CN1946427A - 液体生长激素制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种液体制剂，该制剂包含：生长激素或可刺激内源性hGH释放或增强内源性hGH活性的物质；聚乙二醇－聚丙二醇；柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液、碱金属盐和碱土金属盐或伪碱土金属盐，还涉及其制造方法。

Description

液体生长激素制剂
发明领域
本发明涉及液体生长激素(GH)制剂，具体涉及具有改善的化学和物理稳定性的人生长激素(hGH)液体制剂。本发明液体生长激素(GH)制剂可延长室温下贮存时间。本发明还涉及制备这种液体GH制剂的方法，及其提供形式。
发明背景
人生长激素(hGH)，也称为人体生长激素(INN)或促生长素，是一种由垂体前叶促生长细胞产生和分泌的蛋白激素。人生长激素通过其对蛋白质、碳水化合物和脂质的代谢作用，在儿童身体生长和成人的代谢中起着关键作用。
人生长激素是191个氨基酸的单链多肽(Bewly等，1972)，具有两个二硫键，一个在Cys-53和Cys-165之间，在分子内形成大环，另一个在Cys-182和Cys-189之间，在C端附近形成小环。Martial等(1979)报道了确认氨基酸序列的DNA序列。纯hGH的冻干形式是一种白色无定形粉末。易溶于(浓度＞10mg/L)pH6.5-8.5的水性缓冲液中。
溶液中，hGH主要以单体形式存在，含小部分二聚体或更高分子量的寡聚体。在某些条件下，可诱导hGH形成较大量的二聚体、三聚体和更高的寡聚体。
已知一些hGH的衍生物，包括天然来源的衍生物、变体和代谢产物，生物合成hGH的主要降解产物以及遗传方法制备的hGH遗传工程衍生物。hGH天然来源衍生物的一个例子是GH-V，一种胎盘中发现的生长激素变体。此基因座的其它成员见Chen等(1989)所述。
蛋氨酰hGH是第一种由重组DNA技术制备的hGH。该化合物实际上是N-端具有一个额外的蛋氨酸残基的hGH衍生物(Goeddel等，1979)。
已报道，称为20-K-hGH的天然来源hGH变体见于垂体和血流中(Lewis等，1978；Lewis等，1980)。由于信使核糖核酸交替剪接产生的该化合物缺少了Glu-32到Gin-46的15个氨基酸残基(DeNoto等，1981)。该化合物具有hGH的许多但非全部生物学性能。
20-K-hGH由垂体产生并分泌入血。它占成人分泌的生长激素的大约5％，占儿童分泌的生长激素大约20％。它具有与22kD生长激素相同的促生长活性，据报道其脂解活性等于或高于22kD形式。它结合生长激素受体的亲和力等于22kD生长激素，并具有相当于22kD激素十分之一的催乳(促乳素样)生物学活性。与22kD不同，20-k-hGH的抗胰岛素活性弱。
许多hGH衍生物来自分子的蛋白水解修饰。hGH的主要代谢途径涉及蛋白水解作用。hGH的130-150位残基区域极度易受蛋白水解，已报道了一些该区域中具有缺口或缺失的hGH衍生物(Thorlacius-Ussing，1987)。该区域位于hGH大环内，该处肽键的断裂导致产生通过Cys-53和Cys-165之间二硫键连接的两条链。已报道，许多这种双链形式其生物学活性提高(Singh等，1974)。利用酶已人工制备了许多人生长激素的衍生物。已用胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等对hGH整个分子的不同位点进行了修饰(Lewis等，1977；Graff等，1982)。利用胰蛋白酶，通过控制的hGH蛋白水解，形成一种衍生物，称为双链同化蛋白(2-CAP)(Becker等，1989)。发现2-CAP具有与完整hGH分子相当不同的生物学性能，基本上保留了hGH的促生长活性，但失去了对碳水化合物的大多数代谢作用。
在合适的条件下，蛋白质中的天冬酰胺和谷氨酰胺残基易发生脱酰胺反应。已显示，垂体hGH发生这种反应，导致Asn-152转变为天冬氨酸，并且，在较低程度上，Gln-137转变为谷氨酸(Lewis等，1981)。已显示脱去酰胺基的hGH对枯草杆菌蛋白酶的蛋白水解作用易感性改变，提示脱酰胺在介导hGH蛋白水解断裂中可逆具有生理学意义。已知在某些贮存条件下，生物合成的hGH可发生降解，导致另一个天冬酰胺(Asn-149)脱酰胺。这是脱酰胺的主要位点，但也见于Asn-152位(Becker等，1988)。生物合成的hGH中尚未见报道Gln-137脱酰胺。
蛋白质中的蛋氨酸残基易于氧化，主要形成硫氧化物。垂体产生的和生物合成的hGH在Met-14和Met-125可发生磺化氧化作用(Becker等，1988)。还报道了垂体hGH而非生物合成hGH的Met-170氧化。发现脱酰胺hGH和Met-14硫氧化hGH都具有完全的生物学活性(Becker等，1988)。
通过酶的作用或遗传方法制备了截短形式的hGH。控制胰蛋白酶作用所产生的2-CAP除去了hGH N-端的前8个残基。修饰该基因然后在合适的宿主中表达已制备了其它截短形式的hGH。除去前13个残基，得到了具有不同生物学性能的衍生物(Gertler等，1986)，多肽链不断裂。
虽然人生长激素最初来源于尸体脑垂体，但这些制剂在电泳上不是均质的，用纯度级50％的制剂治疗的患者血清中出现抗体，其免疫原性归因于无活性成分。重组DNA技术可在许多不同的系统中产生能无限供应的hGH。只有少量污染蛋白质的存在，有利于从培养基中纯化hGH。事实上，已证明可在反相HPLC柱上经一步纯化，以实验室规模纯化hGH(Hsiung等(1989))。
重组人生长激素rhGH是由Serono International S.A.生产的，商品名为SEROSTIM，已加速该产品在FDA的审批，用于治疗AIDS患者的体重减轻和消瘦。SAIZEN是用于治疗儿童GH缺乏、女孩特纳综合征以及儿童慢性肾功能衰竭的重组人生长激素。Genentech，Inc.(South San Francisco，CA)生产的PROTROPIN在结构上与天然hGH序列稍有不同，其N-端具有一个额外的蛋氨酸残基。重组hGH通常以装有hGH和其它赋形剂如甘氨酸和甘露醇的药瓶形式销售，为冻干形式。伴随提供的稀释液药瓶，使患者可在给药之前重新构建该产品至所需浓度。重组hGH也可以其它公知的方式销售，例如预填充的注射器。
为得到可市售的hGH治疗剂，必须制备稳定的制剂。这些制剂必须在合适的贮存时间内维持活性并且给药方式能为患者所接受。
可以多种方式配制人GH。例如，US 5,096,885公开的一种稳定的药学上可接受的hGH制剂，除hGH外，还包含甘氨酸、甘露醇、缓冲液和任选地非离子表面活性剂，hGH∶甘氨酸的摩尔比为1∶50。
WO 93/19776公开了一种可注射的GH制剂，其包含柠檬酸盐作为缓冲物质，以及任选地生长因子如胰岛素样生长因子或表皮生长因子、氨基酸如甘氨酸或丙氨酸、甘露醇或其它糖醇、甘油和/或防腐剂如苯甲醇。
WO 94/101398公开了一种GH制剂，其包含hGH、缓冲液、非离子表面活性剂和任选地甘露醇、中性盐和/或防腐剂。
EP-0131864描述了一种分子量超过8500道尔顿的蛋白质水溶液，加有含线性聚氧烯基链的表面活性物质作为稳定剂，可保护蛋白质避免界面吸附、蛋白质变性和沉淀。
EP-0211601描述了一种生长促进制剂，其包含生长促进激素和嵌段共聚物的水性混合物，所述嵌段共聚物含有聚氧乙烯-聚氧丙烯单元，平均分子量约为1,100-40,000，能维持生长促进激素的流动性及给药后的生物学活性。
WO 97/29767公开了一种液体制剂，其包含生长激素，二水合柠檬酸三钠、氯化钠、氢氧化钠、苯甲醇、Pluronic F-68，所述制剂的pH为5.6。
US-5,567,677公开了一种液体制剂，其包含人生长激素、柠檬酸钠、磷酸钠、甘氨酸、甘露醇、任选的苯甲醇。
hGH药物制剂有不稳定倾向，尤其是在溶液中。易发生化学降解如hGH的脱酰胺基或硫氧化物形式，由于物理上不稳定而易形成二聚体或更高分子量的聚集体(Becker等(1988)；Becker等，1987；Pearlman和Nguyen(1989))。
由于hGH在溶液中不稳定，hGH药物制剂通过为冻干形式，使用前必须重新构建。通常，加入药学上可接受的稀释剂如无菌注射用水、无菌生理盐水或合适的无菌生理学上可接受的稀释剂，进行重新构建。
重新构建的hGH溶液优选在4℃下贮存，以尽可能减少化学和物理降解反应，然而，在长达14天的贮存期间仍可发生一些降解。
尤其优选在延长时间内能维持hGH稳定性而不形成沉淀或聚集体或任何其它颗粒物的液体形式的hGH药物制剂。
因此，本发明的一个目的是提供不会形成不良颗粒物质且贮存时间延长的生长激素液体制剂。
发明概述
本发明的一方面涉及一种液体制剂，所述制剂包含：
a)生长激素，或可刺激内源性hGH释放或增强内源性hGH活性的物质；
b)碱金属盐；
c)碱土金属盐或伪碱土金属盐；和
d)柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液。
本发明的第二方面涉及一种制备本发明液体制剂的方法。
第三方面，本发明涉及一种冷冻干燥制剂，可以适当方式重建而产生上述新的液体制剂。
在第三方面，本发明涉及本发明制剂以生长激素单剂量或多剂量给药中的应用。
本发明的第四方面涉及一种提供本发明液体制剂的剂型。
发明详述
根据本发明，发现通过特异性选择的无机盐，可提高液体制剂中生长激素的化学和物理稳定性。因此，可延长所得溶液的贮存时间，例如约1-52周、或1-16周、或1-4周，优选在室温下。
还发现，采用权利要求1所述组合物可改善生长激素液体制剂在延长时间内的稳定性。
因此，本发明涉及一种液体制剂，所述制剂包含：
a)生长激素，或可刺激内源性hGH释放或增强内源性hGH活性的物质；
b)碱金属盐；
c)碱土金属盐或伪碱土金属盐；和
d)柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液。
在一个实施方式中，本发明液体制剂可用于多剂量给药，其中，所述制剂可在室温下贮存1周或1周以上。
根据制剂的设定用途，本发明配制的生长激素可来源于任何物种，例如牛、猪、狗或猫。能刺激内源性hGH释放或增强内源性hGH活性的物质是生长激素释放激素。
优选地，可根据本发明配制以下物质：
a)人生长激素；
b)具有对hGH受体的激动活性的(a)片段；
c)与(a)或(b)具有至少70％序列相同性和对hGH受体具有激动活性的(a)或(b)的变体；
d)在中等严谨条件下能与编码(a)或(b)的天然DNA序列互补链杂交的DNA序列所编码的和对hGH受体具有激动活性的(a)或(b)的变体；或
e)对hGH受体具有激动活性的(a)、(b)、(c)或(d)的盐或官能化衍生物。
优选包含人生长激素的本发明制剂。
本发明中使用的术语“人生长激素”或“hGH”包括天然来源和合成的衍生物，如上所述，非限制性地包括：20kD和22kD人生长激素、GH-V、以及生长激素基因座的其它成员，如“发明背景”中具体所述。
hGH可以是天然来源人生长激素，或优选重组hGH。重组GH可在任何合适的宿主原核宿主或真核宿主中表达。例如，大肠杆菌是尤其适合表达hGH的宿主。酵母、昆虫或哺乳动物细胞也适合表达重组生长激素。优选hGH在人或动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。
术语“hGH”或“生长激素”在这里也包括保留了生长激素生物学活性的官能化衍生物、片段、变体、类似物或盐，即可用作生长激素受体的激动剂。换言之，它们能够结合生长激素受体，启动受体的信号转导活性。
术语“官能化衍生物”或“化学衍生物”在这里涵盖了用本领域已知方法，从官能基团如N-或C-端残基上的侧链而制备的包括在本发明范围内的衍生物，只要它们仍是药学上可接受的，本文所述的hGH生物学活性，即结合hGH受体启动受体信号转导的能力未受破坏，对包含它的组合物没有毒性。这些衍生物可含有化学部分，例如糖或磷酸根残基，只要这种衍生物保留了hGH的生物学活性且仍是药学上可接受的。
例如，所述衍生物包括羧基的脂族酯、羧基与铵或伯胺或仲胺反应产生的酰胺、氨基酸残基与酰基部分(例如，烷酰基或碳环芳酰基基团)形成的N-酰基衍生物或游离氨基，或游离羟基(例如，丝氨酰基或苏氨酰基上的羟基)与酰基部分形成的O-酰基衍生物。这些衍生物还包括，例如，聚乙二醇侧链，它可掩蔽抗原位点，延长该分子在体液中的存留时间。
衍生的或与复合剂组合的生长激素可以是长效的。因此，本发明一个优选实施方式涉及人生长激素的PEG化形式。遗传工程重组的在体内显示长效活性的人生长激素也属于本发明范围内的hGH衍生物例子。
已分离和鉴定了N-端乙酰化的hGH(lewis等，1979)。尚不清楚乙酰化是否具有调节作用，或仅仅是纯化的人工产物。然而，预期该分子显示的GH活性与其它hGH衍生物相似。因此，在一个优选的实施方式中，本发明涉及N-端乙酰化的人生长激素。
优选本发明的制剂包含选自下组的人生长激素二聚体：通过链间二硫键连接的二硫化物二聚体、不可逆的无二硫键的共价连接二聚体、非共价连接的二聚体以及它们的混合物。
术语“盐”在这里指hGH分子或其类似物的羧基盐和氨基的酸加成盐。羧基盐可用本领域已知的方法形成，包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等，以及与有机碱形成的盐，例如，与胺如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等形成的盐。酸加成盐包括，例如，与无机酸例如盐酸或硫酸形成的盐，以及与有机酸如草酸或乙酸形成的盐。当然，任何这些盐都必须保留本发明相关的hGH生物学活性，即结合hGH受体启动受体信号转导的能力。
在另一个优选的实施方式中，本发明涉及人生长激素的片段。
本发明生长激素的“片段”涉及该分子的任何亚组，即保留了所需生物学活性的较短的肽。可通过以下步骤容易地制备这类片段：除去hGH分子任一端的氨基酸，并测试所得分子是否有hGH受体激动剂性能。能从多肽的N-端或C-端一次除去一个氨基酸的蛋白酶是已知的，确定保留了所需生物学活性的片段也仅涉及常规实验。
优选地，本发明hGH片段具有内部缺失，只要该缺失不影响hGH的生物学活性，即结合hGH受体启动hGH受体信号转导的活性。本发明优选的片段缺失谷氨酸(Glu)32到谷氨酸46的15个氨基酸。
hGH片段还包括C-端或N-端截短的片段。本发明也优选缺少人生长激素N-端前8个残基或N-端前13个残基的截短的hGH。
已公开的短C-末端hGH片段保留了hGH的生物学活性，参见5,869,452。因此，本发明优选采用hGH的C-末端片段。本发明尤其优选至少包含hGH的177-191氨基酸残基(LRIVQCRSVEGSCGF)的片段hGH177-191。其它优选的是此肽的衍生物，例如US 6,335,319或WO99/12969所述的肽变体，例如环肽。
此外，具有这种hGH受体激动剂活性的多肽hGH、其类似物或变体、盐、官能化衍生物或片段，在hGH多肽侧翼也可包含其它氨基酸残基。只要所得分子保留了该核心多肽的hGH受体激动剂活性，通过常规实验可确定这种侧翼残基是否会影响核心肽的基本特征和新特征，即其受体激动剂特征。
本发明优选的这种GH变体的一个例子是蛋氨酰人生长激素(Met-hGH)，它在人生长激素的N-端含有一个额外的蛋氨酸氨基。
本发明优选的hGH的变体包括蛋氨酰hGH，它是在其N-端含有一个额外蛋氨酸残基的人生长激素。另一个优选的变体是缺失Glu32到Glu46的15个氨基酸的人生长激素。
本发明人生长激素的“变体”指一种基本上类似于完整蛋白质或其片段的分子。变体也可称为“突变蛋白”。变体可以是hGH的同种型，例如由另路剪接产生的变体。变体(多)肽也可采用本领域公知的方法，通过变体肽的直接化学合成常规来制备。当然，人生长激素变体至少具有类似于hGH的hGH受体结合信号启动活性，从而预计具有与hGH类似的活性。
人生长激素的氨基酸序列变体可用编码合成的人生长激素衍生物的DNA突变制备。这些变体包括，例如，氨基酸序列中残基的缺失、插入或取代。也可进行缺失、插入和取代的任何组合来获得最后的构建物，只要该最后构建物具有所需的活性。显然，在编码变体肽的DNA中产生的突变不应改变读码框。
可在遗传水平上，通过对编码该肽分子DNA中的核苷酸定点诱变(如Adelman等，1983所述)，然后在培养的重组细胞中表达该DNA，来制备这些变体。这些变体通常应至少显示与非变体肽相同的生物学活性。
本发明人生长激素的“类似物”指基本上类似于完整分子或其活性片段的非天然分子。本发明所用的人生长激素类似物应具有GH活性。
可根据不同动物同源蛋白之间的氨基酸变化频率分析，在本发明人生长激素中进行各类取代。基于这种分析，保守取代在本文中被定义为在以下五组基团中的交换：
I.小的脂族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
II.极性、带负电荷残基及其酰胺化物：Asp、Asn、Glu、Gin
III.极性、带正电荷残基：His、Arg、Lys
V.大的脂族、非极性残基：Met、Leu、lie、Val、Cys
V.大的芳族残基：Phe、Try、Trp
在上述基团中，认为以下取代是“高度保守的”：
Asp/Glu
His/Arg/Lys
Phe/Tyr/Trp
Met/Leu/Ile/Val
半保守取代被定义为上述(I)-(IV)组的两组之间的交换。限于超级组(supergroup)(A)包括上述(I)、(II)和(III)之间，或限于超级组(B)，包括上述(IV)和(V)之间的交换。取代并不限于遗传编码或甚至是天然来源的氨基酸。当通过肽合成制备表位时，可直接采用所需的氨基酸。或者，可通过与能够与所选侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，来改变遗传编码的氨基酸。
最常见半胱氨酰残基与α-卤代乙酸酯(及其对应的胺)如氯乙酸或氯乙酰胺反应，得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酰残基还可通过与溴代三氟丙酮、α-溴代-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基-2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基酚或氯代-7-硝基苯基-2-氧代-1，3-二唑反应而衍生化。
由于二乙基碳酸酯原(diethylprocarbonate)试剂对组氨酰侧链具有相对特异性，组氨酰残基可通过在pH5.5-7.0下与其反应而衍生化。也可用仲溴代苯酰甲基溴；该反应优选在pH6.0、0.1M甲胂酸钠中进行。
赖氨酰和氨基末端残基可与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。用这些试剂衍生化具有反转赖氨酰残基电荷的作用。能衍生含α-氨基酸残基的其它合适的反应试剂包括：亚氨酸酯，例如甲基皮考啉亚氨酸酯(picolinimidate)；吡哆醛磷酸酯；吡哆醛；氯代硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-methyliosurea；2，4-戊二酮；以及转氨基酶催化的与乙醛酸酯的反应。
可通过与一种或多种常规反应试剂，例如苯乙二醛；2，3-丁二酮；和茚三酮等反应来修饰精氨酰残基。由于胍官能团的pKa高，精氨酸残基的衍生反应需在碱性条件下进行。而且，这些反应试剂可与赖氨酸、精氨酸的ε-氨基反应。
已广泛研究了酪氨酰残基本身的具体修饰，尤其感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应，将光谱标记引入酪氨酰残基中。最常见地，采用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷来分别形成O-乙酰基酪氨酰物质和ε-硝基衍生物。
通过与碳二亚胺(R′N-C-N-R′)如1-环己基-3-[2-吗啉基-(4-乙基)]碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺反应，可选择性修饰侧链羧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)。而且，通过与铵离子反应，天冬氨酰残基和谷氨酰残基可转变为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基。
谷氨酰胺残基和天冬酰胺酰残基常常脱去酰胺基，形成对应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基。或者，在弱酸性条件下，这些残基脱去酰胺基。这些残基的任一种形式落在本发明的范围内。
可用于获得本发明hGH类似物的在蛋白质中产生氨基酸取代的例子包括已知的方法步骤，例如在Mark等人的美国专利RE 33,653；4,959,314；4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195；和Lee等人的5,017,691中所述，以及美国专利4,904,584(Shaw等)中提出的赖氨酸取代蛋白。其它生长激素变体参见例如US 6,143,523(Cunningham等)中所述。
本发明所用的能结合人生长激素受体启动信号转导的物质是文献中已知的所有生长激素类似物或模拟物，例如，美国专利5,851,992；5,849,704；5,849,700；5,849,535；5,843,453；5,834,598；5,688,666；5,654,010；5,635,604；5,633,352；5,597,709和5,534,617中所述。
优选hGH变体或类似物具有核心序列，与天然序列或其生物学活性片段的序列相同，其氨基酸序列与天然氨基酸序列具有至少70％的相同性，且保留了天然氨基酸序列的生物学活性。更优选地，该序列与天然序列具有至少80％相同性，至少90％相同性，或最优选地，至少95％相同性。
“相同性”反映通过序列比较确定的两条或多条多肽序列之间或者两条或多条多核苷酸序列之间的关系。一般，相同性分别指对在所比较的序列长度中两条多核苷酸的核苷酸与核苷酸或两条多肽序列的氨基酸与氨基酸的精确相对应。
对于不存在精确相对应的序列，可确定其“相同性百分比”。一般，将待比较的两条序列进行比对，以得到两序列之间的最大相关性。这包括在其中一条或两条序列中插入“缺口”来提高比对度。测定相同性百分比可以是对所比较各个序列的全长(所谓总体比对)而言，这尤其适用于长度相同或非常相似的序列，或是对较短的指定长度(所谓局部比对)序列而言，这更适用于长度不等的序列。
比较两条或多条序列相同性或同源性的方法是本领域公知的。例如，可采用Wisconsin序列分析软件包，9.1版(Devereux J等，1984)中的程序，BESTFIT和GAP程序来确定两条多核苷酸之间的相同性百分比或两条多肽序列之间的同源性百分比。BESTFIT采用Smith和Waterman的“局部同源性”算法(1981)，发现两条序列间的最佳单一相似区域。确定序列间相同性和/或相似性的其它程序也是本领域已知的，例如BLAST类程序(Altschul S F等，1990，Altschul S F等，1997，由NCBI主页www.ncbi.nlm.nih.gov获得)和FASTA(Pearson W R，1990；Pearson 1988)。
本发明变体或突变蛋白的优选变化是称为“保守”取代的变化。生长激素多肽或蛋白质的保守性氨基酸取代可包括：具有充分相似的物理化学性质的组内成员之间的取代可保留该分子的生物学功能的同组中的同义氨基酸取代(Grantham，1974)。已知也可在上述序列中进行氨基酸插入或缺失而不改变其功能，尤其是这种插入或缺失仅涉及少数几个，例如30个以下，优选10个以下氨基酸；并且不除去或取代功能构象上有关键作用的氨基酸如半胱氨酸残基时。这种缺失和/或插入所产生的蛋白质和突变蛋白落在本发明的范围内。
也可根据下述方法鉴定本发明的类似物或变体。天然序列的DNA是现有技术已知的，参见文献(Martial等，1979)。认为在高度严谨或中度严谨条件下能与天然DNA或RNA的互补链杂交的任何核酸如DNA或RNA所编码的多肽也在本发明的范围内，只要该多肽保留了天然序列的生物学活性。
严谨条件是杂交实验所采用的温度、杂交溶液中单价阳离子的摩尔浓度以及甲酰胺百分比的函数。为确定某给定条件下的严谨程度，可先用Meinkoth等人(1984)的公式确定100％相同性杂交体的稳定性，表示为DNA-DNA杂交体的解链温度Tm：
Tm＝81.5℃+16.6(LogM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L
其中，M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中G和C核苷酸的百分比，％甲酰胺指杂交溶液中甲酰胺的百分比，L指杂交体的碱基对长度。由100％相同的杂交体计算的Tm每降低1℃，允许的错配量增加约1％。因此，在特定的盐和甲酰胺浓度下，如果某给定杂交实验所用的Tm比根据Meinkoth公式计算的100％杂交体的Tm低10℃时，即使存在高达约10％的错配，也将发生杂交。
如本文所用，高度严谨条件指能够耐受多达约15％序列趋异性的条件，而中度严谨条件指耐受多达约20％序列趋异性的条件。高度严谨(比计算的杂交体的Tm低12-15℃)和中度严谨(比计算的杂交体的Tm低15-20℃)条件的非限制性例子采用在低于计算的杂交体Tm的适当温度下，采用含2×SSC(标准柠檬酸盐水)和0.5％SDS的洗涤溶液。这些条件的最终严谨性主要取决于洗涤条件，尤其是当所用的杂交条件不仅允许形成稳定的杂交体也允许形成较不稳定的杂交体时，高严谨洗涤条件可除去较不稳定的杂交。上述高严谨至中度严谨洗涤条件所用的通用杂交条件是在比Tm低约20-25℃的温度下，在6×SSC(或6×SSPE)、5×Denhardt试剂、0.5％SDS、100g/ml变性片段化的鲑精DNA的溶液中进行杂交。如果使用混合探针，优选采用四甲基氯化铵(TMAC)代替SSC(Ausubel，1987-1998)。
虽然本发明提供了制备人生长激素衍生物的重组方法，但这些衍生物也可通过本领域技术人员熟知的常规蛋白质合成方法来制备。
本发明的制剂包含聚乙二醇-聚丙二醇。该聚合物是非离子表面活性剂。表面活性剂在本文中也称为“表面张力活性”或“表面张力活力剂”。在另一个优选的实施方式中，该制剂包含浓度0.5-5毫克/毫升或1-2毫克/毫升或1.5毫克/毫升的聚乙二醇-聚丙二醇。
在一种优选的制剂中，表面活性剂是普流罗尼(pluronic)多元醇，例如F68。本发明尤其优选Pluronic F68。
通过用表面活性剂PluronicF68(BASF，也称为泊洛沙姆188)配制GH，可获得能够避免任何种类的沉淀、聚集或产生颗粒等问题的稳定制剂。
Pluronic F68是环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物。环氧丙烷嵌段(PO)夹在两个环氧乙烷(EO)嵌段之间。
Figure A20058001218300151
1.控制地将环氧丙烷加到丙二醇的两个羟基上，产生所需分子量的疏水物；和
2.加入环氧乙烷，将该疏水物夹在亲水基团之间。
在Pluronic F68中，聚氧乙烯(亲水物)的百分比为80％，疏水物(聚氧丙烯)的分子量约为1967Da。
Pluronic F68的一般性质如下：
平均分子量：8400；
熔点/倾倒点：52℃；
20℃时的物理状态：固体；
粘度(Brookfield)厘泊：1000[25℃液体，60℃糊剂，77℃固体]；
表面张力，达因/厘米，25℃；
0.1％浓度：50.3
0.01％浓度：51.2
0.001％浓度：53.6
与奴约耳(Nujol)的界面张力，达因/厘米，25℃：
0.1％浓度：19.8
0.01％浓度：24.0
0.01％浓度：26.0
Draves湿度，秒，25℃
1.0％浓度：＞360
0.1％浓度：＞360
泡沫高度
Ross英里，0.1％，毫米，50℃：35
Ross英里，0.1％，毫米，26℃：40
动态，0.1％，毫米，400毫升/分钟：＞600
水溶液中的浊点，℃
0.1％浓度：＞100
10％浓度：＞100
HLB(亲水亲脂平衡)：29
本发明制剂中也可采用具有类似于Pluronic F68性质的其它聚合物。
聚乙二醇-聚丙二醇所用的浓度范围为0.5-5毫克/毫升或1-2毫克/毫升或1.5毫克/毫升。
本领域技术人员将理解，除聚乙二醇聚丙二醇外，还可使用一种或多种其它表面活性剂。
本发明制剂还包含稳定剂。稳定剂的作用也可作为等张剂。
“等张剂”是生理学上可耐受的和可赋予制剂合适张力以在制剂接触水份时防止水份跨细胞膜净流动的化合物。常用已知浓度的化合物如甘油作为等张剂。其它合适的稳定剂包括但不限于：氨基酸或蛋白质(例如，甘氨酸或白蛋白)、盐(例如氯化钠)和糖(例如右旋糖、蔗糖和乳糖)。
本发明中优选使用的稳定剂或等张剂包括非还原糖，包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖(melezitose)和棉子糖、甘露醇，木糖醇、赤藻糖醇、苏糖醇、山梨糖醇和甘油。
在一个优选的实施方式中，稳定剂或等张剂是蔗糖。
在另一个优选的实施方式中，所述制剂含有浓度范围为10-100毫克/毫升或20-80毫克/毫升或约60毫克/毫升的蔗糖。
本发明制剂包含碱金属盐，包括NaCl、KCL、Na2SO4、Na2CO3。在一个优选的实施方式中，碱金属盐是NaCl或Na2SO4。
本发明制剂还包含碱土金属盐，包括CaCl2、MgCl2、MgSO4、NH4CO3。在一个优选的实施方式中，碱土金属盐是MgCl2。
本发明制剂还包含柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液。本发明中使用的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液可以是柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液。
术语“缓冲液”或“生理学上可接受的缓冲液”指一种化合物溶液，已知可安全用于药物或兽医应用的制剂中，并且具有将制剂的pH维持或控制在制剂所需的pH范围内的作用。
优选本发明制剂包含浓度范围为1-100mM或5-50mM或10-20mM的柠檬酸盐/磷酸盐。
根据本发明，优选所述制剂的pH为5-7或5.5-6.5或在6或约为6。更优选地，pH为5.5-5.9。
本发明制剂为液体，因而包含水性稀释剂。
术语“水性稀释剂”指含水液体溶剂。水性溶剂系统可仅包含水，或包含水和一种或多种混溶的溶剂，可包含溶解的溶质如糖、缓冲剂、盐或其它辅料。
制剂还可包含一种或多种非水溶剂。常用的非水溶剂是短链有机醇，例如甲醇、乙醇、丙醇；短链的酮，例如丙酮；以及多元醇，例如甘油。
本发明制剂优选还包含防腐剂。当生长激素用于多剂量给药时，尤其优选加入防腐剂。
“防腐剂”指制剂中所包含的可大大降低细菌作用的化合物，从而有利于多次使用的制剂的生产。潜在的防腐剂的例子包括：十八烷基二甲基-苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中，烷基是长链化合物)和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇如酚、丁醇和苯甲醇、对羟苯甲酸烷基酯如对羟苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和m-甲酚。
防腐剂在这里也可以是抑菌剂。术语“抑菌剂”指加入到制剂中用作抗细菌剂的化合物或组合物。防腐的含GH的本发明制剂优选符合商业上可行的多次使用(多剂量)产品的防腐有效性法定或规定指南。抑菌剂的例子包括：苯酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、甲醋吡喃酮钠和硫柳汞。
优选地，防腐剂存在的浓度范围为1-10毫克/毫升或2-5毫克/毫升或3毫克/毫升。
本发明优选的防腐剂是苯酚。
第二方面，本发明涉及制备液体制剂的方法，所述方法包括制备本发明制剂组分的水溶液的步骤。
本发明还涉及制备液体制剂的方法，所述方法包括将预定量的制剂置于无菌容器中的步骤。通常，用量在毫升范围内。
也可通过将所需纯度的hGH和稳定剂与生理学上可接受的辅料、缓冲剂或防腐剂(《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osoll A.编(1980)混合，来制备治疗用hGH液体制剂。可接受的辅料是在应用浓度和剂量下对患者无毒性的物质，包括，例如，缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、pH和张力调节剂。
需要时，该生长激素液体制剂可还包含一种或多种其它稳定性辅料。其它稳定性辅料包括，例如，氨基酸如甘氨酸或丙氨酸、甘露醇或其它糖醇、或甘油。此外，该液体制剂可包含其它生长因子，例如胰岛素样生长因子或IGF-结合蛋白。
本发明制备的制剂中hGH稳定性的提高使得可更广泛采用比通常所用浓缩更高的hGH制剂。
术语“稳定性”指本发明生长激素制剂的物理、化学和构象稳定性(包括维持生物学效力)。蛋白制剂的不稳定可以是由蛋白质分子化学降解或聚集而形成更高级结构所引起的，由可导致本发明包含的GH多肽的至少一种生物学活性降低的脱糖基化、糖基化修饰、脱酰胺、氧化或其它结构修饰所引起。
自动注射器是本领域已知的，例如Easyject，尤其适用于hGH给药。采用本领域已知的专用装置，本发明也可采用无针头给药。
本发明的又一方面涉及一种药物组合物，所述组合物包括本发明制剂。本发明范围内的组合物包括含有本发明至少一种人生长激素或其衍生物、类似物或变体的所有组合物，其含量可有效实现预定目的。虽然个体需要有所不同，但确定各个组分的最佳有效量范围在本领域技术人员的能力范围内。通常，典型剂量包含约0.001-0.1毫克/公斤体重/天。当给予患者时，hGH疗法可与适合该疾病的其它疗法并行给予。
可用合适的稀释液(例如注射用水)重建生长激素的冻干样品，而得到本发明液体制剂，使该制剂包含上述辅料。
术语“给予”或“给药”指将本发明制剂引入需要的患者体内，来治疗疾病或病症。
在本发明优选的实施方式中，给予hGH的日剂量约为0.1-10毫克或约为0.5-6毫克。在一个实施方式中，日剂量约为0.15-0.3毫克hGH/天，优选皮下注射。在另一个实施方式中，剂量约为每天给予需要的患者1毫克人生长激素。
在另一个实施方式中，以可变剂量给予hGH，第一剂量高于第二剂量。优选地，第一剂量约为1毫克，第二剂量约为0.5毫克。周剂量优选约为6毫克或约5毫克或约4.5毫克，取决于患者的需要。
术语“患者”指需要治疗疾病或病症的哺乳动物。患者包括但不限于以下物种：人、羊、猪、马、牛、兔等。
本发明制剂适用于许多不同的给药方案。例如，可通过胃肠外给药，例如，皮下、静脉内、肌内、口服、腹膜内、气溶胶、经皮、鞘内或直肠途径给药。给剂量型取决于接受者的年龄、健康和体重，既往或并行治疗的类型(如果有的话)，治疗频率和所需效果的性质。
根据本发明，优选的给药途径是皮下和肌内途径。
应理解，本发明组合物或制剂的合适剂量取决于接受者的年龄、健康和体重，并行治疗的类型(如果有的话)，治疗频率，以及所需效果的性质。然而，可根据个体对象确定最优选的剂量，本领域技术人员直到且无需过多实验即可确定。这通常涉及调节标准剂量，例如当患者体重较低时降低剂量。
可以多剂量或单剂量给药形式给予各个治疗所需的总剂量。
术语“多剂量使用”指包括将GH制剂的单一药瓶、安瓿、或药筒用于一次以上注射，例如，2、3、4、5、6或更多次注射。例如，注射时间可间隔6、12、24、48或72小时。
本发明还涉及将本发明制剂用作单剂量给药。在可选的方面，本发明涉及将本发明制剂用于多剂量给药。
典型的hGH多剂量制剂Serono(Saizen)包含1.33、3.33或8毫克hGH。
典型的hGH多剂量制剂Lilly(Humatrope)包含6、12或24毫克hGH。
典型的hGH多剂量制剂Pfizer(Genotropin)包含5或12毫克hGH。
典型的hGH多剂量制剂Novo Nordisk(Genotropin)包含5、10或15毫克hGH。
因此，在典型的制剂中，每药瓶中装有hGH的量为1.33、3.33、5、6、8、10、12、15或24毫克。
对所述疾病或疾病的其它症状可单独或与的其它治疗剂联合给予所述组合物。
可将本发明hGH制剂分装在药瓶中。术语“药瓶”广义地指适合将固体或液体形式的GH保存在密封无菌状态的容器。本文所用药瓶的例子包括安瓿、药筒、泡包装、或适合通过注射器、泵(包括渗透泵)、导管、经皮贴片、肺部或经粘膜喷雾将GH递送至患者的其它容器。适合包装胃肠外、肺部、经粘膜或经皮给药产品的药瓶是本领域公知和认可的。
hGH制剂稳定性的提供使得可在合适的温度，例如冻结点以下(例如，-20℃)，或冻结点以上，优选2-8℃，最优选+5℃，或甚至在室温下，例如+25℃，长期贮存。
用于体内给药的hGH制剂必须无菌。这可通过(例如)无菌滤膜过滤容易地实现。
通常，将治疗用hGH液体制剂置于具有无菌进入孔的容器中，例如，静脉输液袋或装有塞子的药瓶中，皮下注射针可穿透这些容器。
因此，本发明的另一方面涉及本发明液体制剂的提供形式，即使用前以无菌状态密封在适合贮存的容器内。
本发明制剂可用于在儿童中治疗GH缺乏，在AIDS患者中治疗体重损失和消瘦，在女孩中治疗特纳综合征，以及在儿童中治疗慢性肾衰竭。
虽然已结合具体实施方式描述了本发明，但应理解可以进行进一步改进。一般来说，本申请涵盖了遵循本发明的原理对本发明所作的任何变化、用途或适应症，包括本发明所属技术领域已知或常规操作在内的偏离本说明书的那些形式，可按照所附权利要求书的范围将其应用于基本特征。
本文所引用的所有文献，包括杂志文章或摘要，公开或未公开的美国或外国专利申请，出版的美国或外国专利或任何其它文献，都被纳入本文作为参考，包括引用文献中的所有数据、表格、图片和文本。此外，本文所引用的参考文献中所引用文献的全部内容也被完全纳入本文作为参考。
在描述了本发明之后，通过参考以下示例性临床研究中的实施例，即是以示例的方式，将更容易地理解本发明，而不是限制本发明的范围。
实施例
评价以下2种制剂的稳定性：
制剂A
  成分   制剂A
  r-hGH(毫克/毫升)   8.0
  柠檬酸钠磷酸钠pH 5.8(mM)   5.0
  硫酸钠(mM)   100.0
  氯化镁(mM)   50
  苯酚(毫克/毫升)   3.0
  Pluronic F68(毫克/毫升)   1.5
制剂B：
  成分   制剂B
  r-hGH(毫克/毫升)   8.0
  柠檬酸钠磷酸盐pH 5.57(mM)   5.0
  氯化钠(mM)   171.0
  氯化镁(mM)   5
  苯酚(毫克/毫升)   3.0
  Pluronic F68(毫克/毫升)   0.2
40℃贮存样品延长时间，即3周后，评价制剂A和B的化学稳定性。
用RP-HPLC(反相HPLC)测定hGH的稳定性。因此，可由人生长激素主峰的变化程度来确定未改变的完整生长激素的量。换言之，由人生长激素主峰的变化推断变化程度，计算未改变的hGH与0时间对应的峰的百分比。
结果：
制剂A：
将样品在40℃下贮存1个月后，测定的hGH主峰占0时间对应的峰的62％(即40℃下贮存1个月后，发现62％为未改变的hGH)。
室温(25℃)贮存1个月后，测定的hGH主峰占0时间对应的峰的91％(即25℃贮存1个月后发现91％为未改变的hGH)。
制剂B：40℃贮存3周后，测定的hGH主峰占0时间对应的峰的69％(即40℃贮存3周后发现69％为未改变的hGH。
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31.WO 97/29767
32.US-5,567,677

Claims (28)

1.一种液体制剂，所述制剂包含：
a)生长激素，或刺激内源性hGH释放或增强内源性hGH活性的物质；
b)碱金属盐；
c)碱土金属盐或伪碱土金属盐；和
d)柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液。
2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述生长激素是人生长激素。
3.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述刺激内源性hGH释放或增强内源性hGH活性的物质是生长激素释放激素(GHRH)。
4.如上述权利要求中任一项所述的制剂，其特征在于，所述碱金属盐选自：NaCl、KCl、Na2SO4、Na2CO3。
5.如权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述碱金属盐是NaCl或Na2SO4。
6.如上述权利要求中任一项所述的制剂，其特征在于，所述碱土金属盐选自：CaCl2、MgCl2、MgSO4、NH4CO3。
7.如权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述碱土金属盐是MgCl2。
8.如上述权利要求中任一项所述的制剂，其特征在于，所述缓冲液是柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液。
9.如权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述缓冲液的浓度为1-100mM或5-50mM或10-20mM。
10.如上述权利要求中任一项所述的制剂，所述制剂还包含表面活性剂。
11.如权利要求10所述的制剂，其特征在于，所述表面活性剂是聚乙二醇-聚丙二醇。
12.如权利要求11所述的制剂，其特征在于，所述表面活性剂是PluronicF68。
13.如权利要求10或11所述的制剂，所述制剂包含聚乙二醇-聚丙二醇的浓度为0.5-5毫克/毫升或1-2毫克/毫升或1.5毫克/毫升。
14.如上述权利要求中任一项所述的制剂，所述制剂还包含稳定剂。
15.如权利要求14所述的制剂，其特征在于，所述稳定剂是蔗糖。
16.如权利要求15所述的制剂，所述制剂中包含蔗糖的浓度为10-100毫克/毫升或20-80毫克/毫升或约60毫克/毫升。
17.如上述权利要求中任一项所述的制剂，所述制剂的pH为5-7或5.5-6.5或约6。
18.如权利要求17所述的制剂，其特征在于，所述pH为5.5-5.8。
19.如上述权利要求中任一项所述的制剂，所述制剂还包含防腐剂。
20.如权利要求19所述的制剂，所述制剂中包含防腐剂的浓度为1-10毫克/毫升或2-5毫克/毫升或3毫克/毫升。
21.如权利要求19或20所述的制剂，其特征在于，所述防腐剂是苯酚。
22.如上述权利要求中任一项所述的制剂，所述制剂的pH为5.8，并且包含r-hGH、柠檬酸钠/磷酸钠、Na2SO4、MgCl2、苯酚、Pluronic F 68以及任选的注射用水。
23.如上述权利要求中任一项所述的制剂，所述制剂的pH为5.8，并且包含r-hGH、柠檬酸钠/磷酸钠、NaCl、MgCl2、苯酚、Pluronic F 68以及任选的注射用水。
24.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1-23中任一项所述的制剂。
25.一种权利要求1-23中任一项所述液体制剂的包装形式，使用前以无菌状态密封贮存在适于储存的容器内。
26.权利要求1-23中任一项所述制剂在制备用于治疗儿童GH缺乏、AIDS患者体重损失和消瘦、女孩特纳综合征以及儿童慢性肾衰竭的药物中的用途。
27.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述药物用于单剂量给药。
28.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述药物用于多剂量给药。
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