CS243322B1 - Způsob izolace proteolytických enzymů - Google Patents

Abstract

Izolace podle řešení se provádí adsorbcí proteas na částice kávových zrn. Eluce proteas se provádí roztoky anorganických solí, např. sírany a chloridy sodným, draselným nebo amonným, nebo změnou pH elučního roztoku.

Description

Vynález se týká způsobu izolace proteolytických enzymů. Proteolytické enzymy našly široké uplatnění v mnoha odvětvích průmy..lj, v medicíně i v biochemických laboratořích.·

Tyto enzymy je možno z výchozích hrubých směsí /např. živná média po kultivaci produkčních mikroorganismů, extrakty živočišných tkání a rostlinných pletiv apod./ izolovat celou řadou metod, mezi nimiž významné místo zaujímají metody chromatografické.

Kromě ionexové a gelové chromatografie se stále více používá chromatografíe afinitní, která využívá specifických reverzibilních interakcí mezi ligandem, který bývá imobilizován na vhodném nerozpustném nosiči, a izolovanou proteasou /Lowe, C. R., Dean, P. D. G.: Afinitní chromátografie, SNTL Praha, 1979, str. 154; Glemža, A. A.: Pirkl. Biochim. Mikrobiol. 18, 792 /1982/; V. S.: Prikl. Biochim. Mikrobiol. 16, 629 /1980//.

Jako typické příklady je možno uvést izolaci pankreatického trypsinu na ovomukoid-Spheronu /Turková, J., Seifertová, A.: J. Chromatogr. 148, 293 /1978//, izolaci proteas z mouky ze sladované pšenice na sloupci hemoglobin-Sepharosy /chua, g. κ., Bushuk, w.: Biochim. Biophys. Res. Commun. 37, 545 /1969// nebo izolaci pepslnu na sloupci p.olylysin-Sepharosy 4B /Nevaldine, B., Kessel, B.: Biochim. Biophys. Acta 250, 207 /1971//.

Typické afinitní sorbenty pro izolaci proteas jsou připravovány imobilizaci vhodných ligandů na nerozpustné nosiče. Přitom je často nutné použít několikastupňový proces pro aktivaci nosiče, jsou vyžadovány speciální chemikálie apod.

Způsob izolace proteolytických enzymů z komplexních směsí podle vynálezu spočívá v tom, že se proteasy obsažené v roztoku adsorbují na částice kávových zrn. Jejich eluce se provádí roztoky anorganických solí, s výjimkou solí ovlivňujících enzymovou aktivitu, s výhodou sírany a chloridy sodnými, draselnými a amonnými, nebo je možno eluci provést změnou pH elučního roztoku.

Výhodou tohoto způsobu je použití velmi dostupné suroviny /a to i ve formě odpadu, tj. po jejím primárním použití k přípravě nápoje/ a rovněž to, že kávová zrna je možno pro izolaci proteas připravit velmi jednoduchým způsobem.

Vynález je dokumentován příklady použití.

Příprava sorbentu

Pražená kávová zrna /běžné druhy zrnkové kávy získané z obchodní sítě/ byla namleta na běžně používaných kávových mlýncích, částice kávových zrn byly opakovaně povařeny ve vodě, dokud se uvolňovaly hnědě zbarvené látky.

Částice kávových zrn, které po intenzívním povaření neuvolňovaly podstatné množství těchto barevných látek, byly převedeny do kolony. Kolony byly dále promyty vodou, roztokem chloridu sodného nebo síranu amonného /1 mol.I^-1/ a opět vodou, dokud absorbance vodných a solných promyvů při 280 nm a tloušňce vrstvy 1 cm nebyla menší než 0,01.

Příklad 1

Na kolonu s částicemi kávových zrn o rozměrech 150 x 12 mm bylo aplikováno 10 ml modelového roztoku obsahujícího 10 mg trypsinu a 100 mg enzymového hydrolyzátu kaseinu. Balastní bílkoviny byly z kolony vymyty vodou.

Adsorbovaný trypsin byl z kolony eluován zvýšením iontové síly prostředí /elucí roztokem síranu amonného, 1 mol.i^-1/. Obsah bílkovin byl stanoven Lowryho metodou /Lowry, 0. Η., Rosebrough, H. J., Earr, A. L., Randall, R. J.i J. Biol. CHem. Γ93, 265 /1951// a aktivita proteasy byla stanovena azokaseinovou metodou /Šafařík, I.: J. Cheomatogr. 261, 138 /1983//.

Z celkově aplikované proteolytické aktivity se s balastními bílkovinami při eluci vodou vymylo 2 % aktivity, při eluci roztokem síranu amonného se v prvých 136 ml roztoku vymylo 79 % aktivity. Specifická aktivita trypsinu.se po chromatografii zvýšila 9,3krát.

Příklad 2

Za analogických podmínek jako v příkladu l byla provedena chromatografie 10 mg komerčního preparátu chymotrypsinu, rozpuštěného v 10 ml vody. Z celkově aplikované proteolytické aktivity se s balastními bílkovinami při eluci vodou vymylo 3,6 % aktivity, při eluci roztokem chloridu sodného /1 mol.l^-1/ se v celkovém objemu 150 ml vymylo 70 % aktivity. Specifická aktivita chymotrypsinu se po chromatografii zvýšila 3krát.

Příklad 3

Za analogických podmínek jako v příkladu 1 byla provedena izolace proteasy produkované do živného media kmenem Bacillus sp., který byl izolován z půdy. Po aplikaci 10 ml odstředěného kultivačního média byly balastní bílkoviny vymyty vodou a adsorbované proteasy roztokem síranu amonného /1 mol.l^-1/.

Z celkově aplikované proteolytické aktivity se s balastními bílkovinami při eluci vodou vymylo 15 % aktivity, při eluci roztokem síranu amonného se v objemu 150 ml vymylo 75 % aktivity. Specifická aktivita proteasy se po chromatografii zvýšila 75krát.

Přikládá

Za analogických podmínek jako v příkladu 1 /rozměr sloupce 200 x 12 mm/ byla provedena chromatografie kyselého vyčeřeného hovězího pankreatického extraktu. Extrakt byl před aplikací na kolonu 24 hod dialyzován proti tekoucí vodě a poté nechán 24 hod při laboratorní teplotě, aby byla umožněna konverze trypslnogenu a chymotrypsinogenu na aktivní proteasy.

Bylo aplikováno 6 ml roztoku, z celkově aplikované proteolytické aktivity se s balastními bílkovinami při eluci vodou vymylo 12 % aktivity, při eluci chloridem sodným /1 mol.l^-1/ se v objemu 150 ml vymylo 79 % aktivity. Specifická aktivita proteas se po chromatografii zvýšila 4krát.

Příklad 5

Za analogických podmínek jako v příkladu 1 byla provedena chromatografie 400 mg trypsinu nebo 400 mg cymotrypsinu v 50 ml vody pro určení kapacity sorbentů. Po eluci nenavázané proteasy a balastních bílkovin vodou byl adsorbovaný trypsin a chymotrypsin· -eluován roztokem chloridu sodného /1 mol.l^-1/. Kapacita sorbentů je přibližně 2 mg trypsinu a: --3.-mg chymotrypsinu na 1 ml sorbentů.

Příklade

Za analogických podmínek jako v případu 2 byly provedeny chromatografie chymotrypsinu.

K eluci aktivní proteasy bylo rovněž možno použít roztok chloridu draselného /1 mol.l^-1/ a roztok kyseliny chlorovodíkové /cca 0,01 mol.l^-1/.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob izolace proteolytlckých enzymů, vyznačující se tím, že se proteasy obsažené v roztoku adsorbují na částice kávových zrn, jejich eluce se provádí roztoky anorganických solí s výjimkou soli, které ovlivňují enzymovou aktivitu, s výhodou sírany a chloridy sodnými, draselnými a amonnými, nebo je možno jejich eluci provést změnou pH elučního roztoku.