SK281320B6 - Kmeň aspergillus terreus a fermentácia lovastatínu týmto produkčným kmeňom - Google Patents

Kmeň aspergillus terreus a fermentácia lovastatínu týmto produkčným kmeňom Download PDF

Info

Publication number
SK281320B6
SK281320B6 SK1395-97A SK139597A SK281320B6 SK 281320 B6 SK281320 B6 SK 281320B6 SK 139597 A SK139597 A SK 139597A SK 281320 B6 SK281320 B6 SK 281320B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
strain
production
lovastatin
ccm
aspergillus terreus
Prior art date
Application number
SK1395-97A
Other languages
English (en)
Other versions
SK139597A3 (en
Inventor
Gabriela Borošová
Jana Gajdošíková
Adela Vajcíková
Valter Vollek
Original Assignee
Biotika, A. S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotika, A. S. filed Critical Biotika, A. S.
Priority to SK1395-97A priority Critical patent/SK281320B6/sk
Priority to PCT/SK1998/000014 priority patent/WO1999019458A1/en
Priority to TR2000/00996T priority patent/TR200000996T2/xx
Priority to EP98948055A priority patent/EP1047768A1/en
Publication of SK139597A3 publication Critical patent/SK139597A3/sk
Publication of SK281320B6 publication Critical patent/SK281320B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Postupmi klasickej mutagenézy bol získaný nový kmeň Aspergillus terreus CCM 8236. Je opísaný proces aeróbnej fermentácie lovastatínu kmeňom Aspergillus terreus CCM 8236 vo forme kyseliny v submerznej kultúre v laboratórnom meradle. Príprava inokula prebieha v pôde s nízkym pH v rozmedzí 4,5 až 4,7. Ako zdroj uhlíka sa v produkčnej pôde využíva zmes glukózy a laktózy vo vzájomnom pomere 0,5 až 0,7 % hmotn. glukózy a 11 až 15 % hmotn. laktózy a ako komplexný zdroj je použitá bavlníková alebo sójová múka, pričom koncentrácia voľných amoniakálnych iónov je maximálne 0,07 g/l. Za uvedených podmienok produkuje kmeň viac ako 2000 mg/l lovastatínu za 170 hodín.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka nového kmeňa mikroorganizmu druhu Aspergillus terreus, získaného metódou klasickej mutagenézy (kombinovaným pôsobením chemického a fyzikálneho mutagénu), ktorý v optimalizovanom médiu s vhodným zdrojom uhlíka a dusíka produkuje vysoké množstvo lovastatínu.
Doterajší stav techniky
Lovastatín (MK-803, monakolín K, mevinolín) je sekundárny metabolit, ktorý kompetitívne inhibuje enzým 3-hydroxy-3-metylglutaryl-koenzým A (HMG CoA) reduktázu (EC 1.1.1.34), čím znižuje endogénnu syntézu cholesterolu, a tak poskytuje značné možnosti v terapii hyperlipémie. Dôsledkom inhibície HMG CoA reduktázy je nielen zníženie hladiny cholesterolu v cicavčích bunkách, ale aj indukcia cholesterolových receptorov LDL (low density lipoprotein) v pečeni, zmeny v produkcii ubichinónu, izoprenylácii proteínov, syntézy juvenilných hormónov pri hmyze, rastlinných sterolov a pigmentov a fungálnych giberelínov. Z chemického hľadiska je lovastatín (1S, 3S,7S, 8S, 8aR)-l,2,3,7,8,8a-hexahydro3,7-dimetyl-8-[2-[(2R,4R)-tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-y 1 ]ety 1]-1 -naftyl(S)-2-metylbutyrát. Jeho biosyntéza bola u Aspergillus terreus ATCC 20542 dokázaná pomocou značených substrátov z acetátu polyketidovou dráhou. Napriek tomu, že presná štruktúra kľúčových intermediátov medzi acetátom a lovastatínom ešte stále nie je známa, existuje niekoľko pracovných hypotéz biosyntézy (Wagschal et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2357 - 2363, 1996). Lovastatín sa vyskytuje v dvoch formách: vo forme kyseliny a vo forme laktónu, pričom biologicky aktívnou je kyselinová forma. Od roku 1987 sa lovastatín používa vo forme tabliet na znižovanie hypercholesterolémie a na predchádzanie vzniku ischemickej choroby srdca.
U. S. Pat. No. 4 231 938 a E. P. 0 022 478 opisujú fermentačnú prípravu lovastatínu a dihydroxymevinolínu produkčným kmeňom Aspergillus terreus ATCC 20541 a ATCC 20542.
U. S. Pat. No. 4 387 242 opisuje fermentačnú prípravu hypocholesterolemickej a hypolipemickej látky so štruktúrou príbuznou lovastatínu tým istým kmeňom Aspergillus terreus ATCC 20542.
E. P. 0 556 699 sa týka procesu prípravy produkčného kmeňa pre lovastatín z druhu rodu Aspergillus, ktorý pôvodne túto látku neprodukuje (napr. Aspergillus oryzae) Spôsob prípravy takéhoto kmeňa zahŕňa transformáciu protoplastov A. oryzae DNA, izolovanou z produkčného kmeňa J. terrerus.
U. S. Pat. No. 5 403 728 opisuje mikrobiálny proces prípravy lovastatínu vo forme kyseliny i laktónu aeróbnou fermentáciou submerznej kultúry nového druhu Aspergillus obscurus.
V patentovej literatúre sú ako produkčné kmene pre lovastatín uvádzané aj druhy rodu Monascus - M. anka, M. purpurous, M. ruber, M. vitreus, M. paxii (British Patent Specifications Nos. 2 046 737 a 2 049 664).
V literatúre sa uvádzajú aj ďalšie druhy mikroorganizmov, pri fermentácii ktorých sa získavajú malé množstvá lovastatínu. Konkrétne ide o druhy Phoma sp. M 4452, Doratomyces nanus IFO 9551, Gymnoascus umbrinus IFO 8450 (Endo et al.: J. Antibiot. 39, 1609 až 1610, 1986), Pleurotus ostreatus, Pleurotus saca a Pleu rotus sapidus (Gunde - Cimerman, FEMS Mikrobiology Letters 11,203-206,1993).
Napriek tomu, že v patentovej literatúre bolo opísaných viacero kmeňov druhu Aspergillus terreus, produkujúcich lovastatín, jeho výťažnosť pri patentovanom kmeni A. terreus ATCC 20542 je pomerne nízka. Nedostatkom je tiež fakt, že zložky fermentačných pôd opublikovaných v patentoch U. S. Pat. No. 4 231 938, E. P. 0 022 478 a U. S. Pat. No. 4 387 242 sú pre potreby priemyselnej výroby finančne náročné, a tým nedostupné.
Podstata vynálezu
Kombináciou použitia fyzikálneho a chemického mutagénu, ktoré boli aplikované na spóry kmeňa A. terreus, bol získaný nový mutantný kmeň A. terreus CCM 8236, ktorý sa vyznačuje nadprodukciou lovastatínu. V porovnaní s kmeňom A. terreus ATCC 20542 dosahuje minimálne dvojnásobnú produkciu. Inokulačná aj sporulačná pôda je zložená z dostupných a finančne nenáročných surovín, ktoré sú bežne využívané pri fermentácii sekundárnych i primárnych metabolitov. Vynález je založený na použití kmeňa A. terreus CCM 8236 na produkciu lovastatínu vo forme kyseliny a laktónu alebo jeho farmaceutický využiteľných solí alebo esterov.
Pôvodný kmeň A. terreus s pracovným názvom GB1 poskytol dr. Vollek. Na základe relatívne najvyššej produkcie lovastatínu bol vybratý ako východiskový materiál pre produkčný kmeň spomedzi viacerých divých kmeňov, identifikovaných tiež ako A. terreus.
Uvedený kmeň bol podrobený pôsobeniu chemických a fyzikálnych mutagénov s cieľom získať produkčný kmeň pre lovastatín.
V prvej fáze šľachtenia bol východiskový kmeň ovplyvnený silným mutagénom N-metyl, N-nitro, N-nitrózoguanidínom (NTG). Vzhľadom na zvýšenie rezistencie mutantov na NTG boli tieto v druhej fáze šľachtenia striedavo vystavené pôsobeniu ultrafialového žiarenia (UV) a NTG. Získané izoláty (pracovne označované písmenami GB a poradovým číslom) boli testované na výšku produkcie lovastatínu. Takýmto spôsobom bol izolovaný mutant s pracovným označením GB2033 s výrazne zvýšenou produkciou lovastatínu, ktorý bol deponovaný v Českej zbierke mikroorganizmov v Brne pod označením CCM 8236. Zloženie pôd - ako sporulačných, tak aj inokulačných a produkčných - bolo prispôsobené pre tento nový kmeň.
Kultivácia mikroorganizmu, využívaná pri fermentačnom procese, ktorého sa patent týka prebieha v troch krokoch:
1. sporulácia kultúry
2. inokulačný stupeň
3. produkčný stupeň
Pre kvalitu inokula je dôležitá rýchla sporulácia (v priebehu 4 až 5 dní pri 28 °C je kultúra kompletne vysporulovaná, spóry sú škoricovo hnedej farby, kolónie sú ploché, zamatového vzhľadu bez bielych okrajov, s priemerom cca 4 cm, ľahko zmývateľné fyziologickým roztokom s 30 % glycerolu).
Kultivácia inokula prebieha pri 28 °C pri 220 rpm 16 až 20 hodín v pôde s nízkym pH (4,6), ktoré sa počas kultivácie ešte výrazne zníži (3,0 až 3,2). Kvalitné inokulum sa vyznačuje nasledovnými vlastnosťami:
- pelety malé, dobre rozvláknené
- sediment 20 %
-orientačné analytické parametre: obsah glukózy: 40 g/1 obsah fosforu: 200 mg/1 obsah NH4+: 0,2 gú obsah NH2' 0,1 g/1.
Kultivácia produkčného stupňa prebieha pri 28 °C pri 220 rpm 170 až 190 hodín. Produkčná pôda obsahuje vysokú koncentráciu uhlíkatých zdrojov (glukóza a laktóza) v presne definovanom pomere (1 : 22) v prospech laktózy. Ako zdroj dusíka je nevyhnutné použiť organický zdroj, napr. sójovú múku, inaktivované pekárenské droždie a pod. Najvyššie produkcie boli dosahované na pôde, obsahujúcej ako zdroj dusíka bavlníkovú múku Pharmamedia. Anorganický dusík v pôde vo forme NH4 + má na produkčnú schopnosť kmeňa výrazne negatívny účinok. Rovnako sa prejavuje aj posunutie pomeru uhlíkatých zdrojov v prospech glukózy.
Z morfologického hľadiska jc kultúra mikroorganizmu peletová, pelety sú malé (cca 0,2 až 0,5 mm), ku koncu fermentácie sa stávajú kompaktnými a na okrajoch sa začínajú vytvárať konidiofóry. Počas optimálnej fermentácie sediment vzrastie na 45 až 55 %, pH klesne na 6,0 až 5,8, koncentrácia fosforu a zdrojov uhlíka klesne na stopové množstvá.
Po ukončení fermentácie sa pH fermentačnej pôdy upravuje 40 % H2SO4 na hodnotu 4,6 až 4,8. Lovastatín sa extrahuje z takto upravenej vzorky acetónom (1:1) miešaním v ultrazvuku. Produkcia sa stanovuje metódou HPLC v izokratickom systéme 65 % acetonitril a 0,1 % H3PO4.
V takto uskutočnenom baničkovom produkčnom teste produkuje nový kmeň A. terreus CCM 8236 minimálne 2000 mg/1 lovastatínu.
Identita produktu bola overená metódou nukleárnej magnetickej rezonancie.
Nový kmeň A. terreus CCM 8236 sa od východiskového kmeňa GB1 i od patentovaného kmeňa ATCC 20542 líši aj svojimi rastovými schopnosťami na rôznych zdrojoch uhlíka, morfológiou kolónií a pigmentáciou média (tab. 1).
Produkčný kmeň A. terreus, ktorý je predmetom vynálezu a bol získaný cestou klasickej mutagenézy, bol uložený v Českej zbierke mikroorganizmov v Brne pod číslom CCM 8236. Ide o stabilný produkčný kmeň s produkciou 2000 až 3000 mg/l lovastatínu vo forme kyseliny a laktónu, čo predstavuje cca 130 - násobné zvýšenie produkcie oproti východiskovému kmeňu a minimálne dvojnásobne zvýšenú produkciu oproti kmeňu A. terreus ATCC 20542. Pre kvalitu očkovacieho materiálu je dôležitá rýchla sporulácia. Inokulačný stupeň prebieha pri atypickom pH. Zloženie kultivačných pôd plne zodpovedá požiadavkám priemyselnej výroby, čo sa týka finančných nákladov i dostupnosti jednotlivých zložiek.
Tab. L Morfologická charakteristika kmeňov A. terreus GB1, CCM 8236 a ATCC 20542 na Czapek-Doxovom agare s rôznymi zdrojmi uhlíka.
Zdroj uhlíka A. lerrrustiSi A/errwj CCM 8236 Afrrnw ATCC 20542
glukóza VhIuvíU vzdušné mycélium. Vzdušné myuélium zjimntového Vzdušné mycélium zamatového
kolónie pravidelného tvaru » vzhľadu, kolónie pravidelného vzhľadu. kolónie pravidelného
priemerom 2 J až 3 cm. $ dvomi tvaru e priemerom 3 1 varil s priemerom 3
zónami: až 4 cm, i tromi zónami: až 4 cm, s dvomi zónami:
1. cenirätaa zóna bledohnedá i. centrálna wna bledohnedí 1. centrálna zóna škodcovo hne-
2 okrajová rória biela 2! žito sfarbená zóna 3. okrajová zóna biela dá 2. okrajová zóna biela Rozpustný pigment: hnedý
fruktóza Valovité vzdušní mycélium Kolónie pravidelného tvaru s Vatwili· kuktnie pmiieÍGélur
kolónie pravidelného tvaru n priemerom 3 cm. κ dvomi zóna- ivam s priemerom 2 až cm.
priemerom 35 cm. s dvomi zóna- ml: v dvomi zónami:
mi: L «mršina zóna bledohnedá, vo 1. centrálna zóna (kancovo hne-
1. centrálna zóne béžová zamatovým vzhladom dá.
2 okrajová zóna biela 2. okrajová zóna Hela. vntovilň Rozpustný pigment: žltý 2. okrajová zóna biela Rozpustný pignienl:hnedý
Zdroj uhlíka A. irfreu.tGBI A terrrus CCM 8236 A terma ATCC 29542
maltóza Valovilé vzdušné mycélium, kolónie pravidelného tvaru s priemerom 35 ii 4 cm. s dvomi zónami: 1. centrálna zóna bledohnedá 2. okrajová zóna biela Vzdušné mycélium zamatového vzhľadu. kolónie pravidelného tvaru s priemerom 35 až 4 cm. s dvomi zónami: L centrálna zóna hnedá 2. okrajová zóna bicia Rozpustný ptgmcnl: žltý Valovilé vzduiné mycélium. kolónie pravidelného tvaru s priemerom 3 až 4 cm. s dvomi zónami: 1. centrálna zóna škoricovo hnedá 2. okrajová zóna biela Rozpustný pigment: hnedý
laktóza Vatovlté vzdušné mycélium. kolónie pravidelného tvaru s priemerom 2.5 až 3 cm. s dvomi zónami: 1. centrálna zóna bledohnedá 2. okrajová zóna biela Kolónie nepravitelnélui tvaru > priemerom 2 ai 2.5 cm, vytvára sa len žhé Mibatrátové mycélium prerastajúce pôdu. Kolónie ncpraviielného tvaru s priemerom 2 až 25 cm v centrálnej zóne valovité vzdušné mycélium Stého sfarbenia, v okrajovej zóne žlté substrátové mycélium prerastajúce pôdu.
sadtarti Valovité vzdušné mycélium, kolónie pravidelného tvaru s priemetom 3 cm. a dvomi zónami: 1. centrálna zóna bledohnedá 2. okrajová zóna biela Kolónie pravidelného tvaru i priemerom 4 až 45 cm, strund zónami: 1. centrálna zóna hnedá, zamatového vzhľadu 2. vatovitá béžová zónu 3. okrajovú zóna plochá, zamatového vzhlndu. škodcovo hnedá Vatoviié kolónie pravidelného tvaru s priemerom 15 až 2 cm. s dvomi zónami: L centrálna zóna hnedá. 2. okrajová zónu biela Rozpustný pigment: hnedý
glycerol Valovité vzdušné mycéliuin. kolónie pravidelného inmi s priemerom 3 až 35 cm. s dvomi zónami: 1. centrálna zóna žltá 2. okralová zóna biela Kolónie lalokovilého tvaru s priemerom 1 až 15 cm. mysťlium ploché. zamatového vzhladu. béžového sfarbenia. Kolónie lalokovilého tvaru s pnemerom 1 až 1,5 cm, mycélium ploché. zamatového vzhladu, s dvomi zónami: L centrálna zóna škoiiovvn hnedá 2. okrajová zóaa bicia
šktoh Ploché vzdušné mycélium zamatového vzhľadu. kolónie pravidelného Ivani s priemerom 2.5 až 3 cm. s dvorná zónami: 1. centrálna zóna bledohnedá 2. okrajová zónn biela Vzdušné mycélium zamatového vthladu. kolónie viac - menej pravidelného tvaru so slrapcovítými okrajmi. s priemerom 2 už 25 cm s tromi zónami: L centrálna zóna bledohnedá 2. škoriaivohncdá zóna 3. okrajová zóna biela Kolónie pravidelného tvaru, s priemerom 2 až 3 cm. mycélium zamatového vzhľadu, s dvomi zónami: L centrálnu zóna škoricovú hnedú 2. okrajovú am» biela, výrazne ohraničená
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1: Schéma mutačného postupu pri získaní kmeňa Aspergillus terreus CCM 8236.
Pozn.: Uvádzaný je spôsob (UV - ultrafialové svetlo, NTG - N-metyl, N-nitro, N-nitrózoguanidín) a čas ovplyvnenia (v minútach alebo sekundách), pracovné*’ označenie testovaných izolátov (GB1 až GB2050) a produkcia lovastatínu na skriningovej pôde (mg/1 kyselinovej formy a mg/1 laktónovej formy).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1 Mutagenéza kmeňa A. terreus GB1
Príprava spórovej suspenzie: súvislý nárast mycélia, vysporulovaného na sporulačnej pôde s paradajkovým pretlakom (2 %) a ovsenou múkou (2 %) bol zmytý 10 ml fyziologického roztoku a 30 % glycerínu (počet spór 3,5 x 107/ml).
Ovplyvnenie NTG ml spórovej suspenzie s počtom spór 106/ml a 1 ml zásobného roztoku NTG (kone. 5 mg/ml) s minimálnym množstvom dimetylformamidu (pridávaný pre nízku rozpustnosf NTG vo vode) bol pridaný k 8 ml fyziologického roztoku. Koncentrácia NTG v takomto roztoku teda bola 0,5 mg/ml a hustota spór rádovo 105 spór/ml. Ovplyvňovanie biologického materiálu prebiehalo za tmy, stáleho miešania a pri izbovej teplote. Každých 10 min. bol odobratý 1 ml vzorky. Vzorka bola rýchlo scentrifugovaná a ovplyvňovací roztok bol dôkladne odstránený. Spóry boli rozsuspendované v 1,5 ml fyziologického roztoku a znova scentrifugované. Sediment spór bol rozsuspendovaný v 1 ml fyziologického roztoku a riedený 10 a 100-krát. Po 200 μΐ takejto suspenzie bolo
SK 281320 Β6 vysiatych na Petriho misky so sporulačnou pôdou. Petriho misky boli kultivované 8 dní pri 28 °C.
Ovplyvnenie UV žiarením
Na Petriho misku so sporulačnou pôdou bolo vysiate 100 pl sporovej suspenzie s počtom spór rádovo 105 a 104/ml. Po presušení misiek pri 28 °C 30 min. boli vystavené pôsobeniu UV svetla počas 20, 30, 40, 60 a 120 sekúnd. Zdrojom UV žiarenia bola žiarivka Philips s výkonom 30 W. Jej vzdialenosť od povrchu pôdy bola 20 cm. Po ovplyvnení boli misky okamžite umiestnené do tmy na 1 hod. (zabránilo sa priebehu fotoreaktivácie). Boli kultivované počas 8 dní pri 28 °C.
Monokolónie s priemerom cca 4 cm boli zmyté 2 ml fyziologického roztoku s 30 % glycerínu boli priamo testované na produkciu lovastatínu. Prvotným kritériom na výber mutantov do produkčného testu bola kvalita sporulácie a týchlosť rastu mycélia. Vybrané kolónie boli použité v skríningovom produkčnom teste.
Príklad 2
Skríningový produkčný test
Vybrané monoizoláty boli testované na produkčnú schopnosť na pôde s nasledujúcim zložením:
laktóza 100 g/1
sójová múka 20 g/1
NaNOj 3 g/1
KH2PO4 lg/1
KC1 0,5 g/1
MgSO4.7H2O 0,5 g/1
FeSO4.7H2O 0,01 g/1
PH 6,8
Skríningová produkčná pôda bola očkovaná 1 ml
spórovej suspenzie s počtom spór rádovo 107 spór/ml.
Produkcia bola stanovovaná po 120 hodinách kulti-
vácie pri 28 °C a 220 rpm n íetódou HPLC. Produkcia
Kmeň A. terreus (kyselina + laktón) [mg/1]
GB1 0,6 + 3,1
ATCC 20542 200,1 +4,8
CCM 8236 402,2+11,8
Príklad 3: Produkčný test v laboratórnom meradle
1. Sporulácia
Zloženie sporulačnej pôdy:
paradajkový pretlak 20 g/1
ovsená múka 20 g/1
agar 20 g/1
PH 6,5
Vizuálne a mikroskopické hodnotenie sporulácie.
- 65. hodina: Mycélium bielej farby súvisle narastené po celom povrchu, kultúra začína sporulovať a nadobúda žltkasté sfarbenie. Pod mikroskopom viditeľné septované mycélium s vyrastajúcimi konidiofórami.
- 96. hodina: Kultúra už kompletne vysporulovaná, mycélium škoricovej farby. Dobre vyvinuté konidiofóry s ľahko sa uvoľňujúcimi spórami.
Vysporulovaná kultúra bola zmytá fyziologickým roztokom s 30 % glycerolu. Takto pripravenú spórovu suspenziu je možné uchovávať pri 4 °C počas 30 dní bez poklesu produkčnej schopnosti.
2. Inokulačný stupeň
Pre dobrý nárast inokula je potrebná prítomnosť iónov
Fe2+, Mn2+, Zn2+, K+, Mg2+. Ca2+. Potrebný je tiež nadbytok uhlíkatého zdroja, rozpustného fosforu a dusíka v pôde. Ani jeden z týchto faktorov nesmie byť limitujúcim.
ml inokulačnej pôdy sa naočkuje 10 % spórovej suspenzie a kultivuje sa pri 28 °C a 220 rpm 20 hodín.
Zloženie inokulačnej pôdy:
glukóza 50 g/1
CSL 10 g/1
(NH4)2SO4 lg/1
kh2po4 lg/1
Ca(NO3)2.4H2O 2 g/l
MgSO4.7H2O 0,25 g/1
KC1 0,25 g/1
FeSO4.7H2O 0,01 g/1
MnS04.7H2O 0,01 g/1
ZnSO4.7H2O 0,002 g/1
PPG 2000 0,1 ml/50ml
pH bez úpravy (4,6)
sterilizácia 40 min. 115 °C
3. Produkčný stupeň.
Produkčná pôda sa naočkuje 10 % inokula. Fermentácia prebieha 170 hodín pri 28 °C a 220 rpm. Produkcia lovastatínu sa stanovuje metódou HPLC.
Tab. 2 Vplyv pomeru laktózy a glukózy v produkčnej pôde na produkciu lovastatínu.
Kmeň Pomer uhlíkatých zdrojov [glukóza: laktóza]
22: 1 1 :22
PH sedím. [%] prod. (mg/1] kys + lakt pH sedím. [%] prod. mg/1] kys + lakt
ATCC 20542 6,5 45 23 + 4 3,4 45 43 + 14
CCM 8236 6,3 48 55 + 8 2,4 46 114 + 8
Pozn.: Ako zdroj dusíka bola použitá sójová múka a (NH4)2SO4.
Tab. 3a Vplyv dusíkatého zdroja v produkčnej pôde na produkciu lovastatínu.
Kmeň Zdroj dusíka
sójová múka + (NH4)2SO4 sójová múka
pH sedím. [%] prod. [mg/1] kys + lakt pH sedím. [%] prod. (mg/1] kys + lakt.
ATCC 20542 3,4 45 43 + 14 6,0 45 1005 + 0
CCM 8236 2,4 46 114 + 8 5,9 55 1986 + 0
Tab. 3b Vplyv dusíkatého zdroja v produkčnej pôde na produkciu lovastatínu
Kmeň Zdroj dusíka
bavlníková múka + (NH4)2SO4 bavlníková múka
PH sedim. [%] prod. [mg/1] kys + lakt pH sedim. [%] prod. (mg/1] kys + lakt
ATCC 20542 2,9 46 105+15 6,0 45 1347 + 0
CCM 8236 3,4 45 202+ 16 5,8 48 2248 + 0
Pozn. Ako zdroj uhlíka boli použité glukóza a laktóza v pomere 1 :22.
SK 281320 Β6
Z výsledkov pokusov uvedených v tabuľke vyplýva, že prítomnosť síranu amónneho v pôde na začiatku produkčného stupňa má výrazne negatívny vplyv na produkčnú schopnosť. Rovnaký efekt má aj posunutie pomeru zdrojov uhlíka v prospech glukózy. Produkcia lovastatínu je za takýchto podmienok dokonca nižšia ako produkcia v skríningovej pôde. Výsledky pokusov tiež dokazujú, že voľba organického zdroja dusíka je dôležitá. Vo všetkých testovaných pôdach nový kmeň A. terreus CCM 8236 produkoval približne o 100 % viac lovastatínu ako kmeň A. terreus ATCC 20542.
Na základe prezentovaných experimentov bolo zloženie produkčnej pôdy optimalizované.
Optimalizovaná produkčná pôda má zloženie:
glukóza 5 g/1
laktóza 110 g/1
CSL 50 % 5 g/1
bavlníková múka 21 g/1
KH2PO4 1 g/1
CaCO3 5 g/1
PPG 2000 2ml/l
pitná voda do 11
PH 7,0
Na pôde s takýmto zložením bola dosiahnutá priemerná produkcia lovastatínu 2665 mg/1 (n = 7), maximálna dosiahnutá produkcia bola 3042 mg/1 lovastatínu.
Priemyselná využiteľnosť
Nový vysokoprodukčný kmeň mikroorganizmu Aspegillus terreus CCM 8236 je možné využiť pri priemyselnej výrobe lovastatínu, jeho solí a esterov.

Claims (2)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Kmeň Aspergillus terreus s pracovným označením GB2033, produkujúci vysoké množstvo lovastatínu, ktorý bol získaný metódami klasickej mutagenézy a deponovaný v Českej zbierke mikroorganizmov v Brne pod označením Aspergillus terreus CCM 8236.
  2. 2. Fermentačná príprava lovastatínu vo forme kyseliny alebo laktónu, alebo jeho farmaceutický využiteľných solí alebo esterov, vyznačujúca sa tým, že sa kultivuje kmeň Aspergillus terreus CCM 8236 v inokulačnej pôde s pH v rozmedzí 4,5 až 4,7 a v produkčnej pôde, v ktorej je ako zdroj uhlíka použitá kombinácia glukózy a laktózy vo vzájomnom pomere 0,5 až 0,7 % glukózy a 11 až 15 % laktózy a ako komplexný zdroj je použitá bavlníková alebo sójová múka, pričom koncentrácia voľných amoniakálnych iónov je max 0,07 g/1.
SK1395-97A 1997-10-13 1997-10-13 Kmeň aspergillus terreus a fermentácia lovastatínu týmto produkčným kmeňom SK281320B6 (sk)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SK1395-97A SK281320B6 (sk) 1997-10-13 1997-10-13 Kmeň aspergillus terreus a fermentácia lovastatínu týmto produkčným kmeňom
PCT/SK1998/000014 WO1999019458A1 (en) 1997-10-13 1998-10-12 A method of fermentation preparation of lovastatin by an aspergillus terreus strain and the strain for performing the method
TR2000/00996T TR200000996T2 (tr) 1997-10-13 1998-10-12 Bir aspergillus terreus türünün fermantasyonu vasıtasıyla lovastatin elde etme metodu ve bu metodu gerçekleştirmek için gerekli tür.
EP98948055A EP1047768A1 (en) 1997-10-13 1998-10-12 A method of fermentation preparation of lovastatin by an (aspergillus terreus) strain and the strain for performing the method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SK1395-97A SK281320B6 (sk) 1997-10-13 1997-10-13 Kmeň aspergillus terreus a fermentácia lovastatínu týmto produkčným kmeňom

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK139597A3 SK139597A3 (en) 1998-11-04
SK281320B6 true SK281320B6 (sk) 2001-02-12

Family

ID=20434512

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1395-97A SK281320B6 (sk) 1997-10-13 1997-10-13 Kmeň aspergillus terreus a fermentácia lovastatínu týmto produkčným kmeňom

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1047768A1 (sk)
SK (1) SK281320B6 (sk)
TR (1) TR200000996T2 (sk)
WO (1) WO1999019458A1 (sk)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114196552B (zh) * 2021-12-29 2024-05-03 北京工商大学 一株土曲霉btbu20212047及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4387242A (en) * 1981-08-21 1983-06-07 Merck & Co., Inc. Hypocholesterolemic fermentation products and process of preparation
SI9500238A (en) * 1995-07-27 1997-02-28 Krka Tovarna Zdravil Procedure for the production of lovastatin

Also Published As

Publication number Publication date
SK139597A3 (en) 1998-11-04
WO1999019458A1 (en) 1999-04-22
TR200000996T2 (tr) 2000-12-21
EP1047768A1 (en) 2000-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20060281155A1 (en) Microbial process for preparing pravastatin
DE60019898T2 (de) Mikrobielles verfahren zur herstellung von pravastatin
PETERSEN et al. Production of cladospirone bisepoxide, a new fungal metabolite
US7279314B2 (en) Chemical substance having morphogenetic and growth-accelerating activities
EP0842290B1 (en) Process for the preparation of lovastatin
SK281320B6 (sk) Kmeň aspergillus terreus a fermentácia lovastatínu týmto produkčným kmeňom
Hatori et al. FR901512, a Novel HMG-CoA Reductase Inhibitor Produced by an Agonomycetous Fungus No. 14919 I. Taxonomy of the Producing Organism, Fermentation, Isolation and Physico-chemical Properties
US7541336B2 (en) Substance fki-1033 and process for producing the same
Patel¹ et al. Extraction and Molecular Characterization of Antimicrobial Metabolites from Streptomyces rochei against Bacterial Leaf Blight of Cotton Caused by Pantoea sp.
CZ287668B6 (cs) Nový mutantní kmen Aspergillus terreus a způsob fermentace lovastatinu
US5801172A (en) Antifungal agent from sporomiella minimoides
JP2962748B2 (ja) ドレックスレラ属菌又はその代謝産物を含有する雑草防除剤及びそれらによる雑草防除法
KR100453452B1 (ko) 페니실리움 싸이클로피움 종 및 이를 이용한 컴팩틴의 제조방법
US5441987A (en) Antifungal agent
RU2252258C2 (ru) Микробный способ получения правастатина
EP0645963A1 (en) Fungicidal and insecticidal compounds and compositions derived from fungal strains of pyrenophora teres
US5543429A (en) Antifungal agents
GB2240100A (en) Anti-parasitic compound
KR100458067B1 (ko) 페니실리움 종 미생물 및 이를 이용한 컴팩틴의 제조방법
BG108752A (bg) Ферментационен метод за получаване на компактин
De la Fuente Prieto Interactions of Rhizoctonia solani Kuhn and Trichoderma spp. populations in soil
KR19990031527A (ko) 신균주 곰팡이 슈달레세리아 속 ｍｔ60109(ｋｃｔｃ 8804ｐ)와 포스포리파제 ｃ 활성저해용 조성물
JPH02256694A (ja) 新規物質ｐｆ１０１８物質ならびにその製造法及び殺中剤
ZA200503522B (en) Novel substance FKI-1033 and process for producing the same
GB2306474A (en) Antifungal agent