CS253986B1 - Kmen mikroorganismu Penioillium chrysogenum CCM P-786 - Google Patents

Abstract

Účelem řešení je získání kmene produkujícího penicilín ve vyšších koncentracích než je dosahováno předchozími kmeny. Penicilín syntetizuje mutanta kmene Penioillium chrysogenum získaná po působení vhodných mutagenů a pasivní selekci v médiu obsahujícím vhodný zdroj uhlíku, dusíku, síry, fosforu, prekurzorů, křídy, protipěnidla a stopových prvků při vysoké konverzi zdroíe uhlíku za aerobních podmínek při 25 °C. V průběhu 168 hQdin kultivace kmen, na který je uplatňována patentová ochrana, vytváří za laboratorních podmínek 31 000 j./ml penicilinu V nebo 25 800 j/ml penicilinu

Description

Vynález se týká kmene mikroorganismu Pěnicillium chrysogenum CCM F-786 (interní označení UV LV/2O-I/12) produkujícího penicilín V a G.

Dnešní průmyslová technologie výroby penicilinu patří mezi nejlépe zvládnuté technologie fermentačního průmyslu· O tom svědčí enormní vzestup produkce z méně než 10 j/ml v roce 1940 na 1 000 j/ml v roce 1950 a na 30 000 a více j/ml v současně době.

Na vzestupu výtěžnosti penicilinu se podílejí tři činitelé, je to šlechtění kmenů, poznání jejich fyziologie a inžinýring procesu·

Šlechtění kmenů má dnes již 4Oletou tradici· Od počáteční empirie je genetická práce v současné době převáděna na vědeckou bázi, je nahražována racionální selekční technikou, Hlavním ukazatelem efektu šlechtění je vzestup celkového množství penicilinu na jednotku objemu fermentoru za jednotku času· Kmen je třeba posuzovat i z dalších hledisek, např, podle schopnosti sporulace, morfologie, podle schopnosti růstu při vyšší denzitě, podléhání shearu, filtrovatelnosti půdy po fermentaci, podle schopnosti konver ze zdroje uhlíku, podle schopnosti využívat anorganické zdroje dusíku místo organických, podle resistence vůči vlastnímu produktu, tj· penicilinu, podle inkorporace postranního řetězce do molekuly penicilinu, podle odolnosti na toxické působení prekurzorů, podle vhodných technologických vlastností, čímž je myšlena např, tvorba pěny, ulpívání na stěnách tanků atd. Všechny tyto faktory mohou být předmětem řízené selekce.

Kmen Pěnicillium chrysogenum CCM F-786, interního označení UV LV/20-I/12, byl získán působením mutagénů a pasivní selekcí z výchozího kmene CO F-760, interního označení OU 2/40, Postup šlechtění vyplývá z následujícího schématu, ve kterém je uvedena

2S3 986

genealogická linie vedoucí ke kmeni, na nějž je uplatňován patentový nárok.

Penicillium chrýsogenum NMU 2/40

UV

Ψ

UV LII/55

NMG

NMG iII/116

UV > *

UV LV/20

PS

UV.

.V/20-I/12

Vysvětlení zkratek: UV - působení UV-světla

NMG - působení nitrosometylguanidinu PS - pasivní selekce

Aplikace mutagenů: zdrojeS?světla byla germicidní lampa

Philips TW 40 W s předřazeným stabilizátorem sítového napětí ST 250 o výkonu'250 V a citlivosti 1%. Suspense spor ve vodě, 5 ml, byla ozařována v Petriho misce o průměru 45 mm. Během ozařování suspense byla míchána na elektromagnetickém míchadle· Vzdálenost misky od zdroje ozáření byla 20 cm, záření bylo ve vhodných časových intervalech přerušování odebíráním 0,5 ml vzorku, které byly dále ředěny, a vysévány na Petriho misky se sporulační půdou.

Pro mutagenizaci nitrosometylguanidinem byla používána koncentrace 2 mg/ml v konečné mutační směsi. Doba aplikace byl3 od 15 do 40 ňinut při míchání v uzavřených Erlenmayerových baňkách. pH mutační směsi bylxo pufrováno citrofosfátovým pufrem o pH 6,0. V časových intervalech byly odebírány vzorky a ředěny až na neúčinnou koncentraci NMG a vysévány na Petriho misky se sporulační půdou.

- 3 253 986

Spory pro pasivní selekci byly suspendovány v destilované vodě'nebo fyziologickém roztoku, ředěny řadou a faktorem 10. z jednotlivých ředění bylo paralelně očkováno několik misek še sporulační půdou.

Výše navedeným způsobem aplikace, mutagenů a pasivní selekcí byl získán izolát UV LV/20-I/12.

Izoláty byly hodnoceny dle následujícího schématu:

izolovaná kolonie na Petriho misce 1 šikmý agar

Φ vegetativní inokulum vlasln^ fermentace

Izoláty byly hodnoceny ve 2 pokusech před konzervací a ve 3 po kusech po konzervaci. Konzervy slouží k dlouhodobému uchovávání sporového materiálu a umožňují zachování vhodných růstových a produkčních vlastností.

Stanovení účinnosti penicilinu bylo prováděno automatizovaným systémem při použití hydroxamátové kolorimetrické metody.

Tímto hodnotícím systémem byl získán kmen, na který je uplatňován patentový nárok.

Kmen tvoří při monosporickém rozsevu na sporulační půdě typu glycerin-melasa kolonie velikosti cca 12 mm během 9 dnů kultivace při 25°C, střed kolonie je propadlý, od válu k okraji je kolonie žvrásněná, barva spor je béžová. Kultura dobře a rychle sporuluje na různých typech sporulačních půd i na pří rodních substrátech (proso, kroupy atd.)· Počet spor v 1 ml suspense vzniklé smytím Endovy zkumavky 10 ml vody se pohybuje *7 kolem 2.10'/ml a počet spor v 1 ml suspense vzniklé smytím spor 30 g krup 50 ml vody je 8.10? spor/ml.

Pro přípravu vegetativního inokula lze použít půdy obsahující jako zdroj uhlíku glukózu nebo sacharózu při dosažení shodných růstových i produkčních hodnot· Vhoňným zdrojem dusí_ ku pro přípravu inokula je kukuřičný extrakt. Optimální stáří

- 4 253 986 vegetativního inokula vzhledem k dosažení maximálních produkcí je 48 hodin při inkubační teplotě 25°C, fermentační půda je inokulována 10$ vegetativního inokula7 Kmen má značné nároky na dostatečné zásobení kyslíkem i při přípravě vegetativního inokula.

Maximálních produkcí je a tímto kmenem dosaženo ve fermentační půdě typu laktóza či sacharóza -Pharmamedia. Pro uvedený kmen je klíčově důležitá forma zdroje síry a anorganického dusíku, nemalý efekt pak má i obohacení půdy ionty hořčíku, který příznivě ovlivňuje permeabilitu buněčné membrány. Místo Pharmamedie lze použít i sojovou či arašídovou mouku bez významného poklesu produktivity. Utilizace zdroje uhlíku, resp. laktózy je nejekonomičtější při koncentraci 4 - 8$, pro dosažení maximálních produkcí je optimum 13$, z 1 mg laktózy vzniká v laboratorním měřítku 250 j./ml penicilinu.

Citlivost kmene na mechanické namáhání je na úrovni dobrých kmenů, kmen má značné nároky na přenos kyslíku a je citlivý na pokles rozpuštěného kyslíku nebo na zastavení míchání. Biosyntéza penicilinu u tohoto kmene není zastavena v přítomnosti 50 000 j/ml modelově přidaného penicilinu, v průběhu standardní fermentace je rozloženo maximálně 25$ penicilinu a vzniká kolem 2$ p-hy droxy pěnic ilinu.

Příklad 1

Vegetativní inokulum bylo připravováno submersní kultivací v 500 ml varných baňkách se 40 ml inokulqční půdy (zdroj uhlíku sacharóza, dusíkukukuřicný výluh, síran amonný á anorganické sole). Půda pro přípravu vegetativního inokula byla zaočkována kličkou spor ze šikmého agaru nebo 2,5 ml sporové suspense vzniklé smytím krup (30 g) 50 ml vody a byla inkubována na rotačním třepacím stroji 48 hodin.

Takto připraveným vegetativním inokulem byly očkovány 10$ fermentační baňky obsahu 500 ml, objem fermentační půdy 40 ml. Zdrojem uhlíku byla sacharóza a laktóza, zdrojem dusíku Pharmamedia nebo sojová či araěiňová mouka, amonná sůl, půda dále obsahovala prekurzor postranního řetězce, sole, uhličitan vápenatý k pufrování půdy a zdroj síry.

- 5 253 986

Příprava vegetativního inokuia i vlastní fermentace probíhaly na rotačních třepacích strojích při 230 ot./min., výstředník stroje 25 mm,, při teplotě 25°C.

Fermentace za uvedených podmínek trvala 8 dnů, vzorky pro stanovení účinnosti byly odebírány v 6., 7. a 8.dni fermentace· Maxima produkce bylo dosahováno v 7.dni fermentace.

Produkční srovnání výchozího kmene s kmenem, na který je uplatňován patentový nárok;

kmen	penicilín V	penicilín G
(interní označení)	j/ml	j/ml
NMU 2/4o	25 000	23 000
UV LV/2O-I/12	31 000	25 800

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM-F-786 produku jící penicilín V a G.