CS248897B1 - Způsob izolace proteolytických enzymů - Google Patents

Abstract

Izolace se provádí adsorpsí proteolytických enzymů na částice uhlí. Eluce proteinas se provádí roztoky anorganických solí, např. sírany a chloridy sodnými, draselnými a amonnými, nebo změnou pH elučního roztoku.

Description

Vynález se týká způsobu izolace proteolytických enzymů.

Proteolytické enzymy se ze směsí /např. živná média po kultivaci produkčních mikroorganismů, hrubé extrakty živočišných tkání nebo rostlinných pletiv apod./ mohou izolovat celou řadou metod, jako je např. srážení síranem amonným nebo vychlazenými organickými rozpouštědly, ultrafiltrací, ionexovou, gelovou a afinitní chromatografii a dalšími technikami. Pouze při použití afinitní chromatografie je možno získat výrazně přečištěné preparáty protelnas v jednom kroku.

Jako typické příklady izolacé protelnas afinitní chromatografii je možno uvést izolaci pepsinu na sloupci polylysin-Sepharosy 4B /Nevaldine, B., Kassell, B.: Biochim. Biophys.

Acta 250, 207 /1971//, izolaci pankreatického trypsinu na ovomukoid-Spheronu /Truková, J., Seifertová, A.: J. Chromatogr. 148, 293 /1978//, nebo izolaci protelnas z listů ovsa na hemoglobin-Sepharose /Drivdahl, R. H., Thimann, K.; Plant Physiol. 59, 1059 /1977//.

Typické afinitní sorbenty pro izolaci protelnas jsou připravovány imobilizací vhodných ligandů na nerozpustné nosiče. Přitom je často nutno použít několikastupňový proces pro aktivaci nosiče, jsou vyžadovány speciální chemikálie apod.

Způsob izolace proteolytických enzymů z komplexních směsí podle vynálezu spočívá v tom, že se proteinasy obsažené v roztoku adsorbují na částice uhlí. Jejich eluce se provádí roztoky anorganických solí, s výjimkou solí ovlivňujících enzymovou aktivitu, s výhodou sírany a chloridy sodnými, draselnými.a amonnými, nebo je možno eluci provést změnou pH, např. roztokem tetraboritanu dvojsodného nebo hydroxidu amonného.

K izolaci je možno použít jak kolonové, tak i vsádkové uspořádání. Výhodou tohoto způsobu je použití velmi dostupné suroviny /uhlí/ a. rovněž to, že uhlí je možno připravit pro izolaci velmi jednoduchým způsobem.

Vynález je dokumentován příklady použití.

Přikladl

Skleněná kolona byla naplněna částicemi hnědého uhlí o rozměrech 0,30-0,35 mm, rozptýlenými ve vodě, přičemž byl vytvořen sloupec o rozměrech 180 x 12 mm. Po naplnění byla kolona pranyta vodou, roztokem chloridu sodného /1 mol.-l^-1/ a opět vodou, dokud absorbance promyvů při 280 nm a tlouštce vrstvy 1 cm neklesly k nule. Poté bylo aplikováno 10 ml kultivačního média po kultivaci Bacillus sp., který produkuje extracelulární proteinasy.

Balastní bílkoviny byly z kolony vymyty vodou. Adsorbované proteinasy byly z kolony eluovány zvýšením iontové síly prostředí /elucí roztokem chloridu sodného, 1 mol.l ¹/.

Obsah bílkovin byl sledován Lowryho metodou /Lowry, 0. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. , Randall, R. J.: J. Biol. Chem. 193, 265 /1951// a aktivita protelnas azokaseinovou metodou /Šafařík, I.: J. Chromatogr. 261, 138 /1983//.

Z celkově aplikované proteolytické aktivity se s balastnimi bílkovinami při eluci . vodou vymylo 1,3 i aktivity, při eluci roztokem chloridu sodného se v celkovém objemu 130 ml vymylo 70,7 i aktivity. Specifická aktivita proteinas se po chromatografii zvýšila 51krát.

V

Příklad 2

Za analogických podmínek jako v příkladu 1 byla provedena chromatografie 30 mg amorfního trypsinu pro bakteriologii, rozpuštěného v 10 ml vody. Z celkově aplikované proteolytické aktivity se s balastnimi bílkovinami při eluci vodou vymylo 5 % aktivity, při eluci roztokem chloridu sodného /1 mol.I^-1/ se v celkovém objemu 130 ml vymylo 40 % aktivity. Specifická aktivita trypsinu se po chromatografii zvýšila 2,8krát.

Příklad 3

Za' analogických podmínek jako v příkladu 2 byly provedeny chromatografie trypsinu.

K eluci aktivní proteinasy bylo rovněž možno použít roztok chloridu draselného /1 mol.i^-1/ a síranu amonného /1 mol.l^-1/.

Příklad 4

Za analogických podmínek jako v příkladu 2 byly provedeny chromatografie trypsinu.

K eluci aktivní proteinasy bylo rovněž možno použít změny pH elučního roztoku, např. promytím sloupce 4% roztokem hydroxidu amonného nebo 4% roztokem tetraboritanu sodného.

Příklad 5

Částice uhlí byly před použitím suspendovány v roztoku bílkoviny /1% roztok kaseinu/ a poté důkladně promyty vodou, roztokem chloridu sodného /1 mol.l^-1/ a opět vodou, jako v příkladu 1. Byla provedena chromatografie trypsinu jako v příkladu 2. Výtěžnost proteinasy eluované roztokem NaCl /1 mol.l ¹/ byla o 10 až 20 % vyšší než v případě, kdy chromatografie probíhala na nemodifikovaném uhlí.

Příklad 6

Bylo smícháno 50 ml kultivačního média po kultivaci Bacillus sp., který produkuje extracelulární proteinasy, a 20 g jemně mletého uhlí ve 200 ml vody. Po 5 hodinové inkubaci byly částice uhlí odfiltrovány na Buchnerově nálevce a důkladně promyty vodou. Adsorbované proteinasy byly eluovány roztokem síranu amonného /1 mol-1^-1/. Výtěžnost proteolytické aktivity byla 50 %, specifická aktivita se zvýšila 40krát.

Claims (2)

1. Způsob izolace proteolytických enzymů, vyznačující se tím, že sé proteolytické enzymy obsažené v roztoku adsorbují na částice uhlí, jejich eluce se provádí roztoky anorganických solí s výjimkou solí, které ovlivňují enzymovou aktivitu, s výhodou sírany a chloridy sodnými, draselnými a amonnými, nebo se eluce provádí změnou pH elučního roztoku.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že částice uhlí jsou před použitím suspendovány v roztoku bílkoviny.