CS241812B1 - Způsob izolace proteolytických enzymů - Google Patents

Abstract

Izolace podle vynálezu se provádí adsorpcí iproteas na částice čaje. Eluce .proteas se provádí roztoky anorganických solí, např. sírany a chloridy sodnými, draselnými nebo amonnými nebo změnou dH elučního roztoku.

Description

241812

Vynález; se 'týká 'způsobu izolace proteoly-tic-kých enzymů.

Proteoilytieké emzyiny je možno- ze směsí(najpř. .hrubé -extrakty živočišnýidh tkání aro-stlilnných pleti-v, živná média 'po kultivaciprodukčních mikroorganismů apo-d.) izolo-vat celou řadou metod, mezi nimiž význam-né místo zaujímají metody chromatografic-ké.

Kromě lo-nexové -a gelové chromatografiese stále více používá chromatografie aflnit-ní, která využívá specifických reverzibilnííchinterakcí mezi llgandem, který bývá imobi-lizován na vhodném inertním nerozpustnémnosiči, a izolovanou pro-teasou (Lowe, C. R.,Dean, P. D. G.: Afi-nitiní chroimato-grafie,SNTL Praha, 1979, str. 154; Vesa, V. S.:Prikll. Biochim. Mikrobiol. 16, 629 /1980/;Glemiža, A. A.: Prik.1, Biochim. Mikrobiol.18, 792 /19--82/].

Jako typické příklady je možno uvést izo-laci pepsinu na sloupci polylysin-Sepharosy4B (Nevaldine, B., Keisselil, B.: Biochim. Bio-phys. A-cta 250, 207 /19-71/ j, izolaci p-ankrea-tického trypsitau na evomukoid-Spheronu(Turková, J., Seifertová, A.: J. Ohromátogr.14,8, 293 /1978/), nebo izolaci 'proteas -z listůovsa na hemoglobiin-Seipharose (Drivdahil,R. H., Thimamn, K.: Plant. Physicl. 59, 1-059/1977/).

Typické afini-tní s-orbenty pro- izolaci pro-teas jsou připravovány imobilizací vhodnýchligandů na nerozpustné nosiče. Přitom jenutno často1 použit -několikastupňový procespro aktivaci nosiče, jsou v-yžadovány spe-ciální chemikálie apod.

Způsob -izolace proteoilyticlkýeh enzymů zk-omiplexnxích směsí podíle vynálezu spočíváv tom, že se ‘proteasy obsažené v roztokuadsorbují na částice čaje. Jejich eiluoe seprovádí roztoky anorganických solí, s výjim-kou solí ovlivňujících enzymovou aktivitu,s výhodou sírany a chloridy sodnými, dra-selnými a amonnými, nebo je možno eluciprovést změnou pH eluičního roztoku. Výhodou tohoto způsobu j,e použití velmidostupné suroviny (a to i ve formě odpadu,tj. po jejím primárním použití k přípravěnápoje), a rovněž to, že čaj je možno proizolaci proteas připravit velmi jednoduchýmzpůsobem.

Vynález je dokumentován příklady použi-tí. Příprava sorbentu Čaj (běžné druhy čaje získané z obchod-ní sítě) byli opakovaně povařein ve vodě,dokud se uvolňovaly hnědě zbarvené .látky,Čaj, který po intenzívním povaření neuvol-ňova’1 tyto barevné látky, byl převeden dokolony. Kolony byly dále promyty vodou,roztokem chloridu sodného nebo síranu a-monného (1 mol. I-1] a opět vodou, dokudabsorbantce vodných a solných promyvů při28-0 mm a tloušťce vrstvy 1 cm nebyla men-ší než 0,01. Příklad 1

Na kolonu s -částicemi čaje o rozměrech110 X 12 mm bylo aplikováno 10 ml mode-lového roztoku obsahujícího 10 mig trypsinua 100 mg enzymového hydrolyzátu kasetou.Baiast-ní bílkoviny byly z kolony vymyty vo-dou. Adsorbovaný trypsin byl z kolony eluo-ván zvýšením iontové s-íly (prostředí (elucíroztokem chloridu sodného, 1 mol.I-1).

Obsah bílkovin byl stanoven Lowryho me-todou (Lo-wiry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr,A. L., Randall, R. J.: Bio.1. Chem. 193, 2615/1951/j a aktivita proteasy byla stanovenaazokaseinovou metodou (Šafařík, I.: J. Chro-matogr. 261, 138 /1983/). Z celkově aplikované pr-oteolytické akti-vity se s balastními bílkovinami při elucivodou vymylo 17 % aktivity, při elu-ci roz-tokem chloridu sodnéih-o se v prvých 50 mlroztoku -vymylo 65 % aktivity a v celkovémobjemu 150 ml se roztokem NaCl vymylo81 % -z vnesené aktivity. Specifická aktivitatrypsinu se po chiromatografii zvýšila 18ikrát. Příklad 2

Za analogických podmínek jako v příkla-du 1 byla provedena chromatografie 10 mgtrypsinu pro bakteriologii (cca 7 let starýpreparát), rozpuštěného v 10 mil vody. Zcelkově aplikované proteoly-ti-cké aktivity seš balastními bílkovinami při eluici vodouvymylo 12 % aktivity, při eluci roztokemchloridu sodného (1 mol. I-1) se v -celko-vém -objemu 150 ml vymylo 85 %. Specific-ká aktivita trypsinu se po -chiromatografiizvýšila 2,2,krát. Příklad 3

Za analogických podmínek jako v příkla-du 1 (rozměr sloupce 200 X 12 mm) bylaprovedena izollace proteasy produkované doživného média kmenem Bacillus isjp., kterýbyl izolován z půdy. Po aplikaci 10 ml od-středěného kultivačního média byly b-alast-ní bílkoviny vymyty vodou a adsorbovanéproteasy roztokem síranu amonného (1 mol..I-1). Z -celkově aplikované proteoilytieké akti-vity se s balastními bílkovinami při etocfvodou vymylo 15 % aktivity, při eluci roz-tokem' síranu amonného se v> -celkovém ob-jemu 150 ml vymylo 77 % aktivity. Speci-fická aktivita piroteasy se po chromatogra-fii zvýšila eOtorát. P ř i fc 1 a d 4

Na sloupci čaje o rozměrech 20-0 X 12immbyla provedena -chromatografie kyselého vy-čeřeného hovězího p-ankreaticlkého extrak-tu. Extrakt by.l předem aplikací na kolonu24 hod dialyzován proti tekoucí vodě a po-

Claims (1)

1. 241312 té necháln 24 hod při laboratorní teplotě,aby byla umožněna konverze trypsinogenua chymotrypsinogenu na aktivní proteasy. Bylo aplikováno 6 m'l roztolkn, z celkoivěaplikované 'piroteolytické aktivity se s ba-lastními bílkoviínami při eluci vodou vymy-lo 10 % aktivity, při elu-ci roztokem NaC,l(1 moil.il-1) se v objemu 140 ml vymylo 02procent aktivity. Specifická aktivita proteasse po cihromatografii zvýšila 4krát. Příklad 5 Za analogických podmínek jako v příkla-du 1 byla provedena cihromatografie 400 mgtrypsinu v 50 mil vody pro určení kapacity pRedm Et Způsob izolace proteolytických enzymů,vyznačující se tím, že se proteasy obsaženév roztoku adsorbují na částice čaje, jejicheluce se provádí roztoky anorganických so-lí s výjimkou solí, které ovlivňují enzymo- sorbentu. Po eluci nenavázaného- trypsinua balastnícb bílkovin vodou byil adsorbova-ný trypsin eluován roztokem chloridu sod-ného (1 mol. I-1). Kapacita soťbentu je při-bližně 2 míg čistého trypsinu na 1 ml sor-bentu. Příklad 6 Za analogických podmínek jako v přípa-du 2, byly provedeny chroimatografie tryp-sinu. K eluci aktivní proteasy bylo rovněžmožno použít roztok chloridu draselného(1 mol.il-1) a roztok kyseliny chlorovodí-kové [cca 0,01 mol. I-1). vou aktivitu, s výhodou sírany a chloridysodnými, draselnými a amonnými nebo jemožno jejich elu-ci provést změn-ou pH eluč-ního roztoku.