CS239242B1 - Kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM F-760 - Google Patents

Abstract

Kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM F-760, produkující penicilín G a V. Tento kmen umožňuje zvýšenou produkci penicilinů při submersní fermentaci, je odolný vůči mechanickému namáhání, rychle roste na tuhých i kapalných mediích a ja vysoce stabilní v následných sporových generacích.

Description

Vynález se týká kmene mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM produkujícíh® penicilín G a V.

Přesto, že výroba penicilinu probíhá ve výrobních fermentačních tancích více než 30 let, dochází k neustálému zvyšování objemu vyrobeného penicilinu. Celkové zvýšení výroby může být dosaženo buď zvětšováním výrobní kapacity, nebo zvýšením výtěžku penicilinu při jeho výrobě. V současné době je druhý způsob jedinou možnou cestou zvýšení výtěžku, kde hlavním přínosem je zlepšení produkčních vlastností kmene. Tyto kmeny jsou získávány řadou zavedených postupů v dlouhodobých šlechtitelských programech. Výsledné kmeny vykazují pak řadu významných odlišných vlastností, z nichž nej důležitější jsou ty vlastnosti, které se projevují ve zvýšené produkci penicilinu ve velko objemových fermentorech.

Kmen Pěnic i llium chrysogenum CCM 3?- Wo.

byl získán působením mutagenů a opakovanými.

pasivními selekcemi na výchozí kmen N 9541· Způsob šlechtění kmenů je znázorněn na následujícím schématu, kde je uvedena genealogická linie vedoucí ke kmeni, na nějž je uplatňován patentový nárok.

Penicillium chrysogenum N 9541 ψ PS

9541-16 ý UV 1

UV 1/47 f PFP 1

PFP 1/17

I

- 2 ψ ps

ΡΡΡ 1/17-30 | NMU 1

NMU 1/27 | NMU 2

NMU 2/40 239 242

Zkratky: PS - pasivní selekce - selekce bez působení mutagenu UV - působení UV- záření

PPP - působení parafluorofenylalaninu NMU - působení nitrosometylmočoviny.

Poslední mutagenní působení bylo na kmen interního označení NMU 1/27. Použitý mutagen NMU byl aplikován v koncentraci 6 mg/ ml směsi pufrované c-itr^tf osfátovým pufrem. Během působení byla mutagenní směs míchána na elektromagnetickém míchadle při 25^eC, V časových intervalech byly odebírány vzorky a ředěny až ha neúčinnou koncentraci.

Spory pro pasivní selekci byly suspendovány v destilované vodě, ředěny ředící řadou s faktorem 10 a očkovány na Petriho misky se sporulační půdou. Po. 14denní inkubaci při teplotě 2í/*C byly izoláty vysporulovány a bylo možné je přeočkovat na šikmé agary. Inkubace tohoto základního sporulacního materiálu probíhala při téže teplotě 9 dnů.

Výše uvedeným způsobem aplikace mutagenů a pasivních selekcí byl získán izolát NMU 2/40. Izoláty byly hodnocenypdle následujícího schématu:

šikmý agar

Ý vegetativní inokulum ý vlastni fermentace

Izoláty byly hodnoceny ve 2 pokusech před lyofilizací a ve 3 pokusech po lyofilizací· Lyěfilizované konzervy slouží k dlouhodobému uchovávání sporováho materiálu a umožňují zachování vhodných růstových a produkčních vlastností kmene.

Stanovení účinnosti penicilinu bylo prováděno automatizovaným systémem při použití hydroxamátové kolorimetrické metody.

239 242

Kmen tvoří při monosporickém rozsevu na sporulační půdě typu glycerin-melasa kolonie velikosti 20-22 mm se zvýšeným střed,ním válem o průměru 5 <rfí 6 mm během 7 áž 10 dnů kultivace při 25 Směrem od válu k okraji kolonie se vytvářejí nepravidelné radiální vrásy. Na minimální půdě typu Czapek-Dox se vytvářejí kolonie o velikosti až 25 mm, kde střední část tvořená válem je průměru 3 až 5 mm. Na okraji kolonie i na této půdě se vytvářejí radiální vrásy, které nejsou tak zřetelné jako na 3porulační půdě typu glycerin-melasa. Barva vysporulované kolonie je na sporulační půdě béžová, starší kolonie začínají tmavnout, na minimální půdě Czapek-Dox jsou kolonie bílé a při stárnutí se směrem do středu projevuje odstín béžové. Kmen patří mezi kmeny rychle rostoucí při všech používaných teplotách pro kmeny druhu Penicillium chrysogenum, a to jak na tuhých, tak v kapalných médiích.

Předností kmene je vysoká stabilita v následných sporových generacích. Tento kmen bez jakéhokoliv výrazného produkčního po» klesu snáší přeočkování až do 4.generace.

Kmen je tolerantní ke zvýšeným koncentracím penicilinu přidá ného do média na počátku fermentace.

Vhodnou vlastností kmene je zlepšená konteerze hlavního zdroje uhlíku - sacharózy na penicilín.

Další významnou vlastností kmene je jeho tolerance k mechanickéůu namáhání, kterému je kultura podrobena během míchání ve fermentační nádobě. Při vysokém mechanickém namáhání dochází u tohoto kmene k minimálnímu poškození vláken mycelia. Tato výhoda je uplatněna speciálně při velkoobjemových fermeníacích. Hlavní a nej významnější vlastností kmene Penicillium chrysogenum CCM P- je zvýšená produkce penicilinu při submersní fermentaci.

Příklad 1 v

Fermentace v bankách na rotačních třepačkách.

Vegetativní inokulum bylo připravováno submersně v 500 ml varných bankách se 40 ml inokulační půdy (zdroj uhlíku sacharoza, dusíku kukuřičný výluh, síran amonný a anorganické sole). Půda pro přípravu vegetativního inokula byla zaočkována kličkou spor ze šikmého agaru a inkubována na rotačním třepacím stroji 30 až 40 hodí n.

- 4 239 242

Takto připraveným vegetativním inokulem byly očkovány fermentační baňky obsahu 500 mlj objem fermentační půdy 40 ml (zdroj uhlíku laktoza a glukóza, zdroj dusíku kukuřičný výluh, sojóvá mouka a amonná sůl, prekurzor postranního řetězce, anorganické sole, uhličitan vápenatý a zdroj síry)· Permentače probíhaly 9 dnů, maximální produkce bylo zpravidla dosahováno v 8.dnu kultivace· Produkce penicilinu za výše uvedených podmínék dosahovala 25 000 j./ml.

Příklad 2

Permentače v poloprovozních fermentorech·

Permentače v poloprovozních fermentorech objemu 250 1 byla třístupňová· Předočkovací půda obsahovala jako zdroj uhlíku sacharózu, zdrojem dusíku byly kukuřičný výluh, bavlníková mouka a anorganický zdroj, dalšími složkami půdy byly rozpustné sole a uhličitan vápenatý· Očkovací půda mela stejné složení. Permentační půda obsahovala sacharózu, kukuřičný výluh, bavlníkovou ůouku, prekurzor postranního řetězce a další sole·

Permentační tank byl plněn 150 1 půdy a inokulován 10 % objemovými z očkovacího fermentoru',' fermentační teplota 25°C, míchání 300 až 320 ot./min., vzdušnění 150 až 180 1 /min.,'doba fermentace 200'hodin. Průběh fermentace byl řízen dávkováním zdrojů uhlíku, dusíku, fosforu a prekurzoru.

Zvětšující se objem fermentační půdy a růst kultury byly kompenzovány a udržovány pomocí odběrů půdy a příslušným ředěním.

Takto řízenou fermentací bylo ve fermentoru dosaženo ve 174.hodině hladipy penicilinu 38 OOO j./ml, ekonomický koeficient dosáhl hodnoty 0,140 mia/m?.hód. a bylo dosaženo velmi příznivých parametrů konverze sacharózy na penicilin (5,8 kg/kg).

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   239 242

   Kmen mikroorganismu. Pěni cil lium chrysogenum CCM P— Ho produkující penicilín V a G·