JP3071029B2 - リゾチームの精製回収方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細菌の細胞壁溶解酵素
であるリゾチームの精製回収方法に関する。

【０００２】リゾチームは細菌細胞壁のムコペプチドな
どに存在するN-アセチルムラミン酸(MurNAc)とN-アセチ
ルグルコサミン(GlcNAc)の間の結合を加水分解する酵素
である。動物、植物に広く分布しており、細菌細胞壁を
溶解し、細菌感染の防御に重要な役割を果している。特
に卵白由来のリゾチームは広く研究が行われ、アミノ酸
配列が決定され、遺伝子操作による大量生産なども試み
られている。卵白由来のリゾチームには抗炎症作用や抗
出血作用が確認されており、消炎酵素薬として市販され
ている。また風邪薬や目薬などにも配合されており、さ
らに育児用ミルクに配合されたりする。このほか食品の
保存に用いるなどの試みがなされている。卵白からのリ
ゾチームの回収として、塩析法とイオン交換ゲル法（吸
着法) の2 方法がしばしば用いられている。しかしこの
方法は卵白のように大量のリゾチームを含有する原料か
らの回収方法としては適してはいるが、細菌や細胞など
からリゾチームを回収する方法としては、その含有濃度
が低いため長時間とかなりの手間とを必要とする。

【０００３】このため、リゾチームに親和性を有する化
合物を用いたアフィニティークロマトグラフィが開発さ
れている。例えば、リゾチームの基質であるGlcNAC結合
を持つ化合物であるキチンを担体とした方法が検討され
ている。Imoto らはキチン粉末や、キチンをコーティン
グしたセルロース粉末を担体としたクロマトグラフィー
を開発している(Imoto,T. et.al. Agric. Biol. Chem.
vol.37, 465-470,1973同じく1191−1196,1973)。しかし
キチンを粉砕し粉末として使用した場合には、水とのな
じみも悪く、カラムに充填した際にも通液性等に問題が
あり、リゾチームの吸着量が低い。キチンコーティング
セルロースはキチンがセルロースの表面を覆っているた
め、吸着量も多くなく、またキチン自身がリゾチームの
基質であるため、繰り返しの使用や、長時間の使用では
分解されるという欠点を有していた。このため、キチン
を脱アセチル化したキトサンを多孔質粒状とした後、再
度アセチル化して、これをリゾチーム吸着用担体とする
方法が特開昭63-44884号公報に開示されている。しかし
この担体も架橋された担体であるが、アセチル化による
キチン骨格を有する物質を担体として使用する限り、リ
ゾチームによる分解を受けることが指摘されている。

【０００４】キチンの脱アセチル化物であるキトサンも
リゾチームに親和性を有することが知られている。Muzz
arelliらはキトサンを用いてリゾチームを精製する方法
を開発している(Muzzarelli et.al.,Biotechnology and
Bioengineering,vol.20,87-94,1978)。しかしこの方法
はキトサンに吸着されたリゾチームの活性回収が55％と
低く、またキトサン担体は滴下法により作成したゲル化
物であり、圧力に弱いなどの欠点を有している。

【０００５】

【解決しようとする課題】本発明者らはリゾチームの精
製方法について検討を進めた結果キトサンの架橋化物に
スルフォン基を導入した担体を用いることにより、リゾ
チームを特異的に吸着させることが可能であり、しかも
活性の殆どを高い回収率で回収することが可能であるこ
とを見出した。このような担体をリゾチームの精製に用
いることは、これまで試みられたことはなかった。従っ
て本発明は、キトサンの架橋化物にスルフォン基を導入
した担体を用い、高い回収率でリゾチームを精製回収す
る新規な方法を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、架橋型キトサ
ンの硫酸エステル化物にリゾチーム含有溶液を接触さ
せ、リゾチームを吸着させたのち、この吸着されたリゾ
チームを溶出することにより、リゾチームを精製回収す
ることにある。

【０００７】本発明で用いるキトサンの硫酸エステル化
物は、特開昭61-40337号公報に開示された方法で製造さ
れた多孔質粒状キトサンを架橋化、スルフォン化して作
られる。すなわち、平均分子量10,000〜230,000 の低分
子量キトサンを酢酸、ジクロル酢酸、蟻酸の単独若しく
は混合物の水溶液に溶解し、該溶液を塩基性溶液よりな
る凝固浴中に落下せしめて多孔質粒状キトサンを得る。
このような方法で得られた多孔質粒状キトサンを常温で
24時間ジカルボン酸誘導体と溶媒中で攪拌して架橋反応
をさせる。架橋剤としてはジカルボン酸誘導体である活
性エステル、例えばジ-P- ニトロフェニルエステル、ジ
-N- ヒドロキシスクシイミドエステル等もしくは酸クロ
ライド、酸ブロマイド等が用いられる。ジカルボンボン
酸としては、シュウ酸、アジピン酸、セパシン酸を用い
ることが好ましい。このようにして架橋された粒状化キ
トサンはキトパールの商品名で富士紡績より販売されて
いる。

【０００８】架橋化された粒状化キトサンは無水硫酸を
用いて硫酸エステル化することにより容易に硫酸基が導
入される。このようにして硫酸エステル化された架橋型
キトサンは、スルフォン化キトパールの商品名で富士紡
績株式会社より販売されており、容易に入手可能であ
る。

【０００９】多孔質粒状化担体に導入するスルフォン基
の量は、担体1ml 当たり10〜50μmol 好ましくは担体1m
l 当たり27〜50μmol に調整する必要がある。キチンは
リゾチームにより分解されるが、キトサンはリゾチーム
によって分解されないため、長期に安定である。また、
架橋化された担体は、強度が高く、高圧においても変形
しないため、大量の試料を高速度で処理するための、高
速液体クロマトグラフィー用担体として用いることがで
き、従来の担体の持つ欠点を解消することができる。架
橋型キトサンの硫酸エステル化物は、通常粒子径 0.1〜
0.5mm(42〜200 メッシュ) で使用することが取り扱い
上、推奨されるが、これ以上の粒子径であっても、これ
以下の粒子径であっても差し支えない。架橋型キトサン
の硫酸エステル化物は予め、pH4.0 〜10.0の緩衝液を用
いて洗浄、膨潤させておいたものを吸着用担体として使
用する。一般には、リゾチーム含有液と類似の条件であ
らかじめ前処理を行っておくことが好ましい。このよう
な前処理を行った担体に対し、リゾチーム含有液を接触
させる。架橋型キトサンの硫酸化物として市販のスルフ
ォン化キトパールを用いた場合、この市販担体は樹脂1m
l 当たり、20〜80mgの蛋白質を吸着することが確認され
ており、きわめて大量のサンプルを処理することができ
る。

【００１０】リゾチーム含有溶液としては、卵白、菌体
や細胞の抽出液、涙、尿、唾液、乳汁等が用いられる。
これらの試料は、卵白などは塩析処理など通常のリゾチ
ーム回収の際に行う前処理を行った後、また菌体や細胞
はホモジナイズ処理を行ったのち、pH4.0 〜10.0、特に
好ましくはpH6.0 〜8.0 に調整した後、バッチ式もしく
はカラム法により、担体と接触させリゾチームを吸着さ
せる。従来の担体では、リゾチームによる分解を受ける
ため、可能な限り低温で処理することが必要であった
が、本発明の方法では室温であってもなんら差し支えな
い。次いでpH7.0〜10.0に調整した50mM濃度グリシン−N
aOHもしくは50mM トリス−HCl 緩衝液により十分洗浄
を行い、リゾチーム以外のキトサン吸着蛋白質を溶出す
る。架橋型キトサンの硫酸化物に吸着されたリゾチーム
は非常に強固に吸着されており、通常用いる塩溶液では
溶出されないため、リゾチーム以外の蛋白質を、この洗
浄操作によりほぼ完全に除去できる。

【００１１】次いで、チオシアン酸塩を含むpH6.0 〜8.
0 の緩衝液で吸着リゾチームを溶出する。チオシアン酸
塩としては、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カ
リウムなどのチオシアン酸アルカリ金属塩を例示するこ
とができる。また、これ以外の塩であっても良い。チオ
シアン酸塩の濃度は 0.1〜5M、とくに好ましくは、3Mの
チオシアン酸ナトリウムを用いる。また必要により、エ
タノールを添加した溶出緩衝液を用いることができる。
エタノールの添加量は緩衝液に対し、20重量％程度が適
当である。溶出緩衝液にチオシアン酸アルカリ金属塩あ
るいはさらにこれにエタノールを添加することによりリ
ゾチームを高い回収率で回収することができる。溶出し
たリゾチーム含有画分は透析により、溶出に使用した塩
類を除くことができる。透析脱塩処理後、凍結乾燥によ
り、純粋なリゾチーム画分を回収することができる。

【００１２】以下に実施例を示し発明をさらに詳細に説
明する。

【実施例１】卵白リゾチームの精製 架橋型キトサンの硫酸エステル化物として市販のスルフ
ォン化キトパール( 富士紡績製・商品名) スルフォン基
35μmol/ml・ゲルを使用した。このキトパールを充填し
たカラム（φ0.5 ×5.0cm)をpH9.0 に調整した50mMグリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液により充分洗浄した。

【００１３】一方、上記緩衝液に市販リゾチーム（シグ
マ社製) を45,000IU/ml の濃度になるように溶解し、酵
素溶液を調製した。この酵素溶液1ml をカラムに負荷
し、次いで、溶解に用いた緩衝液で充分洗浄し、その後
次に示す溶出液で溶出した。溶出液は下記表１に示した
ように、(A) 1M KCl水溶液、(B) 2M NaCl を含む50mMグ
リシンNaOH緩衝液 pH9.0、(C) 3M NaSCNを含む50mMトリ
ス−HCl 緩衝液 pH8.0、(D) 3M NaSCN及び20％エタノー
ルを含む50mMトリス−HCl 緩衝液 pH8.0を用い、クロマ
トグラムを行った。カラムからの溶出流速は1ml/min と
し280nm の蛋白質の吸収を測定し、溶出画分を分取し
た。フラクションは1ml ずつ、採取し、リゾチーム活性
を測定し、リゾチーム活性を総計して回収量とした。リ
ゾチーム活性はOssermanらの方法(Osserman E.F. et.a
l.,J.Exp.Med.,vol.124,921-952,1966)に記載された菌
体混合寒天培地を用いたプレート法により検定した。

【００１４】リゾチームは全てカラムに吸着されたが、
溶出は塩濃度によって溶出量が異なり、上記(D) 3M NaS
CN及び20％エタノールを含む50mMトリス−HCl 緩衝液 p
H8.0を用いた場合に完全に回収できた。各溶出緩衝液に
よる回収結果を表１に示した。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【実施例２】卵白からのリゾチームの精製 鶏卵卵白をホモジナイザーを用いてホモジナイズし、5m
M 硫酸を加え、４倍に希釈した。ついで、pHを5.5 〜6.
5 に調整し、室温で一時間攪拌を行った。その後、４℃
の冷蔵庫中で一昼夜放置した後、1500rpm で1 時間遠心
し、沈殿を除去し、上清を回収した。この上清を0.22〜
0.45μm のメンブランフィルターで濾過を行った。架橋
型キトサンの硫酸エステル化物として市販のスルフォン
化キトパール（富士紡績製) スルフォン基35μmol/ml・
ゲルを使用した。このキトパールを充填したカラム（φ
0.5 ×5.0cm)をpH9.0 に調整した50mMグリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液により充分洗浄した。このカラムに上
記試料をpH9.0 に調整した後、10mlを負荷した。ついで
pH9.0 に調整した50mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液により充分洗浄した。その後 3M NaSCN 及び20％エタ
ノールを含む50mMトリス−HCl 緩衝液 pH8.0を溶出液と
して、1ml/min の溶出スピードで溶出を行った。溶出フ
ラクションは1ml ずつ分取し、各フラクションの蛋白質
量をプロテインアッセイキット( バイオラッド社製) を
用いて測定した。また280nm の吸光度をモニターした。
酵素活性は実施例1 と同様にプレート法により測定し
た。溶出曲線を図1 に示した。リゾチームは蛋白質の溶
出に一致し、単一ピークで回収された。また回収率を表
２に示した。

【００１７】

【表２】

【００１８】この結果にみられるように、一回のクロマ
トグラフィー操作により約73倍に濃縮された。また回収
率は84％に達した。比活性は結晶化した鶏卵卵白リゾチ
ームの活性 51300unit/mg に匹敵する高純度を達成し
た。この実施例で回収画分をSDS ポリアクリルアミド電
気泳動を行い、分子量の測定と純度の検定を行った。こ
の結果を図２に示した。図２にみられるように、回収画
分は、卵白リゾチーム標準品の分子量に一致し、単一の
バンドが検出された。また原料中に存在する他のバンド
は一切認められなかった。

【００１９】

【発明の効果】本発明の実施により、新規なリゾチーム
の精製回収方法が提供される。本発明の精製方法による
と一回のクロマトグラフィーにより、高純度のリゾチー
ムを高い回収率で得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】卵白中のリゾチームのクロマトグラムを示す。

【符号の説明】

○─○：リゾチーム活性を示す。 ●─●：蛋白質の280nm における吸収を示す。 （２）：その位置で洗浄から、3M NaSCN及び20％エタノ
ールを含む50mMトリス−HCl 緩衝液 pH8.0を溶出液とし
て溶出を行った点を示す。

【図２】実施例２で得た精製リゾチームのSDS 電気泳動
パターンを示す。

【符号の説明】

レーン１：分子量マーカーの電気泳動パターンを示す。
（上からホスホリラーゼ 分子量97,400、牛血清アルブ
ミン 分子量66,200、オボアルブミン 分子量42,700、
カルボニックアンヒドラーゼ 分子量31,000、大豆トリ
プシンインヒビター 分子量21,500及びα−ラクトアル
ブミン 分子量14,400である） レーン２：スルホン化キトパール溶出画分のSDS 電気泳
動パターンを示す。 レーン３：酸処理卵白遠心上清（１mg/ml)のSDS 電気泳
動パターンを示す。 レーン４：酸処理卵白遠心上清（10mg/ml)のSDS 電気泳
動パターンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−44884（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−53669（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リゾチーム含有溶液を架橋型キトサンの
   硫酸エステル化合物と接触させて、リゾチームを吸着さ
   せ、ついでこの吸着されたリゾチームを溶出することを
   特徴とするリゾチームの精製回収方法。
2. 【請求項２】 吸着されたリゾチームの溶出を 0.1〜5M
   のチオシアン酸アルカリ金属塩を含む緩衝液またはこれ
   にエタノールを添加した緩衝液を用いて行うことを特徴
   とする請求項１記載の精製回収方法。