CS235405B1 - Způsob izolace proteolytických enzymů - Google Patents

Abstract

Izolace podle vynálezu ee provádí po- ■ocl ve vodS nerozpustného teraicky modifikovaného kaseinu. Eluce enzyaů ae provádí roztoky anorganických solí, například sírane· a chloride· sodný·, draselný· nebo aaonnýa. Teraická aodifikace kaseinu se provádí při 150 až 250 C po dobu 30 aS 180 ainut.

Description

Vynález ee týká způsobu Izolace proteolytických enzymů.

Proteolytické enzymy je mošno ze emisi ikolovat celou řadou metod. Významná mláto mezi nimi zaujímá afinitní chromatografií, využívající specifických reversibilnloh interakcí mezi ligandem (substrát, analog substrátu, inhibitor, protilátka), který bývá imobilizován na vhodném inertním nerozpustném nosiči, a Izolovanou proteázou (Veaa,

V.S.: Prikl. Biochim, Mikrobiol. 16. 629 (1980); Lowe, C.R., Beán, P.D.G.: Afinitní chromatografie, SNTL Praha, 1979, str. 154j.

Jako typické příklady je mošno uvést izolaci proteas z mouky ze sladované pšenice na sloupci hemoglobin-Sepharoay (Chua, G.K., Buahuk, ¥.: Biochim. Biophys. Rea. Commun.

37. 545 (1969)), izolaci hovězího tripsinu na sloupci ovomukoid-Sepharosy 2B (Preinstein, G. :'PEBS Lett. 2, 353 (1970)) nebo izolaci proteas z hovězí pankreatické šťávy na sloupci Sepharosy s navázaným inhibitorem trypsinu ze sojových bobů (Reeck, G. H., Walsh, K. A., Neurath, H.: Biochemistry £0, 4 690 (197D) .

V nékterých případech je mošno pro separaci specifických proteolytických enzymů použit nerozpustnou bílkovinu jako substrát, bez imobilizace na nosiS. Jedná ae např. o separaci kolagenázy z Clostridium histolyticum na nativních vláknech kolagenu. Kolagenáza ae poté uvolni odbouráním substrátu (Oallop, P.M., Seifter, S., Ueilman, X.:

J. Biol. Chem. 227. 891 (1957)).

Afinitní sorbenty pro izolaci proteáz jaou dosud připravovány Ímobilizaci vhodných ligandů na nerozpustné nosiče. Často je nutno použit nékolikaatupňový proces pro aktivaci nosiče, jsou vyžadovány apeciálnl chemikálie.

. · . .

Podstata spůsobu izolace proteolytických enzymů z komplexních sméaí podle vynálezu spočívá v tom, že ae izolace provádí pomoci ve vodé nerozpustného termicky modifikovaného kaseinu. Eluce ae provádí rozšoky anorganických soli, a výjimkou soli ovlivňujících enzymovou aktivitu, s výhodou sírany a chloridy sodnými, draselnými a amonnými. Termická modifikace kaseinu ee provádí při teploté 150 až 250 °C po dobu 30 až 180 min. K izolaci lze použit tradiční kolonové uspořádáni. Balil výhodou tohoto způsobu izšlace ja jednoduchá příprava afinitnlho sorbentů z velmi dostupné suroviny kaseinu jednoduchým způsobem.

Vynález je dokumentován příklady použití

Příprava sorbentů

Kasein podle Hammarstena (Lachema, ČSSR nebo Reanal, MLR), který je dodáván v granulované formé (průměr vétžiny granuli » 1 mm) byl bez jakékoliv úpravy zahřát v tenké vrstvi v horkovzdušném sterilátoru na teplotu 190 ^eC po dobu 30 až 180 minut, reap. na teplotu 230 °C po dobu 120 minut. Získaný tepelné modifikovaný kaaein (žluté až temné hnědé barvy, v závislosti na teploté a dobé záhřevul byl promýván 0,5 až 1% roztokem NaOH, vodou, roztokem zíránu amonného (1 mol/1) a opét vodou. Promýván! bylo nékolikrát opakováno, dokud absorbance vodných a síranových promyvů při 280 nm a tloušťce vrstvy 1 cm nebyla menši než 0,01 až 0,03.

Přiklad I

Skleněná kolona (130 x 18 ma) byla naplhšna připraveným sorbentem (zlákán při zahříváni kaseinu při teploté 230 °C po dobu 120 minut) rozptýleným ve vodé. Po naplnéní a ekvilibraci kolony bylo aplikováno 10 nl modelového vzorku (100 mg enzymového hydrae lyzátu kaseinu a 5 mg trypsinu v 10 nl vody). Balaatnl bílkoviny byly z kolony vymyty vodou. Adsorbovaná proteáza byla z kolony eluována zvýšením iontové sily'prostředí (alucl 1 M/NH^/gSop. Obsah bílkovin byl sladován Lowryho metodou a aktivita proteázy azokaeeinovou metodou za následujících podmínek stanovení: 1 ml 1% roztoku azokeseinu v 0,1 M fos>

řétovém pufru jpH 7,0 ee smísí a 0,5 al vzorku, po 30 minutách inkubace při 37 °C ae přidá

1,5 ml 5% kyseliny trichloroctové. Po odstředění ee měří absorbance při 366 nm proti srovnávacímu roztoku při tloušťce vrstvy 1 srn. Linearita je zaručena do hodnoty absorbance 2.

Z aplikované proteolytické aktivity se 75 eluovelo v prvých 90 m efluentu po změně elučních podmínek (elucí roztokem síranu amonného). S balastníai bílkovinami se vodeu eluovelo 13,4 'H> aktivity. Specifická aktivita ae po chromatografu zvýšila 10,6 x.

Přiklad 2

Za analogických podmínek jako v příkladu 1 byla provedená chromatografie 15 mg trypsinu (cca 5 let sterý preparát) rozpuštěného v 10 al vody. Z aplikovaná proteolytické aktivity ae 81,2 £ eluovalo v prvých 140 ml efluentu po započati eluce roztokem síXanu amonného. S balaetnlmi bílkovinami ae vodou eluovalo 10,6 % proteolytické aktivity. Specifická aktivita ae po chromatograf!i zvýšila 2,2 x.

Přikladl

Za analogických podmínek jako v příkladu 1 byla provedena chromatografie 700 mg trypsinu rozpuštěného v 50 ml vody pro určení kapacity připraveného aorbentu. Po eluci nenavázaného trypsinu a balastních bílkovin vodou byl adsorbovaný trypsin eluován roztokem síranu amonného. Kapacita sorbentů je přibližně 0,5 mg čistého trypsinu na 1 ml aorbentu.

Příkladě

Byla provedena chromatografie modelového vzorku (100 mg enzymového hydrolyzétu kaaeinu a 10 mg trypsinu v 10 ml vody) va skleněných kolonách naplněných různě tepelně modifikovaným kaaeinem (rozměr sloupce 200 x 10 mm). Jako aorbent byl použit kasein modifikovaný 30 min/190 °C, 60 min/190 °C, 90 min/190 *C, 180 min/190 °C, 120 min/230 °C,

180 min/,50 °C, 30 min/250 °C a 60 min/250 °C. Ve všech případech měla chromatografie analogický průběh, výtěžnost vnesené proteézové aktivity byla vyšší než 75 %. Specifická aktivita ae zvýšila 10 x až 15 x. Získané hodnoty jsou uvedeny v tabulce.

T a b u 1 k a 1

Vliv teploty a doby záhřevu kaseinu na výtěžnost vnesená proteolytické aktivity a vzrůst
specifické proteolytické aktivity	\
Teplota	Boba záhřevu		Výtěžnost	Vzrůst spec.
°C	min.	<·/	%	aktivity
150	180		76,3	11,0
190	30		77,7	10,8
190	60		76,8	10,3
190	90		77,0	11,2
190	180		78,3	12,0
230	120		88,6	14,6
250	30		79,2	13,1
250	. 60		77,9	12,8

235*05 *

P ří k 1 a d 5 - '

Ma koloně o rozměrech 200 x 10 u (použit kasein modifikovaný 180 ain/190 °C) byla provedena chromatografie kyselého vyčařanáho hovězího pankreatického extraktu. Extrakt byl před aplikací na kolonu 24 hod dialyzovén proti tekoucí vodovodní vodě a poté nechán 24 hod při laboratorní teplotě, aby byla uaoiněua konverze trypsinogenu a chymotrypainoganu na aktivní proteaay. Bylo aplikováno 10 ml roztoku, po eluci balastních bílkovin vodou byjy adsorbovaná proteaay eluovány roztokám NaCl (t mol/l). Z aplikovaná protaolytická aktivity se 70,6 X> eluovalo v prvých 154 ml afluantu po začátku eluce roztokám NaCl. S balaatnlmi bílkovinami sa vodou eluovalo 23,8 % proteolytlcká aktivity. Specifická aktivita ae po chromatografii zvýěila 2,75x.

Analogická výsledky byly dosaženy, jestliže byl k eluci použit roztok KC1 (1 mol/l).

Přikládá

Na koloně o rozměrech 210 x 12 mm (byl použit kasein modifikovaný 180 minut/190 °C) byla provedena chromatografie kultivačního mádla po kultivaci mikroorganismu Bacillua ap. (isolován z půdy), který do média produkuje axtracalulární proteolytlcká enzymy. Po odstředění buněk bylo na kolonu aplikováno 10 ml mádla. Po vymytí halaatních bílkovin vodou byly adsorbovaná proteaay eluovány 1 M NaCl. S balaatnlmi bílkovinami se při eluci vodou vymylo 16,6 k z celkově aplikovaně proteolytlcká aktivity, při eluci 1 M NaCl aa vymylo v celkovém objemu 1.50 ml 73,2 % aktivity. Specifická aktivita protaaa sa po chromatografii zvýěila 48 krát.

Claims (1)

1. Způsob izolace proteolytlckých enzymů, vyznačující sa tím, že aa izolace provádí pomocí ve vodě nerozpustného při teplotě 150 al 250 °C po dobu 30 až 180 minut termicky modifikovaného kaaeinu, sluce se provádí roztoky anorganických aalí a výjimkou solí, která ovlivňují enzymatickou aktivitu, a výhodou sírany a chloridy sodnými, draselnými naho amonnými.