CS235292B1 - Způsob izolace proteolytických enzymů - Google Patents
Způsob izolace proteolytických enzymů Download PDFInfo
- Publication number
- CS235292B1 CS235292B1 CS57984A CS57984A CS235292B1 CS 235292 B1 CS235292 B1 CS 235292B1 CS 57984 A CS57984 A CS 57984A CS 57984 A CS57984 A CS 57984A CS 235292 B1 CS235292 B1 CS 235292B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- activity
- eluted
- proteases
- isolation
- proteolytic enzymes
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Izolace podle vynálezu se provádí adsorpcí proteas na dřevěné piliny. Eluce proteas se provádí roztoky anorganických solí, např. síranem a chloridem sodným, draselným nebo amonným.
Description
Vynález se týká způsobu izolace proteolytických enzymů»
Proteolytické enzymy se ze směsí /živná média p© kultivaci produkčních mikroorganismů, hrubé extrakty živočišných tkání neb© rostlinných pletiv a pod./ izolují celou řadou metod, např» srážením síranem amonným nebo vhodnými organickými rozpouštědly, ultrafiltrací, ionexovou, gelovou a afinitní chromatografií a dalšími technikami0 Významné místo mezi nimi zaujímá afinitní chromatografie, využívající specifických reverzibilních interakcí mezi ligandem (substrát, analog substrátu, inhibitor, protilátka), který bývá imobilizován na vhodném inertním nerozpustném nosiči, a izolovanou proteasou (Lowe,G.R., ^eanjP.D.G.: Afinitní chromatografie, SNTL Praha, 1979, str» 154$ Vesa,V.S.: Priklo 3iochim. Mikrobiol. 16, 629 (^980)^ Glemža,A.A.: Prikl. Biochim. Mikrebiolo 18, 792 (1982))«
Jako typické příklady je možno uvést izolaci pepsinu na sloupci polylysin-Sepharosy 43 (Nevaldin,3., Kessell,B.: Biochim. Biophys. Acta 290, 207 (1971)), izolaci proteas z mouky ze sladované pšenice na sllupči hemoglobin-Sepharosy (Ghua,
G.K., Bushuk,W.: Biochim. Biophys. Res. Commun. 37. 545 (1969)), izolaci pankreatického trypsinu na ovomukoid-Spheronu (Turková, J., Seifertová,A.: J. Ghromatogr. 148. 293 (1978)), nebo izolaci proteas z hovězí pankreatické šlávy na sloupci Sepharosy s navázaným inhibitorem trypsinu ze sojových bobů (Reeck,G.-R., Walsh,K.A., Neurath,H$: Biochemistry 10. 4690 (1971)).
Typické afinitní sorbenty pro izolaci proteas jsou připravovány imobilizaci vhodných ligandů na nerozpustné nosiče. Eři4* tom je nutno často použít několikastupňový proces pro aktivaci nosiče, jsou vyžadovány speciální chemikálie apod.
235 292
Způsob izolace proteolytichých enzymů z komplexních směsí podle vynálezu spočívá v tom, že proteasy obsažené v roztoku se absorbují na dřevěné piliny. Jejich eluce se provádí roztoky anorganických solí, s výjimkou solí ovlivňujících enzymovou aktivitu, s výhodou sírany a chloridy sodnými, draselnými a amonnými. K izolaci lze použít tradiční kolonové uspořádání. Výhodou tohoto způsobu izolace je jednoduchá příprava sorbentu z velmi dostupné suroviny (pilin).
Vynález je dokumentován příklady použití.
Příprava sorbentu
Dřevěné piliny (maximální rozměr částic byl 2 mml byly opakovaně promývány 2 -‘4 % roztokem hydroxidu sodného, vodou,
- 3 % roztokem kyseliny chlorovodíkové a opět vpdou, dokud se uvolňovalo hnědé barvivo» Poté byl sorbent rezsuspendován ve vodě a byly naplněny skleněné kolony» Kolony byly dále promývány vodou, roztokem chloridu sodného nebo síranu amonného (l.mol.l*1) a opěi vodou, dokud absorbance vodných a síranových promyvů při 280 nm a tlouštce vrstvy 1 cm nebyla menší než 0,01 až 0,03»
Příklad 1
Na kolonu z pilin borovice o rozměrech 170 x 12 mm bylo aplikován® 10 ml modelového vzorku obsahujícího 10 mg trypsinu a 100 mg enzymového hydrolyzátu kaseinu» Qalastní bílkoviny byly z kolšny vymyty vodou» Adsorbovaný trypsin byl z kolony eluován zvýšením iontové síly prostředí (elucí rožtokem síranu amonného, 1 molel“!). Obsah bílkovin byl sledován Lowryho metodou a aktivita proteasy azokaséinovou metodou za následujících podmínek stanovení: 1 ml 1 % roztoku azokaseinu ve fodfátovém pufru (0,2 mol.l“1) o pH 7,2 se smísí s 0,5 ml vzorku, po 30 min inkubace při 37 °C se přidá 1,5 ml 5 % kyseliny trichloroctové. Po odstředění sraženiny se měří absorbance supernatantu při 366 nm proti slepému vzorku. Linearita je zaručena do hodnoty absorbance 2.
Z celkově aplikované proteolytické aktivity se s balastními bílkovinami při eluci vodou vymylo 35,4 % aktivity, při eluci roztokem síranu amonného se v objemu 45 ml
- 3 235 292 vymyl© 47,1 % aktivity a v celkovém objemu 150 ml se roztokem síranu amonného vymyl© 53,3 % z vnesené aktivity. Specifická aktivita trypsinu se po chromatografii zvýšila 11,7-krát.
Příklad 2
Za analogických podmínek jak© v příkladu 1 (rozměr sloupce 150 x 12 mm) byla provedena chromatografie 10 mg trypsinu pro bakteriologii (cca 7 let starý preparát), rozpuštěného v 10 ml vody. Z celkově aplikované proteolytické aktivity se a balastními bílkovinami při eluci vodou vymylo 24,9 % aktivity, při eluci zoztokem síranu amonného se v celkovém objemu 145 ml vymyl© 80J3 %. Specifická aktivita trypsina se po chromatografii zvýšila 1,7-kráto
Příklad 3
Za analogických podmínek jako v příkladu 1 (rozměr sloupce 200 x 12 mm) byla provedena izolace proteasy produkované do živného media kmenem Bacillus sp·, který byl izolován z půdy.
Po aplikaci 10 ml kultivačního media byly balastní bílkoviny vymyty vodou a adsorbované proteasy roztokem síranu amonného (1 mol.l“!). Z celkově aplikované proteolytické aktivity sé s balastními bílkovinami vymylo 19,8 % aktivity, při eluci roztokem síranu amonného se v objemu 150 ml vymylo 65,1 % aktivity. Specifická aktivita proteasy se po chromatografii zvýšila 70-krát.
Příklad 4
Na sloupci pilin o rozměrech 200 x 12 mm byla provedena chromatografie kyselého vyčeřeného hovězího.pankreatického extraktu. Extrakt byl před aplikací na kolonu 24 hod dialyzován proti tekoucí vodě a poté nechán 24 hod při laboratorní teplotě, aby byla umožněna konverze trypsinogenu a chymotrypsinogenu na aktivní proteasy. Bylo aplikováno 6 ml roztoku, zocelkově aplikované proteolytické aktivity se s balastními bílkovinami při eluci vodou vymylo 9,5 % aktivity, při eluci roztokem NaCl (1 mol.l 1) se v objemu 130 ml vymylo 83,2 % aktivity. Specifická aktivita proteas se po chromatografii zvýšila čtyřikrát.
,/
Příklad 5
Pře izolaci proteasy produkované 3acillus ap. byly s úspě chem použity rovněž piliny smrkové a dubové a sluce byle možno dosáhnout roztoky chloridu sodného a chloridu drasolného (1 mol.l ).
Claims (1)
1. Způsob izolace pro tedy ti ckých enzymů* vyanočujloí ae tía, že se protoasy obsažené v roztoku adsorbuji na dřevěné piliny, jejich eluce se provádí roztoky anorganických solí s výjimkou solí, které ovlivňují enzymovou aktivitu, s výhodou sírany a chloridy sodnými, draselnými a amonnými*
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS57984A CS235292B1 (cs) | 1984-01-25 | 1984-01-25 | Způsob izolace proteolytických enzymů |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS57984A CS235292B1 (cs) | 1984-01-25 | 1984-01-25 | Způsob izolace proteolytických enzymů |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS235292B1 true CS235292B1 (cs) | 1985-05-15 |
Family
ID=5338125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS57984A CS235292B1 (cs) | 1984-01-25 | 1984-01-25 | Způsob izolace proteolytických enzymů |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS235292B1 (cs) |
-
1984
- 1984-01-25 CS CS57984A patent/CS235292B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lin et al. | Purification and characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain | |
| Redinbaugh et al. | Adaptation of the bicinchoninic acid protein assay for use with microtiter plates and sucrose gradient fractions | |
| Buonocore et al. | Stable, inducible thermoacidophilic alpha-amylase from Bacillus acidocaldarius | |
| Pike et al. | Partial purification and characterization of a phytochrome-degrading neutral protease from etiolated oat shoots | |
| US3649456A (en) | Separation of polypeptide substances with macroreticular resins | |
| Sebastian et al. | Purification and characterization of cutinase from a fluorescent Pseudomonas putida bacterial strain isolated from phyllosphere | |
| Sharma et al. | Purification of wheat germ amylase by precipitation | |
| Brümmer et al. | Preparation and Properties of Carrier‐Bound Enzymes | |
| Solomon et al. | Studies on adsorption of amyloglucosidase on ion‐exchange resins | |
| Planelles et al. | Purification and some properties of the secreted arginase of the lichen Evernia prunastri and its regulation by usnic acid | |
| Pangburn et al. | Affinity chromatography of thermolysin and of neutral proteases from B. subtilis | |
| Burger | Multiple forms of acidic endopeptidase from germinated barley | |
| Geller et al. | Modification of hepatic fructose 1, 6-diphosphatase activity by proteolytic enzymes and sulfhydryl reagents | |
| Murao et al. | Enzymes lytic against Pseudomonas aeruginosa produced by Bacillus subtilis YT-25 | |
| US4609625A (en) | Process for the production of modified proteins and product thereof | |
| CS235292B1 (cs) | Způsob izolace proteolytických enzymů | |
| US4806626A (en) | α-amylase inhibitor | |
| CA1177422A (en) | Process for preparing semisynthetic enzymes | |
| Wrobel et al. | Identification and partial characterization of high Mr neutral proteinases from 4-day germinated barley seed | |
| Pacaud | Purification of protease II from Escherichia coli by affinity chromatography and separation of two enzyme species from cells harvested at late log phase | |
| Sakiyama et al. | Performance of protease as a cleaning agent for stainless steel surfaces fouled with protein | |
| Tomomatsu et al. | Purification and properties of two enzymes hydrolyzing synthetic substrates, N-α-benzoyl-D, L-arginine p-nitroanilide and leucine p-nitroanilide, from pea seeds | |
| CS235405B1 (cs) | Způsob izolace proteolytických enzymů | |
| CS243322B1 (cs) | Způsob izolace proteolytických enzymů | |
| CS246696B1 (cs) | Způsob izolace proteolytických enzymů |