CS227392B1 - Způsob přípravy velkého množství vysoce fyziologicky aktivních konidií mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul. - Google Patents

Abstract

Vynález chrání způsob přípravy velkého množství vysoce fyziologicky aktivních konidií mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul. dvoustupňovou stacionární kultivací na hladině kapalného živného media. V prvním stupni, který se očkuje vegetativním submerzním inokulem nebo klidovými konidiemi ve vodné suspenzi, medium obsahuje pouze limitované množství asimilovaného uhlíku, což vede. až k úplnému zastavení prodlužovacího vegetativního nediferenciovaného růstu sfaceliového mycelia. Ve druhém stupni je medium nahrazeno mediem čerstvým, které obsahuje zdroj asimilovatelného uhlíku, s výhodou sacharozu, v koncentraci 25 až 35 % hmot. a kultura se inkubuje až do ukončení fáze odškrcování konidií.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy velkého množství vysoce fyziologicky aktivních konidií mikroorganismu Claviceps purpurea f Fr.) Tul.

Průmyslová kultivace vláknitých hub je zpravidla nepříznivě ovlivňována tím, že pro zaočkování produkční půdy ve velkoobjemových fermentorech je nutno připravovat velké objemy inokula. Příprava velkých objemů inokula vyžaduje pomnožování vegetativních vláken submerzní kultivací v řadě očkovacích tanků postupně vzrůstající velikosti. V průběhu množení narůstá sice stále větší množství biomasy, avšak kvalita inokula se takovým postupem trvale snižuje.

Účinnou složkou inokula jsou především nejmladší buňky rostoucích konců vláken a jejich větví, zatímco starší již nerostoucí buňky, vzdálenější od apexu, v podmínkách submerzní kultivace zpravidla rychle vakuolizují, odumírají a lyžují. Tzv. „velmi dobře“ narostlé inokulum, tvořené „homogenní“ hustou suspenzí vláken je proto vždy směsí buněk fyziologicky více či méně aktivních s buňkami inaktivními.

Tyto nepříznivé výsledky postupného stárnutí části populace množených buněk jsou nadto zpravidla doprovázeny i degenerativními změnami, k nimž dochází vždy v průběhu opakovaného pasážování vegetativních vláken produkčních kmenů, ať už jde o degeneraci na úrovni změn fyziologických nebo na úrovni změn genetické informace.

Hlavním důvodem, proč je nutno připravovat velké objemy inokula postupným pomnožováním biomasy rostoucích vegetativních hyf jsou obtíže, spojené s přípravou velkého množství sporového materiálu. Spory vláknitých hub jsou totiž zpravidla připravovány na šikmených agarových půdách ve zkumavkách nebo na sypaných půdách v malých Erlenmayerových baňkách v množství, postačujícím k přípravě jen malého množství inokula v baňkách na třepacích strojích, či v malých předočkovacích tancích.

Vegetativní promycelium, připravené synchronním vyklíčením spor v submerzní kultuře, představuje na rozdíl od vláken, získávaných jeho dalším postupným množením, skutečně homogenní populaci fyziologicky maximálně aktivních buněk. Proto je také ideální formou inokula.

Vedle přípravy sporového materiálu stacionární kultivací na povrchu agarem ztužených či sypaných sporulačních půd je možno v mnoha případech připravovat i velká množství spor submerzní kultivací. Kvalita těchto spoř však nikdy nedosahuje kvality spor, odškrcených v povrchové stacionární kultuře. To se projevuje zpravidla nejen značnou nehomogenitou morfologickou (tvar, velikost), ale i fyziologickou. Submerzní spory jsou vždy více či méně vakuolizované a mají proti sporám stacionárním vždy více či méně sníženou klíčivost. Insuficience submerzních spor se také velmi nepříznivě projevuje tím, že při uchovávání i při snížené teplotě relativně rychle odumírají a špatně snášejí jakýkoliv způsob konzervace.

Typickým průmyslovým mikroorganismem, pro který platí vše, co bylo dosud řečeno, je druh Claviceps purpurea (Fr.) Tul. Produkční kmeny této houby jsou používány jednak pří polní produkci námele a jednak při fermentační přípravě námelových alkaloidů. Pro úspěšné zajištění obou těchto výrob je nezbytným předpokladem příprava velkého množství vysoce virulentních konídií.

Soustavným experimentálním výzkumem regulace konidiace druhu C. purpurea se podařilo postupně vytypovat a optimalizovat kultivační podmínky tak, že umožňují prakticky synchronní konidiaci za vzniku překvapivě velkého množství morfologicky jednotných a fyziologicky maximálně aktivních spor, a to i u tzv. oligosporogenních kmenů.

Bylo zjištěno, že konidiaci podmiňují dva následné signály, přijímané z prostředí. První z nich je adresován rostoucí sfacelii, která na něj reaguje ukončením polárního růstu. Ukončení růstu sfacelie je nutným předpokladem iniciace konidiačni fáze. Druhý signál, podmíněný další změnou prostředí, je přijímán již nerostoucí sfacelii a rozhoduje o experzi konidiace. Exprese konidiace je pochodem nevratným. Proto buňky sfacelie, které v reakci na první signál přerušily vrcholový růst, mají již jen dvě alternativy: jsou-li vystaveny druhému signálu začínají odškrcovat konidie, v opačném případě postupně odumírají.

Vlastní experimentální průkaz významu obou signálů byl proveden dvoustupňovou povrchovou kultivací sfacelie metodou výměny kultivačního media. První stupeň byl inokulován mladým vegetativním inokulem reprezentovaným sfacelii v počátku logaritmické fáze růstu, vykultivovanou submerzně z konídií, v mediu obsahujícím 3 % hmot. sacharozy. Ukončení apikálního růstu sfacelie bylo v prvním stupni dosaženo tím, že z kultivačního media byla zcela vypuštěna cukerná složka. Růst umožnila zbytková sacharoza, vnesená spolu s inokulem. Alternativně byl první stupeň inokulován klidovými konidiemi, suspendovanými v destilované vodě. V tomto případě byly do media pro kultivaci prvního stupně přidány stopy cukerné složky, umožňující minimální nárůst souvislé plenky sfacelie. V průběhu sedmidenní inkubace prvního stupně vyrostla tedy na hladině media jen tenká plenka mycelia, jejíž růst se ke konci inkubace zcela zastavil. Ve druhém stupni bylo medium nahrazeno mediem stejným, avšak obsahujícím navíc 30 % hmot. sacharozy. Přídavek sacharozy vedl k diferenciaci sfacelie do fáze konidiace a projevil se intenzivní tvorbou spor. Nebylo-li medium prvního stupně nahrazeno, vytvářely se konidie jen ojediněle právě tak, jako když bylo pro výměnu použito media nezměněného. Velmi slabá konidiace byla zaznamenána i po čtrnáctidenní kultivaci v jednom stupni na msdiu se 30 % hmot. sacharozy.

Předcházející rozbor problematiky sporulace vláknitých hub a konkrétní objasnění konidiace u druhu C. purpurea umožňují pochopit i obecně známou skutečnost, že konidie vláknitých hub vznikají mnohem snáze ve stacionárních kulturách na svrchní straně myceliální kolonie než v míchané kultuře submerzní. Příčinou je zřejmě polarizovaný charakter stacionární kolonie a její podstatně pomalejší průběh stárnutí na rozdíl od rychle stárnoucího nepolárního submerzního mycelia.

Uvedených poznatků bylo využito při vypracování způsobu přípravy velkého množství vysoce fyziologicky aktivních konidií mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul. stacionární kultivací tohoto mikroorganismu na hladině kapalného živného media, obsahujícího zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku a minerální živné sole, při teplotě 20 až 30 °C, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se kultivace provádí ve dvou stupních, přičemž v prvním stupni kapalné živné medium obsahuje zdroje asimilovatelného dusíku, minerální živné sole a zdroj asimilovatelného uhlíku, s výhodou sacharozu, v koncentraci 0,02 až 0,2, s výhodou 0,05 až 0,1 % hmot. a ve druhém stupni kapalné živné medium obsahuje zdroj asimilovatelného uhlíku, s výhodou sacharozu, v koncentraci 25 až 35 % hmot., s výhodou 30 % hmot., a inkubace kultury se vede až do ukončení fáze odškrcování konidií.

Účelně se kapalné živné medium v prvním stupni inokuluje submerzním vegetativním inokulem produkčního mikroorganismu v logaritmické fázi růstu nebo klidovými sporami ve vodné suspenzi.

Podle pracovních podmínek trvají oba stupně kultivace zpravidla stejně dlouhou dobu, obvykle 6 až 8 dní.

Způsob podle vynálezu umožňuje běžnými jednoduchými prostředky získávat materiál pro očkovací látku, používanou při infekci žita v polních podmínkách, s několikanásobně zvýšenou produkcí námele. Stejně tak lze konidií, získaných způsobem podle vynálezu, použít pro přípravu velkých objemů inokula k zaočkování produkční půdy pří fermentační výrobě námelových alkaloidů.

Příklad 1

a) Vegetativní inokulum

Submerzní vegetativní inokulum bylo připraveno ve varných baňkách obsahu 500 ml, plněných po 80 ml inokulační půdy tohoto složení (v % hmot.): sacharoza 3, kukuřičný výluh 0,4, kryst. síran hořečnatý 0,1, dihydrogenfosforečnan draselný 0,04, kryst. dusičnan vápenatý 0,144, terč. citran amonný 1, pH 5,8 (upraveno amoniakem]. Po naplnění byla půda sterilizována v autoklávu 20 minut při 0,1 MPa. Vychladlá půda byla naočkována suspenzí konidií připravenou z kultur sporové generace, narostlých na agarem ztužené sporulační půdě tohoto složení: pivovarská sladina 5° Bé, kyselý hydrolyzát kaseinu 1 % hmot., kryst. síran hořečnatý 0,1 % hmot., agar 3 % hmot., pH 6,3 (upraveno hydroxidem draselným). K přípravě suspenze bylo použito sterilní inokulační půdy. Suspenze konidií, získaná setřením s povrchu sporové generace, byla zfiltrována nasátím do sterilní dělené pipety (10 ml) s mírně odříznutou špičkou, přetaženou dvěma vrstvami gázy. Tím byla ze suspenze odstraněna vlákna a kousky mycelia a zabráněno vzniku pelet srůstáním růstových center, popřípadě nárůstu nežádoucího kuličkového mycelia.. Hustota takto připravené suspenze konidií byla orientačně kontrolována odečtením na Bůrkerově komůrce, popřípadě nefelometricky. Každá baňka byla zaočkována množstvím asi 0,3 X 10⁹ konidií. Vegetativní submerzní inokulum bylo inkubováno na třepacím stroji při teplotě 24 °C po dobu 30 hodin.

bj První stupeň

V prvním stupni došlo k růstu vegetativního vzdušného bílého mycelia (sfacelie) ve stacionární kultuře na hladině půdy bez sacharozy tohoto složení (v % hmot.); kukuřičný výluh 0,4, kryst. síran hořečnatý 0,1, dihydrogenfosforečnan draselný 0,04, kryst. dusičnan vápenatý 0,144, terč. citran amonný 1, pH 5,8 (upraveno amoniakem). Půda byla plněna do Blackeových baněk (5,5 cm) po 30 ml a sterilizována v autoklávu 20 minut pří 0,1 MPa. Vychladlá půda byla inokulována po 1 ml vegetativního submerzního inokula. Po zamíchání zaočkované půdy bylo inkubováno v klidu při teplotě 24 °C po dobu 7 dnů.

c) Druhý stupeň

Ve druhém stupni došlo k diferenciaci sfaceliového mycelia, narostlého v průběhu prvního stupně, do fáze sporulace a k odškrcování konidií. Toho bylo dosaženo tak, že vyčerpaná půda prvního stupně byla za sterilních kautel odlita a mycelium opět opatrně podvrstveno 30 ml sporulační půdy tohoto složení (v % hmot.]: sacharoza 30, kukuřičný výloh 0,4, kryst. síran hořečnatý 0,1, dihydrogenfosforečnan draselný 0,04, kryst. dusičnan vápenatý 0,144, terč. citran amonný 1, pH 6,2 (upraveno amoniakem). Sporulační půda byla sterilizována ve zku4 mavkách po 30 ml. Po podvrstvení mycelia byly baňky opět zazátkovány a dále inkubováno znovu 7 dní při teplotě 24 °C. Z jedné baňky (kultivační plocha hladiny půdy byla 25 cm²) bylo získáno průměrně 18 X 10⁹ konidií.

Příklad 2

Kultivace byla provedena obdobně jako je uvedeno v příkladě 1 s tím rozdílem, že k inokulaci prvního stupně bylo použito vodné suspenze konidií, obsahující v 1 ml 0,03 X X 10⁹ klidových konidií a do media pro kultivaci prvního stupně bylo přidáno 0,075 % hmot. sacharozy. Z jedné baňky bylo získáno průměrně 21 X 10⁹ konidií.

Získané konidie byly použity k infekci žita v polním pokuse ve srovnání s konidiemi, připravenými dosavadní rutinní metodou submerzní kultivací. Koncentrace konidií v obou srovnávaných očkovacích látkách byla nastavena shodně na hodnotu 20 X 10⁹ živých konidií (stanoveno metodou vitálního barvení erythrosinem) v 10 1 očkovací látky. Tímto množstvím očkovací látky obou typů byla infikována vždy plocha 1 aru žita opakovaně na třech různých lokalitách. Po infekci, provedené kontrolní očkovací látkou, bylo sklizeno v průměru 1,84 kg námele, zatímco při použití očkovací látky, připravené z konidií způsobem podle vynálezu, bylo získáno v průměru 4,12 kg námele.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT

   Způsob přípravy velkého množství vysoce fyziologicky aktivních konidií mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul. stacionární kultivací tohoto mikroorganismu na hladině kapalného živného media, obsahujícího zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku a minerální živné sole, při teplotě 20 až 30 °C, vyznačující se tím, že se kultivace provádí ve dvou stupních, přičemž v prvním stupni kapalné živné medium obsahuje zdroje asiVYNÁLEZU milovatelného dusíku, minerální živné sole a zdroj asimilovatelného uhlíku, s výhodou sacharozu, v koncentraci 0,02 až 0,2, s výhodou 0,05 až 0,1 % hmot., a ve druhém stupni kapalné živné medium obsahuje zdroj asimilovatelného uhlíku, s výhodou sacharozu, v koncentraci 25 až 35 % hmot., s výhodou 30 % hmot. a inkubace kultury se vede až do ukončení fáze odškrcování konidií.