CS218514B1 - Kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM F-720 - Google Patents

Abstract

Vynález se týká nového kmene Penicillium chrysogenum CCM F-720, který za běžných kultivačních podmínek produkuje penicilín G a V v podstatně vyšších výtěžcích.

Description

Vynález se týká kmene mikroorganismu Peniícillium ch-rysogenum CCM F-720 produkujícího penicilín G a V.

Tento kmen byl získán z kmene Penicillium chryso,genům evidenčního· čísla 65/41 působením mutagenů a opakovanými pasivními selekcemi.

Použité mutageny: UV-světlo· a nitrometylurea (NMU).

Aplikace UV-světla: Zdrojem světla byla germicidní lampa 40 W s předřazeným stabilizátorem síťového napětí v 5 ml destilované vody byly ozařovány v Petriho misce o průměru 45 ml. Během ozařování byla suspense míchána na elektromagnetickém míchadle. Vzdálenost misky od zdroje záření byla 20 cm, během ozařování byly ve vhodných časových intervalech odebírány vzorky po 0,5 ml, které byly dále zředěny a vysévány na Petriho mlsky se sporulační půdou složení melasa, glycerin, kvasniční extrakt a soli, jak je popsáno u postupu pro pasivní selekci. , 1'

Aplikace NMU: NMU (Κ. &Λ K. Laboratories, lne.) byl aplikován v koncentraci 5.’· ^g/ml. Muťagen byl za stálého míchání rozpuštěn v citrátofosfátoyém pufru pH 6,0, pak byly přidány sporý suspendované v témže pufru. Mutační směs byla míchána na elektromagnetickém míchaďle při 25 °C. Ve vhodných časových intervalech byly odebírány vzorky po 1 ml a ředěny do vyředění MNU na neúčinnou koncentraci. Odebírané Vzorky byly vysévány na Petriho misky, jak je popsáno u postupu pro pasivní selekci.

Pasivní selekce: S.pory pro pasivní selekci byly suspendovány v destilované vodě nebo fyziologickém roztoku, ředěny ředicí řadou a faktorem 10 a očkovány na Petriho misky se shodnou sporulační půdou. Z jednotlivých ředění bylo paralelně očkováno· několik misek. Po 6 — 9denní inkubaci při teplotě 25 ^QC byla u izolátů ukončena sporulace a bylo možné je přeočkoivat na šikmé agary se shodnou sporulační půdou. Inkubace tohoto materiálu probíhala rovněž při teplotě 2i5 °C po dobu 6 až 8 dnů.

Vhodným střídáním mutagenů a pasivní selekcí byl získán Izolát 43/28—80 D.

Izoláty byly hodnoceny podle následujícího· sichémíatu:

izolovaná kolonie na Petriho· misce i

šikmý agar l

vegetativní inokulum l

vlastní fermentace

Získané vysokoprodúkční izoláty jsou u4 chovávány ve formě lyoíilizovaných konzerv.

Stanovení účinnosti penicilinu bylo prováděno hydroxamáltovou metodou.

Tímto hodnotícím systémem byl získán kmen, který je předmětem ochrany.

Kmen tvoří při monosporickém rozsevu ha sporulační půdě typu glycerin-melasa během 6 dnů kolonie velikosti 7 — 10 mm při teplotě kultivace25 °C. Kultura intenzívně sporuluje na různých typech sporulačních půd i na přírodních substrátech, jako je proso, ječmen, kukuřice, rýže apod., síporulace je ukončená během 7 dnů kultivace; Barva vysporulované kultury je sytě zelená. Kolonie na pevných půdách jsou zbrázděné p'aprsíčitými rýhami, které jsou patrné i na spodní straně kolonie. Střed kolonie je proláklý, okraj kolonie je bíle lemován v šířce cca 2 mm. Konidiofor je dlouhý cca 300 ₍um a má hladké stěny. Štětičky jsou asymetrické, na větvích vyrůstají svazky metul. KOnidionosný krček je zúžen. Kónidie jsou oválné, . velikosti cca 2,5 až 3 ^m. Kmen. ha agarových půdách je stabilní, několik týdnů, na přírodních substrátech několik měsíců.

Další charakteristiky^ kmene: Mycelium kmene je středně citlivé k intensivnímu namáhání v průběhu fermentace, želelzo při koncentraci 50 χ/ml inhibuje biosymtézu ze 30 až 40 %, biosyntéza penicilinu je inhibována vlastním produktem až při koncentracích penicilinu vyšších než 30 000 j./ml, kmen uitilizuje různé zdroje uhlíku, přednostně laktózu, šachárézu, glukózu a různé oleje, vhodným zdrojem dusíku vedle organických zdrojů jsou i ahorganické sloučeniny dusíku, přednostně pak síran amonný. V průběhu fermentace vzniká kolem 3 .% vedlejších penicilinů. ' < >

Příklad 1 ’ i

Vegetativní inokulum bylo připravováno submersně v 500 mí varných baňkách se 60 ml inokulační půdy, která obsahuje základní živiny, ťj. zdroj uhlíku sacharózu, dusíku, kukuřičný extrakt a síran amonný a soli. Půda pro přípravu vegetativního inokula byla záockováma kličkou spor ze šikmého agaru a inkubována na rotačním trepacím stroji kolem 40 hodin.

Takto připraveným vegetativním inokulem byly očkovány fermentační baňky obs*ahu 500 ml, objem fermentační půdy 40 ml. Zdrojem uhlíku bylá laktóiza, sacharóza a sojový olej, zdrojem dusíku sójová mouka a amonná sůl, půda dále obsahóvála prekursor postranního řetězce penicilinu, soli, uhličitan vápenatý a zdroj síry.

Příprava vegetativního inokula i vlastní fermentace probíhaly na rotačních třepacích strojích při 230 ot./min, výstřednost 25 mm, při teplotě 25 °C.

Fermentace probíhaly 11 dnů, Vzorky pro stanovení účinnosti byly odebírány v 8., 9.,

10. a 11. dni fermentace. Maximální produkce bylo zpravidla dosaženo v 10. dni fermentace. Za uvedených podmínek fermentace bylo v laboratorním měřítku dosahováno 16 500 j./ml.

Kmen Penicillium chrysogenum, značený 43/28—80 D, byl uložen v čs. sbírce mikroorganismů (Czechoslovak Collečtion of Microorganisms), Univerzita J. E. Purkyně, Brno, Tř. Obránců míru 10, pod čís. CCM F-720.

Claims (1)

1. PREDMlI VYNALEZU

   Kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM F-720, produkující penicilín V a G.