CZ287668B6 - Nový mutantní kmen Aspergillus terreus a způsob fermentace lovastatinu - Google Patents
Nový mutantní kmen Aspergillus terreus a způsob fermentace lovastatinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ287668B6 CZ287668B6 CZ20001194A CZ20001194A CZ287668B6 CZ 287668 B6 CZ287668 B6 CZ 287668B6 CZ 20001194 A CZ20001194 A CZ 20001194A CZ 20001194 A CZ20001194 A CZ 20001194A CZ 287668 B6 CZ287668 B6 CZ 287668B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- lovastatin
- production
- strain
- glucose
- aspergillus
- Prior art date
Links
- PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N lovastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N 0.000 title claims abstract description 39
- PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N Monacolin X Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 38
- QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N lovastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C21 QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 38
- 229960004844 lovastatin Drugs 0.000 title claims abstract description 37
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 title claims description 26
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title abstract description 13
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title abstract description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 14
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims abstract description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims abstract description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 9
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 claims 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 51
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 abstract description 8
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 abstract description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 7
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 abstract description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 abstract description 2
- 241000241602 Gossypianthus Species 0.000 abstract 1
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 abstract 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 abstract 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- -1 ammonia ions Chemical class 0.000 abstract 1
- 230000002402 anti-lipaemic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 abstract 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 23
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 244000223760 Cinnamomum zeylanicum Species 0.000 description 6
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 6
- 235000017803 cinnamon Nutrition 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 241000813221 Aspergillus terreus ATCC 20542 Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000015113 tomato pastes and purées Nutrition 0.000 description 2
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N (3S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 1
- HMVYERAUBSAVAX-UHFFFAOYSA-N 1-nitro-1-nitrosoguanidine Chemical compound NC(=N)N(N=O)[N+]([O-])=O HMVYERAUBSAVAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 241001183327 Auxarthron umbrinum Species 0.000 description 1
- 241001520138 Cephalotrichum nanum Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000451298 Melophorus vitreus Species 0.000 description 1
- 241000228347 Monascus <ascomycete fungus> Species 0.000 description 1
- 241000409281 Monascus paxii Species 0.000 description 1
- 244000113306 Monascus purpureus Species 0.000 description 1
- 241000031003 Monascus ruber Species 0.000 description 1
- 241001207509 Phoma sp. Species 0.000 description 1
- 241000222350 Pleurotus Species 0.000 description 1
- 235000007685 Pleurotus columbinus Nutrition 0.000 description 1
- 240000001462 Pleurotus ostreatus Species 0.000 description 1
- 235000001603 Pleurotus ostreatus Nutrition 0.000 description 1
- 241000392433 Pleurotus sapidus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- ICSSIKVYVJQJND-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ICSSIKVYVJQJND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000006787 czapek-dox agar Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000000055 hyoplipidemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000871 hypocholesterolemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 230000006122 isoprenylation Effects 0.000 description 1
- 229930014550 juvenile hormone Natural products 0.000 description 1
- 239000002949 juvenile hormone Substances 0.000 description 1
- 150000003633 juvenile hormone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- QLJODMDSTUBWDW-BXMDZJJMSA-N mevinolinic acid Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H](C)C=C21 QLJODMDSTUBWDW-BXMDZJJMSA-N 0.000 description 1
- 230000007483 microbial process Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001225 nuclear magnetic resonance method Methods 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 235000002378 plant sterols Nutrition 0.000 description 1
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 1
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930010796 primary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Postupy klasické mutageneze byl získán nový kmen Aspergillus terreus CCM 8236. Je popsán proces aerobní fermentace lovastatinu kmenem Aspergillus terreus CCM 8236 ve formě kyseliny v submerzní kultuře v laboratorním měřítku. Příprava inokula probíhá v půdě s nízkým pH. Jako zdroj uhlíku se v produkční půdě využívá směs glukózy a laktózy (poměr 1:22) ve vysoké koncentraci a jako zdroj dusíku Pharmamedia. Na takovéto půdě kmen produkuje více než 2000 mg/l lovastatinu za 170 hodin.ŕ
Description
Nový mutantní kmen Aspergillus terreus a způsob fermentace lovastatinu
Oblast techniky
Vynález se týká nového kmene mikroorganismu druhu Aspergillus terreus, získaného metodou klasické mutageneze (kombinovaným působením fyzikálního a chemického mutagenu), který v optimalizovaném médiu s vhodným zdrojem uhlíku a dusíku produkuje vysoké množství lovastatinu.
Dosavadní stav techniky
Lovastatin (MK-803, monakolín K, mevinolin) je sekundární metabolit, který kompetativně inhibuje enzym 3 - hydroxy - 3 - metylglutaryl - koenzym A/HMG CoA) reduktázu (EC
I. 1.1.34), čímž snižuje endogenní syntézu cholesterolu a tak poskytuje značné množství v terapii hyperlipemie. Důsledkem inhibice MHG Coa reduktázy je nejen snížení hladiny cholesterolu v savčích buňkách, ale i indukce cholesterolových receptorů LDL (low density lipoprotein) v játrech, změny v produkci ibuchinonu, izoprenylaci proteinů, syntéze juvenilních hormonů u hmyzu, rostlinných sterolů a pigmentů a fungálních giberelinů. Z chemického hlediska je lovastatin (lS,3S,7S,8S,8aR)-l,2,3,7,8,8a-hexahydro-3,7-dimethyl-8-(2-((2R,4R)-tetrahydro4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-yl]etyl]-l-naftyl(S)-2-metylbutyrát. Jeho biosyntéza byla u Aspergillus terreus ATCC 20542 dokázaná pomocí značených substrátů zacetátu polyketidovou dráhou. Přestože přesná struktura klíčových intermediátů mezi acetátem a lovastatínem ještě stále není známá, existuje několik pracovních hypotéz biosyntézy (Wangschal et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2357-2363, 1996). Lovastatin se vyskytuje ve dvou formách: ve formě kyseliny a ve formě laktonu, přičemž biologicky aktivní je kyselinová forma. Od roku 1987 se lovastatin používá ve formě tablet na snižování hypercholesterolemie a na předcházení vzniku ischemické choroby srdce.
U.S.Pat. No. 4, 231, 938 a E.P. 0 0022 478 popisují fermentační přípravu lovastatinu a dihydroxymevinolínu produkčním kmenem Aspergillus terreus ATCC 20541 a ATCC 20542.
U.S.Pat. No. 4,387,242 popisuje fermentační přípravu hypocholesterolemické a hypolipemické látky se strukturou příbuznou lovastatinu tím stejným kmenem Aspergillus terreus ATCC 20542.
E.P. 0 556 699 se týká procesu přípravy produkčního kmene pro lovastatin z druhu rodu Aspergillus, který původně tuto látku neprodukuje (např. Aspergillus oryzaé). Způsob přípravy takového kmene zahrnuje transformaci protoplastů A. oryzae DNA, izolovanou z produkčního kmene A. terreus
U.S. Pat. NO. 5,403,728 popisuje mikrobiální proces přípravy lovastatinu ve formě kyseliny i laktonu aerobní fermentací submersní kultury nového druhu Aspergillus obscursus.
V patentové literatuře jsou jako produkční kmeny pro lovastatin uváděné i druhy rodu Monascus - M.anka, M.purpurous, M.ruber, M.vitreus, M.paxii (British Patent Specifications Nos. 2,046,737 a 2,049,664).
V literatuře se uvádějí i další druhy mikroorganismů, při fermentaci kterých se získávají malá množství lovastatinu. Konkrétně jde o druhy Phoma sp. M. 4452, Doratomyces nanus IFO 9551, Gymnoascus umbrinus IFO 8450 (Endo et al.: J. Antibiot. 39, 1609 - 1610, 1986), Pleurotus ostreatus, Pleurotus saca a Pleurotus sapidus (Gunde - Cimerman, FEMS Mikrobiology Letters
II, 203-206, 1993).
-1 CZ 287668 B6
Přestože bylo v patentové literatuře popsáno více kmenů druhu Aspargillus terreus, produkujících lovastatin, jeho výtěžnost u patentovaného kmene A. terreus ATCC 20542 je poměrně nízká. Nedostatkem je také fakt, že složky fermentačních půd opublikovaných v patentech U.S.Pat. No. 4,231,938, E.P. 0 022478 a U.S.Pat.No. 4,387,242 jsou pro potřeby průmyslové výroby finančně náročné a tím nedostupné.
Podstata vynálezu
Kombinací použití fyzikálního a chemického mutagenu, které byli aplikované na spory kmene A. terreus, byl získaný nový mutantní kmen A. terreus CCM 8236, který se vyznačuje nadprodukcí lovastatinu. V porovnání s kmenem A. terreus ATCC 20542 dosahuje minimálně dvojnásobnou produkci. Inokulační i sporulační půda je složená z dostupných a finančně nenáročných surovin, které jsou běžně využívané při fermentaci sekundárních i primárních metabolitů. Vynález je založený na použití kmene A. terreus CCM 8236 na produkci lovastatinu ve formě kyseliny a laktonu, nebo jeho farmaceuticky využitelných solí nebo esterů.
Původní kmen A. terreus s pracovním názvem GB1 poskytl Dr. Vollek. Na základě relativně nej vyšší produkce lovastatinu byl vybraný jako výchozí materiál pro produkční kmen mezi vícero divokými kmeny, identifikovanými také jako A. terreus.
Uvedený kmen byl podroben působení fyzikálních a chemických mutagenů s cílem získat produkční kmen pro lovastatin.
V první fázi šlechtění byl výchozí kmen ovlivněný silným mutagenem N-methyl, N-vitro, Nnitrozoguanidinem (NTG). Vzhledem na zvýšení rezistence mutantů na NTG byli tyto v druhé fázi šlechtění střídavě vystavené působení ultrafialového záření (UV) a NTG. Získané izoláty (pracovně označované písmeny GB a pořadovým číslem) byly testované na výšku produkce lovastatinu. Takovým způsobem byl izolovaný mutant s pracovním označením GB 2033 s výrazně zvýšenou produkcí lovastatinu, který byl deponovaný v České sbírce mikroorganismů v Brně pod značením CCM 8236. Složení půd - jak sporulačních, tak i inokulačních a produkčních - bylo přizpůsobené pro tento nový kmen.
Kultivace mikroorganismu, využívaná při fermentačním procesu, kterého se patent týká, probíhá ve třech krocích:
1. sporulace kultury
2. inokulační stupeň
3. produkční stupeň
Pro kvalitu inokula je důležitá rychlá sporulace (v průběhu 4 až 5 dni při 28 °C je kultura kompletně vysporulovaná, spory jsou skořicově hnědé barvy, kolonie jsou ploché, sametového vzhledu bez bílých okrajů, s průměrem cca. 4 cm, lehce smývatelné fyziologickým roztokem s 30 % glycerolu).
Kultivace inokula probíhá při 28 °C při 220 rpm 16 až 20 hodin v půdě s nízkým pH (4,6), které se po dobu kultivace ještě výrazně sníží (3,0 až 3,2). Kvalitní inokulum se vyznačuje následujícími vlastnostmi:
• pelety malé, dobře rozvlákněné • sediment 20 % • orientační analytické parametry:
obsah glukózy: obsah fosforu: obsah NH4+ obsah NH2 g/1
200 mg/1
0,2 g/1
0,1 g/1
Kultivace produkčního stupně probíhá při 28 °C při 220 rpm 170 až 190 hodin. Produkční půda obsahuje vysokou koncentraci uhlíkatých zdrojů (glukóza a laktóza) v přesně definovaném poměru (1:22) ve prospěch laktózy. Jako zdroj dusíku je nevyhnutelné používat organický zdroj, např. sojovou mouku, inaktivované pekárenské droždí apod. Nejvyšší produkce byly dosahované na půdě, obsahující jako zdroj dusíku bavlníkovou mouku Pharmamedia. Anorganický dusík v půdě ve formě NN4 + má na produkční schopnost kmene výrazně negativní účinek. Stejně se projevuje i posunutí poměru uhlíkatých zdrojů ve prospěch glukózy.
Z morfologického hlediska je kultura mikroorganismu peletová, pelety jsou malé (cca 0,2 až 0,5 mm), ke konci fermentace se stávají kompaktními a na okrajích se začínají vytvářet konidiofory. Během optimální fermentace sediment vzroste na 45 až 55 %, pH klesne na 6,0 až 5,8, koncentrace fosforu a zdrojů uhlíku klesne na stopová množství.
Po ukončení fermentace se pH fermentační půdy upravuje 40% H2 SO4 na hodnotu 4,6 až 4,8. Lovastatin se extrahuje z takto upraveného vzorku acetonem (1:1) mícháním v ultrazvuku. Produkce se stanovuje metodou HPLC v izokratickém systému 65% acetonitril a 0,1% H3PO4.
V takto uskutečněném baničkovém produkčním testu produkuje nový kmen A. terreus CCM 8236 minimálně 200 mg/1 lovastatinu.
Identita produktu byla ověřená metodou nukleární magnetické rezonance.
Nový kmen A. terreus CCM8236 se od výchozího kmene GB1 i od patentovaného kmene ATCC 20542 liší i svými různými schopnostmi na různých zdrojích uhlíku, morfologií kolonií a pigmentací média (tab. 1).
Produkční kmen A. terreus, který je předmětem vynálezu a byl získaný cestou klasické mutageneze, byl uložený v České sbírce mikroorganismů v Brně pod číslem CCM 8236. Jde o stabilní produkční kmen s produkcí 2000 až 3000 mg/1 lovastatinu ve formě kyseliny a laktonu, což představuje cca 130-násobné zvýšení produkce oproti výchozímu kmeni a minimálně dvojnásobně zvýšenou produkci oproti kmeni A. terreus ATCC 20542. Pro kvalitu očkovacího materiálu je důležitá rychlá sporulace. Inokulační stupeň probíhá při atypickém pH. Složení kultivačních půd plně odpovídá požadavkům průmyslové výroby, což se týká finančních nákladů i dostupnosti jednotlivých složek.
-3CZ 287668 B6
Tab. 1 Morfologická charakteristika kmenů A. terreus GB1, CCM 8236 a ATCC 20542 na Czapek - Doxově agaru s různými zdroji uhlíku
| Zdroj uhlíku | A. terreus GB 1 | A. terreus CCM 8236 | A. terreus ATCC 20542 |
| Glukóza | Vatovité vzdušné mycélium, kolonie pravidelného tvaru s průměrem 2,5 až 3 cm, s dvěma zónami: 1. centrální zóna bleděhnědá 2. okrajová zóna bílá | Vzdušné mycélium matného vzhledu, kolonie pravidelného tvaru s průměrem 3 až 4 cm, s třemi zónami: 1. centrální zóna bleděhnědá 2. žlutě zabarvená zóna 3. okrajová zóna bílá | Vzdušné mycélium matného vzhledu, kolonie pravidelného tvaru s průměrem 3 až 4 cm, s dvěma zónami: 1. centrální zóna skořicově hnědá 2. okrajová zóna bílá Rozpustný pigment: hnědý |
| Fruktóza | Vatovité vzdušné mycélium, kolonie pravidelného tvaru s průměrem 3,5 cm, s dvěma zónami: 1. centrální zóna béžová 2. okrajová zóna bílá | Kolonie pravidelného tvaru s průměrem 3 cm, s dvěma zónami: 1. centrální zóna bleděhnědá s matným vzhledem 2. okrajová zóna bílá, vatovitá Rozpustný pigment: žlutý | Vatovité kolonie pravidelného tvaru s průměrem 2 až 3 cm, s dvěma zónami: 1. centrální zóna skořicově hnědá 2. okrajová zóna bílá Rozpustný pigment: hnědý |
| Maltóza | Vatovité vzdušné mycélium, kolonie pravidelného tvaru s průměrem 3,5 až 4 cm, s dvěma zónami: 1. centrální zóna bleděhnědá 2. okrajová zóna bílá | Vzdušné mycélium matného vzhledu, kolonie pravidelného tvaru s průměrem 3,5 až 4 cm, s dvěmi zónami: 1. centrální zóna hnědá 2. okrajová zóna bílá Rozpustný pigment: žlutý | Vatovité vzdušné mycélium kolonie pravidelného tvaru s průměrem 3 až 4 cm, s dvěmi zónami: 1. centrální zóna skořicově hnědá 2. okrajová zóna bílá Rozpustný pigment: hnědý |
| Laktóza | Vatovité vzdušné mycélium, kolonie pravidelného tvaru s průměrem 2,5 až 3 cm, s dvěmi zónami: 1. centrální zóna bleděhnědá 2. okrajová zóna bílá | Kolonie nepravidelného tvaru s průměrem 2 až 2,5 cm, vytváří se jen žluté substrátové mycélium přerůstající půdu. | Kolonie nepravidelného tvaru s průměrem 2 až 2,5 cm v centrální zóně vatovité vzdušné mycélium žlutého zabarvení, v okrajové zóně žluté substrátové mycélium přerůstající půdu. |
| Sacharóza | Vatovité vzdušné mycélium, kolonie pravidelného tvaru s průměrem 3 cm, s dvěmi zónami: 1. centrální zóna bleděhnědá 2. okrajová zóna bílá | Kolonie pravidelného tvaru s průměrem 4 až 4,5 cm, s třemi zónami: 1. centrální zóna hnědá, matného vzhledu 2. vatovitá béžová zóna 3. okrajová zóna plochá, matné ho vzhledu, skořicově hnědá | Vatovité kolonie pravidelného tvaru s průměrem 1,5 až 2 cm, s dvěmi zónami: 1. centrální zóna hnědá 2. okrajová zóna bílá |
| Glycerol | Vatovité vzdušné mycélium, kolonie pravidelného tvaru s průměrem 3 až 3,5 cm, s dvěma zónami: 1. centrální zóna žlutá 2. okrajová zóna bílá | Kolonie lalokovitého tvaru s průměrem 1 až 1,5 cm, mycélium ploché, matného vzhledu, béžového zabarvení | Kolonie lalokovitého tvaru s průměrem 1 až 1,5 cm, mycélium ploché, matného vzhledu, se dvěmi zónami: 1. centrální zóna skořicově hnědá 2. okrajová zóna bílá |
| Škrob | Ploché vzdušné mycélium matného vzhledu, kolonie pravidelného tvaru s průměrem 2,5 až 3 cm, s dvěmi zónami: 1. centrální zóně bleděhnědá 2. okrajová zóna bílá | Vzdušné mycélium matného vzhledu, kolonie víceméně pravidelného tvaru se střapatými okraji s průměrem 2 až 2,5 cm, s třemi zónami: 1. centrální zóna bleděhnědá 2. skořicověhnědá zóna 3. okrajová zóna bílá | Kolonie pravidelného tvaru s průměrem 2 až 3 cm, mycélium matného vzhledu s dvěma zónami: 1. centrální zóna skořicovohnědá 2. okrajová zóna bílá, výrazně ohraničená |
Přehled obrázků na výkrese
Obr. 1: Schéma mutačního postupu při získání kmene Aspergillus terreus CCM 8236.
ío Pozn: Uváděný je způsob (UV - ultrafialové světlo, NTG - N-methyl, N-nitro, Nnitrozoguanidin) a doba ovlivnění (v minutách nebo v sekundách), pracovní označení testovaných izolátů (GB1 až GB2050) a produkce lovastatinu na skríningové půdě (mg/1 kyseliny formy a mg/1 laktonové formy).
-4CZ 287668 B6
Příklad uskutečnění vynálezu
Příklad 1. Mutageneze kmenu A. terreus GB1.
Příprava sporové suspenze: souvislý nárůst mycelia, vysporulovaného na sporulační půdě s rajčatovým protlakem (2 %) a ovesnou moukou (2 %) byl smytý 10 ml fyziologického roztoku a 30 % glycerínu (počet spor 3,5 x 107/ml)
Ovlivnění NTG ml sporové suspenze s počtem spor 106/ml a 1 ml zásobníku roztoku NTG (konc. 5 mg/ml) s minimálním množstvím dimetylformamidu (přidávaný pro nízkou rozpustnost NTG ve vodě) byl přidaný k 8 ml fyziologického roztoku. Koncentrace NTG v takovém roztoku tedy byla 0,5 mg/ml a hustota spor řádově 105 spor/ml. Ovlivňování biologického materiálu probíhalo za tmy, stálého míchání a při pokojové teplotě. Každých 10 minut byl odebraný 1 ml vzorku. Vzorek byl rychle scentrifugovaný a ovlivňovací roztok by důkladně odstraněný. Spory byly rozsuspendované v 1,5 ml fyziologického roztoku a znovu scentrifugované. Sediment spor byl rozsuspendovaný v 1 ml fyziologického roztoku a ředěný 10 až 100-krát. Po 200 μΐ takovéto suspenze bylo vysetých na Petriho misky se sporulační půdou. Petriho misky byly kultivované 8 dní při 28 °C.
Ovlivnění UV zářením
Na Petriho misku se spolurační půdou bylo vyseto 100 μΐ sporové suspenze s počtem spor řádově 105 a 104/ml. Po přerušení misek při 28 °C 30 min. byly vystavené působení UV světla po dobu 20, 30, 40, 60 a 120 sekund. Zdrojem UV záření byla zářivka Philips s výkonem 30 W. Její vzdálenost od povrchu půdy byla 20 cm. Po ovlivnění byly misky okamžitě umístěné do tmy na dobu 1 h. (zabránilo se průběhu fotoreaktivace). Byly kultivované po dobu 8 dní při 28 °C.
Monokolonie s průměrem cca 4 cm, smyté 2 ml fyziologického roztoku s 30 % glycerínu, byly při testované na produkci lovastatinu. Prvotním kriteriem pro výběr mutantů do produkčního testu byla kvalita sporulace a rychlost růstu mycelia. Vybrané kolonie byly použité k stríningovém produkčním testu.
Příklad 2: Skríningový produkční test
Vybrané monoizoláty byly testované na produkční schopnost na půdě s následujícím složením:
| Laktóza | 100 g/1 |
| Sojová mouka | 20 g/1 |
| NaNO3 | 3 g/1 |
| KH2PO4 | 1 g/1 |
| KC1 | 0,5 g/1 |
| MgSO47H2O | 0,5 g/1 |
| FeSO47H2O | 0,01 g/1 |
| PH | 6,8 |
Skríningová produkční půda byla očkovaná 1 ml sporové suspenze s počtem spor řádově 107 spor/ml.
-5CZ 287668 B6
Produkce byla stanovená po 120 hodinách kultivace při 28 °C a 220 rpm metodou HPLC.
| Kmen A. terreus | Produkce (kyselina+lakton) [mg/1] |
| GB1 | 0,6+ 3,1 |
| ATCC 20542 | 200,1+ 4,8 |
| CCM 8236 | 402,2+ 11,8 |
Příklad 3: Produkční test v laboratorním měřítku
1.
Sporulace
Složení sporulační půdy:
Rajčatový protlak Ovesná mouka Agar
PH g/1 g/1 g/1
6,5
Vizuální a mikroskopické hodnocení sporulace • 65. hodina: Mycelium bílé barvy souvisle narostené po celém povrchu, kultura začíná sporulovat a získává žlutavé zabarvení. Pod mikroskopem viditelné septované mycelium s vyrůstajícími konidioforami.
96. hodina: Kultura už kompletně vysporulovaná, mycelium skořicové barvy. Dobře vyvinuté konidiofory s lehce se uvolňujícími sporami.
Vysporulovaná kultura byla smytá fyziologickým roztokem s 30 % glycerolu. Takto připravenou sporovou suspenzi je možné uchovávat při 4 °C po dobu 30 dní bez poklesu produkční schopnosti.
2. Inokulační stupeň
Pro dobrý nárůst inokula je potřebná přítomnost iontů Fe2+, Mn2+, Zn2+, K+, Mg2+, Ca2+. Potřebný je též nadbytek uhlíkatého zdroje, rozpustného fosforu a dusíku v půdě. Ani jeden z těchto faktorů nesmí být limitujícím. 50 ml inokulační půdy se naočkuje 10% sporové suspenze a kultivuje se při 28 °C a 220 rpm 20 hodin.
| Složení inokulační půdy: | |
| Glukóza | 50 mg/1 |
| CSL | 10 g/1 |
| (NH4)2SO4 | lg/1 |
| kh2po4 | ig/i |
| Ca(NO3)2.4H2O | 2 g/1 |
| MgSO47H2O | 0,25 g/1 |
| KC1 | 0,25 g/1 |
| FeSO4.7H2O | 0,01 g/1 |
| MnSO4.7H2O | 0,01 g/1 |
| ZnSO4.7H2O | 0,002 g/1 |
| PPG 2000 | 0,1 ml/50ml |
| pH | bez úpravy (4,< |
6)
-6CZ 287668 B6 sterilizace 40 min 115 °C
3. Produkční stupeň
Produkční půda se naočkuje 10 % inokula. Fermentace probíhá 170 hodin při 28 °C a 220 rpm. Produkce lovastatinu se stanovuje metodou HPLC.
Tab. 2. Vliv poměru laktózy a glukózy v produkční půdě na produkci lovastatinu.
| Kmen | Poměr uhlíkatých zc | rojů [glukóza:laktóza] | ||||
| 22:1 | 1:22 | |||||
| PH | sediment | prod. [mg/1] | PH | sediment | prod. [mg/1] | |
| [%] | kys + lakt | [%] | kys + lakt | |||
| ATCC 20542 | 6,5 | 45 | 23 + 4 | 3,4 | 45 | 43+14 |
| CCM 8236 | 6,3 | 48 | 55 + 8 | 2,4 | 46 | 114+8 |
Pozn.: Jako zdroj dusíku byla použita sójová mouka a (NH^SCU.
Tab. 3a. Vliv dusíkatého zdroje v produkční půdě na produkci lovastatinu.
| Kmen | Zdro dusíku | |||||
| sójová mouka + (NFL^SCL | sójová mouka | |||||
| PH | sediment | prod. [mg/1] | pH | sediment | prod. [mg/1] | |
| [%] | kys + lakt | [%] | kys + lakt | |||
| ATCC 20542 | 3,4 | 45 | 43 + 14 | 6 | 45 | 1005 + 0 |
| CCM 8236 | 2,4 | 46 | 114+ 8 | 5,9 | 55 | 1986 + 0 |
Tab. 3b. Vliv dusíkatého zdroje v produkční půdě na produkci lovastatinu.
| Kmen | Zdro | dusíku | ||||
| bavlníková mouka + (NHO2SO4 | bavlníková mou | ca | ||||
| pH | sediment | prod. [mg/1] | PH | sediment | prod. [mg/1] | |
| [%] | kys + lakt | [%] | kys + lakt | |||
| ATCC 20542 | 2,9 | 46 | 105 + 15 | 6 | 45 | 1347 + 0 |
| CCM 8236 | 3,4 | 45 | 202 + 16 | 5,8 | 48 | 2248 + 0 |
Pozn. Jako zdroj uhlíku byly použité glukóza a laktóza v poměru 1:22.
Z výsledků pokusů v tabulce vyplývá, že přítomnost síranu amonného v půdě na začátku produkčního stupně má výrazně negativní vliv na produkční schopnost. Stejný efekt má i posunutí poměru zdrojů uhlíku ve prospěch glukózy. Produkce lovastatinu je za takovýchto podmínek dokonce nižší než produkce v skriningové půdě. Výsledky pokusů též dokazují, že volba organického zdroje dusíku je důležitá. Ve všech testovaných půdách nový kmen A. terreus CCM 8236 produkovat přibližně o 100 % více lovastatinu než kmen A. terreus ATCC 20542.
Na základě prezentovaných experimentů bylo složení produkční půdy optimalizované.
Optimalizovaná produkční půda má sloužení:
| Glukóza | 5 g/1 |
| Laktóza | 110 g/1 |
| CSL 50% | 5 g/1 |
| Bavlníková mouka | 21 g/1 |
| KH2PO4 | 1 g/1 |
| CaCO3 | 5 g/1 |
| PPG 2000 | 2 ml/1 |
| Pitná voda | do 11 |
| pH | 7,0 |
Na půdě s takovýmto sloužením byla dosažena přiměřená produkce lovastatinu 2665 mg/1 (n = 7), maximální dosažená produkce byla 3042 mg/1 lovastatinu.
Průmyslová využitelnost
Nový vysokoprodukční kmen mikroorganizmu Aspergillus terreus CCM 8236 je možné využít při průmyslové výrobě lovastatinu, jeho solí a esterů.
Claims (2)
1. Kmen Aspergillus terreus CCM 8236, produkující vysoké množství lovastatinu, který byl získán metodami klasické mutageneze.
2. Způsob fermentační přípravy lovastatinu ve formě kyseliny nebo kaltonu, anebo jeho farmaceuticky využitelných soli anebo esterů, vyznačující se tím, že se kultivuje kmen Aspergillus terreus CCM 8236 v inokulační půdě s pH v rozmezí 4,5 až 4,7 a v produkční půdě, ve které je jako zdroj uhlíku použitá kombinace glukózy a laktózy ve vzájemném poměru 0,5 až 0,7 glukózy a 11 až 15 % laktózy a jako komplexní zdroj je použitá bavlníková nebo sojová mouka, přičemž koncentrace volných amoniakálních iontů je 0 až 0,07 g/1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20001194A CZ287668B6 (cs) | 1998-10-12 | 1998-10-12 | Nový mutantní kmen Aspergillus terreus a způsob fermentace lovastatinu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20001194A CZ287668B6 (cs) | 1998-10-12 | 1998-10-12 | Nový mutantní kmen Aspergillus terreus a způsob fermentace lovastatinu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20001194A3 CZ20001194A3 (cs) | 2000-09-13 |
| CZ287668B6 true CZ287668B6 (cs) | 2001-01-17 |
Family
ID=5470169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20001194A CZ287668B6 (cs) | 1998-10-12 | 1998-10-12 | Nový mutantní kmen Aspergillus terreus a způsob fermentace lovastatinu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ287668B6 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114196552B (zh) * | 2021-12-29 | 2024-05-03 | 北京工商大学 | 一株土曲霉btbu20212047及其应用 |
-
1998
- 1998-10-12 CZ CZ20001194A patent/CZ287668B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ20001194A3 (cs) | 2000-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20060281155A1 (en) | Microbial process for preparing pravastatin | |
| DE60019898T2 (de) | Mikrobielles verfahren zur herstellung von pravastatin | |
| CN1590555A (zh) | 利用小单孢菌将密实菌素羟基化为普伐他汀 | |
| PETERSEN et al. | Production of cladospirone bisepoxide, a new fungal metabolite | |
| US20040228854A1 (en) | Novel chemical substance having morphogenetic and growth-accelerating activities | |
| EP0547898B1 (en) | Microbial process for the production of trans-4-hydroxy-L-proline | |
| JP6527521B2 (ja) | 新規なストレプトマイセス・フィラメントサス変異株及びこれを用いたダプトマイシンの生産方法 | |
| US6323021B1 (en) | Mutant strain of penicillium citrinum and use thereof for preparation of compactin | |
| US9365880B2 (en) | Fermentation process for the production of rapamycin | |
| EP0842290B1 (en) | Process for the preparation of lovastatin | |
| CZ287668B6 (cs) | Nový mutantní kmen Aspergillus terreus a způsob fermentace lovastatinu | |
| KR100186758B1 (ko) | 프라바스타틴(pravastatin)전구체의제조방법 | |
| US7541336B2 (en) | Substance fki-1033 and process for producing the same | |
| SK281320B6 (sk) | Kmeň aspergillus terreus a fermentácia lovastatínu týmto produkčným kmeňom | |
| JP2009505681A (ja) | 酸代謝産物生成の調節 | |
| RU2252258C2 (ru) | Микробный способ получения правастатина | |
| KR100453452B1 (ko) | 페니실리움 싸이클로피움 종 및 이를 이용한 컴팩틴의 제조방법 | |
| DE2739449A1 (de) | Hydroxypatschulol, herstellungsverfahren und verwendung zur herstellung von patschulol-derivaten | |
| US5441987A (en) | Antifungal agent | |
| ElKichaoui | Strain improvement of Aspergillus niger to increase lovastatin production | |
| Compaore et al. | Enhancement of antibacterial compounds production by Aspergillus flavus and Penicillium citrinum isolated from locals foods in Bobo Dioulasso and Ouahigouya, Burkina Faso | |
| BG108752A (bg) | Ферментационен метод за получаване на компактин | |
| RU2223322C2 (ru) | Способ получения рокефортина и штамм для его осуществления | |
| WO2003050104A1 (fr) | Nouvelle substance fki-1083 et son procede de production | |
| KR20020066082A (ko) | 신규한 모나스커스 속 미생물, 이를 함유한 미생물제 및제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20071012 |