BG108752A

BG108752A - Ферментационен метод за получаване на компактин

Info

Publication number: BG108752A
Application number: BG108752A
Authority: BG
Inventors: Надежда ИВАНОВА; Маргарита СТОЯНОВА-АЛКУШЕВА; Милен РУСИНОВ; Живко ИВАНОВ; Росица ВАСИЛЕВА; Борис МАРИНОВ; Мариана ИВАНОВА
Original assignee: "Биовет" Ад
Priority date: 2004-06-09
Filing date: 2004-06-09
Publication date: 2005-12-30

Abstract

Компактинът е антихиперхолестеричен и антиартериосклеротичен агент от групата на статините и се използва като междинен продукт за получаване на правастатин. Работи се с щам мутант, чрез който се повишава титърът на продукта в културалната среда и се натрупват сравнително малко странични продукти в процеса на ферментацията. По метода за получаването му щам-продуцент Penicillium citrinum, регистриран в НБПМКК под № 8359, се култивира дълбочинно върху хранителната среда, съдържаща в тегл.%: глюкоза от 3 до 15; пептон от 1 до 1.5; соево шротовo брашно от 3 до 5; натриев нитрат от 0.1 до 0.7; магнезиев сулфат от 0.05 до 0.5; глицерол от 4 до 12 и соево масло от 1 до 3. Ферментационният процес се провежда в аеробни условия при температура от 22 до 28°С, налягане 0.4-0.6 bar и рН от 5.3 до 8.0.

Description

ФЕРМЕНТАЦИОНЕН МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА КОМПАКТНИ

Област на техника

Изобретението се отнася до ферментационен метод за получаване на компактни, който намира приложение във фармацевтичната промишленост.

Предшестващо състояние на техниката

Компактинът е изолиран за първи път от културална течност на Penicillium brevicompactum и както съобщават Brown и сътр. през 1975 г. той представлява противогъбен метаболит.(Brown A.G. et al., 1976, Cristal and molecular structure of Compactin, a new antifungal metabolite from P.brevicompactum, J.C.S. Perkin I, 1165-1170).

По-късно Endo и сътр. откриват, че компактни се продуцира и от Penicillium citrinum. Те установяват и неговата хипохолестерична активност, причисляваща го към групата на статините - вещества, инхибиращи 3хидрокси-3-метилглутарил-коензим А-редуктазата - ключов ензим в биосинтеза на холестерол.( Endo М.К., Y.Tsjita, 1976, J.Antibiot., 29, 13461348; Endo M.K., Y.Tsjita, 1976, FEBS Lett., 72, 323-326).

Известен е ферментационен метод за получаване на компактни чрез щам Penicillium citrinum. Hosobuchi и сътр. описват условията на култивирането на щама върху ферментационна среда, съдържаща голямо количество въглероден източник (глицерол), подходящи азотни източници, неорганични соли и подхранване с глицерол и малтоза по време на ферментация. Ферментацията протича за 12 дни при аеробни условия и температура +24°С. (Hosobuchi М., et al., Biosci.Biotech.Biochem., 57(9), 1414-1419, 1993)

Известен е ферментационен метод за получаване на компактни чрез щам-продуцент Penicillium adametzioides който се култивира върху хранителна среда, съдържаща азотни и въглеродни източници и £- · · · · · · ·· · · ···· ··· ··· • ·· · · ···· · ··· • · · · · · ♦ · ? ··· · · · · · • · · · · · · ··· • · · · ·· · · ·· · неорганични соли, при температура 23-:-28⁰ С за 7-11 дни с максимален добив 1,6 g/l. (US 5691173)

Недостатък на метода е ниската продуктивност на използувания щам.

Известен е ферментационен метод за получаване на компактни от щам Gliocladium sp.YJ-9515 , който се култивира върху хранителна среда, съдържаща източници на въглерод, азот и неорганични соли. Ферментационният процес протича при температура 10-36°С и pH 4,08,0.(US 6204032).

Недостатък на метода е ниския добив на целевия продукт.

Известен е ферментационен метод за получаване на компактни чрез ф имобилизиране на спори от Penicillium cyclopium. Ферментационният процес се провежда в биореактор върху твърда хранителна матрица. (WO 0181611)

Недостатък на метода е необходимостта от създаване на подходяща установка за прилагането му.

Известен е ферментационен метод за получаване на компактни, при който щам Penicillium citrinum ATCC 38065 се посява върху хранителна среда, съдържаща 7% глюкоза, 3% глицерол, 1% фармамедия, 1% царевичен екстракт и неорганични соли. Ферментационният процес протича при pH 4-9, температура 20-35°С за 5 дни.(1186323021)

Недостатък на метода е ниския добив на компактни.

Известен е ферментационен процес за получаване на компактни при ф който щам-продуцент Penicillium citrinum SANK 18767( НБППМКК 3426) се култивира при аеробни условия върху хранителна среда, съдържаща малцов екстракт, глюкоза, пептон и агар при pH 3-9 и температура 20-30°С (US 3983140, US 4049495 ) .

Недостатък на този метод е ниския добив на целевия продукт, което го прави неефективен за промишлено приложение.

Техническа същност на изобретението

3..

Целта на изобретението е да се създаде щам-микроорганизъм, при култивирането на който върху подходящо подбрана хранителна среда да се натрупва висок титър на компактни.

Съгласно метода, обект на изобретението, за получаване на компактни щам Penicillium citrinum, регистриран в НБПМКК под № 8359 се култивира дълбочинно при аеробни условия върху хранителна среда, съдържаща усвояеми източници на азот, въглерод и неорганични соли. Ферментационният процес се провежда при температура 22-28°С, налягане 0.4-0.6 бара и pH от 5.3 до 8.0 за време 260-300 часа.

Щам Penicillium citrinum НБПМКК 8359 се получава от щам Penicillium citrinum НБПМКК 3426, при облъчване с UV светлина и третиране с NTG (нитрозогуанидин). Полученият вариант на щама се стабилизира посредством естествена селекция.

За охарактеризиране на изходния родителски щам Penicillium citrinum НБПМКК 3426 и получения при селекцията подобрен щам са използвани следните хранителни среди:

.Сабуро-декстрозен агар, със състав в тегловни проценти: глюкоза4.0;пептон -1.0; агар-1.5; pH -5.6±0.1.

2. Малцово-царевичен агар, със състав в тегловни проценти: малцов екстракт -2.0; царевичен екстракт -1.0; агар-1.5; pH -6.5 ± 0.2.

3. Сабуро-малтозен агар, със състав в тегловни проценти :месен пептон 0.5; казеин-0.5; малтоза- 2.0; агар-1.5; pH -5.6 ± 0.1.

4. Комбиниран агар, със състав в тегловни проценти :малцов екстракт1.5; пептон -0.075; малтоза-1.3; декстрин -0.3; глицерол -0.25; монокалиев фосфат -0.1; амониев хлорид -0.1; агар -1.5; pH -4.8± 0.2.

5. Малцов агар, със състав в тегловни проценти: малцов екстракт 3.0; соев пептон-0.3; агар-1.5; pH -5.6 ±0.1.

Морфолого-културалните характеристики на двата щама са направени на 14'^ия ден от развитието им и са представени в таблица 1.

• · · · ···· • ·· · · · · · · ··· · • · ··· ·· ·· ··· ····· • · · ·······

9· · · · · ·· · ··

Таблица 1. Сравнителна морфологична характеристика на щамове

Penicillium citrinum НБПМКК 3426 и 8359

№	Хранителна среда	Родителски щам Р. citrinum НБПМКК 3426	Подобрен щам Р. citrinum НБПМКК 8359
	2	3	4
1	Сабуродекстрозен агар	Едри кръгли колонии 25-30 мм, радиално нагънати с връх в средата; пухкав ВМл4; СМ-пб	Кръгли колонии 5-10 мм, силно повдигнати с набръчкана повърхност, червеникавокафяв пигмент ВМ -л4; СМ- г1
2	Малцовоцаревичен агар	Едри колонии 25-30 мм, без радиални гънки с връх в средата; пухкав ВМл4; СМ-зЗ.	Кръгли колонии 5-10 мм, повдигната леко набраздена повърхност; червеникаво-кафяв пигмент; ВМ-л7; СМ -г1
3	Сабуромалтозен агар	Едри колонии 30-40 мм, без радиални гънки с връх в средата; пухкав ВМ-а7; СМ-д2.	Кръгли колонии 5-10 мм, повдигнати с кратер в средата ; светлокафяв пигмент; пухкав ВМ-о5; СМ-мб.
4	Комбиниран агар	Едри колонии 20-25 мм, радиално нагънати без връхче в средата, пухкав ВМ и5; СМ- лЗ.	Кръгли колонии 3-5 мм, силно повдигнати с радиални гънки в основата; не отделя пигмент в средата; ВМ-г2; СМ- к1.
5	Малцов агар	Едри колонии 20-25 мм, радиално нагънати с връхче в средата, пухкав ВМ л4; СМ- ЛЗ	Кръгли плоски колонии 3-8 мм с радиални гънки; бледожълт пигмент; пухкав ВМ-и2; СМ-мб.

·· · · · # · · • · · · · ♦ ·· • · · · · · ·«· ···· • · · · · · · · · ··· · · ·«· ♦ · · · · ♦ · ··· ·· ·· ·· ·· ·· ·

Цветът на въздушния мицел е определен по скалата на Бондарцев (Бондарцев А. С., Шкала цветов, ИздАН СССР , 1954)

Данните за усвояване на различни въглехидратни източници от двата щама са представени в Табл. 2. Анализът е извършен на среда с единствен въглехидратен източник в концентрация 1%, със състав в тегловни проценти: амониев сулфат - 0.026; монокалиев фосфат - 0.024; дикалиев фосфат - 0.56; магнезиев сулфат - 0.1; солев разтвор* - 0.1; агар -1.5; pH 6.8-7.0.

Солев разтвор: меден сулфат - О.бЗд; железен сулфат - 0.11д; манганов сулфат- 0.79д; цинков сулфат - 0.15д; дестилирана вода до 100 ml. Захарите се добавят под формата на стерилни разтвори при температура около 60° С.

Таблица 2. Усвояване на въглехидратни източници от родителския щам

Penicillium citrinum НБПМКК 3426 и щам Penicillium citrinum НБПМКК 8359

№	Субстрат	Penicillium citrinum НБПМКК 3426	Penicillium citrinum НБПМКК 8359
1	Контрола	+	+
2	Глюкоза	+++	++
3	Фруктоза	+++	+
4	Захароза	++	++
5	Малтоза	++	++
6	Лактоза	++	++
7	Г алактоза	++	I¹ 1
8	Рафиноза	++	+
9	Ксилоза	+++	++

Означения в таблицата: ”+”-положителен ръст; ” ++”-добър ръст ; ”+++”- много добър ръст.

·· 44 ·· 44 • · « · · · • ··· · · ·· е 4 · · · ·« ·♦ ·· »·

• · • 4 4 • · ·· ·

Щамът се съхранява върху скосен агар при температура до +4°С, при което свойствата му се запазват в рамките на 2 месеца. За по-дълъг период от време щамът се съхранява, като лиофилизирана култура при използване на обезмаслено мляко.

Щам Penicillium citrinum НБПМК 8359 се развива върху епруветка скосен CSM агар, със състав в тегловни проценти: бакгопептон Difco 1.0 1.5; соево шротово брашно 1.0 - 1.5; натриев нитрат 0.2 - 0.4; магнезиев сулфат хептахидрат 0.1-0.3; глюкоза, безводна 3 - 5; глицерол 5 - 7; агар1.5 - 1.8. pH се коригира в границите 6.3-6.5 и средата се стерилизира при температура 121 °C за 30 мин. От свежата култура се прехвърлят стерилно около 2 cm² от сланта на епруветката върху 30 ml посевна хранителна среда, със състав в тегловни проценти: бактопептон Difco 1.0-1.5; соево шротово брашно 2.0 - 2.5; натриев нитрат 0.2 - 0.4; магнезиев сулфат хептахидрат 0.1 - 0.3; глюкоза безводна 5 - 10. pH се коригира в границите 6.2-6.4 и средата се стерилизира при температура 121 °C за 30 мин. Процесът на култивиране протича при температура 24°С и непрекъснато разбъркване за време 48-72 часа.

От 7 до 12 обемни процента от посевния материал се добавят към ферментационна среда, съдържаща в тегловни проценти: източници на въглерод 15-25%, източници на органичен азот 3-5 % и минерални соли 0.1-1 %. pH на ферментационната хранителна среда се поддържа в границите 5.3-8.0. Вегетативната фаза може да бъде двустепенна. Ферментационният процес се провежда при температура 22-28°С и налягане 0.4-0.6 бара за период от време 260-300 часа.

Като източници на въглерод във ферментационната среда могат да се използват: глюкоза, захароза, глицерол и соево масло. Като източници на органичен азот могат да се използват: пептон, профло, соево шротово брашно, сухи дрожди, фармамедия Специфично за щам Penicillium citrinum НБПМКК 8359 е, че от хранителните субстрати усвоява по-добре глюкоза, пептон, соево шротово брашно и глицерол. Като минерални соли в състава на хранителната среда се използуват натриев нитрат и магнезиев сулфат.

ί

Ί ♦ · «· ·* ·· a· • · · » ····«· • · · · · · ··· · φ ·а • · ··· · · ·· « · · · ···· • · · · · · · · ·a ·· ·* ·· ··♦· ·

Предимство на метода е високият тигър на продукта в културалната среда на подобрения щам, в сравнение с родителския щам.

Пояснение на приложените фигури

Компактинът, получен по метода, обект на изобретението, е определен количествено чрез HPLC метод. Резултатите от анализа са показани, както следва:

1. На фиг.1 са показани резултатите от HPLC анализ на стандартен разтвор на компактин.

2. На фиг.2 са показани резултати от HPLC анализ на проба от културалната течност от изходния щам.

3. На фиг.З са показани резултатите от HPLC анализ на проба от културална течност компактин, получен по метода, описан в Пример 1.

Примери за изпълнение на изобретението

Изобретението се илюстрира със следните примери:

ПРИМЕР 1

Култура от щам Penicillium citrinum НБПМКК 8359, се развива 10-12 дни при температура 24°С върху епуветка скосен CSM агар със следния състав:

№	Компонент	Количество g/l
1.	Бактопептон Difco	15
2.	Соево шротово брашно	15
3.	Натриев нитрат	4
4.	Магнезиев сулфат, хептахидрат	3
5.	Глюкоза, кристална	45
6.	Глицерол	65
7.	Arap Difco	15
8.	Дестилирана вода	До1 I

·· · · · · · ·· •· ·· ·· ·· ··

От добре развита епруветка се прехвърлят около 2 cm² от сланта в 300 ml Ерленмайерова колба, съдържаща 30 ml посевна среда със следния състав:

№	Компонент	Количество, g/l
1.	Бактопептон Difco	15
2.	Соево шротово брашно	25
3.	Натриев нитрат	2
4.	Магнезиев сулфат, хептахидрат	3
5.	Глюкоза, кристална	80
6.	Дестилирана вода	До1 I

pH на посевната среда се коригира до 6.2±0.2 и се стерилизира 30 мин. при 121 °C. pH на средата след стерилизация е 6.0±0.2. Глюкозата се стерилизира отделно, след което се добавя към всяка колба преди посев. Развива се при 24°С на кръгова кпатачка 48-72 часа.

до 12 обемни процента от посевния материал се подават към ферментационна среда със следния състав:

№	Компонент	Количество, g/l
1.	Бактопептон Difco	15
2.	Соево шротово брашно	35
3.	Натриев нитрат	5
4.	Магнезиев сулфат хептахидрат	1
5.	Глюкоза, кристална	30
6.	Захароза, кристална	100
7.	Глицерол	100
8.	Дестилирана вода	До 11

pH на средата, включваща бактопептон Difco, соево шротово брашно, натриев нитрат, магнезиев сулфат хептахидрат, глюкоза кристална, се

• · · • · · · · • · коригира до 6.4±0.2, след което се разливат по 30 ml в Ерленмайерови колби от 300 ml, стерилизира се 30 мин. при 121 °C. pH на средата след стерилизация е 6.2±0.2. Захарозата и глицеролът се стерилизират отделно и се добавят към всяка колба преди посев. Ферментацията протича при 24°С на кръгова клатачка с 250 оборота в минута и 5 cm отклонение за 260300 часа. След завършване на ферментационният процес, всяка колба се анализира за качествено и полуколичествено съдържание на компактни по TLC метод, спрямо референтна субстанция. Колбите, показали най-висок добив се анализират за количествено съдържание на компактни по HPLC метод. Продуктивност - 5-7 д/1.

ПРИМЕР 2

Култура от щам Penicillium citrinum НБПМКК 8359, се развива 10-12 дни при температура 24°С върху епуветка скосен CSM агар със състав, посочен в Пример 1.

От добре развита епруветка се прехвърлят около 2 cm² от сланта в 500 ml Ерленмайерова колба, съдържаща 100 ml от посевна среда, със състав посочен в Пример 1.

Развива се при температура 24°С на кръгова клатачка 48-72 часа.

ml от развитата посевна култура се прехвърлят в 500 ml Ерленмайерова колба, съдържаща 100 ml от същата посевна среда. Развитието продължава при същите условия за около 46-60 часа. Така полученият посевен материал (1Г^ри вегетатив), а също и изготвен от него при същите условия ПГ™ вегетатив, си използува за посев на 50 I посевен апарат, съдържащ следната посевна среда .

№	Компонент	Количество, g/l
1.	Бактопептон	15
2.	Соево шротово брашно	25
3.	Натриев нитрат	2
4.	Магнезиев сулфат, хептахидрат	3

• · • · · · · · • ···· · ··· • ·· · · · ····· • · · · · · ·

5.	Глюкоза, кристална	80
6	Силикон	2
7.	Водопроводна вода	До 11

Култивирането се провежда при температура 24°С, аерация 1:1-1/1 /min, налягане 0.4-0.6 бара за време 48-68 часа. Готовият посевен материал има pH не по-ниско от 5.8 и биомаса не по-ниска от 18-20%.

до 12 обемни процента от посевния материал се подават към 50 I работен апарат със следната ферментационната среда:

N	Компонент	Количество, g/l
1.	Бактопептон	15
2.	Соево шротово брашно	35
3.	Натриев нитрат	5
4.	Магнезиев сулфат хептахидрат	1
5.	Глюкоза, кристална	110
6.	Глицерол	120
7.	Соево масло	25
8.	Силикон SAG	1.8
9.	Водопроводна вода	До 11

Средата се стерилизира при стандартни условия, след което се добавя отделно стерилизираният глюкозен разтвор; pH след стерилизация е 5.8±0.2. Култивирането се провежда при температура 24°С, аерация 0.5:1- l/l/min, налягане 0.4-0.6 бара за 260-300 часа. По време на ферментационния процес се контролират следните параметри: pH, ниво на глюкозата, запенването, разтвореният кислород и натрупването на биомаса. Образуването на компактина започва след 40 час и се следи по HPLC метод до края на ферментацията.

Натрупаният в края на процеса продукт е в количество 12-14 g/l.

Количественото съдържание на компактни се определя чрез следния HPLC метод:

За изготвяне на стандартен разтвор на октиламинна сол на компактни киселина се разтварят 0.010 g стандартна субстанция във 25 ml НгО. Резултатите от анализа на този разтвор по метод HPLC са показани на фигура 1. Използван е работен стандарт с активност 73%.

Кутуралната течност получена в резултат на ферментационния процес се разрежда 5 или 10 пъти (в зависимост от възрастта на културата) с фосфатен буфер с pH 12, бърка се на магнитна бъркалка 1 час, след което се филтрува през Millipor 0,45 μ. Полученият разтвор се хроматографира на колона Lichrosorb (Merck)RP- 8 /5 цт/125-4, при подвижна фаза .съдържаща 235 ml метилцианид, 365 ml вода, 0.45 ml ледена оцетна киселина и 0.45 ml триетиламид, скорост на потока 1.00 ml/min, детекция 238 nm и обем на въвеждане 20 μΙ. Резултатите от анализа на тази проба по метод HPLC са показани на фигура 2 и фигура 3.

Продуктът е доказан качествено чрез TLC метод, спрямо референтна субстанция при използване на сорбент хроматографски плаки Merck 5553, при подвижна фаза: дихлоретан: оцетна киселина=7:3, насищане на камерата около един час, разстояние на придвижване 15 cm.

Разтвори за нанасяне:

Разтвор 1: 5 ml културална течност се екстрахира с 25 ml етилацетат в продължение на 30 мин. На стартовата точка ”а” се нанасят от 15 до 20 μΙ в зависимост от очакваната активност.

Разтвор 2: от стандартизиран воден разтвор на компактин-киселина се прави разреждане до μο/μΙ. На стартова точка ”б” се нанасят 20 μΙ от стандартния разтвор.

Проявяване: след пълно отстраняване на разтворителите(2 мин. при 100°С). Плаката се напръсква с разтвор на бромфенолово синьо (0.1 g бромфенолово синьо се разтваря с 20 ml етанол и се довежда до 100 ml с дестилирана вода ). Нагрява се 5 мин. при 100°С.

• · · · • · · · • · · · · « · · • · · ·

Оценка: наблюдаваното основно петно над стартова точка ”а” трябва да бъде по Rf стойност,големина и интензитет еднакво с това над стартова точка ”б”. Rf стойността е 0.66.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1 .Ферментационен метод за получаване на компактен, включващ култивиране на щам-продуцент от вида Penicillium citrinum върху хранителна среда, съдържаща източници на въглерод, азот и минерални соли, характеризиращ се с това, че като щам-продуцент се използува Penicillium citrinum, регистриран в НБПМКК под номер 8359, а култивирането се провежда върху хранителна среда, съдържаща в тегловни проценти: глюкоза от 3 до 15; глицерол от 4 до 12; соево масло от 1 до 3; пептон от 1 до 1.5; соево шротово брашно от 3 до 5; натриев нитрат от 0.1 до 0.7; магнезиев сулфат от 0.05 до 0.5, в аеробни условия при температура 22© 28°С, налягане 0.4-0.6 бара и pH от 5.3 до 8.0.