CS249200B1 - Způsob izolace proteolytických enzymů - Google Patents

Abstract

Izolace se provádí adsorpcí proteinas na částice materiálu, který obsahuje vysoké množství nerozpustné bílkoviny keratinu, jako vlasy a rohovina. Eluce proteinas se provádí roztoky anorganických solí, například sírany a chloridy sodným, draselným nebo amonným, nebo změnou pH elučního roztoku.

Description

Vynález se týká způsobu izolace proteolytických enzymů.

Proteolytické enzymy se používají v nejrůznějších oblastech průmyslu, v medicíně i v biochemických laboratořích. Proteolytické enzymy se většinou z výchozích surovin izolují pomocí různých separačních technik, jako je srážení síranem amonným nebo vychlazenými organickými rozpouštědly, ionexová chromatografie, gelová chromatografie nebo afinitní c^hromatografie.

Z těchto technik je výhodná zejména afinitní chromatografie, která umožňuje získat velmi XXXXKK čisté preparáty proteinas v jednom kroku. Využívá se přitom specifických reverzibilních interakcí mezi ligandem, který bývá imobilizovén na vhodném inertním nosiči, a izolovanou proteinasou (Lowe,C.R., Dean,P.D.G.: Afinitní chromatografie, SNTL Praha, 1979, str. 154J Glemža,A.A.: Prikl. Biochim. Mikrobiol. J8, 792 (1982); Uf Vesa,V.l.: Prikl. Biochim. Mikrobiol. 16, 629 (1980)).

Příprava typických afinitních sorbentů bývá v mnoha pří·» pádech náročná, často je nutno použít několikastupňový proces pro aktivaci nosiče, jsou požadovány speciální chemikálie pro aktivaci apod.

-3 249 200

Způsob izolace proteolytických enzymů z komplexních směsí podle vynálezu spočívá v tom, že se proteinasy obsažené v rottoku adsorbují na materiál, obsahující vysoké množství nerozpustné bílkoviny UJDI keratinu, s výhodou na vlasy nebo na rohovinu. Jejich eluce se provádí roztoky anorganických solí, s výjimkou solí ovlivňujících enzymovou aktivitu, s výhodou sírany a chloridy sodnými, draselnými a amonnými, nebo je možno eluci provést·změnou pH elučního roztoku. Výhodou tohoto způsobu je použití velmi dostupné suroviny (v mnoha případech odpadu) a rovněž to, že uvedený materiál je možno pro izolaci připravit velmi jednoduchým způsobem.

Vynález je dokumentován příklady použití.

Příklad 1

Lidské vlasy byly umyty vlasovým šamponem, nastříhány na částice 2-3 mm dlouhé a poté byly suspendovány v horkém (60 °C) % roztoku hydroxidu sodného. Promytí v roztoku hydroxidu sodného bylo UnaumyilH několikrát opakováno. Poté byly vlasy důkladně promyty vodou. Takto připravený sorbent byl převeden do kolony, a byl důkladně promyt vodou, roztokem chloridu sodného (1 mol.l ) a opět vodou, dokud absorbance vodných a silných promyvů při 280 nm a tlouštce vrstvy 1 cm neklesla k nule.

(42.x «Οi*,)

X Na kolonu obsahující lidské vlasy bylo aplikováno 10 mg trypsinu pro bakteriologii rozpuštěného v 10 ml vody. Balastní bílkoviny byly z kolony vymyty vodou. Adsorbovaný trypsin byl z kolony eluován zvýšením iontové sily prostředí (elucí roztokem chloridu sodného, 1 mol.l“¹). Obsah bílkovin byl stanoven Lowryho metodou (Lowry,0.H., Rosebrough,N.J., Farr,A.L., Randall,R.J.: J; Biol. Chem. 193. 265 (1951)) a aktivita proteinasy byla stanovena azokaseinovou metodou (Šafařík,I.:

J. Chromatogr. 261. 138 (1983)).

Z celkově aplikované proteolytické aktivity se s balastními bílkovinami při eluci vodou vymylo 13,2 % aktivity, při eluci roztokem chloridu sodného se vymylo 60 % aktivity. Specifická aktivita trypsinu se po chromatografii zvýšila 2,1-krát.

249 200

Příklad 2

Za analogických podmínek jako v příkladu 1 bylá provedena chromatografie 10 ml kultivačního media po kultivaci Bacillus sp., který produkuje extracelulární proteinasy. Z celkově aplikované proteolytické aktivity ee s balastními bílkovinami při eluci vodoi vymylo 24,4 % aktivity, při eluci roztokem chloridu sodného XX (1 mol.l”^) se v celkovém objemu 130 ml vymylo 70,3 % aktivity. Specifické aktivita proteinas se po chromatografii zvýšila 15-krát.

Příklad 3

Částice rohoviny (průměr částic 0,3 - 1 mm) byly opakovaně promyty horkou a studenou vodou. Po naplnění do kolony byly promyty jako v příkladu 1.

Na sloupec částic rohoviny o rozměrech 140 x 12 mm bylo naneseno 10 ml kultivačního media po kultivaci Bacillus sp., jako v příkladu 2. ^{Z celkově} aplikované proteolytické aktivity se s balastními bílkovinami při eluci vodou vymylo 39 % aktivity, při eluci roztokem NaCl (1 mol.l“^) se v celkovém objemu 140 ml vymylo 58 % aktivity. Specifická aktivita proteinas ae po chromatografii zvýšila 35-krát.

Příklad 4

Za analogických podmínek jako v příkladu 1 byla provedena chromatografie trypsin^u. K eluci aktivní proteinasy bylo rovněž možno použít roztoky chloridu draselného a síranu amonného (1 mol.1 ).

Příklad 5

Za analogických podmínek jako v příkladu 3 byla provedena chromatografie extracelulárních bakteriálních proteinas.

K eluci aktivních proteinas bylo rovněž možno použít roztok kyseliny chlorovodíkové (cca 0^01 mol.l”^)

Příklad 6

Za analogických podmínek jako v příkladech t a 3 bylo rovněž možno izolovat proteinasy z pankreatického extraktu a přečistit komerční preparát chymotrypsinu.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT

   VYNÁLEZU

   249 200

   1.Způsob izolace proteolytických enzymů, vyznačující se tím, že se proteinasy obsažené v roztoku adsorbují na částice materiálu, který obsahuje vysoké, množství nerozpustné bílkoviny keratinu_#4s výhodou vlasy nebo rohovina^, jejich eluce se provádí roztoky anorganických so^í s výjimkou solí, které ovlivňují enzymovou aktivitu, s výhodou sírany a chloridy sodnými, SKiQE draselnými a amonnými, nebo je možno jejich eluci provést změnou pH elučního roztoku.