CN87100708A - 具有免疫活性的乳清成分及其制取方法 - Google Patents

Abstract

将液体状的含有免疫活性免疫球蛋白(Ig)的乳清，通过可控制的一或二步超滤过程，制成一种干燥的、有免疫活性的、过滤制品。这种制品可作为天然初乳的代用品。口服这种过滤制品可增强各种动物(包括人类)的抵抗疾病的能力，并提高生长的速度。这种制品的免疫活性来源于其组成中含量明显增高的活性Ig及其它乳清免疫活性成分，这些成分的含量已大大高于液状乳清原料中的量，而在原料中这些活性成分的量只处于无免疫效能的浓度。

Description

本项发明涉及一种具有免疫活性的乳清成分及其制取方法。本申请是1986年1月13日提出的6/818，610号专利申请的延续;而后者又是1985年4月15日提出的美国专利申请6/723，612号的延续。上述申请中披露的内容包含在本文的参考文献中。

与大多数家畜一样，小牛出生时是没有免疫能力的。母畜（母亲）通过最初的乳腺分泌（称做初乳），在产后向幼畜传输被动免疫。初乳中具有免疫活性的高分子量蛋白质（称做免疫球蛋白，以下简称Ig）的水平会很快的降低。这些Ig分子具有抗体的性质，只有成年动物才能产生以增强动物对细菌、病毒或寄生虫感染的免疫力。可是在小牛出生时，它的血液中缺乏Ig。只有当它出生以后不久，从母畜初乳中消化与吸收一定数量与质量的Ig，才能使小牛的免疫系统具备有效的功能。

在天然的被动免疫传输机制中第一重要的因素关系到母畜初乳的特性。为了能有理想的被动免疫，母畜初乳中应含有适量的Ig，而且这种Ig中应具有对不同的病原体的特异性抗体，每一种特异性抗体还应有合适的浓度。如果母畜初乳中对某些重要的病原体的特异性抗体的浓度不够，则小牛只能由此得到对该几种病原体不充分的抗体，这样就会因此而形成对这几种病原体的免疫能力的缺陷。

天然被动免疫传输机制中的第二重要的因素是小牛的调整，即关系到初乳消化的量和时间。对于消化的量，以前的研究曾经指出，为了使吸收的Ig进入小牛循环系统达最大水平，被消化的初乳体积是有极限的。食入超过2升的初乳则不能有意义地增高小牛对Ig的吸收。而且，新生牛在一次喂食期间难以消化多于2升的液体。至于消化的时间，新生小牛肠道对大分子Ig的穿透性随出生后小肠细胞的成熟而迅速下降。这种已经被充分了解的天然的小肠的机制可以称作为“吸收的关键时期”，它的意思是指，只有在产后的一段很短的时期内小牛必须食入并吸收合适量的高质量的初乳，以达到其理想的被动免疫水平。虽然在产后24小时食入初乳还可能实现一定程度的免疫传输，再晚则初乳的食入对被动免疫已经没有什么效力了。理想的情况是，在产生后的前8个小时内摄入初乳。

实际上，相当数量的新生小牛或是吃不到合理数量与质量的初乳，或是不能在这个吸收的关键时期吃到初乳。结果所造成的免疫传输的失败表现为高死亡率、对疾病的易感性增加和生长速度减慢。

在出生时，小牛缺乏对疾病的免疫性的证据是血清抗体浓度低。大约在产后的6-12小时内，小牛摄入2升有合理的Ig浓度并对病原体有广泛特异性抗体的初乳。当大分子Ig，或抗体被肠道吸收时，血清抗体浓度会迅速上升。初乳摄入后的几个小时，初乳Ig分子经肠道进入小牛血流的过程即可完成。在以后的数天内，通过正常的系统更新，来源于母畜初乳的血清Ig逐渐降低。随后，小牛的免疫系统开始产生活性的Ig以取代逐渐降低的初乳来源的Ig。最后，小牛的免疫系统达到了能自身维持或生产活性Ig的能力，并从而保持了必要的恒定的血清Ig浓度。

以前的研究指出，血清的Ig浓度在20毫克/毫升的水平或高于此水平是理想的。具有这样的Ig浓度的小牛与只具有较低水平被动免疫的小牛相比，表现出死亡率明显降低，对疾病的抵抗力增高和生长速度加快。

理想的免疫传输与实际存在的自发进行的免疫传输相差甚远。食入的初乳量不够或是仅得到低Ig浓度的初乳造成被动免疫传输缺陷。如果这种被动免疫水平不足的小牛接触疾病（这种可能性是极大的）就会得病，需要付出昂贵的医疗费用，小牛也可能会死去或缺乏充分的生长能力。

因为产奶的牛被选择性的繁殖以取得最大的牛奶产量，对于牛奶场场主来说，这种被动免疫传输问题是特别实际的。在哺乳一开始，生产牛奶的母牛因其奶量大而很快地稀释了初乳中有限量的Ig分子。结果是，新生牛所食入的牛奶中Ig分子的浓度大大低于为了实现合适的被动免疫所需要的水平。因为典型的不爱争食的小牛在其吸收的关键时期仅能吃到相对少量的初乳，使在小牛肠道中的Ig分子的数目及可供吸收到血流中的Ig经常低到不合理的程度。结果造成被动免疫水平难于提供合适的对疾病的抵抗力。

为了与上述的免疫缺陷问题作斗争，有些有小奶牛的牛奶场主人为从一头母牛那里收集一些他们认为质量好的初乳并在吸收关键期强迫喂给新生小牛。这种费力的控制初乳喂食时间和量的方法，无法补偿初乳中Ig含量低或缺乏抗重要致病菌特异性抗体的困难。因为对于初乳中Ig浓度及抗体分布的测定只能用复杂的费时的实验室测定方法，这些牧场主无法判断他们耗时费力所得来的这些喂新生牛的初乳，是否能提供合适的被动免疫水平。

在众多的牛奶场中，另一种办法被用于控制初乳的摄入时间、Ig的质量及初乳中对病原体特异的抗体的分布。把一群母牛产后12小时内收集到的牛奶混合，然后将一定量的这种混合的“初乳”喂给每一头新生牛。但是因为牛奶场主无法控制混合“初乳”中的Ig的浓度及对病原体特异的抗体分布，这种费力的劳动仍是不能得到满意的结果。

另一种增强小牛对某一疾病抗性的有吸引力的方法是采用在产前对母牛用疫苗进行免疫。免疫的结果增高了血清中对这种病原体特异的抗体的浓度，并导致在初乳中也有较高的该种抗体。当小牛食入这样的初乳后增强了免疫力，但仅仅是针对上述选定的疾病。

在实验研究中，研究者们化验了初乳中Ig的浓度及对病原体特异的抗体的分布，并在吸收关键时期内令小牛食入一定量的初乳。证实了初乳的Ig水平与小牛的抗病能力、死亡率、生长速度之间有直接的相关。虽然这些实验室的测试大大增加了我们对动物天然被动免疫传输机制的了解，但他们并未提供一种控制初乳中Ig浓度和对病原体特异的抗体分布的方法，因此仍未解决上述的免疫传输问题。

由于无法控制被动免疫传输机制，给牛奶场主和其他人造成了重大的经济损失，这说明对一种能促进免疫传输机制的产品或方法有强烈的需求。

本发明的主要目的在于，利用初级分离罐将乳清底层的最低分子量部份与中层较高分子量部份和上层最高分子量部份分开，然后用二级分离罐将乳清中层部份与上层部份分离开，从而产生一种高度浓缩的具有免疫活性的产品。

本发明的另一主要目的在于，以两台分开的超滤分离罐完成乳清的分部分离。第一台分离罐将乳清的底层部份与中层及顶层的部份分开，并同时具有保证第二台分离罐能行使将乳清的中层与顶层分开的功能。

本发明的另一个主要目的在于，提供一种乳清的分部分离方法，它能使较高分子量的乳清蛋白与较低分子量的乳清蛋白分离，从而得到一种含量增高的较高分子量的免疫活性乳清蛋白。

本发明的另一个目的在于，提供一种由乳清中提取天然存在的Ig分子的方法，以生产一种高浓度的免疫活性产品，这种产品以后可以溶于液体中成为初乳的代用品或补充食品，这种产品的Ig浓度可控制，并已知其中所含有的对各种病原体抗体的分布和浓度。

本发明的另一个目的是，通过让新生牛在吸收关键时期内喂食免疫活性乳清制品，以控制天然被动免疫传输机制的方法，使新生牛对广谱病原体的每种抗体都能达到设想的浓度，而且无需依赖于食入天然的初乳。

本发明的另一个主要目的是，由乳清中制取上述的免疫活性物质，这种物质是低廉的牛奶场的付产品。

本发明的另一个目的是，应用市场上可供应并且在牛奶场中普遍使用的装备来制取上述的产品。

本发明的另一个目的在于，提供以合理的价格生产大量的上述乳清制品的方法。

本发明的另一个目的在于，对上述产品制成干粉状的制品，以便于能保存相当长的时间。

本发明还有一个目的在于，上述的制品可按小牛的需要（按照其大小）来投予，以提供被动免疫。

简而言之，本项发明包括从其主要部份的Ig分子是处于活性形式的乳清粗制品中，通过特定的可控超滤方法来制取一种干燥的、具有免疫活性的过滤产品。这种过滤产品的活性Ig浓度至少占固体量的大约7%，并同时具有其分子量高于或低于Ig的其它乳清免疫活性成分。虽然以前的看法坚持认为，新生牛所食入的初乳需每升含有40-50克Ig，才能实现理想的被动免疫并激活主动免疫系统，但本项发明所叙述的乳清过滤产品只需3.5克/升就能显现出完全有效地取代天然初乳的能力。本项发明所叙述的免疫活性过滤产品也被试用做食品添加剂，并证实当在一段时期内反复小量给药时，它能提高动物对疾病的抵抗力，并促进生长速度。因为这项过滤产品已被证实它的活性不仅对动物而且也针对人类的抗原，因此对人类可能会有很好应用前景，特别是做为新生儿的补充食品。

本项发明的产品生产，或是用一级超滤罐，或是将一级和二级超滤罐串连使用。一级超滤罐使用含有活性Ig及其它免疫活性成分的粗制乳清为原料生产一种初级产品，它保持了相对高分子量的乳清的中层及顶层部分，使大部分相对低分子量的乳清底层部分滤掉。初级的产品可在二级超滤罐中被进一步浓缩，得到一种二级产品，它保持住相当丰富的乳清顶部成分，这种成分中含有Ig及其它高分子量免疫活性物质，而将占一定百分比的较低分子量的中层部分滤掉。将二级产品干燥，以产生本项发明的干燥的免疫活性产品。全部操作及干燥过程都是在能保护Ig及其它免疫活性成分的免疫活性的条件下进行的。

一级超滤罐在非预期条件下操作，使乳清再成形，这样降低了乳清蛋白在二级罐超滤膜的较大的孔眼限制动态膜的倾向。对第二级超滤罐来说使用再成形的原料能使乳清的中层和顶层部分得以分级，因而在二级产品中得以实现Ig和其它高分子量免疫活性物质的浓度明显增高的结果。如果没有这种二阶段的操作程序，则在二级罐的超滤膜上很快形成动态膜，使乳清中的中层和顶层成分的分级无法进行。

发明之处将特别在申报的权利要求书中指出。但是，发明的操作及其目的和优点可参考下列详细的叙述，并同时参阅下列的图注来得到较好的了解。即：

图1：小牛食用天然初乳及食用本项发明所说的乳清制品后血清中Ig浓度的比较。

图2：操作流程图，说明改进了的超滤过程以产生高浓度Ig的过滤产品。

图3：操作流程图。说明一种综合的超滤/离子交换过程，以由乳清中分离免疫活性Ig。

图4：操作流程图。说明在图2中指出的从流路A中过滤的产品与在图3中指出的流路B离子交换单位中的高浓度Ig合并，产生一种具有高浓度Ig的混合物，这样的浓度大大高于仅用超滤方法所能得到的。

图5：示出乳清蛋白部份的组成

图6：流程图。说明液状乳清原料通过初级分离罐和二级分离罐的二个阶段操作。

为了较好地说明本项发明的优点及其在本领域中的贡献，下面较为详细地说明本发明产品及方法的较好实施。

像由奶场母牛这样的家畜分泌的牛奶中长期含有低浓度的Ig，这样的Ig当摄入后表现不出被动免疫的效应。本项发明关系到从乳清中提取和浓缩Ig的方法，操作是在小心控制的条件下进行的，以保护结构易损，对热敏感的Ig的免疫活性。所谓“免疫学活性”或“免疫上有活性”这样的术语与Ig分子相连系时，意味着Ig分子与抗原结合的能力。这种浓缩的、免疫上有活性的Ig分子可在产后喂给新生的小牛，或是做为初乳的代替品或是做为初乳的补充，以增强天然的免疫传输机制。本项发明认识到并且利用了Ig分子在牛奶中是最大的分子和在乳酪制造过程的乳清付产品中存在有少量的廉价的这种分子这样的事实。作为奶酪生产的付产品，全世界每年产生大约85，000，000公吨乳清，其中的大约34，000，000公吨未在经济上被利用。因此，在实施本项发明的过程中能以最低的成本利用乳清副产品，并且减轻处理废乳清的负担。

在常规的乳酪综合生产过程中，粗牛奶加工成凝乳，即初级的奶酪成分，和一种液状的乳清付产物。粗制的牛奶输入物中包含大约14%的固体。其中4%由蛋白质构成，包括高分子量的免疫活性Ig蛋白质和其它有免疫活性的乳清蛋白成份。牛奶中蛋白成份中的相当部分在奶酪制造过程中被沉淀出来形成酪蛋白。在乳清付产品中可能含大约6%的固体，其中的70%是乳糖，30%是蛋白质、矿物质及脂肪。这些残留的乳清蛋白一般形成乳白蛋白、乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白（Ig）和多肽的混合物。

在本项发明中所用的术语“乳清”包括二种成份：一是奶酪制造过程中形成的液状乳清付产品，二是已去掉酪蛋白的牛奶。

本项发明的目的是在小心控制的条件下处理粗制牛奶及其乳清付产品，以增加最终产品中Ig的浓度，而不像在粗制牛奶中那样仅有少量的、免疫学上无作用的Ig浓度。这项操作必须在小心控制的条件下进行，以避免Ig分子的免疫活性的明显降低。

现已有多种由乳清提取并制成干燥浓缩的蛋白产品的方法。这些蛋白提取物通常称作乳清蛋白浓缩物或“WPC”。在这类提取和浓缩蛋白的技术中主要关心的是保持WPC的食用性，如味道、嗅味、溶解度等等。虽然这些乳清和WPC提取技术可以生产有用的食品，但在这些方法中的粗牛奶、乳清和生产出的WPC都暴露在下列因素的影响下：1）过热（时间/温度）;2）过多的细菌;3）在操作中加入或由细菌中产生过多的酶的活力。

现在详细讨论能由粗牛奶中分离出Ig分子并生产出高度浓缩的免疫活性Ig的产品的方法步骤。

一批粗牛奶一般都得自生长在某一特定地理环境中的一群或数群奶牛场母牛。粗牛奶首先被施用瞬间的巴斯德灭菌，例如快速加热到160°F，在这一温度维持15-20秒钟，然后迅速降温。测试表明，在这样的瞬间巴斯德灭菌中，相对快的升温，在高温中仅保持短的时间及迅速地降温可合宜的将牛奶中的微生物活力控制在一定的水平上，而对牛奶中Ig的免疫活性无明显影响。

如果在操作中明显偏离了上述的瞬时巴斯德灭菌法的要点，就像其它通常所熟知的较长时间的巴斯德灭菌操作那样，牛奶中的Ig分子的免疫活性会出现明显降低或破坏，因此在操作本项发明所述的方法时需加以避免。

在某些情况下，在乳清加工中可再加以第二次瞬间巴斯德灭菌。这样的第二次巴斯德灭菌会导致Ig分子的免疫活性的降低，但仍可将免疫活性保持在有用的水平上。已经证实进行第三次瞬间巴斯德灭菌的结果将造成Ig分子的全部免疫活性破坏，因此在大部分情况下务必避免。在本项发明操作中于每次瞬间巴斯德灭菌后都需仔细测试Ig分子的免疫活性，以判定Ig的免疫活性是否仍保持着。这些测试的结果将提示巴斯德灭菌的步骤是否需要修正或限制。

巴斯德灭菌完成后，牛奶将被加入制造奶酪的引发剂，如乳酸杆菌。如同普通的奶酪加工过程一样，奶酪形成桶的温度被调到华氏86到90度，并维持二个小时，直到凝乳的形成达到设计的程度。此时，奶酪桶的温度提高到大约102°F，并将乳清排出，此过程通常需要30-45分钟。乳清付产品即刻移入约100°F的澄清器或分离器，在那里乳清付产物中的脂肪和酪蛋白颗粒成分将被分离。此时，澄清的乳清或被贮存于40°F以抑制细菌的生长，或立即移入一个超滤系统中，超滤过程中乳清被加热并维持在大约120°F-130°F。上述的操作参数可基本上保持Ig的免疫活性。在实施本项发明的操作时，上述的时间和温度必要时可改变，但需用下述的测试方法监测，以基本上能保持住Ig的免疫学活性。在奶酪制造过程中或超滤操作中，将乳清或乳清付产物始终保持在低于130°F的温度下是十分重要的。

超滤技术多年来用于从澄清的乳清中将较低分子量的非蛋白成分与各组较大分子量的蛋白分离开。本项发明中沿用了相似的超滤技术。温热的澄清乳清直接注入称作“UF1”的第一级超滤装置。具体说是UF1中所用的超滤膜可容许分子量低于大约10，000的分子穿过，但不让像蛋白质这样的较高分子量的分子通过。被超滤膜保留住的物质称作“保留物”，而对能穿过超滤膜的物质称之为“穿透物”。不希望要的低分子物质，如乳糖、矿物质和无机盐穿透过超滤膜在第一级超滤中随水一起从乳清付产物中除去。

当保留物或是反复通过一台单个的超滤装置，或是直接注入串连的第二台超滤装置后，保留物被浓缩成有较多的固体物质，表现出粘性增加，并在超滤膜上出现极化现象使膜失效。克服极化现象的方法是用水稀释保留物，令稀释的保留物作进一步的超滤，这样的操作称为透析过滤（diafiltration）。一系列的超滤步骤反复进行，直至保留物所含的固体中达到高浓度的蛋白质含量，最好能高到含70-80%的蛋白质。在这时，Ig分子在全部保留物蛋白质中的含量低于10%。因为在保留物中的Ig分子的最小分子量处于等于或高于160，000道尔顿的水平，又因为第二大的保留的蛋白质分子是血清白蛋白，它的分子量处于66，000道尔顿的水平，上述初步滤过分离的保留物可直接再通过一台或数台能让血清白蛋白和其它低分子量蛋白通过但不能让较大的Ig分子通过的超滤装置，就能明显增加保留物中的Ig浓度。具有这样能力的超滤膜在市场上是可以买到的。

虽然在上面的叙述中第一级超滤过程用切割分子量10，000的膜，第二级超滤用切割分子量100，000的膜，这种特定的切割水平仅是为了用做说明的目的。这项发明可在多种不同的方式下执行，或是反复利用一台单独的超滤装置并顺序采用有不同穿透能力的膜;或是利用有固定穿透能力或逐渐增加的穿透能力膜的一系列的超滤装置;或是仅利用一台具有穿透能力为大约66，000-160，000道尔顿的超滤装置。实际上，一台有100，000道尔顿穿透膜的超滤装置可以工作得颇为不错。基于上述对目的与操作的记叙，为了达到对大分子量Ig有满意的高浓度的浓缩，选择合宜的超滤装置和超滤操作是本项方法中基本的技巧之一。

在实际运用本项发明时，在各步操作中包括超滤步骤，保持Ig分子的免疫活性是至为重要的。方法是：合适的温度控制，最低的微生物活性，同时要小心控制和监测加热及巴斯德灭菌。在现有的奶酪加工厂和超滤工厂中，几乎无一注意到这些安全措施，结果造成它们所生产的WPC只能含有无免疫活性的Ig。

因为Ig分子免疫性质的丧失可能并不变更分子的大小和分子量，因此在实施本项发明中基本保持所有Ig分子的免疫活性是重要的。在加工过程中期望仅仅只有一小部分Ig分子在免疫上失活。新生牛摄入一份免疫学上无活性的Ig溶液无助于在它们的血液中形成有效的血清免疫活性Ig浓度。因此在实施本项发明的每一步中都要维持活性的Ig要显著高于非活性的Ig，以生产一种能够控制被动免疫传输的产品。

随后，产品用通常的冰冻干燥（低压冻干）法或喷雾干燥技术弄干。在多数情况下，喷雾干燥法较好，因为这种装置在一般的奶牛场中都有。同时，喷雾干燥效率高、速度快，并较冰冻干燥法来得便宜。最后形成的过滤产品可置室温下保存。

因为Ig的免疫活性易被过热所破坏，低温或冰冻则对其并无影响，因此从部分脱水的超滤保留物中用冰冻干燥装置脱水不会影响Ig的免疫活性。在喷雾干燥中，是另一种机制防止了Ig免疫活性的明显降低。虽然在喷雾干燥装置中部分脱水的保留物是在约300°F的温度下经受高速空气的吹动，可是Ig分子却由于水蒸发的吸热作用而保持在较低的温度下。总而言之，喷雾干燥与冰冻干燥相比更为经济，并可以用远为高速的方式生产出干燥的粉状WPC。

以前用部分干燥浓缩超滤保留物的技术来生产作为动物和人类食品的WPC时，经常将保留物在高温下置真空装置中6-8小时。虽然以这种方式真空干燥的WPC的嗅味和营养可能并未受影响，Ig的免疫活性则可完全被破坏了。因此在执行本项发明时，这类干燥技术是不能使用的。

在保留物被干燥以后，对干燥的粉状产品将被化验其所含Ig的免疫学性质，包括Ig中所含对病原体特异抗体的浓度和分布。由于在不同批产品中Ig分子是由不同批的含不同Ig分布与浓度的牛奶中制造的，应用本项发明所生产的各批产品中对病原体特异的抗体的相对浓度是不同的。实际上，每种最低可接受的抗体水平都要小心地测定，以保证对在产后一定时期内喂以一定量上述产品的小牛，至少在对某一特定疾病所获得的被动免疫能力上应该达到预计的水平。

对产品中病原体特异抗体活性的测量所用的测试方法称作“EIA”试验。这种测试方法记叙在一篇篇名为“用酶联免疫法定量测定牛对产气荚膜梭状芽胞杆菌B毒素产生的IgG、IgM和IgA抗体，I、为提高免疫力的被动传输而进行的预先免疫”的论文中。这篇论文发表在“兽医免疫学和免疫病理学”（Veterinary    Immunology    and    Immunopathology）第4卷（1983）579-591页，作者是W·A·Fleenor和G·H·Stott这篇论文包括在参考文献中。那篇论文中所讨论的EIA测定对在合适领域中有过基本训练的人来说是熟知的。

将EIA方法与辐射状免疫扩散（RID）试验合用能测量出在本项发明的操作中所造成免疫学上失活的Ig百分数。虽然RID可测出牛奶、乳清或过滤产品中Ig分子的数目，但无力区分免疫学上有活性与无活性的免疫球蛋白分子。

因此可对牛奶或乳清原料制品进行双重的分析：1）用EIA方法测定在原料中对一种或数种病原体特异的抗体的活性;2）用RID方法测定原料中Ig分子的总数。EIA结果除以RID结果所得到的第一组比例数代表了每一种被测试病原体特异抗体与原料中Ig分子总数之比，不论这种分子在免疫学上有无活性。

EIA和RID试验被以同样的方式用于过滤产品，EIA的测试结果除以RID的测试结果得到第二组比例数，代表了每一种被测试病原体特异抗体与过滤产品中Ig分子总数之比，不论这种分子在免疫学上有无活性。比较第一组与第二组中的各个比例数将示出每一种病原体特异抗体的相对浓度下降的百分比，这就代表了在应用本发明的加工过程中造成免疫失活的Ig分子的百分数。

因此，上述的EIA/RID联合测试方法代表了一种技术，用它可以判断在执行本项发明中基本上维持住了Ig分子的免疫活性。可对加工中的每一步及产品都施用这样的联合监测，以找出和排除造成Ig分子免疫活性不可接受地被降低的操作条件。一但加工过程标准化了的时候，可以考虑停止EIA/RID的联合测试，直至又出现免疫失活的问题。

一但整个加工过程的标准化已被确立，也可仅仅用EIA测试监测过滤产品中对病原体特异抗体的分布和浓度。如果发现有一种病原体特异抗体的浓度变化与整个加工过程引起的Ig免疫活性的降低有直接的比例关系，则可用此单一病原体特异抗体代替EIA/RID联合测试来监测免疫失活问题。

新生牛一般会碰到下列的病原菌，因此需要对下列病原体的被动免疫：

1、大肠杆菌

2、都柏林沙门氏菌

3、产气荚膜梭状芽胞杆菌，B型和C型

4、呜疽梭状芽胞杆菌（肖氏梭菌）

5、睡眠嗜血杆菌

6、Paraflueuza    3粘病毒

7、传染性牛鼻子宫颈炎（Rhinotracheitis）

8、鼠伤寒沙门氏菌

EIA或等效的测试程序可被选用来测试对某一类常见病原体特异抗体的出现和浓度。以商品规模执行本项发明时所选用的化验测试种类的范围取决于所选用方法的复杂性、重复性及价格，也取决于对某一特定病原体被动免疫所欲增高的水平。例如，在某些条件下测试程序可以修改或扩展，以测定像诸如巴斯德氏菌属、产气荚膜梭状杆菌D型、Rota病毒、冠状病毒等。

在将本项发明应用于商业规模时所用的化验手段一般都要选用在全过程质量控制中所拟定的一组病原体的抗体，以确定每批产品的合格程度。必要时可修改化验方法以适应不同的质量控制标准，例如地区的质量控制标准。

当使用过滤产品来控制小牛的被动免疫传输时，取一定量的本产品溶于液体中，如初乳、牛奶或水，形成1-2升Ig溶液。在吸收关键期将此Ig溶液喂给小牛，一般是产后12小时内，最好在产后2小时内。因为新生牛在最初的吸乳中最多吃入1-2升液体，因此需保证在溶液中有足够高的Ig浓度，以使有合适量的Ig分子进入小牛的血液从而达到最低血清有效Ig浓度。

市场研究指出，用户乐于用干燥形式药物喂给动物，而不是液体的药物。为迎合这种需求，本产品也可制成药片或胶囊。将产品装入一种两部分的明胶胶囊，可用一种方便的现存的技术，也避免了产品遇热。胶囊被小牛摄入后溶解并释出本产品。随后它会溶解在给药时同时被小牛食入的液体中，如水、牛奶或母牛的初乳中。Ig溶液中的Ig随之通过小牛肠道而被吸收。无论用固体或是液体的形式投予，本产品的剂量都是一样的。

已经得知，为了实现合适的被动免疫传输，至少要在小牛血清中Ig水平达到15毫克/毫升，最好20毫克/毫升，因此对一头通常是100磅的小牛必须要投予较高浓度的Ig溶液供它摄入。因为仅仅大约200克本产品可溶于一升初乳、牛奶或水中，又因为一头新生牛通常在一次喂食中仅能吸收一到二升液体，因此在产品中含Ig达到40-50%的产品将可使小牛血清中的Ig浓度达到通常被认可的水平。

现在对本项产品在控制病原体特异抗体的浓度和分布方面的适应性做详细的讨论。必要时，混合二批或多批干燥的免疫活性过滤产品来得到一种能符合质量控制标准的要求是有利的，此时往往单批的产品达不到要求。

应用更加复杂的过滤操作和超滤膜可去掉更多的非Ig分子，这样的超滤方法可以生产有高浓度的免疫活性的过滤产品，并因此而增加每一种病原体特异抗体的浓度。在多数情况下，通过高水平的超滤产生更为浓缩的产品往往可达到较低浓缩的产品达不到的质量标准。

既使不应用上述的混合技术，按照本发明所生产的过滤产品也可达到相对均匀的病原体特异抗体的浓度和分布，这是因为用于将牛奶加工成乳清Ig的原料来自一群大的、同一地区的母牛。虽然由一头母牛或是一小群母牛得到的牛奶可能缺乏必要的病原体特异抗体或是只具有较低的Ig浓度，本过滤产品则不会表现出这种来自个别牛奶样品的免疫不适应性。相反，由于它的均匀性，过滤产品可具有更多同样有用的免疫学性质。

作为应用本项发明产生高浓度免疫活性Ig过滤产品的直接结果，可导致大量其它的对天然被动免疫实施正相控制的技术，这对一个掌握了本项发明基本技术的人来说，显然因此而可以得到附加的技术及利益。

当本项发明的方法在某一选定设备中执行时，要用上述的化验来监测原料、中间产品及最终产物，以判定Ig的免疫活性是否已被基本保持住了。如果在加工过程的某一步骤中Ig的免疫活性被明显地降低或丧失了，需判定出其原因并加以排除。一般说来，免疫活性的丧失是由于温度过高，在某一给定温度持续的时间过长，微生物的活力过高或是由于过高的微生物酶活力而引起分子的破坏。

按本项发明所讨论的被动免疫机制主要与奶牛场奶牛有关。但是，其它的小牛和牛以外的家畜，只要它们也是通过摄入初乳样的乳腺分泌物实现对疾病的被动免疫者，也可从应用本项发明从中得到好处。这里之所以首先考虑到奶牛场小牛，是因为认识到在那里有普遍的免疫学问题，并因此而对牛奶场主造成严重的经济损失。

一项最近发表的研究提示牛的抗体，如抗旋转病毒的抗体，可能对人的旋转病毒株也有充分的活性，从而也可预防感染。如果进一步的研究能确实证实牛的抗体能预防选定的人类疾病，本项发明所叙及的免疫活性产品也可在人类被用于预防这些疾病。

下面详细讨论一些应用上述的乳清产品的实验结果。

例1

这项发明的加工过程基本按上述记叙的步骤执行。澄清的乳清在第一级有10，000道尔顿分子量超滤膜的超滤罐中加工成初级产品，它含35%蛋白质，其中5%为Ig。初级产品然后直接注入第二级超滤罐，第二级罐的超滤膜是100，000道尔顿。在超滤操作时，超滤装置和原料维持在室温下。进行反复的超滤和透析过滤。最后得到干燥的粉状二级产品，Ig浓度7%，总蛋白浓度约80%。

先有技术研究指出在产后短期内投予的初乳应含有足够量的Ig，使小牛血液中足以产生15毫克/毫升，最好20毫克/毫升或更高的浓度的Ig。这种只有7%Ig的过滤产品和它在牛奶中溶解后的最大Ig浓度远远达不到传统认为的在新生小牛可实现被动免疫传输的最低Ig浓度。但是用这样的产品对一组奶牛场小牛做了实验，研究是否这种乳清产品对控制和调节新生小牛的免疫系统有潜力，这些过滤产品首次实验的结果总结在表1中。

三十头新生小牛分为5组，每组6头。第3组中有一头小牛因为剪脐带时太靠近脐眼而出血死亡，因为这头小牛的死亡原因与实验无关，其死亡未列入到第三组的实验结果中去。

进行了特别的安排以保证在不让新生小牛有机会从其母畜吸取初乳的条件下取得它们。第1组新生牛在产后大约4小时喂给2升牛奶，然后在第一次喂食后的大约12小时时又第二次喂给2升牛奶。第1组小牛除从普通牛奶中得到无意义量的Ig外，得不到任何其它Ig。

第2组是对照组，在其产后的最初2次喂食中通过天然的初乳得到Ig。在本次实验中这2次喂食的时间都是相同的。

第3、4、5组小牛喂以乳清制品的Ig，生产的方式是通过上述的100，000道尔顿超滤膜装置。第3组接受2次喂食，每次2升牛奶。300克制品溶于2升牛奶中，共2次，故喂食了600克过滤产品。小牛共食入600克溶于牛奶中的乳清Ig，而每300克含7%Ig相当于在每次喂食中投予21克Ig，故二次42克。

第4组接受2次2升的牛奶，每次溶入100克过滤产品。每一次的Ig剂量为7克，共得到14克乳清Ig。

第5组在产后约4小时接受一次100克过滤产品溶于2升牛奶中。本组因而得到仅7克乳清Ig。

取血样的时间是：第一次喂食前，24小时以后，产后第五天，第十天和第二十天。每份血样化验其Ig总量，并测定6种在新生小牛中最常见的病原体特异抗体的活力。总Ig量用辐射状免疫扩散（RID）法测定，其中使用羊抗牛免疫球蛋白。病原体特异抗体活性用酶联免疫法（EIA）测定。进行2份测定，一份用羊抗牛免疫球蛋白，另一份用来自单克隆杂交瘤的小鼠抗牛免疫球蛋白。测试病原体的抗原使用商品疫苗。

在本实验中使用的新生小牛当它们出生时购自8家不同的奶牛场。11头由其中的一家，8头从第2家，其它的则来自剩下的6家。对本实验中所用的30头新生小牛尽可能施用相似的饲养和处理方法。

第1组中6头小牛中的4头在生后数天内死亡。因此用牛奶喂养的第1组与其它接受初乳或本产品的组之间差别十分明显。显然，第1组的小牛未能控制病原微生物通过小肠上皮进入体循环。而第2-5组似乎适当地控制住了这些病原微生物的传输。

血清学资料显示，第1组中的2头小牛在第一次喂食前已有低浓度的Ig（0.3和2∶3毫克/毫升）。这些Ig显然或是通过胎盘或是通过未察觉的吸食初乳得到的，这些Ig已可充分地保护这两头动物不让病原微生物在它们生命的第一个24小时内的传输，在那段时间内上皮细胞仍可将摄入物传入体循环。在以后的血清学样品中，这两头小牛显示产生了自身的抗体，表现为总血清Ig量的增加和病原体特异抗体的增加。而第1组中死去的4头小牛未表现出任何有抗体活性增加的证据。

第2组是对照组，这一组的小牛被喂以含有最高量Ig浓度的初乳，从多克隆和单克隆抗体测定中都显示有高水平的病原体特异抗体。每头小牛接受不同母牛的初乳，而且在多数情况下，有一头母牛不是来自该小牛的出生地。正如预期的，在喂食后24小时，所有第2组小牛的血清Ig浓度都是很高的（17-35毫克/毫升）。

第3组小牛得到总量为600克本产品，含有42克来自乳清的Ig。这些小牛吸收了充分量的Ig，并显示出血清Ig水平为3-4毫克/毫升，在产后24小时有明显的病原体特异抗体活力。第3组小牛中无死亡，发病也有限。

第4组小牛得到200克本产品，含有14克乳清Ig。这些小牛达到1-1.5毫克/毫升的血清Ig浓度。与第3组小牛相比，在产后24小时时第4组小牛的病原体特异抗体活性较低，在产后20天时Ig的产生和活性抗体数都较低，有较高的死亡率和发病率。第4组中的2头小牛于产后第5天死于严重腹泻和脱水。

第5组小牛喂以100克本产品，含Ig7克。这些小牛死亡率和发病率都很高。这些小牛得到的Ig量足以预防败血症或摄入的病原微生物的吸收，但很易染上腹泻及以后出现的呼吸道疾病。第5组的大多数小牛表现出慢性病态，其中的两头在早期死于营养疾患。第5组中有一头牛血清浓度达到1.2毫克/毫升，从产后24小时直到产后20天都表现出明显的病原体特异抗体浓度。

这些初步的实验结果证实，小牛的生长及对疾病的抗性取决于要吸收充分量的乳清Ig，以实现血清的Ig浓度至少要有1毫克/毫升，也取决于在产后第24小时时病原体特异抗体的形成程度。任何不能满足这一最低要求的小牛将易于染病，并可能形成一种慢性病态。

本次实验中的所有30头小牛在60天实验期内都每天给予仔细观察。对每头小牛都给以一项合并的主体/客体发病率得分。正如表Ⅰ第7行所示，第3组用本产品喂养的小牛发病率得分为80，明显超出第2组初乳喂养小牛的得分50。牛奶喂养小牛的发病率得分及第5组小牛的得分低于第2组初乳喂养组的得分。

在60天的实验完成后，小牛的死亡率、发病率和生长率都被加以仔细地评价。表Ⅰ中的发病率一项表明每一组相对的、长期的整体功能。正如表中所示的，接受42克乳清Ig的第3组小牛超过了第2组喂以初乳的小牛。这样的结果是令人惊奇并完全未预料到的，因为以前普遍认为必须食入充分量的Ig，以使血清Ig水平在产后短期内至小达到15毫克/毫升，最好要20毫克/毫升，才能得到合宜的被动免疫。事实上第2组喂初乳的小牛血清Ig水平达到以前预想的17-35毫克/毫升，并且具有满意的免疫系统功能。虽然喂给本产品的第3组小牛所达到的血清Ig浓度仅为3-4毫克/毫升，这比以前通常认为的最低需要低得多，这些小牛的免疫系统的功能却超过了初乳喂养组。

此外，按照本项发明所生产的乳清Ig可完善地执行由天然初乳所具有的三项不同的免疫学功能。首先，天然初乳能在上述的吸收关键期阻止病原菌进入小牛的体循环。在这个吸收关键时期内，新生小牛可通过肠壁上的上皮细胞将Ig及其它摄入物转入体循环内。如上所述，仅仅第一组中牛奶喂养的小牛出现症候并死于败血症，说明这一项免疫功能的完全失效。如列于表1中的实验结果所指出的，乳清制品甚至在低的Ig浓度，在吸收关键时期控制病原微生物通过小肠方面可以有与高浓度的天然初乳一样的效力。这项实验证实乳清来源的产品的确执行了这第一项免疫功能。

第二项免疫功能提供合宜数量的Ig以供小肠在吸收关键时期内将它们吸收入体内，以对新生畜提供有效的被动免疫，直至其主动免疫发生效能。在第3-5组中喂给小牛的乳清Ig总量仅是初乳中（第2组）所喂给的200-720克Ig的一部份。而且，第3组小牛仅喂给42克Ig，血清Ig水平也只达到3-4毫克/毫升，却在实验中所测试全部6种病原中，都得到了对其特异性抗体8-10倍的增高。再者，第3实验组中死亡率是零，发病率得分为80，而第2组初乳喂养组中发病率得分仅有50。第4组小牛仅得到了14克乳清Ig，但仅有二例死亡，存活者的发病也尚有限-可与第2组初乳喂养小牛的免疫能力相比较或更好一点。

第三项免疫功能关系到对小牛主动免疫功能的激活。新生小牛依靠其被动免疫直至其主动免疫系统有能力生产出合宜的、高水平的抗体活力。有效的被动免疫增强新生畜主动免疫系统发育的能力，因此对短期及长期的健康状况都有影响。如果新生喂给乳清产品后不能够实现合适的主动免疫系统的功能，那么这样的产品就不能做为天然初乳的代用品。例1中的实验清楚地证实，在第1组中，未通过胎盘或初乳得到Ig的四头小牛从出生到死亡未表现出任何病原体特异抗体的增高，但是初乳及乳清产品喂养组都激活了主动免疫系统。

例1的实验证实，接受了42克乳清Ig的第3组小牛的全部免疫功能高于喂给了2次最大体积的含高浓度天然初乳的第2组。对6种病原的抗体浓度，在初乳喂养小牛中都相应地显著高于本产品喂养组。因此，第3组用产品喂养的小牛的良好免疫功能似可认为，与取自各个母牛的初乳中的抗体相比，乳清产品中含有针对更为广泛的病原体的抗体。乳清的Ig来源于数以百计的母牛这一事实可以解释在乳清产品中的抗菌谱要比天然初乳中来得广泛这一现象。乳清产品中有广谱的免疫能力代表了本产品优于天然初乳的方面，并且提供了调节小牛免疫系统活性水平的方法和控制能被小牛的免疫系统有效地加以中和的病原菌谱的方法。因此，例1的实验证实乳清产品在功能上完全可做为天然初乳的代用品，能够：1）在新生阶段阻止病原微生物进入体循环;2）在传输被动免疫的有效性方面可与初乳相比较或更好一些;3）可在较早的阶段提供激活与增高广谱免疫活性的因子。

例2

第二次乳清过滤物试验分5组，每组10头小牛，如表2所示。在二级超滤罐中分别用120，000道尔顿螺旋超滤膜和100，000道尔顿中空纤维超滤膜，以产生不同批次含9%Ig的二级产物。与例1中相同的技术被用来生产这二批过滤物。第一组喂初乳的小牛作为对照，类似于例1中第二组小牛。例2实验中所有小牛均于产后4小时内喂食并在12小时后再喂食一次。本次试验在极为严峻的条件下进行，小牛要接触比通常情况下多得多的病原体。

第二组小牛喂食二次，每次150克溶解在牛奶中的本产品，总的乳清Ig为27克。如表2中最后一行所示，第二组小牛免疫系统的功能比第一组对照差得多。

在产后4小时内，第三组小牛给300克溶解在牛奶中的本产品，总的乳清Ig为27克。第二次喂2升天然初乳，含有200-720克初乳Ig。第三组小牛的免疫系统反应性在实验初期很好，但小牛长期的健康情况最终较对照组差。

第四组小牛喂食二次，每次300克溶解在牛奶中的本产品，总的乳清Ig为54克。第四组小牛的免疫系统功能很好，长期健康状况略差于对照组。

第五组小牛喂2次，每次300克溶解在牛奶中的本产品，总的乳清Ig为54克。第五组小牛的免疫系统功能很好，长期健康状况与对照组一样的好。

第二次实验的结果与第一次相类似。表2的资材指出：在严峻的条件下，54克乳清Ig能产生令人满意的免疫系统功能。接受54克乳清Ig的第五组小牛所达到的优良的免疫系统功能与第一次实验中接受42克乳清Ig的第三组小牛相同。

第二组小牛较差的免疫系统功能表明：2次每次只有13.5克乳清Ig的喂食不能达到将乳清Ig作为天然初乳代用品的水平。接受27克本产品，然后给初乳的第三组小牛，其免疫系统功能在严峻的条件下虽比对照组差，但在较为正常的条件下，27克的剂量却有可能是适当的。

例3

以不同于例1和例2实验的方式进行第三次实验，以试验本发明的乳清过滤物。第三次试验采用从单一牧群来的60头小牛，分成三组，每组20头。试验在相当有利的条件下进行。

在第三次实验中用了二种不同浓度的Ig。有100，000道尔顿中空纤维超滤膜的二级超滤罐，用于使含35%蛋白质的初级产品加工成含9%Ig的二级产品。在同样的二级超滤罐中，如延长初级产品的加工时间，则其产品Ig浓度达12%。小牛或喂300克9%Ig的产品，或喂227克12%Ig的产品，它们都溶解在1升牛奶中，这都能使每次喂食的乳清Ig总量为27克。实验结果列于表3。

表3

小牛    Ig来源    剂量    通过产品摄    长期健康状况

分组    入的总Ig

1    初乳    5×1升    -    对照组

喂6天

1升

1次    27克    与对照组

2    产品    300克，9%Ig    一样好

或227克，12%

Ig产品

1升

产品    1次（300克9%    27克    与对照组

3    然后初乳    或227克12%），    一样好

然后4×1升初

乳喂6天

第一组小牛产后四天中接受5次天然初乳，每次1升。这一组作为对照。第二组小牛接受27克溶解在1升牛奶中的乳清Ig。表3最后一行表明：第二组小牛的免疫系统功能像对照组一样，使小牛达到长期健康。

第三组小牛在产后初期接受27克溶解在1升牛奶中的乳清Ig，并在产后四天中又接受了4次天然初乳，每次1升。第三组小牛的免疫系统功能与对照组一样好，使小牛达到长期健康。

第三次实验表明：如果在产后短期内给27克乳清Ig产品，在较好的条件下免疫系统功能可能达到天然初乳所具有的水平。把本次实验的结果与例2实验中第二组小牛的结果对照时，表明在好的条件下，27克乳清Ig代表了Ig的有效治疗剂量，它能达到天然初乳所能达到的三个目标中的每一个目标。这与例2实验中第三组小牛在严峻条件下得到的结果一致，表明使免疫系统功能达到足够水平可能不一定需要给第二次初乳。事实上例1中第四组小牛只接受14克乳清Ig，此Ig水平所达到的免疫系统功能与用天然初乳所达到的水平可相比较，这表明根据现在发明的加工方法产生的乳清Ig至少应该给到大约14克。14克乳清Ig是最低水平，希望至少27克，这代表了在好的条件下使免疫系统达到与用天然初乳相似的水平的治疗有效剂量。在严峻条件下，为了使免疫系统功能相当或优于用高质量天然初乳所达到的水平，新生牛在产后头12小时内应摄入大约40-50克的治疗有效剂量的Ig。

虽然在表1、2、3中列的实验结果都以小牛摄入Ig的克量来表示，乳清Ig的重量与动物体重之比在评价产品对某一特定动物治疗有效剂量中是合适的参数。由于实际上上述各次实验中所用动物体重都在90-100磅之间，彼此之间没有明显差异，故表中未列出。

如果以对体重为100磅的小牛，25克乳清Ig为最小治疗有效剂量，40-50克为最适治疗有效剂量，以这样的概念来评价实验结果，那么按乳清Ig与动物体重比，对任何新生小牛至少应该给体重的0.055%，最好给0.09-0.10%的乳清Ig。此比例用于体重为125磅（56750克）的新生小牛，产后4小时内至少一次剂量应该给31克乳清Ig。根据上述表格中所列出的详细实验结果来决定其它产品的剂量、剂量分布和与天然初乳合并使用的量显然是本项技艺中的基本技巧之一。为了使小牛外的其它动物免疫系统功能达到与天然初乳相当的效果，治疗有效剂量可以根据例1、2、3中所叙的类型来测定。

显然，本发明的乳清产品既能作为天然初乳的补充物以提高Ig水平低的天然初乳中Ig的有效水平，又能作为经小牛或其它牛免疫系统最后达到广谱活性免疫力的来源。乳清产品同样可在连续小剂量服用的基础上用作小牛、成熟牛或任何其它动物，包括人的食品的补充物，以提供有免疫活性的免疫球蛋白和产品中其它免疫学活性的乳清成分，使之能攻击动物消化系统中存在的病原体。作为食品补充物可以用较少量的本产品，对100磅体着的动物每天大约2克或更少。

为了试验这个设想，用38头动物进行60天试验。19头饲养的小牛（体重大约300磅）作为对照组并接受定额的正常高蛋白饲养，其余19头小牛除了上述饲养外，每天给5-10克本产品，内含7%Ig。

在试验的头30天，喂本产品的小牛的日体重增加超过对照组。每天体重的增加比对照组多0.4磅，高16%。在试验的第二个30天中，喂产品的小牛每天体重增加超过对照组0.3磅。一般说喂本产品的小牛显出比对照组更健康，生长快，发病率低。这试验似可证明乳清产品可作为食品的补充物，对正在生长或成熟的动物有用。

用上述实验3中所叙述的含100，000道尔顿中空纤维超滤膜的二级超滤罐生产了一定量的乳清过滤产品。为了得到最大的Ig浓度，运用了再循环和透析过滤（diafiltration）。这个实验最后产生的过滤产品具有12%Ig。

参阅图2，此图详细记叙了在上述系统上略加改变的超滤系统。乳清、脂肪和酪蛋白原料在干酪加工的标准装置中澄清，得到脂肪、酪蛋白副产物和用于本发明的澄清的乳清原料。澄清的乳清然后直接通过巴氏消毒器进行第二次瞬间巴氏消毒，以破坏乳清中存在的细菌和粗制凝乳酶，前者是利用乳酸杆菌，后者是干酪制备过程中的试剂。进行第二次短时间瞬间巴氏消毒发现对澄清乳清中Ig分子的免疫学活性没有不好的影响。

巴氏灭菌的乳清然后直接进入超滤装置，超滤器中有一层或多层穿透1000-10000道尔顿的超滤膜。用上面所讲的100，000道尔顿超滤膜的经验表明，在超滤膜上迅速形成胶状物，降低了对100，000道尔顿以下物质的穿透能力。可穿透1000-10000道尔顿的超滤膜足以从乳清中去除水、乳糖和无机盐。在超滤保留物中残存的乳糖和无机盐在干燥时和喂新生小牛时不会产生不希望的副作用。

超滤时穿透的物质直接进入废物容器。超滤保留物包括大约80%蛋白质，其中Ig浓度是8%。这些保留物直接进入喷雾干燥器，制成干燥的过滤产品，它们含有8%经试验和证明有免疫学活性的Ig。这种乳清过滤产品然后包装和贮存起来，溶解在液体如牛奶或水中，并在上文所讲的关键吸收时期喂给新生牛。这种乳清Ig将具有广谱抗体，因为它们是来自不同地理分布、不同牧群的几百头奶牛牛乳的乳清副产物。

最初叙述并结合图2所描述的超滤过程能产生一种可作为初乳代用品的过滤产品，此产品被生产和销售、赢利。然而为了提高含乳清Ig的产品的商业价值，希望把剂量降到远远低于例1第三组小牛所需喂给的600克。因为从超滤过程得到干燥过滤产品中约80%是蛋白质，这些蛋白质作为食品具有很高经济价值，因此为了增加产品中Ig浓度而从中去除非Ig蛋白成分的过程将引起经济上的注意。如果这一过程能实现，那么非Ig蛋白能通过现有的商业渠道作为食物制品出售，从而降低了喂新生小牛的产品的制造价，使现在的发明更具实用性。

再参阅图2，3和4。超滤系统的输出物能与超滤或离子交换系统相连生产一种混合产品，它具有更高的Ig浓度而较小分子量蛋白质浓度并没有明显降低。随着混合产品中Ig浓度的提高，在给相应的乳清Ig时能明显地降低本产品所用的剂量，实际上由于避免使用大量无免疫活性的蛋白质而节省了开支。

使用这些不同的技术来生产初乳代用品，图2的超滤过程用来制备具有大约8%Ig的过滤产品。而当像图4所指出的，含8%Ig的流路A产品与含50%Ig的流路B的离子交换产品混合，使乳清产品达到相当高的Ig浓度。

参阅图3，本图详细叙述了为了产生含50%Ig的产品，流路B结合了超滤和离子交换过程。图3的过程利用与图2超滤系统中所用相同的乳清、脂肪和酪蛋白原料。如图3中所示离子交换Ig分离可放在与图2的超滤系统所在的同一位置进行，或在不同的干酪生产厂进行。

原料被澄清以除去脂肪和酪蛋白，澄清的乳清直接通过第二次瞬间巴氏消毒步骤，就像图2超滤系统中的那样。

澄清乳清的超滤是用有1000-10000道尔顿超滤膜的超滤单元进行，产生含37%蛋白质的保留物。超滤穿透物直接进入废液单元。用这种超滤过程可能要用透析超滤从保留物中除去盐，使它的电导率降到接近零，在2-3毫姆水平。电导率超过这个水平时，说明离子交换仪已无效。另一些技术，如电渗析也可以用来脱盐。

含37%蛋白质的保留物直接进入离子交换单元，这样的离子交换单元对在这一相应领域中有基本训练的人来说是熟知的。这种离子交换单元能构成阳离子或阴离子提取的模式。现在为了经济上的原因，首选的是阳离子模式。

离子交换单元能从乳清蛋白超滤保留物中分离出带电荷不同于大部分非Ig蛋白的Ig蛋白。当用阳离子交换系统在PH值略低于正常乳清PH值（PH6.2）时操作，离子交换单元的柱床吸附Ig蛋白和另一些蛋白（50%Ig蛋白和50%其它蛋白）。当洗脱离子交换柱床时，离子交换产品中大约含有50%Ig和50%非Ig蛋白。

当离子交换单元以阴离子模式操作，在PH6.2时非Ig蛋白结合到离子交换柱上，带相反电荷的Ig蛋白不结合而直接通过柱。这个阴离子过程同样产生大约50%Ig浓度的产品。

阳离子和阴离子交换单元的特殊构造列在下面的例4和例5中：

例4

用阳离子交换纯化Ig，所用的阳离子交换材料如S-Sepharose（Pharmacia）用10mM醋酸缓冲液PH4.5-6.0，即5.0平衡。脱盐的乳清蛋白溶液，电导2毫姆（2ms），PH调到5.0，加到S-Sepharose凝胶中，约每毫升凝胶2-500毫克，例如4毫升50毫克/毫升的乳清蛋白溶液，与2毫升凝胶混合或通过2毫升的柱。乳清蛋白溶液中大约50%或更多的Ig结合到凝胶上。未结合的蛋白质用10mM醋酸缓冲液PH5.0或用水（5毫升对2毫升胶）洗出来。用高盐（100mM    NaCl配在10mM醋酸缓冲液中）或高PH（8.0）洗脱Ig，例如100mM磷酸二钠或碳酸铵。2毫升胶用5毫升洗脱缓冲液是合适的。

例5

阴离子交换是通过结合非Ig蛋白而纯化Ig。阴离子交换凝胶如Q-Sepharose或Amicon-AM凝胶用10mM    PH7.5磷酸缓冲液平衡。低盐（2ms）的乳清蛋白溶液被调到PH7.5并且与阴离子交换凝胶混合（100毫克蛋白/毫升凝胶）。收集未结合的蛋白，它们是富集Ig的蛋白（80%以上是Ig）。

参阅图4，通过图2过程流路A得到的8%Ig产品与图3流路B离子交换Ig分离过程产生的50%Ig浓度的离子交换产品混合。当流路A8%产品与流路B50%Ig浓度的产品以某种比例混合时，得到的产物具有的Ig浓度在8%-50%之间。

现在出于经济上的考虑，为了降低对非Ig蛋白成分的花费，建议产品使用剂量不超过300克。

上述表中的实验结果指出：一次用含40克免疫活性乳清Ig的产品就能使免疫系统功能达到高水平。如果238克流路A的8%产品（8%×238克＝19克Ig）与42克从流路B来的50%Ig（50%×42克＝21克）混合，那末280克就含有40克乳清Ig。总量280克中含40克Ig代表14%Ig浓度。

由于流路A超滤产物被过滤到8%Ig浓度，在全部280克剂量的238克成分中基本没有除去非Ig蛋白。由于流路A超滤保留物具有的最大蛋白浓度是8%，保留物中的大约20%是乳糖和无机物。试验指出，这种含量相对较低的乳糖和无机盐不影响新生小牛，也不引起腹泻。

图3表明，从离子交换单元第二出口得到的残留物大约有35%蛋白质。选择这样的蛋白浓度是因为这是食品市场所用标准的、商业上可接受的蛋白浓度。35%蛋白的制品通过蒸发器和喷雾干燥器，最后包装并再销售到现有的食品市场上。

出售无免疫活性的蛋白质制品实际上是一个成本回收过程，明显降低混合物的成本，混合物是由流路A低浓度Ig产品与流路B高浓度Ig产品混合得到的浓缩Ig产品。

混合的乳清产品被包装并投放市场。为了将此产品喂给新生小牛，可将其溶入大约1-2升的牛奶中，并按上述方式喂给新生牛。

根据上述表格所列出的实验结果，混合产品应该至少含25克Ig，作为体重100磅的新生牛在好的条件下的初乳代用品。对体重不是100磅的新生牛应该按Ig重量/体重比为0.055计算。为了使免疫系统功能相当于或优于天然初乳，应该在产后12小时内给新生牛40-50克Ig（0.09%-0.10%）。

正如用直接超滤产品的场合一样，混合Ig产品同样可用作初乳的补充物而不是初乳的替代物。此外，混合产品可以作为免疫活性食品的补充物。虽然流路A产品与流路B产品的特定比例已在上面讲了，很容易根据上面详细的记述使流路A和流路B按多种比例使混合制品中达到不同的Ig水平。根据混合Ig产品的特殊应用以及经济、成本因素决定与流路B混合的流路A的量。

为了比较喂正常量天然初乳小牛的免疫系统功能与喂相对低量的现在发明的乳清产物的小牛免疫系统功能，对初乳产品原料和小牛血清的免疫学特性进行了广泛的研究。这些试验的主要目的是鉴定和定量出引起表Ⅰ-Ⅲ中所列结果的乳清产品中的免疫活性成分。

表4是将例1中第二级产品与例1中的初乳和牛奶原料中所存在的对某些病原体特异的抗体比较的ELISA试验数据。表4证明：普通的牛奶与初乳相比对病原体特异的抗体数量很少，但二级产品中病原体特异抗体水平则超过初乳2-20倍。因此表4的数据证明与天然初乳相比，乳清产品中免疫活性成分有可能大大提高。

表4

例1-不同饲料的抗体滴度

微生物    二级产品    初乳    牛奶

传染性牛鼻子宫颈炎    400    200    ＜10

B·abortus流产杆菌    4000    200    12

产气荚膜梭菌    5500    350    32

大肠杆菌    4000    1250    60

睡眠嗜血杆菌    3200    180    24

都伯林沙门氏菌    2300    450    16

表5列出了产后第5天和第10天例1中小牛血清抗体滴度的平均ELISA数据：第一组小牛喂牛奶，第二组喂初乳，第三组喂本产品。

表5    例1-小牛血清抗体滴度

EIA-5天    EIA-10天

微生物    第一组    第二组    第三组    第一组    第二组    第三组

喂牛奶    喂初乳    喂产品    喂牛奶    喂初乳    喂产品

传染性牛鼻子

＜5    16    15    ＜5    5    16

宫颈炎

B·abortus

流产杆菌    ＜5    80    16    ＜5    20    21

产气荚膜梭菌    ＜5    95    34    ＜5    5    30

大肠杆菌    ＜5    230    52    ＜5    23    60

睡眠嗜血杆菌    ＜5    40    60    ＜5    5    16

都伯林沙门氏    ＜5    270    76    ＜5    20    30

菌

表5材料证明：第一组喂牛奶的小牛在产后5天和10天其免疫系统基本没有活性。第二组喂初乳的小牛在产后第五天明显出现血清抗体，而产后第十天主要由于来源于初乳的免疫活性成分耗尽而使抗体水平下降。第三组喂本产品的小牛，产后第五天虽然血清抗体滴度相当于或低于第二组喂初乳的小牛，但产后10天第三组喂本产品的小牛血清抗体滴度却超过了第二组喂初乳的小牛。因此表5证明现在发明的乳清产品具有很好地激活新生牛免疫系统的能力。表5中记叙的引起免疫系统功能优势的特异性免疫活性成分现在尚未完全鉴定出来。

虽然例1、2、3中所用的二级产品中Ig水平实际低于天然初乳中平均的Ig水平，但用相对低剂量的二级产品所达到的小牛免疫系统功能则可相当于或高于天然初乳所能达到的水平。为了解释这一不寻常的现象，研究了产品中其它可能的提高免疫力的成分。已知未加工的乳清含有分子量为90000道尔顿并具有免疫活性的乳铁蛋白。除了已知具有直接抗菌效应外，乳铁蛋白能与Ig分子复合形成Ig/乳铁蛋白复合物。一种Ig/乳铁蛋白复合物已从未加工的乳清中分离出来，并证明其分子量为400000。对此复合蛋白分子特异的单克隆抗体已经制备出来并用于标准的EIA试验来测定牛奶、初乳和过滤产品中Ig/乳铁蛋白复合物的浓度。分析结果列于表6。

表6材料证明在牛乳中几乎没有Ig/乳铁蛋白复合物的活性，初乳中仅有少量活性，但在乳清产品中确有相当的活性。产品中高分子量Ig/乳铁蛋白复合物的存在和活性与其强烈的未设想到的免疫学活性有关已被证实。

为了鉴别产生Ig/乳铁蛋白复合物的机理，分析了未加工的原料牛奶中和奶酪制造过程产生的牛奶中来的乳清中复合物的抗体滴度。分析结果列于表7。被评价的原料指产后1、2、5或10天的母乳或同一母乳样品来的乳清。一种对Ig/乳铁蛋白复合物特异的单克隆抗体被用于EIA试验以定量复合物的浓度。研究结果列于表7。

^＊第一天为初乳

产后10天母乳样品只有微量Ig/乳铁蛋白复合物，而来自牛乳的乳清样品则被证实在较长时间内有此复合物。因此，表7资材指出Ig/乳铁蛋白复合物对现在发明的过滤物的免疫活性是有明显意义的。

虽然没有特别研究，但在包括过滤产品在内的乳清各部分中还有下列免疫活性成分：溶菌酶、乳过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、淋巴因子和促细胞分裂剂。所有这些物质的分子量都能使它们保留在超滤保留液中。在保留液中测到了有免疫活性的乳过氧化物乳清蛋白，虽然量低但确实存在。

例3中小牛的血清Ig水平一直追踪到产后70天。第一组喂初乳、第二组喂本产品，第三组喂产品加初乳，数据列于表8。

虽然产后35天内第二、第三组喂产品的小牛的Ig水平明显低于第一组喂初乳的小牛的Ig水平，但到了产后第70天，喂本产品的小牛的Ig水平已相当于或超过第一组喂初乳的小牛的Ig水平。因此表8的试验结果确定了含27克免疫活性Ig的过滤产品是能有效地将免疫力转到新生牛的剂量。

小牛血清中对病原体特异的抗体活性的更详细的研究为表8资料提供了补充材料。例3小牛血清抗体活性的详细分析列于表9。

表9表明：产后第一天喂初乳的小牛的抗体滴度超过喂产品或喂产品加初乳的小牛。如例1中表5的血清抗体滴度的情况那样，喂初乳小牛的抗体滴度随时间下降，而喂本产品的小牛由于本身产生抗体而使抗体滴度随时间增加。产后70天，第三组小牛的免疫功能已接近或超过第一组和第二组小牛。表9分析结果表明：本发明的产品能成功地作为高质量天然初乳的代用品，它最终能使小牛活性免疫系统功能相当于和喂初乳一样的结果。这一结果是令人惊奇和意想不到的，由于事实上过滤产品中Ig浓度远低于以前在这一领域中认为应接受的最低水平。这结果表明过滤产品含有天然初乳中不存在的或以很低的浓度存在的免疫活性成分。

表10-A列出样品A、B和C（从不同天生产的过滤产品取样）的成分分析。

表10-A    过滤产品的组成

产品取样

成分    A    B    C

湿度（%）    5.51    5.72    5.52

蛋白质（%）    63.80    70.10    69.30

非蛋白氮（%）    0.83    0.88    0.81

脂肪（%）    4.10    5.92    5.25

乳糖（%）    19.70    11.80    14.90

灰分（%）    3.57    2.68    3.05

钙（mM/kg）    114    104    113

磷酸盐（mM/kg）    32    16    22

钠（mM/kg）    99    88    93

钾（mM/kg）    213    148    180

Ig/蛋白质（%）    11.50    11.50    10.80

乳铁蛋白/蛋白（%）    0.50    0.22    0.67

乳过氧化物酶/蛋白（%）    0.11    1.80    0.31

表10-B列出样品A、B和C的Ig/乳铁蛋白复合物ELISA滴度，这些样品的成分分析在表10-A。

表10-B    过滤产品中Ig/乳铁蛋白复合物的ELISA滴度

抗体滴度

微生物

A    B    C

传染性牛鼻子宫颈炎    8000    7000    8000

B·abortus流产杆菌    8000    6000    15000

产气荚膜梭菌    8000    8000    16000

大肠杆菌    16000    8000    16000

睡眠嗜血杆菌    16000    8000    16000

都伯林沙门氏菌    8000    8000    16000

表10-B指出过滤产品中含有有明显免疫活性的Ig/乳铁蛋白复合物。

参阅图6，乳清的二步分级的例子将被详细讨论。上面叙述了二步分级过程的原理，乳清的首次分级是通过具有一层或数层10000道尔顿膜的初级超滤罐，然后初级超滤罐的保留液通过具1层或多层100000道尔顿膜的次级超滤罐进一步分级。

如表9所指，乳清中包括（1）0-8000道尔顿的底层部分，包括低分子量的物质如乳糖和无机盐;（2）8000-70000道尔顿的中层部分，含有较低分子量的蛋白质如α-乳清蛋白，β-乳球蛋白，血清白蛋白和溶菌酶;（3）70000-400000道尔顿的顶层部分，含高分子量蛋白如免疫球蛋白，乳铁蛋白，乳过氧化物酶及蛋白质复合物。用表11所列的相同术语，图6指出作为初级分离罐原料的液状乳清由下层、中层和顶层部分组成。

表11    乳清各部分的组成

分级    分子量范围    典型的固体成分

70000    高分子量蛋白，包括Ig、乳

顶层    400000或更高    铁蛋白、乳过氧化物酶和蛋白

质复合物

8000    低分子量不形成复合物的蛋白

中层    70000    质，包括α-乳清蛋白、β-

乳球蛋白，血清白蛋白和溶菌

酶

0    乳糖、无机盐

底部    8000    非蛋白氮

本发明的目的是提高这种加工过程生产的过滤产品中乳清的各种免疫活性成分的浓度。Ig被广泛认为具有有用的免疫功能，乳铁蛋白、溶菌酶和乳过氧化物酶也是如此。当用“其它有免疫活性的乳清成分”这一短语时，表示非Ig的免疫活性乳清成分，包括乳铁蛋白，溶菌酶，和乳过氧化物酶以及其它尚未确定的免疫活性乳清成分。

初级和二级超滤罐保留物的免疫活性被监测，这些保留物的相对免疫活性一般是通过测定Ig免疫活性来定量。由于Ig是已知乳清蛋白中对热最敏感的免疫活性，所以Ig免疫活性的任何降低都反映了超滤保留物中总免疫活性的丧失。一个新的免疫活性测量技术已可采用，这种技术能适用于测量已知和现在未知或未确定的免疫活性乳清成分的存在、分布、强度和分子量。

参阅下面表12，图6中所示的在初级和二级分离罐中乳清的二步分级将被详细叙述。图6代表了一个概念图，表明初级分级罐使顶层/中层部分保留，而底层通过，二级分离罐使顶层部分保留，中层部分通过的这种方式。实际上没有一个分离系统能产生这样理想的纯的分级。确实初级分离罐的保留液或初级产品包括浓缩的乳清顶层和中层部分，但也包括少量底层部分。同样，二级分离罐的保留液或二级产品含有浓缩的乳清顶层部分，但也含有少量底层和中层部分。然而图6还是精确地从概念上表明了本发明的过程。表12中试验厂的资料指出：以现在发明的这种方式可将Ig浓度为0.63毫克/毫升的液状乳清原料进行分级。

液状乳清原料是通过上面所讲的商品干酪制备中澄清和分离步骤得到的。小心地控制澄清和分离操作避免Ig分子失去免疫活性。为此操作最好在温度不超过105°F的条件下进行。

在表12引出的试验性工厂的运行中，一个六步的超滤系统作为初乳分离罐。标准的10000道尔顿的聚砜（plysulfone）超滤膜用于分离底层低分子量乳清的中、顶层高分子量乳清。前四步超滤不需要透析过滤，而后二步超滤需要透析过滤。

如表12所指，液状乳清原料被分成可通过的部分（测不出Ig）和初级保留液（Ig浓度为18.5毫克/毫升）。通过初级分离罐使Ig与总固体量的比从原料中的1%增加到初级产品中的9.1%，同时蛋白质浓度从12.5%增加到83%。没有高分子量的乳清蛋白进入流出液或底层部分，这一部分中主要是水、乳糖、无机盐和非蛋白氮（NPN）。Ig与固体物比例从1.0%增加到9.1%表明初级分离罐使Ig浓度提高910%。

初级产品作为二级罐的原料，主要含有乳清中层和顶层蛋白部分，已证明初级产品重量的83%是蛋白质。

二级分离罐利用二个超滤单位，每个超滤单位含有一个螺旋状弯曲的100000道尔顿的聚砜超滤膜。这种膜的型号是HFM-181。可从马塞诸萨州威明顿的Koch公司的Abcor分部买到。每种超滤单位都要透析过滤。

二级分离罐的超滤单位入口压为60磅/英吋²，出口压为20磅/英吋²。PH控制在大约7.3。二级罐原料的最高温度限于90°F，在二级罐中滞留时间尽量短。

表12指出二级罐原料Ig浓度为18.5毫克/毫升，蛋白量83%。二级分离罐将原料分成二级产品（Ig浓度36.4毫克/毫升）和中层流出液（Ig浓度为0.05毫克/毫升）。用100000道尔顿超滤膜使二级分离罐保留大部分Ig、Ig/乳铁蛋白复合物、100000道尔顿和更高分子量的免疫活性乳清成分，而使低分子量的乳清蛋白进入流出液。表12表明二级分离罐具有使低分子量的中层蛋白进入流出液，高分子量的顶层蛋白进入保留液的能力，流出液蛋白浓度69.6%，保留液蛋白浓度88.4%。中层和顶层蛋白的分离使Ig浓度提高174%（从原料中的9.1%到二级产品中的15.8%），只有少量（1.92%）进入流出液。初级和二级分离罐合用可使Ig浓度增加1580%（从乳清原料中1%到二级产品中15.8%）。

为了市场出售，商业食品规格的WPC必须具有最低蛋白浓度为35%。如表12所示，二级分离罐产生的流出液具有蛋白浓度超过35%，这种主要是无免疫活性的蛋白质能作为商业规格的WPC产品出售。从本发明过程得到的这个WPC副产品的收益大大降低了有免疫活性的二级产品的成本。

通过上面所叙述的喷雾干燥去除了二级产品中的水份。合适的喷雾干燥装置可由具高压喷嘴的塔形喷雾干燥器和筒状收集器构成。用这种仪器，入口空气温度控制在大约390°F，这样出口温度就在160°F-180°F。二级产品中的水份干燥到占4-6%，最好是5%。喷雾干燥过程必须仔细监测和控制，以避免二级产品中Ig和其它免疫活性乳清成份的热失活。

以前的乳清蛋白浓缩（WPC）技术是：一步超滤的保留物直接进入蒸发器，那里温度维持在140°F-160°F，保留液停留5-10分钟以预热，然后再喷雾干燥。这种蒸发器预热的操作使WPC和有免疫活性的Ig暴露在过热的条件下，完全破坏剩下的免疫活性。

根据现在的发明，二级产品在喷雾干燥器中停留时间应力争最短，而且温度控制在不使二级产品中Ig和其它免疫活性乳清成分的生物学活性遭受破坏的水平。

由喷雾干燥器干燥的二级产品密闭贮存和包装以避免受潮。

干燥的高质量的二级产品，以总固体量的百分比计算应该具有下列成分：（1）蛋白质浓度至少应该占70%，最好达到80-85%;（2）乳糖加无机盐的浓度少于30%;（3）脂肪含量少于6%;（4）水份少于6%;（5）活性Ig含量至少占7%。在干燥的二级产品中Ig的免疫活性应该试验以测出免疫活性抗体的浓度和分布。进行Ig试验的步骤上面已经讲了。

初级产品中蛋白质占总固体量的百分比可以从30%-85%。缩短初级分离罐的停留时间，限制初级超滤罐中的中间超滤步骤数造成低的蛋白/总固体量比，因此延长停留时间和增加中间超滤步骤数对获得85%蛋白/固体量之比是必须的。在执行本发明时，争取得到的最终蛋白/总固体量之比是在60%-85%之间，更好一些的是达到不低于70%的水平，以使二级产品中Ig和其它免疫活性乳清成分达到最大的浓度。

如果初级分离罐的设计和操作产生出只含30%-35%蛋白/总固体比的初级产品，那末在初级产品中就含有较多的乳糖和无机盐。这样高的乳糖和无机盐使初级产品不适合作为新生牛的被动免疫传递物，因为它会引起腹泻、严重脱水、甚至可能死亡。

乳清原料中Ig浓度至少0.7毫克/毫升，例如约0.7-1.2毫克/毫升，那末初级分离罐能产生含7%-10%Ig的初级产品，这样的Ig含量能在许多场合下用于提高免疫力或传递免疫力。

在干燥的二级产品中Ig和其它免疫活性乳清成分的浓度直接与液状乳清原料中的Ig和其它免疫活性乳清成分的浓度有关。为了降低生产成本和使二级产品中Ig和其它免疫活性乳清成分达到最大浓度，选择具有最大Ig和其它免疫活性乳清成分的乳清是十分重要的。现在设计的干酪生产过程产生酸性乳清或甜乳清。现在干酪生产技术产生的酸乳清中免疫活性成分浓度为零。因此在现在的发明中希望用通过粗凝乳酶沉淀酪蛋白后产生的甜乳清。甜乳清/酪蛋白分离应该在PH6.5-4.6进行。利用在此范围内较高的PH分离条件产生较高浓度的免疫活性Ig。

从不同类型干酪生产过程中产生的甜乳清其Ig浓度不同。下列干酪生产过程得到的甜乳清比较好。（1）Swiss;（2）Mozzarella/Provolons;（3）Chaddar;（4）Gouda;（5）Cottage干酪。

乳清中Ig浓度的变化直接与牛奶中Ig浓度有关。已发现牛奶中Ig浓度夏天最低冬天最高。因此夏天的乳清要经过比冬天乳清更长时间的超滤，在某种情况下冬天乳清经过初级分离罐处理后就能用。

乳清中Ig浓度随干酪生产过程变化而每天都不同。生产过程中的时间、温度、微生物的活性水平的变化都会引起未加工乳清原料中Ig浓度的变化。干酪生产参数的标准化能减少这种每天间的变化，但不能消除。

在干燥的二级产品中Ig浓度的变化也与分级过程的参数，如温度、停留时间、泵的搅动和微生物活性有关。正如上面详细解释的，减少Ig和其它免疫活性乳清成分暴露在高温中以及缩短这些物质在高温操作过程中的停留时间是十分重要的。微生物活性应该控制并尽量减少。过量的微生物活性可能导致加工过程中PH下降，结果Ig和其它免疫活性成分失活。通过缩短制备过程中的停留时间可以降低微生物的活性。因此希望在干酪生产的初次瞬间巴氏消毒后约4小时内完成二级产品的干燥。

避免将乳清暴露于空气中，在分级罐中避免或尽量少用离心泵，因为离心泵使被泵物暴露于空气中并受到强烈的机械搅动。这样可使Ig和其它免疫活性乳清成分达到最高浓度。实际上应该用正相顶推泵（positive    displacement    pumps）而不用离心泵。

上面分析的动物试验资料指出，在过滤产品中免疫活性Ig的浓度至少应该7%，比较好的是9%、最好大于12%。上面图6中所述的二步分级过程产生的过滤产品具有的Ig/固体量之比为15.8%。进一步提高能使Ig/固体重量之比为20%或35%以上。

虽然上面提议单个100000道尔顿膜能用在初级分离罐中直接分离乳清顶层部分与底层及中层部分，但发现在100000道尔顿超滤膜的入口一面比较长的乳清蛋白形成一层网或“动态膜”。在过滤开始后10分钟内，这层动态膜就使有效超滤膜的孔径从100000道尔顿降至10000道尔顿。不管所用膜的孔径，初级分离罐能将乳清的底层部分与中层和顶层分开，但不能将乳清的中层与顶层分开。动态膜限制了初级分离罐使初级产品中Ig和其它大分子量免疫活性乳清成分浓度的提高。

图6中所示的初级分离罐的操作和乳清底层与中、顶层的分离，通过现在尚未知的机理又重新形成乳清。这种重新形成的初级产品直接进入二级过滤罐，它的100000道尔顿超滤膜没有明显地引起动态膜，也没有明显地降低100000道尔顿膜的有效孔径。二级超滤罐的100000道尔顿膜直接与它们的孔径大小有关，成功地将乳清中层与顶层分开。

为了成功地完成上述功能，选择初级超滤罐的超滤膜大小，以保证低分子量乳糖、无机盐和有关乳清成分通过初级分离罐的超滤膜，直接进入初级分离罐的流出液中。孔径10000到120000道尔顿的超滤膜可用于此目的。在100000或120000道尔顿的初级分离罐中，动态膜的形成使超滤开始几分钟内比较大孔径的膜功能上相当于10000道尔顿的膜。

二级产品可以经过第三个分离罐，使其中Ig浓度增加。第三个分离罐由超滤系统或反向渗透单元构成，从二级产品中除去水分并增加第三分离罐保留液中的Ig浓度。

如图6所示用初级分离罐，接着用二级分离罐的结果比单用初级分离罐提高了产品质量。图6所示的二步分离过程可使免疫活性二级产品的生产全年进行，虽然夏季乳清中Ig浓度与其它季节相比是明显低的。在免疫活性过滤产品的某些应用中，例如用于被动免疫传输时，新生牛必须摄入一个最低量的免疫活性Ig。因为图6二步法生产的二级产品中有较高的Ig浓度，那末较少量的二级产品溶解于牛奶并喂给新生牛就能输入达到这个最低需要量的Ig，这就明显地降低了每剂的价格。

在许多不同的情况下都能用现在发明的免疫活性过滤产品。过滤产品的一个特殊用途是将被动免疫力传输给新生牛，这一点已着重讨论过。由于猪、山羊、绵羊和其它家畜具有类似的免疫传输机制，过滤产品或可用于将被动免疫力传输给所有这些动物。根据牛抗体能有效地中和人的抗原这一事实，过滤产品能用于抵抗人类疾病或降低人对某些疾病的易感性。一定量的过滤产品配入婴儿食品中，能提高婴儿对疾病的耐受性，这代表了将过滤产品用在人类的一项好用途。过滤产品可以作为幼畜或成年家畜的补充饲料或作为幼儿或成人的食品补充物。过滤产品同样可能用于改变结肠或小肠细菌丛或控制、降低口腔微生物丛以控制口腔斑的形成。在兽医、医学和免疫学领域中的专业人员会很容易地想到本发明过滤产品的大量其它用途。

应用在抗病方面，过滤产品的有效治疗量可以用液体或固体形式喂给。以固体形式，过滤产品可以被包装或以各种该领域中的专业人员熟知的方式封装。产品外面可以涂肠衣使之到达小肠后才释放出来。在包装或制胶囊过程中本产品不应该暴露于高温。

至今，干酪生产过程中的乳清副产物被认为是令人讨厌的、不希望要的副产品，它们会引起严重的废物处理问题。在一定程度上，超滤系统可以回收免疫学上无活性的乳清蛋白，用作食品添加剂。

上面所讲的这种一步或二步超滤技术，使本发明的过程能以粗乳清为原料生产具有可控制的免疫活性成分的过滤产品。这种过滤产品中免疫活性成分的浓度能将被动免疫力传输给新生小牛，因此可以作为天然初乳的全效代用品。令人惊奇的是：过滤产品中相对低的Ig浓度与其它免疫活性乳清成分一起，显示出与具有高Ig浓度的天然初乳同样有效或甚至更有效。

由于几乎消除了动态膜的有害效应，本发明的二步分离罐技术能产生一种过滤产品，它们主要由乳清顶层部分组成，含一定量的Ig及其它的乳清免疫活性成分，而乳清中层的副产品则可直接用作商业WPC食品。

根据对少数几例成功地实施了本发明的详细描述，对在本领域有专长的人员来说显然公开了改进分级和回收免疫活性乳清成分的多种可能性，也可能设想出上述实施方式以外的其它方案。据此，在申报的权利要求书中将包括所有的那些根据本发明而做出的变化和修正，只要它们是在本发明的精神实质和范围之内。

Claims (12)

1、从液状乳清生产免疫活性产物的方法，此乳清具有(1)底层部分含乳糖和无机盐；(2)中层部分含低分子量蛋白；(3)顶层部分含有具免疫活性的免疫球蛋白的高分子量蛋白，此方法包括如下步骤：

a、选择有免疫活性免疫球蛋白的乳清；

b、在保护上述的免疫球蛋白的免疫活性的条件下，超滤上述的乳清得到一种产品，该产品中上述的底层部分浓度显著降低，而上述的中层和顶层部分浓度明显增高，在该产品中上述的顶层部分中有免疫活性的免疫球蛋白至少要占总固体量的7%；

c、在保护上述的初级产品免疫球蛋白免疫活性的条件下，由上述的产品中除去水份制成干燥的产品。

2、按照权利要求1的方法，其中所述乳清加工步骤一直继续到该产品中有免疫活性的免疫球蛋白的浓度至少增加到该产品固体量的7%，该产品中底层部分的浓度低于总固体量的30%，中层和顶层部分的浓度至少增加到总固体量的70%。

3、按照权利要求2的方法，其中所述乳清的加工步骤是采用超滤方法进行，超滤膜使上述的底层部分大部分通过，而保留上述的顶层部分的大部分。

4、按照权利要求3的方法，其中所述超滤方法还包括：

a、初级超滤罐具有保留大部分中层和顶层部分并使大部分底层部分通过的超滤膜;

b、二级超滤罐具有保留大部分顶层部分并使大部分中层和底层部分通过的超滤膜。

5、按照权利要求4的方法，其中所述的产品包括：（1）该产品中底层部分的浓度占总固体量的10-30%;（2）该产品中中层和顶层部部分的浓度占总固体量的70%-85%。

6、按照权利要求1的方法，还进一步包括：为了将被动免疫力转给动物，在关键吸收期喂一次或多次该干燥产品给动物，使该动物所消耗的该产品中的免疫球蛋白重量等于或大于该动物体重的0.055%。

7、按照权利要求1的方法，还进一步包括：喂给动物的剂量至少为每天1克该干燥产品。

8、按照权利要求1的方法，还进一步包括：定期检查该产品，并测量其中免疫活性的水平。

9、按照权利要求4的方法，其中所述的初级超滤罐中的超滤膜穿透性约为10000-120000道尔顿，二级超滤罐的超滤膜穿透性约为80000-120000道尔顿。

10、按照权利要求1的方法，其中所述的干燥产品包括一定量有治疗效果的其它免疫活性乳清成分。

11、从液状乳清得到的一种干燥的有免疫活性的产品，此乳清具有：（1）底层部分含乳糖和无机盐;（2）中层部分含低分子量蛋白质;（3）顶层部分含具有免疫活性免疫球蛋白的高分子量蛋白质，该产品包含：

（1）明显降低浓度的底层部分;

（2）至少有70%或更高浓度中层和顶层部分，上述的顶层部分包括几乎全部乳清免疫活性免疫球蛋白，浓度至少占该产品中总固体量的7%。

12、从乳清超滤得到的一种干燥的免疫活性产品，其主要的免疫球蛋白部分是活性形式，该产品具有乳糖和无机盐很少的高分子量部分，并且含有几乎全部乳清的活性免疫球蛋白和其它免疫活性乳清成分，该产品所含的活性免疫球蛋白浓度至少占总固体量的7%。

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