CS235447B1 - Kmen mikroorganismu Peniciliium chrysogenum CCM F-747 - Google Patents

Abstract

Vynález se týká kmene mikroorganismu Peniciliium chrysogenum CCM F-747 produkujícího penicilín G a V. Nový kmen byl získán z kmene Peniciliium chrysogenum F 713 působením mutagenů a opakovanými pasivními selekcemi.

Description

Vynález se týká kmene mikroorganismu Penicillium chrysogepura CCM F-747 (interní označení NMU XIX/40) produkujícího penicilín G a V.

Výroba penicilinu, která se realizuje ve výrobních fermentačních tancích již více než 30 let, se neustále zyyšuje. Zvýšení výroby souvisí se zvýšenými nároky na objem výroby polosyntetiekých penicilinů odvozených od 6-aminopenicilánové kyseliny získané biologickou nebo chemickou cestou z penicilinu V nebo G. Zvýšení výroby je bu3 realizováno rozšiřováním výrobních fermentačních provozů, nebo zvyšováním výtěžnosti fermentace.

První alternativa vyžaduje významné investiční náklady, druhá je umožněna bu3 zlepšením fermentačních podmínek na základě dokonalejšího řízení fermentačního procesu, nebo zvýšením produkční schopnosti kmenů používaných pro biosyntézu. Šlechtitelská linie kmenů pro biosyntézu penicilinu jsou vedeny dlouhodobě řadou zavedených postupů.

Kmen Penicillium chrysogenum CCM F-747 byl získán z kmene Penicillium chrysogenum CCM F-713 působením mutagenů (vždy nitrósometylmočovina) a opakovanými pasivními selekcemi. Poslední mutagenní působení bylo na kmen interního označení NMU XVIII/81. Použitý mutegen- nitrosome.tylmočovina (NMU) byl aplikován v koncentraci 6 mg/ml směsi pufrované citrátfosfátovým pufrem (pH 6,0). Navážka NMU byla za stálého míchání rozpuštěna v pufru, potom byly přidány spory suspendované v téqjže pufru. Během působení byla mutační směs míchána na elektromagnetickém míchadle při 25 °C. V časových intervalech byly odebírány vzorky po 1 ml e zředěny až na neúčinnou koncentraci NMU.

Spory pro pasivní selekce byly suspendovány v destilované vodě nebo fyziologickém rcztoku, zředěny ředicí řadou s faktorem 10 e očkovány na Petriho misky se sporulační půdou. Z jednotlivých ředění bylo paralelně očkováno několik misek. Po 7 ež 14denní inkubaci při teplotě 26 °C byly izoláty vysporulovány a bylo možné je přeočkovat na šikmé agary se shodnou sporulační půdou. Inkubace tohoto sporulačního materiálu probíhá při teplotě 26 °C po dobu 6 až 10 dnů.

Výše uvedeným způsobem aplikace mutegenů a pasivní selekcí byl získán izolát CCM-747.

Izoláty byly hodnoceny podle následujícího schématu:

izolovaná kolonie na Petriho misce

I šikmý*agar vegetativní inokulum vlastní fermentace

Izoláty byly hodnoceny ve dvou pokusech před lyofilizací (konzervací) a ve 3 pokusech po lyofilizaci. lyofilizované konzervy slouží k dlouhodobému uchovávání sporového materiálu a umožňují zachování vhodných růstových a produkčních vlastností.

' Stanovení účinnosti penicilinu bylo prováděno automatizovaným systémem při použití hydroxamátové kolorimetrické metody.

Tímto hodnotícím systémem byl získán kmen podle vynálezu. Nejvýznamnější vlastností kmene Penicillium chrysogenum CCM-F-747 je zvýšená produkce penicilinu minimálně o 5 % na celkovou hodnotu produkce 24 500 j/ml penicilinu V ve srovnání s kmenem GCM-F-713, který produkuje asi 23 000 j/ml.

Kmen tvoří při monosporickém rozsevu na sporulační půdě typu glycerin-melasa kolonie velikosti 10 až 15 mm během 7 až 10 dnů kultivace při 25 °C. Při sledování růstu je do 6. dne kultivace rychlost prakticky shodná se věemi nejrychleji rostoucími kmeny, a to jek při 25 °C, tak při 28 °C. Významné diference se projevují až ve 13. dni kultivace, kdy např. kmen CCM-F-713 se jeví jako kmen rychleji rostoucí. Kultura dobře a rychle sporuluje na různých typech sporulačních půd i na přírodních substrátech. Barva vysporulované kultury je béžová. Kmen na přírodních substrátech je stabilní po dobu několika měsíců. Růstové schopnosti tohoto kmene při submerzní fermentaci jsou vhodné. Za 24 hodin dosahuje při přípravě submerzního vegetativního inokula takového množství myceliální hmoty jako jiné kmeny za dvojnásobnou dobu. Při vlastní fermentaci je dosaženo požadované koncentrace biomasy pro zahájení biosyntézy penicilinu o 24 až 48 hodin než u jiných kmenů.

\

Předností kmene je jeho tolerance k vysokým koncentracím penicilinu přítomného ve fermentaění půdě. Modelové přidání 30 000 j/ml penicilinu na počátku fermentace do půdy neovlivní biosyntézu penicilinu. Přídavek 50 000 j/ml penicilinu je únosný od 48. hodiny fermentace. Při tomto obsahu penicilinu v půdě přidávaného ve výše uvedených hodinách není snížena biosyntetická schopnost kmene.

Kmen je tolerantní k vysokým koncentracím železa ve fermentačním médiu. Při 50 gama/ml Fe je biosyntéza snížena méně než o 10 %, zatímco u většiny průmyslových kmenů při stejné koncentraci železa dochází ke snížení až o 25 %.

Důležitou předností kmene je jeho tolerance k významnému mechanickému namáhání v průběhu fermentace. I při drastickém způsobu míchání dochází k minimálnímu poškození myceliálních vláken. Toto poškození je sledováno na základě uvolňování nukleotidů z buněk do fermentačního média v průběhu fermentace.

Je třeba konstatovat, že množství penicilinu získeného ve filtrátu je možno zvýšit elucí zbylého sedimentu o 30 % a desintegrací mycelia o dalších 10 %.

Přikladl

Vegetativní inokulum bylo připravováno submersně v 500 ml věrných baňkách se 60 ml inokulační půdy, které obsahuje základní živiny, t.j. zdroj uhlíku sacharózu, dusíku kukuřičný extrakt a síran amonný a soli. Půda pro přípravu vegetativního inokula byla zaočkováne kličkou spor ze šikmého agaru a inkubována na rotačním třepacím stroji 32 až 36 hodin.

' Takto připraveným vegetativním inokulem byly očkovány fermentační baňky obsahu 500 ml, objem fermentační půdy 40 ml. Zdrojem uhlíku byla laktóza a glukóza, zdrojem dusíku kukuřičný extrakt, sojová mouka a amonná sůl, půda dále obsahovala prekurzor postranního řetězce, soli, uhličitan vápenatý k pufrování půdy a zdroj síry.

Příprava vegetativního inokula i vlsstní fermentace probíhaly na rotačních třepacích strojích při 230 obr./min., výstřednost 25 mm, při teplotě 25 °C.

Fermentace probíhaly 7 dnů, vzorky pro stanovení účinnosti byly odebírány v 5., 6. a 7. dnu fermentace, maximální produkce bylo zpravidla dosaženo v 6. dnu fermentace.

Výše uvedeným postupem jsou dosahovány produkce 24 500 j/ml penicilinu V a 25 000 j/ml penicilinu G.

Příklad 2

Fermentace v poloprovozních fermentorech, objem 250 1, byla třístupňová. Předočkovací půda obsahovala jako zdroj uhlíku sacharózu, zdrojem dusíku byly kukuřičný extrakt, bavlníková mouka a anorganický zdroj, dalšími složkami půdy byly rozpustné soli a uhličitan vápenatý. Očkovací půda měla stejné složení. Fermentační půda obsahovala sacharózu, kukuřičný extrakt, alkalický eluát bavlníkové mouky, prekurzor postranního řetězce, křídu a delší soli.

Průběh fermentace byl řízen dávkováním sacharozy, síranu amonného, močoviny, prekurzoru a fosforečnanu draselného.

Předočkovací fermentor byl plněn 100 litry půdy, inokulace provedena kulturou vyrostlou na cca 80 g krup, teplota kultivace 25 °C, míchání 300 ot/min, vzdušnění ,00 l/min, doba kultivace 36 hodin.

‘ t

Očkovací fermentor byl plněn 150 1 půdy a očkován 10 % obj. z předočkovacího fermentoru, teplote kultivace 25 °C, míchání 300 ot/min, vzdušnění 150 l/min, doba kultivace 18 hodin.

Fermentační tank byl plněn 150 1 půdy a inokulován 10 % obj. z očkovacího fermentoru, fermentační teplota 25 °C, míchání 300 až 320 ot/min vzdušnění 150 až 180 l/min, doba fermentace 150 až 200 hodin.

Během fermentace byly kontinuálně nebo semikontinuálně přidávány roztoky sacharozy, prekurzoru, zdrojů dusíku a fosforu, zvětšující se objem fermentační půdy a růst kultury byly kompenzovány a udržovány pomocí odběrů půdy a příslušným ředěním. Takto řízenou fermentací bylo ve fermentoru dosaženo před 200 hod. fermentace hladiny 40 000 j/ml, přičemž ve 4 odběrech fermentační půdy se pohybovala hladina penicilinu od 27 000 do 36 000 j/ml.

Kmen· vzhledem k vynikajícím růstovým a regeneračním vlastnostem umožňuje dosáhnout urychlení fermentačního procesu (ekonomické parametry byly optimální mezi 150.·,až 170. hod.).

Claims (1)

1. Kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM F-747, produkující penicilín V a G.

   Severografia, n. p., MOST