Petri dish slant agar t vegetative inoculum i own fermentation

Izoláty byly produkčně hodnoceny ve 2 pokusech, nejlepší byly zlyofilizovány nebo uloženy do kapalného dusíku, po vyočkování byly izoláty opětně hodnoceny ve třech pokusech. Konzervy slouží k dlouhodobému uchovávání kmenů a umožňují zachování získaných vlastností.Isolates were evaluated for production in 2 experiments, the best were lyophilized or stored in liquid nitrogen, after inoculation the isolates were re-evaluated in three experiments. Cans are used for long-term storage of strains and allow the preservation of acquired properties.

Stanovení účinnosti penicilinu bylo prováděno automatizovaným systémem při použití hydroxamátové kolorimetrické metody.Determination of penicillin efficacy was performed by an automated system using the hydroxamate colorimetric method.

Tímto hodnotícím systémem byl získán kmen a jeho selektáty, na který je uplatňován patentový nárok.This evaluation system resulted in the strain and its selectants for which the patent claim is made.

Kolonie kmene při monosporickém rozsevu v průběhu 9 dnů dorůstají do velikosti cca 12 mm, střed kolonie je miskovitý, od válu k okraji jsou kolonie zvrásněné, barva spor je béžová. Kultura dobře a rychle sporuluje na různých typech sporulačních půd a na různých přírodních substrátech jako je rýže, kroupy, proso atd. Počet spor v 1 ml suspenze vzniklé smytím .spor z Endovy zkumavky 10 ml vody se pohybuje ko262188Colonies of the strain in monosporic sowing grow to a size of about 12 mm within 9 days, the center of the colony is cup-shaped, the colonies are wrinkled from the base to the edge, the color of the spores is beige. The culture sporulates well and quickly on various types of sporulation soils and on various natural substrates such as rice, groats, millet, etc. The number of spores in 1 ml of suspension formed by washing spores from an Endo tube with 10 ml of water varies from 262188

Lem 3.107 a počet spor v 1 ml suspenze vzniklé smytím spor ze 30 g krup 50 ml vody je 9 . 107 spor v ml.Lem 3.10 7 and the number of spores in 1 ml of suspension formed by washing spores from 30 g of groats with 50 ml of water is 9.10 7 spores in ml.

Vegetativní inokulum lze připravovat na půdách, obsahujících jako zdroj uhlíku glukózu noho sacharózu při dosažení shodných růstových hodnot. Vhodným zdrojem dusíku pro přípravu inokula je kukuřičný extrakt. Optimální stáří vegetativního mokni;? je 3tí až 43 hodin, optimální teplota 25 stupím Celsia.Vegetative inoculum can be prepared on soils containing glucose or sucrose as a carbon source, achieving identical growth values. A suitable nitrogen source for the preparation of inoculum is corn extract. The optimal age of the vegetative sap is 3 to 43 hours, the optimal temperature is 25 degrees Celsius.

Maximálních produkcí je s tímto kmenem dosahováno ve fermeníační půdě obsahující jako zdroj uhlíku laktózu či. sacharózu, nejvhodnějším zdrojem dusíku jo Pharmamedia v kombinaci s anorganickým zdrojem dusíku. Dále fermeníační půda musí obsahovat zdroj síry, fosforu, hořčík, uhličitan vápenatý, prekurzor postranního řetězce penicilinu a protipěnidlo. Optimální teplota pro biosyntézu penicilinu je 25 C.Maximum production is achieved with this strain in a fermentation medium containing lactose or sucrose as a carbon source, the most suitable nitrogen source is Pharmamedia in combination with an inorganic nitrogen source. Furthermore, the fermentation medium must contain a source of sulfur, phosphorus, magnesium, calcium carbonate, a penicillin side chain precursor and an antifoam. The optimal temperature for penicillin biosynthesis is 25 C.

Výběr kmenů byl prováděn i s ohledem na odolnost na mechanické namáhání.The selection of strains was also carried out with regard to resistance to mechanical stress.

Příklad 1Example 1

Vegetativní inokulum bylo připravováno submerzní kultivací v 500 ml varných baňkách se 4.0 ml inokulační půdy (zdroj uhlíku sacharóza, dusíku kukuřičný výluh, síran amonný a anorganické soli). Půda pro Tabulka kmen (interní označení)Vegetative inoculum was prepared by submerged cultivation in 500 ml boiling flasks with 4.0 ml of inoculum medium (carbon source sucrose, nitrogen corn steep liquor, ammonium sulfate and inorganic salts). Medium for Table strain (internal designation)

NMU 2/40 UVLXIII/70 Příklad 2NMU 2/40 UVLXIII/70 Example 2

Fermentační postup byl shodný s postupem uvedeným v příkladu 1 s tím rozdílem, že do části fermentačních baněk byl přidán buď keramický váleček délky 6 mm, šířky 4 mm, nebo skleněná kulička o průměru 4 mm. Keramické válečky byly 4. den ferpenicilín V j/mlThe fermentation procedure was identical to that described in Example 1, except that either a ceramic roller 6 mm long, 4 mm wide, or a glass bead 4 mm in diameter was added to some of the fermentation flasks. The ceramic rollers were treated with ferpenicillin V U/ml on day 4.

300300

400 přípravu vegetativního inokula byla zaočkována kličkou spor za šikmého agaru se sporulační půdou nebo 2,5 ml sporové suspenze vzniklé smytím krup (30 g) 50ml destilované vody a inkubována na rotačním třepacím stroji 48 hodin.400 preparation of vegetative inoculum was inoculated with a loop of spores on a slant agar with sporulation medium or 2.5 ml of spore suspension obtained by washing groats (30 g) with 50 ml of distilled water and incubated on a rotary shaker for 48 hours.

Takto připraveným vegetativním inoikulem byly očkovány 10% fermentační baňky obsahu 500 ml se 40 ml fermentační půdy. Zdrojem uhlíku ve fermentační půdě byla laktóza v kombinaci se sacharózou, zdrojem dusíku Pharmamedia v kombinaci s dusičnanem amonným, dále půda obsahovala zdroj hořčíku, síry, fosforu, prekurzor postranního řetězce, uhličitan vápenatý a protipěnidlo. Při biosyntéze penicilinu G byl prekurzor přidáván v průběhu fermentace.The vegetative inoculum thus prepared was inoculated into 10% fermentation flasks of 500 ml with 40 ml of fermentation medium. The carbon source in the fermentation medium was lactose in combination with sucrose, the nitrogen source Pharmamedia in combination with ammonium nitrate, and the medium also contained a source of magnesium, sulfur, phosphorus, a side chain precursor, calcium carbonate, and an antifoam. In the biosynthesis of penicillin G, the precursor was added during the fermentation.

Příprava vegetativního inokula i vlastní fermentace probíhaly na rotačních třepacích strojích (230 obr./min., výstředník 25 mililitrů) při 25 rC.The preparation of the vegetative inoculum and the actual fermentation took place on rotary shakers (230 rpm, eccentric 25 milliliters) at 25 ° C.

Doba fermentace byla 8 dnů, vzorky na stanovení účinnosti penicilinu byly odebírány v 6., 7. a 8. dni fermentace. Maxima produkce bylo dosaženo v 7. dni fermentace.The fermentation period was 8 days, samples for determining the efficacy of penicillin were taken on the 6th, 7th and 8th day of fermentation. The maximum production was reached on the 7th day of fermentation.

Produkční srovnání výchozího kmene s kmenem, na který je uplatňován patentový nárok, je uvedeno v následující tabulce.The production comparison of the parent strain with the strain claimed is shown in the following table.

penicilín G j/mlpenicillin G u/ml

600 30 900 mentace sterilně z baněk odstraněny. Vzorky pro stanovení penicilinu byly odebírány počínaje 3. dnem ve 24hodinových intervalech do 8. dne fermentace. Přidávaná tělíska sloužila k detekci odolnosti mycelia na mechanické namáhání, jejich vliv na produkci penicilinu vyjádřený v j/ml vyplývá z následující tabulky.600 30 900 mentation were sterilely removed from the flasks. Samples for penicillin determination were taken starting from the 3rd day at 24-hour intervals until the 8th day of fermentation. The added bodies were used to detect the resistance of the mycelium to mechanical stress, their effect on penicillin production expressed in u/ml is shown in the following table.

T a b nika podmínky ve fermentační baňce dny standardní 1. ker, váleček -* 1 skleněná kuličkaTable of conditions in the fermentation flask days standard 1. bush, roller -* 1 glass ball

4. den odstraněn kmenDay 4, stump removed

NMU 2/40 NMU 2/40 UV LXIII/ /70 UV LXIII/ /70 NMU 2/40 NMU 2/40 UV LXIII/ /70 UV LXIII/ /70 NMU 2/40 NMU 2/40 UV LXIII/ /70 UV LXIII/ /70 3. 3. 5 500 5,500 1400 1400 3 800 3,800 4 000 4,000 4 800 4,800 5 300 5,300 4. 4. 11 300 11,300 15 600 15,600 2 200 2,200 3 500 3,500 4 800 4,800 8 900 8,900 5. 5. 20 500 20,500 23 700 23,700 1 800 1,800 3 200 3,200 4 500 4,500 12 300 12,300 6. 6. 28 000 28,000 33 400 33,400 1 800 1,800 12 300 12,300 8 800 8,800 19 300 19,300 7. 7. 29 500 29,500 33 400 33,400 2 200 2,200 17 800 17,800 10 200 10,200 23 000 23,000 8. 8. 32 200 32,200 30 600 30,600 2 600 2,600 25 300 25,300 13 100 13,100 26 600 26,600

282188282188

Kmen, na který je uplatňován patentový nárok, podléhá negativnímu vlivu mechanického namáhání minimálně a navíc má značné regenerační schopnosti, jak vyplývá z výsledků uvedených v předchozí tabulce.The strain to which the patent claim is made is minimally subject to the negative effects of mechanical stress and, in addition, has significant regenerative abilities, as shown by the results shown in the previous table.

Příklad 3Example 3

Fermentace penicilinu V byla uskutečněná v čtvrtprovozním měřítku v objemu 201itrových laboratorních fermentačních tanků (v dalším LFT).Penicillin V fermentation was carried out on a quarter-scale in 201-liter laboratory fermentation tanks (hereinafter referred to as LFT).

Inokulum s kmenem UV LXIII/70 bylo připraveno z provozní ječmenné sporové konzervy též v LFT na standardní inokulační půdě za 32 hodin kultivace.The inoculum with the UV LXIII/70 strain was prepared from an operational barley spore preserve also in LFT on standard inoculation medium after 32 hours of cultivation.

Fermentace penicilinu V na půdě s obsahem 4% sójové mouky, 1% CSL o sušině 60procentní, dále prekurzoru, vápence a dalších solí probíhala za obvyklých kultivačních a technologických podmínek za semikontinuálního přidávání dalších živin (sacharóza, síran amonný, sójový olej, fenoxyoctová kyselina) po dobu 211 hodin. Byla dosažena produkce penicilinu V stanovená jodometricky 35 980 mj/ml, což bylo 118,7 % oproti kontrolní .Eermentaci s kmenem NMU 2/40.Penicillin V fermentation on a medium containing 4% soy flour, 1% CSL with a dry matter content of 60%, as well as precursor, limestone and other salts was carried out under usual cultivation and technological conditions with semi-continuous addition of other nutrients (sucrose, ammonium sulfate, soybean oil, phenoxyacetic acid) for 211 hours. Penicillin V production determined by iodometry was 35,980 IU/ml, which was 118.7% compared to the control fermentation with strain NMU 2/40.

Claims (1)

pRedmEt vynalezuI will invent the object Kmen mikroorganismu Pcnicillium chrysogenum CCM F- 8012, produkující penicilín V a G.Pcnicillium chrysogenum strain CCM F- 8012, producing penicillin V and G. Saveroxrafla, n. p. závod 7, MoatSaveroxrafla, N. Plant 7, Moat
CS877167A 1987-10-06 1987-10-06 Penicillium chrysogenuniCCM F-8012 strain CS262188B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS877167A CS262188B1 (en) 1987-10-06 1987-10-06 Penicillium chrysogenuniCCM F-8012 strain

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS877167A CS262188B1 (en) 1987-10-06 1987-10-06 Penicillium chrysogenuniCCM F-8012 strain

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS716787A1 CS716787A1 (en) 1988-07-15
CS262188B1 true CS262188B1 (en) 1989-03-14

Family

ID=5420296

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS877167A CS262188B1 (en) 1987-10-06 1987-10-06 Penicillium chrysogenuniCCM F-8012 strain

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS262188B1 (en)

Also Published As

Publication number Publication date
CS716787A1 (en) 1988-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Newton et al. Isolation of cyanobacteria from the aquatic fern, Azolla
Ordentlich et al. Rhizosphere colonization by Serratia marcescens for the control of Sclerotium rolfsii
WO2002072795A2 (en) Isolated bacteria for the protection of plants against phytopathogenic fungi and bacteria
CN106282044B (en) A kind of preparation method of Hyphomicrobium and pyrroloquinoline quinone
Alazard Nitrogen fixation in pure culture by rhizobia isolated from stem nodules of tropical Aeschynomene species
Schwinghamer Studies on induced variation in the rhizobia. I. Defined media and nodulation test techniques
US5492818A (en) Method of producing L-glutamic acid by fermentation
Smith et al. Symbiotic and free‐living denitrification by Bradyrhizobium japonicum
Rai The salt tolerance of Rhizobium strains and lentil genotypes and the effect of salinity on aspects of symbiotic N-fixation
Fisher et al. Antifungal effects of Massarina aquatica growing on oak wood
CS262188B1 (en) Penicillium chrysogenuniCCM F-8012 strain
Rosbrook et al. The abilities of three Frankia isolates to nodulate and fix nitrogen with four species of Casuarina
KR100373510B1 (en) Teicoplanin producing microorganism
CS273134B1 (en) Strain of "penicillium chrysogenum ccm 8013" microorganism
US3483086A (en) Method for increasing alkaloid production of submerse claviceps cultures
Vezina et al. ANTIMYCIN A FERMENTATION I. PRODUCTION AND SELECTION OF STRAINS
KR102106479B1 (en) ANURINIBACILLUS MIGULANUS strain and use thereof
KR0139589B1 (en) Microorganism and producing method of streptokinase and streptodornase
CS253986B1 (en) Microorganism strain Penioillium chrysogenum CCM P-786
SU881117A1 (en) Actinomyces grisesus vniigenetika-107f strain as grisin antibiotic producent
CZ281824B6 (en) Strain of penicillium chrysogenum ccm 8157 micro-organism
CN108949604A (en) One streptomycete category bacterial strain and its cultural method and application
Rai Manganese-resistant mutants of Azospirillum brasilense: their response of associative nitrogen fixation, dry-matter production and nitrogen content of cheena (Panicum miliaceum L.) to different amounts of applied nitrogen in acid soil
CZ282335B6 (en) High-production strain of penicillium chrysogenum ccm 8197 micro-organism
SK278906B6 (en) High-productive strain of penicillium chrysogenum microorganism