NO330880B1

NO330880B1 - Flytende veksthormonformulering og fremgangsmate til fremstilling derav

Info

Publication number: NO330880B1
Application number: NO20054707A
Authority: NO
Inventors: Fabrizio Samaritani; Piergiorgio Donati
Original assignee: Ares Trading Sa
Priority date: 2003-03-18
Filing date: 2005-10-13
Publication date: 2011-08-08
Also published as: AU2004222528A1; US20060252682A1; WO2004082707A2; WO2004082707A3; CA2516314A1; JP4949828B2; NO20054707L; EP1603588A2; CA2516314C; JP2006520366A

Abstract

Oppfinnelsen angår en flytende formulering som omfatter et veksthormon eller et stoff som stimulerer frigjøring eller styrker aktiviteten til endogent hGH, en polyetylen-polypropylenglykol, en sitratbuffer og en stabilisator, og en fremgangsmåte til fremstilling derav.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår flytende veksthormon (GH) formuleringer og særlig flytende formuleringer av humant veksthormon (hGH) som signifikant forbedrer oppløseligheten av veksthormon og forblir hovedsakelig fri fra partikkelstoff over en forlenget tidsperiode. Den foreliggende oppfinnelse angår ytterligere en fremgangsmåte til fremstilling av slike flytende GH-formuleringer.

Humant veksthormon (hGH), også kjent som somatropin (INN) eller somatotropin, er et proteinhormon produsert og sekrert av de somatotrofe cellene i fremre hypofyse. Humant veksthormon spiller en nøkkelrolle i somatisk vekst i barndom og i stoffskiftet hos voksne gjennom dets virkninger på metabolismen av proteiner, karbohydrater og lipider.

Humant veksthormon er en enkel polypeptidkjede på 191 aminosyrer (Bewly et al., 1972) som har to disulfidbindinger, én mellom Cys-53 og Cys-165, som danner en stor løkke i molekylet og den andre mellom Cys-182 og Cys-189, som danner en liten løkke nær C-terminus. DNA-sekvensen som konfirmerte aminosyresekvensen ble rapportert av Martial et al. (1979). Renset hGH er et hvitt amorft pulver i sin lyofiliserte form. Det er lett oppløselig (konsentrasjoner > 10 mg/l) i vandige buffere ved pH i et område fra 6,5-8,5.

I oppløsning eksisterer hGH hovedsakelig som en monomer med en liten fraksjon som dimerer og oligomerer med høyere molekylvekt. Under visse betingelser kan hGH induseres til å danne store mengder av dimerer, trimerer og høyere oligomerer.

Flere derivater av hGH er kjent, inkludert naturlig forekommende derivater, varianter og metabolske produkter, degraderingsprodukter primært av biosyntetisk hGH og konstruerte derivater av hGH produsert ved genetiske metoder. Ett eksempel på et naturlig forekommende derivat av hGH er GH-V, en variant av veksthormonet funnet i placenta. Andre medlemmer av genlokuset er beskrevet i Chen et al. (1989).

Metionyl hGH var den første form av hGH som ble produsert gjennom rekombinant DNA-teknologi. Denne forbindelsen er i virkeligheten et derivat av hGH som har et tilleggsmetioninresidu på sin N-terminus (Goeddel et al., 1979).

En naturlig forekommende variant av hGH, kalt 20-K-hGH er blitt rapportert å forekomme i hypofysen så vel som i blodstrømmen (Lewis et al., 1978; Lewis et al., 1980). Denne forbindelse, som mangler de 15 aminosyreresiduene fra Glu-32 til Gln-46, oppstår fra en alternativ spleising av budbringerribonukleinsyre (DeNoto et al., 1981). Denne forbindelse deler mange, men ikke alle de biologiske egenskapene til hGH.

20-K-hGH er fremstilt i hypofysen og sekrert inn i blodet. Den utgjør ca. 5 % av veksthormonutstrømningen hos voksne, og ca. 20 % av veksthormonutstrømningen hos barn. Det har den samme vekstfremmende aktivitet som 22 kD veksthormon, og er blitt rapportert å ha lik eller større mengde av lipolytisk aktivitet enn 22 kD-

formen. Den bindes til veksthormonreseptorer med samme affinitet som 22 kD veksthormon, og har en tiendedel av den laktogene (prolaktinliknende) bioaktivitet enn 22 kD-hormonet. I motsetning til 22 kD har 20-K-hGH svak anti-insulinaktivitet.

Et antall derivater av hGH oppstår fra proteolytiske modifikasjoner av molekylet. Den primære ruten for metabolismen av hGH involverer proteolyse. Regionen til hGH rundt residuene 130-150 er ekstremt utsatt for proteolyse og flere derivater av hGH som har brudd (nicks) eller delesjoner i denne regionen er blitt beskrevet (Thorlacius-Ussing, 1987). Denne regionen er i den store løkken til hGH og spalting av en peptidbinding der resulterer i dannelsen av to kjeder som er koblet sammen gjennom disulfidbindingen til Cys-53 og Cys-165. Mange av disse tokjedeformene er rapportert å ha øket biologisk aktivitet (Singh et al., 1974). Mange derivater av humant veksthormon er blitt dannet kunstig ved anvendelse av enzymer. Enzymene trypsin og subtilisin så vel som andre er blitt brukt til å modifisere hGH på forskjellige punkter i molekylet (Lewis et al., 1977; Graff et al., 1982). Et slikt derivat kalt tokjedet anabolisk protein (2-CAP), ble dannet ved den kontrollerte proteolyse av hGH ved bruk av trypsin (Becker et al., 1989). 2-CAP ble funnet å ha biologiske egenskaper klart adskilt fra de til det intakte hGH-molekyl, ved at den vekstfremmende aktivitet til hGH var i stor grad bibeholdt og de fleste effektene på karbohydratmetabolismen var forsvunnet.

Asparagin- og glutaminresiduer i proteiner er utsatt for deamideringsreaksjoner under egnede betingelser. Hypofyse hGH er blitt vist å gjennomgå denne type reaksjon, som resulterer i konversjon av Asn-152 til asparaginsyre og også i mindre grad konversjon av Gln-137 til glutaminsyre (Lewis et al., 1981). Deamidert hGH er blitt vist å ha en endret utsatthet for proteolyse med enzymet subtilisin, noe som antyder at deamidering kan ha fysiologisk signifikans ved styring av proteolytisk spaltning av hGH. Biosyntetiske hGH er kjent for å degraderes under visse lagringsbetingelser, som resulterer i deamidering på et annet asparagin (Asn-149). Dette er det primære deamideringssetet, men deamidering ved Asn-152 er også sett (Becker et al., 1988). Deamidering på Gln-137 er ikke blitt rapportert i biosyntetisk hGH.

Metioninresiduer i proteiner er utsatt for oksidasjon, hovedsakelig til sulfoksidet. Både hypofyseavledet og biosyntetisk hGH gjennomgår sulfoksideringer på Met-14 og Met-125 (Becker et al., 1988). Oksidering på Met-170 har også blitt rapportert i hypofyse men ikke biosyntetisk hGH. Både desamid hGH og Met-14 sulfoksid hGH er blitt funnet å utvise full biologisk aktivitet (Becker et al., 1988).

Trunkerte former av hGH er blitt produsert, enten gjennom virkningen av enzymer eller ved genetiske metoder. 2-CAP dannet ved den kontrollerte virkningen av trypsin, har de første åtte residuene fjernet på N-terminus til hGH. Andre trunkerte versjoner av hGH er blitt produsert ved å modifisere genet før ekspresjon i en egnet vert. De første tretten residuene er blitt fjernet for å gi et derivat som har karakteristiske biologiske egenskaper (Gertler et al., 1986) hvori polypeptidkjeden ikke er spaltet.

Skjønt humant veksthormon opprinnelig ble oppnådd fra hypofysekjertler hos kadavre, var ikke disse preparatene elektroforetisk homogene og antistoffer kom til syne i serum hos pasienter behandlet med preparater med størrelsesorden 50 % renhet, hvor immunogenisiteten er blitt tillagt innaktive komponenter. Rekombinant DNA-teknologi tillot produksjon av en ubegrenset tilførsel av hGH i et antall forskjellige systemer. Rensing av hGH fra kulturmediet blir fasilitert ved nærvær av bare lave mengder av kontaminerende proteiner. Faktum er at det er blitt vist at hGH kan renses på laboratorieskala med et enkelt rensetrinn på reversert fase HPLC-kolonne (Hsiung et al., 1989).

Rekombinant humant veksthormon, rhGH blir fremstilt av Serono International S.A. som SEROSTIM<®>, hvis produkt er blitt gitt akselerert FDA-godkjennelse for å behandle vekttap og uttæring hos AIDS-pasienter. SAIZEN<®>er rekombinant humant veksthormon indikert for GH-svikt hos barn, for Turner syndrom hos piker, så vel som kronisk nyresvikt hos barn. PROTROPIN<®>, fremstilt av Genentech, Inc.

(South San Francisco, CA), adskiller seg lett i struktur fra naturlig sekvens hGH, idet det har en ytterligere metioninresidu i N-terminus. Rekombinant hGH blir generelt markedsført som ampuller som inneholder hGH pluss ytterligere eksipienter, f.eks. glysin og mannitol, i en lyofilisert form. En annen fortynningsmiddelampulle er tilveiebrakt, noe som tillater pasienten å rekonstituere produktet i den ønskede konsentrasjonen før administrering av dosen. Rekombinant hGH kan også markedsføres på andre velkjente måter, så som foroppfylte sprøyter.

Generelt har ingen signifikante forskjeller blitt observert i farmakokinetikk eller biologiske aktiviteter mellom rekombinant naturlig sekvens hGH, rekombinant N-metionyl-hGH, eller hypofyseavledet materiale hos mennesker (Moore et al., 1988; Jorgensson et al., 1988).

For at hGH skal være kommersielt tilgjengelig som et terapeutisk middel må stabile formuleringer fremstilles. Slike formuleringer må være i stand til å opprettholde aktiviteten over egnede lagringstidsrom og være akseptable for administrering av pasienter.

Humant GH er blitt formulert på flere måter. Ved hjelp av eksempel beskriver US

5 096 885 en stabil farmasøytisk akseptabel formulering av hGH som omfatter, i tillegg til hGH glysin, mannitol, en buffer og eventuelt en ikke-ionisk surfaktant, hvor det molare forholdet hGH:glysin er 1:50.

WO 93/19776 beskriver injiserbare formuleringer av GH som omfatter sitrat som buffersubstans og eventuelle vekstfaktorer så som insulinliknende vekstfaktorer eller epidermal vekstfaktor, aminosyrer så som glysin eller alanin, mannitol eller andre sukkeralkoholer, glyserol og/eller et preserverende middel så som benzylalkohol.

WO 97/29767 tilkjennegjør stabile, flytende formuleringer av veksthormon. Dette dokumentet beskriver at de stabiliserende midlene er valgt fra (i) polyetylen-polypropylenglykol, ikke-ioniske, overflateaktive midler slik som Pluronics, (ii) taurokolsyre eller salter eller derivater derav og (iii) meylcellulosederivater, men beskriver derimot ikke sukrose som et stabiliserende middel.

WO 94/101398 beskriver en GH-formulering som inneholder hGH, en buffer, en ikke-ionisk surfaktant og eventuelt mannitol, et nøytralt salt og/eller et preserverende middel.

EP-0131864 beskriver en vandig oppløsning av proteiner med molekylvekt over 8500 Dalton, som er blitt beskyttet fra adsorpsjon på grensesnitt, mot denaturering og mot presipitering av proteinet ved tilsetting av et lineært polyoksyalkylen kjedeinneholdende overflateaktivt stoff som et stabiliserende middel.

EP-0211601 beskriver en vekstfremmende formulering som omfatter en vandig blanding av vekstfremmende hormon og en blokkopolymer som inneholder polyoksyetylen-polyoksypropylen-enheter og som har en gjennomsnittelig molekylvekt på ca. 1100-40000, som opprettholder fluiditeten av det vekstfremmende hormonet og dens biologiske aktivitet ved administrering.

WO 97/29767 beskriver en flytende formulering som omfatter et veksthormon, trinatriumsitratdihydrat, natriumklorid, natriumhydroksid, benzylalkohol, Pluronic F-68, hvor nevnte formulering har en pH på 5,6.

US 5 567 677 beskriver flytende formuleringer som omfatter humant veksthormon, natriumsitrat, natriumfosfat, glysin, mannitol og eventuelt benzylalkohol.

Farmasøytiske preparater av hGH har en tendens til å være ustabile, særlig i oppløsning. Kjemiske degraderte forbindeleser så som deamiderte eller sulfoksylerte former av hGH opptrer, og dimere eller høyere molekylvektaggregate forbindelser kan resultere fra fysisk ustabilitet (Becker et al. (1988); Becker et al., 1987; Pearlman and Nguyen (1989)).

Som en følge av ustabiliteten til hGH i oppløsning er farmasøytiske formuleringer av hGH generelt i lyofilisert form, som deretter må rekonstitueres før anvendelse. Rekonstitusjon blir vanligvis utført ved tilsetting av et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel så som sterilt vann for injeksjon, sterilt fysiologisk saltoppløsning eller et egnet sterilt fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel.

Rekonstituerte oppløsninger av hGH blir fortrinnsvis lagret ved 4°C for å minimalisere kjemiske og fysiske degraderingsreaksjoner, noe degradering vil imidlertid skje under slik lagring som kan være over en periode på opptil 14 dager. En farmasøytisk formulering av hGH tilveiebrakt i en flytende form, særlig én som opprettholder stabiliteten til hGH uten dannelse av utfelling eller aggregering eller noe annet partikkelstoff over en forlenget tidsperiode ville være spesielt fordelaktig.

Derfor er det en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe flytende formuleringer av veksthormon som ikke resulterer i dannelsen av uønsket partikkelstoff og som har en forlenget lagringstid.

Oppløseligheten til veksthormon kan signifikant økes ved tilsetting av en polyetylen-polypropylenglykol til den flytende formuleringen. Den flytende veksthormonformuleringen kan lagres ved både romtemperatur og +5°C hvis sitratbuffer blir brukt.

Derfor angår oppfinnelsen flytende formuleringer som omfatter:

a) et veksthormon, eller et veksthormonfrigjørende hormon; b) polyetylen-polypropylenglykol;

c) en sitratbuffer; og

d) sukrose som stabilisator.

En annen side av oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til å fremstille den flytende

formuleringen i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1: RP-HPLC-resultater etter 4 ukers lagring ved +25 + 2°C av r-hGH flytende formuleringer som inneholder mannitol eller sukrose eller ingen eksipient; Fig. 2: RP-HPLC-resultater etter 4 ukers lagring ved +25 + 2°C av r-hGH flytende formuleringer som inneholder tensioaktive ved forskjellige konsentrasjoner og ingen tensioaktive; Fig. 3: regresjons linjer av laboratorieskalaformuleringer testet med RP-HPLC for beslektede proteiner opp til 6 måneders lagring ved +25 + 2°C; Fig. 4: regresjonslinjer av laboratorieskalakandidatformuleringer #3, #4 og #5 testet ved RP-HPLC for beslektede proteiner opptil 6 måneders lagring ved +25 + 2°C; Fig. 5: pH i laboratorieskalaformuleringer opptil 6 måneders lagring ved +25 + 2°C; Fig. 6: pH i laboratorieskalaformuleringer opptil 12 måneders lagring ved 5 + 3°C; Fig. 7: stabilitet til hGH i multidoseformuleringer 6 (firkanter), 7 (sirkler) og 8 (ruter) ved +5°C; Fig. 8: stabilitet av hGH i multidoseformuleringer 6 (firkanter), 7 (triangler) og 8 (sirkler) ved +5°C; Fig. 9: stabilitet til hGH i forskjellige multidoseformuleringer ved +25°C i måneder; Fig. 10: stabilitet til hGH i forskjellige multidoseformuleringer ved +5°C i måneder; Fig. 11: pH i multidoseformuleringer som omfatter acetat (firkanter og ruter), sitronsyre (triangler) eller sitrat (halve firkanter) ved +25°C over 6 måneder.

I rammen av foreliggende oppfinnelse er det blitt funnet at en spesifikk gruppe av surfaktanter forbedrer signifikant oppløseligheten av veksthormon og gjør det således mulig å oppnå oppløsninger som hovedsakelig er fri for partikkelstoff.

Det har videre blitt funnet at forbedret stabilitet av veksthormonet i flytende formuleringer over lange tidsperioder kan oppnås med sitrat som en buffer.

Derfor angår oppfinnelsen spesifikt en flytende formulering som omfatter

c) en sitratbuffer; og

d) sukrose som stabilisator i en konsentrasjon fra 10 mg/ml til 100 mg/ml,

eller 20 mg/ml til 80 mg/ml, eller omtrent 60 mg/ml.

Veksthormon som kan formuleres i henhold til foreliggende oppfinnelse kan avledes av enhver art, så som storfe, svin, hund eller kattedyr, avhengig av den tenkte bruk av formuleringen. Et stoff som stimulerer frigjøring eller styrker aktiviteten av endogent hGH, er f.eks. veksthormonfrigjørende hormon.

Fortrinnsvis kan følgende stoffer formuleres i henhold til foreliggende oppfinnelse: a) humant veksthormon; b) et fragment av (a) som har agonistisk aktivitet på hGH-reseptoren; c) en variant av (a) eller (b) som har minst 70 % sekvensidentitet med (a) eller (b) og som har agonistisk aktivitet på hGH-reseptoren; d) en variant av (a) eller (b) som er kodet av en DNA-sekvens som hybridiseres til komplementet av den native DNA-sekvensen som koder (a) eller (b) under moderat stringente betingelser, og som har agonistisk aktivitet på hGH-reseptoren; eller e) et salt eller funksjonelt derivat av (a), (b), (c) eller (d) som har agonistisk aktivitet på hGH-reseptoren.

En formulering som omfatter humant veksthormon er foretrukket i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Betegnelsen "humant veksthormon", eller "hGH" som brukt i foreliggende oppfinnelse er ment å inkludere de naturlig forekommende og syntetiske derivatene, som angitt ovenfor, inkludert uten begrensning både 20 kD og 22 kD humant veksthormon, GH-V, og andre medlemmer av veksthormongenlokuset, som beskrevet i detalj i beskrivelsens innledning.

hGH kan være naturlig forekommende humant veksthormon eller det kan fortrinnsvis være rekombinant hGH. Rekombinant hGH kan uttrykkes i enhver egnet vert, enten en prokaryot eller en eukaryot vert. E. coli er en vert som er særlig

egnet for ekspresjon av hGH f.eks. Gjær-, innsekt- eller pattedyrceller er ytterligere egnet for ekspresjon av rekombinant veksthormon. Fortrinnsvis er hGH uttrykt i humane eller dyreceller, f.eks. i kinesisk hamsterovarie (CHO) celler.

Betegnelsen "hGH" eller "veksthormon" som brukt heri inkluderer også funksjonelle derivater, fragmenter, varianter, analoger eller salter som bibeholder den biologiske aktiviteten til veksthormonene, dvs. som virker som agonister til veksthormonreseptoren. Med andre ord er de i stand til å bindes til veksthormonreseptoren for å initiere reseptorens signalaktivitet.

Betegnelsen "funksjonelle derivater" eller "kjemiske derivater" som brukt heri dekker derivater som kan fremstilles fra de funksjonelle grupper som forekommer som sidekjeder på residuene til de N- eller C-terminale grupper, ved midler kjent på området og som er inkludert i oppfinnelsen så lenge de forblir farmasøytisk akseptable, og ikke ødelegger den biologiske aktiviteten til hGH som beskrevet heri, dvs. har evnen til å bindes til hGH-reseptoren og initiere reseptorsignalisering, og ikke gir toksiske egenskaper til sammensetninger som inneholder dem. Derivater kan ha kjemiske rester, så som karbohydrat eller fosfatresiduer, forutsatt at slike derivater bibeholder den biologiske aktiviteten til hGH og forblir farmasøytisk akseptable.

F.eks. kan derivater inkludere alifatiske estere av karboksylgrupper, amider av karboksylgrupper ved reaksjon med ammoniakk eller med primære eller sekundære aminer, N-acylderivater eller frie aminogrupper til aminosyreresiduer dannet med acylrester (f.eks. alkanoyl eller karbosykliske aroylgrupper) eller O-acylderivater av frie hydroksylgrupper (f.eks. den til seryl eller treonylresiduer) dannet med acylrester. Slike derivater kan også f.eks. inkludere polyetylenglykolsidekjeder, som kan maskere antigene seter og utvide oppholdstiden til molekylet i kroppsvæsker.

Et veksthormon som er blitt derivatisert eller kombinert med et komplekserende middel kan vare i lang tid. Derfor angår en foretrukket utforming av oppfinnelsen PEGylerte versjoner av humant veksthormon. Veksthormonet genetisk konstruert for å utvise en lengevarende aktivitet i kroppen er også eksempler på hGH-derivater som er innenfor området i foreliggende oppfinnelse.

hGH som er acetylert på N-terminus er blitt isolert og identifisert (Lewis et al., 1979). Det er ikke klart om acylering tjener en regulatorisk rolle eller ganske enkelt er en artifakt ved rensingen. Det er imidlertid forventet at dette molekylet utviser pH-aktivitet på samme måte som andre hGH-derivater. Derfor angår, i en foretrukket utforming, oppfinnelsen humant veksthormon som er acetylert på sin N-terminus.

Fortrinnsvis omfatter formuleringen i henhold til oppfinnelsen en dimer av humant veksthormon selektert fra gruppen som består av en disulfiddimer koblet gjennom mellomkjededisulfidbindinger, og en kovalent irreversibel ikke-disulfiddimer, en ikke-kovalent dimer og blandinger derav.

Betegnelsen "salter" heri refererer seg til både salter av karboksylgrupper og til syreaddisjonssalter av amingrupper i hGH-molekylet eller analoger derav. Salter av en karboksylgruppe kan dannes ved midler kjent på området og inkluderer organiske salter f.eks. natrium-, kalsium-, aluminium-, jern- eller sinksalter og liknende, og salter med organiske baser som de dannet f.eks. med aminer, så som trietanolamin, arginin eller lysin, piperidin, prokain og liknende. Syreaddisjonssalter inkluderer f.eks. salter med mineralsyrer, så som f.eks. saltsyre eller svovelsyre, og salter med organiske syrer, så som f.eks. eddiksyre eller oksalsyre. Selvfølgelig må alle slike salter bibeholde den biologiske aktiviteten til hGH relevant til foreliggende oppfinnelse, dvs. evnen til å bindes til hGH-reseptoren og initiere reseptorsignalisering.

I en ytterligere foretrukket utforming angår oppfinnelsen fragment av humant veksthormon.

Et "fragment" av veksthormon i henhold til foreliggende oppfinnelse betegner ethvert undersett av molekylet, dvs. et kortere peptid som bibeholder den ønskede biologiske aktivitet. Fragmenter kan lett fremstilles ved å fjerne aminosyrer fra hver ende av hGH-molekylet og teste resultatet for dets egenskaper som en hGH-reseptoragonist. Proteaser til å fjerne én aminosyre av gangen fra enten N-terminalen eller C-terminalen til et polypeptid er kjent, og dermed for å fremstille fragmenter som bibeholder den ønskede biologiske aktivitet involverer bare rutineeksperimenter.

Fortrinnsvis kan hGH-fragmenter ha indre delesjoner, så lenge som delesjonene ikke påvirker den biologiske aktiviteten til hGH, dvs. bindes til og initiering av signalisering gjennom hGH-reseptoren. Et fragment som er foretrukket i henhold til foreliggende oppfinnelse mangler 15 aminosyrer fra glutaminsyre (Glu) 32 til glutaminsyre 46.

hGH-fragmentet kan ytterligere være trunkert på C- eller N-terminus. Trunkert hGH som mangler de første åtte N-terminale residuene eller de første tretten N-terminale residuene i humant veksthormon er også foretrukket i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Et kort C-terminalt hGH-fragment er blitt beskrevet å bibeholde en biologisk aktivitet til hGH, se US 5 869 452. Derfor er anvendelse av et C-terminalt fragment av hGH foretrukket i henhold til oppfinnelsen. Fragment hGH 177-191, som omfatter minst aminosyreresiduene 177-191 i hGH (LRIVQCRSVEGSCGF) er særlig foretrukket i henhold til foreliggende oppfinnelse. Ytterligere foretrukket er derivater av dette peptid, så som peptidvariantene beskrevet i US 6 335 319 eller WO 99/12969, f.eks. sykliske peptider.

I tillegg kan polypeptidet som har slik hGH-reseptoragonistaktivitet, det være seg hGH, en analog eller variant, salt, funksjonelt derivat eller fragment derav, også inneholde ytterligere aminosyreresiduer som flankerer hGH-polypeptidet. Så lenge som det resulterende molekylet bibeholder hGH-reseptoragonistabilitet til kjernepolypeptidet kan man bestemme om enhver slik flankerende residu påvirker de basiske og nye egenskapene til kjernepeptidet, dvs. dets

reseptoragonistkarakteristika ved rutineeksperimentering.

Et eksempel på en slik GH-variant som er foretrukket i henhold til foreliggende oppfinnelse er metionyl humant veksthormon (Met-hGH), som har en ytterligere metioninrest på N-terminus i det humane veksthormon.

Varianter av hGH, som er foretrukket i henhold til oppfinnelsen, omfatter metionyl hGH, som er et humant veksthormon som har en ytterligere metioninresidu på sin N-terminus. En ytterligere foretrukket variant er et humant veksthormon som mangler 15 aminosyreresiduer fra Glu32 til Glu46.

En "variant" av det humane veksthormonet i henhold til foreliggende oppfinnelse refererer seg til et molekyl som er hovedsakelig lik enten hele proteinet eller et fragment derav. En variant kan også kalles et "mutein". En variant kan f.eks. være en isoform av hGH, så som en variant dannet ved alternativ spleising. Variant (poly)peptider kan også egnet fremstilles ved direkte kjemisk syntese av variantpeptidet, ved å bruke fremgangsmåter velkjent på området. Selvfølgelig ville et variant humant veksthormon ha i det minste lik gHG-reseptorbinding og signalinitierende aktivitet som hGH og som derfor ville være forventet å ha lik aktivitet til hGH.

Aminosyresekvensvarianter av det humane veksthormon kan fremstilles ved mutasjoner i DNA, som koder de syntetiserte humane veksthormonderivater. Slike varianter inkluderer f.eks. delesjoner fra eller innskudd eller substitusjoner i residuer i aminosyresekvensen. Enhver kombinasjon av delesjon, innskudd og substitusjon kan også foretas for å komme frem til det endelige konstrukt, forutsatt at det endelige konstrukt har den ønskede aktivitet. Selvsagt må mutasjoner som fremstilles i det DNA-kodede variantpeptid ikke forandre leserammen.

På det genetiske nivå kan disse variantene fremstilles ved setestyrt mutagenese (som eksemplifisert av Adelman et al., 1983) av nukleotider i DNA som koder peptidmolekylet, for derved å produsere DNA som koder varianten, og deretter uttrykke DNA i rekombinant cellekultur. Variantene utviser typisk minst den samme kvalitative biologiske aktiviteten som ikke-variantpeptidet.

En "analog" av humant veksthormon i henhold til foreliggende oppfinnelse refererer seg til et ikke-naturlig molekyl som er hovedsakelig likt enten hele molekylet eller et aktivt fragment derav. En analog av humant veksthormon som er nyttig i foreliggende oppfinnelse vil utvise GH-aktivitet.

Typene av substitusjoner som skal foretas i det humane veksthormon i henhold til foreliggende oppfinnelse kan være basert på analyser av frekvenser av aminosyreforandringer mellom et homologt protein fra forskjellige arter. Basert på slik analyse kan konservative substitusjoner defineres heri som utvekslinger i én av følgende fem grupper:

I. Små, alifatiske, ikke-polare eller lett polare residuer:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

II. Polare, negativt ladede residuer og deres amider:

Asp, Asn, Glu, Gin

III. Polare, positivt ladede residuer:

His, Arg, Lys

IV. Store alifatiske ikke-polare residuer:

Met, Leu, Ile, Val, Cys

V. Store aromatiske residuer:

Phe, Try, Trp

Innenfor de foregående gruppene er følgende substitusjoner vurdert å være "meget konservative":

Semikonservative substitusjoner er definert å være utvekslinger mellom to av gruppene (I)-(IV) ovenfor som er begrenset til supergruppe (A), som omfatter (I), (II) og (III) ovenfor, eller til supergruppe (B), som omfatter (IV) og (V) ovenfor. Substitusjoner er ikke begrenset til de genetisk kodede eller til og med de naturlig forekommende aminosyrer. Når epitopen blir fremstilt ved peptidsyntese kan den ønskede aminosyre anvendes direkte. Alternativt kan en genetisk kodet aminosyre modifiseres ved å reagere den med et organisk derivatiserende middel som er i stand til å reagere med utvalgte sidekjeder eller terminale residuer.

Cysteinylresiduer er mest vanlig reagert med alfa-haloacetater (og tilsvarende aminer), så som kloreddiksyre eller kloracetamid, for å gi karboksylmetyl eller karboksyamidometylderivater. Cysteinylresiduer blir også derivatisert ved reaksjon med bromtrifluoraceton, alfa-brom-beta-(5-imidazoyl)propionsyre, kloracetylfosfat, N-alkylmaleimider, 3-nitro-2-pyridydisulfid, metyl-2-pyridyldisulfid, p-klormerkuribenzoat, 2-klormerkuri-4-nitrofenol, eller klor-7-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazol.

Histidylresiduer blir derivatisert ved reaksjon med dietylprokarbonat ved pH 5,5-7,0 fordi dette middel er relativt spesifikt for histidylsidekjeden.

Parabromfenacylbromid er også nyttig; reaksjonen blir fortrinnsvis utført i 0,1 M natriumkakodylat ved pH 6,0.

Lysinyl og aminoterminale residuer blir reagert med ravsyre eller andre karboksylsyreanhydrider. Derivatisering med disse midler har den virkning at den reverserer ladningen til lysinylresiduene. Andre egnede reagenser for derivatisering alfa-amino syreholdig residuer inkluderer imidoestere så som metylpikolinimidat, pyridoksalfosfat, pyridoksal; klorborhydrid; trinitrobenzensulfonsyre; O-metyliosurea; 2,4-pentandion; og transaminase-katalysert reaksjon med glykosylat.

Arginylresiduer blir modifisert ved reaksjon med én eller flere konvensjonelle

reagenser, blant dem fenylglyoksal; 2,3-butanedion; og ninhydrin. Derivatisering av argininresiduer krever at reaksjonen utføres under alkaliske betingelser på grunn av den høye pKa til guanidinfunksjonelle gruppe. Videre kan disse reagensene reagere med grupper av lysin, så vel som arginin epsilon-aminogruppe.

Den spesifikke modifikasjon av tyrosylresiduer i seg selv er blitt undersøkt i utstrakt grad, med særlig interesse i å introdusere spektrale merker i tyrosylresiduene ved reaksjon aromatisk diazoniumforbindelse eller tetranitrometan. Mest vanlig er N-acetylimidazol og tetranitrometan brukt til å danne henholdsvis O-acetyltyrosylforbindelser og e-nitroderivater.

Karboksylsidegrupper (aspartyl eller glutamyl) blir selektivt modifisert ved reaksjon med karbodiimider (R'N-C-N-R') så som l-sykloheksyl-3-[2-morfolinyl-(4-etyl)]karbodiimid eller l-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylpentyl)karbodiimid. Videre blir aspartyl- og glutamylresiduer konvertert til asparaginyl- og glutaminylresiduer ved reaksjon med ammoniumioner.

Glutaminyl- og asparaginylresiduer blir ofte deamidert til de tilsvarende glutamyl-og aspartylresiduer. Alternativt er disse residuene deamidert under svakt sure betingelser. Hver form av disse residuene faller innenfor foreliggende oppfinnelses ramme.

Eksempler på produksjon av aminosyresubstitusjoner i proteiner som kan anvendes for å oppnå analoger av hGH for anvendelse i foreliggende oppfinnelse inkluderer kjente fremgangsmåtetrinn, så som presentert i US patent RE 33,653; 4 959 314;

4 588 585 og 4 737 462, til Mark et al.; 5 116 943 til Koths et al.; 4 965 195 til Nåmen et al.; og 5 017 691 til Lee et al., og lysinsubstituerte proteiner presentert i US patent 4 904 584 (Shaw et al.). Ytterligere veksthormonvarianter er blitt beskrevet f.eks. i US 6 143 523 (Cunningham et al.). Stoffene som bindes til og initierer signalisering av den humane veksthormonreseptor som kan anvendes i henhold til foreliggende oppfinnelse er alle av de veksthormonanalogene og hermerne som allerede er kjent i litteraturen, så som f.eks. de beskrevet i US patent 5 851 992, 5 849 704, 5 849 700, 5 849 535, 5 843 453, 5 834 598, 5 688 666, 5 654 010, 5 635 604, 5 633 352, 5 597 709, og 5 534 617.

Fortrinnsvis vil hGH-varianten eller analogen ha en kjernesekvens som er den samme som den til den native sekvensen eller biologisk aktive fragment derav, som har en aminosyresekvens som har minst 70 % identitet til den native aminosyresekvens og bibeholder den biologiske aktiviteten derav. Mer fortrinnsvis har en sekvens minst 80 % identitet, minst 90 % identitet eller mest fortrinnsvis minst 95 % identitet til den native sekvens.

"Identitet" reflekterer et slektskap mellom to eller flere polypeptidsekvenser eller to eller flere polynukleotidsekvenser, bestemt ved å sammenligne sekvensene. Generelt refererer identitet seg til en nøyaktig nukleotid til nukleotid eller aminosyre til aminosyre tilsvarenhet av henholdsvis de to polynukleotider eller to polynukleotidsekvenser, over lengden av sekvensene som blir sammenlignet.

For sekvenser hvor det ikke er en nøyaktig tilsvarenhet, kan en "% identitet" bestemmes. Generelt blir de to sekvensene som skal sammenlignes opplinjert for å gi en maksimal korrelering mellom sekvensene. Dette kan inkludere å innskyte "gap" i enten én eller begge sekvenser, for å forsterke graden av opplinjering. En prosent identitet kan bestemmes over hele lengden av hver av sekvensene som blir sammenlignet (såkalt global opplinjering), som er spesielt egnet for sekvenser av samme eller meget lik lengde, eller over kortere definerte lengder (såkalt lokal opplinjering) som er mer egnet for sekvenser av ulik lengde.

Fremgangsmåter til å sammenligne identiteten og homologiteten til to eller flere sekvenser er velkjent på området. Således kan programmer tilgjengelig i the Wisconsin Sequence Analysis Package, versjon 9.1 (Devereux J. et al., 1984), f.eks. programmene BESTFIT og GAP, anvendes til å bestemme % identitet mellom to polynukleotider og % identitet og % homologi mellom to polypeptidsekvenser. BESTFIT benytter den "lokale homologi" algoritmen til Smith and Waterman

(1981) og finner den beste enkle likhetsregion mellom to sekvenser. Andre program for å bestemme identitet og/eller likhet mellom sekvensene er også kjent på området, f.eks. BLAST-familie av programmer (Altschul S.F. et al., 1990, Altschul S.F. et al., 1997, tilgjengelig på hjemmesiden til NCBI på www. ncbi. nlm. nih. gov) og FASTA (Pearson W.R., 1990; Pearson 1988).

Foretrukne forandringer for varianter eller muteiner i henhold til foreliggende oppfinnelse er det som er kjent som "konservative" substitusjoner. Konservative aminosyresubstitusjoner i veksthormonpolypeptider eller proteiner kan inkludere synonyme aminosyrer innenfor en gruppe som har tilstrekkelig like fysikokjemiske egenskaper at substitusjon mellom medlemmer av gruppen vil preservere den biologiske funksjonen til molekylet (Grantham, 1974). Det er klart at innskudd og delesjoner av aminosyrer også kan foretas i ovenfor definerte sekvenser uten å forandre deres funksjon, særlig hvis innskuddene eller delesjonene bare involverer noen få aminosyrer, f.eks. under 30, og fortrinnsvis under 10, og ikke fjerner eller forskyver aminosyrer som er kritiske for en funksjonell konformasjon, f.eks. cysteinresiduer. Proteiner og muteiner fremstilt ved slike delesjoner og/eller innskudd kommer innenfor den foreliggende oppfinnelses område.

Analoger eller varianter kan også bestemmes i henhold til den følgende fremgangsmåte. DNA til den native sekvens er kjent i den kjente teknikk og er funnet i litteraturen (Martial et al., 1979). Polypeptider kodet ved enhver nukleinsyre, så som DNA eller RNA, som hybridiserer til komplementet til det native DNA eller RNA under meget stringente eller moderat stringente betingelser, så lenge som polypeptidet opprettholder den biologiske aktiviteten til den native sekvens, er også vurdert å være innenfor foreliggende oppfinnelses område.

Stringente betingelser er en funksjon av temperaturen brukt i hybridiseringseksperimentet, molariteten til de monovalente kationer og prosentandelen av formamid i hybridiseringsoppløsningen. For å bestemme graden av stringens involvert med ethvert gitt sett av betingelser, benytter man først ligningen til Meinkoth et al. (1984) for å bestemme stabiliteten av hybrider for 100 % identitet uttrykt som smeltetemperatur Tm til DNA-DNA-hybridet: Tm = 81,5°C + 16,6 (LogM) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/1

hvor M er molariteten til monovalente kationer, %GC er prosentandel av G- og C-nukleotider i DNA, % form er prosentandelen av formamid i

hybridiseringsoppløsningen, og L er lengden av hybridet i baseparene. For hver 1°C som Tm blir redusert fra den kalkulert for 100 % identitets hybrid blir den tillatte mengde av misstilpasning øket med ca. 1 %. Således, hvis Tm brukt i ethvert gitt hybridiseringseksperiment ved de spesifikke salt- og formamidkonsentrasjoner er 10°C under Tm beregnet for en 100 % hybrid i henhold til Meinkoths ligning, vil hybridisering skje selv om det er opptil ca. 10 % misstilpasning.

Som brukt heri er meget stringente betingelser de som er tolerante for opptil ca. 15 % sekvensdivergens, mens moderat stringente betingelser er de som er tolerante for opptil 20 % sekvensdivergens. Uten begrensning, eksempler på meget stringente (12-15°C under den beregnede Tm til hybridet) og moderat (15-20°C under den beregnede Tm til hybridet) betingelser benytter en vaskeoppløsning på 2 X SSC (standars saltoppløsningssitrat) og 0,5 % SDS ved den egnede temperatur under den kalkulerte Tm for hybridet. Den ultimate stringens av betingelser skyldes hovedsakelig vaskebetingelsene, særlig hvis hybridiseringsbetingelsene brukt er de som tillater mindre stabile hybrider å dannes sammen med stabile hybrider. Vaskebetingelsene ved høyere stringens fjerner deretter mindre stabile hybrider. En vanlig hybridiseringsbetingelse som kan anvendes med meget stringent til moderat stringent vaskebetingelser beskrevet ovenfor er hybridisering i en oppløsning av 6 X SSC (eller 6 X SSPE), 5 X Denhardts reagens, 0,5 % SDS, 100 ug/ml denaturert fragmentert laksesperm DNA ved en temperatur på ca. 20-25°C under Tm. Hvis blandede prober blir brukt er det foretrukket å anvende tetrametylammoniumklorid (TMAC) istedenfor SSC (Ausubel, 1987-1998).

Mens den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer rekombinante metoder for å fremstille de humane veksthormonderivater, kan disse derivater også fremstilles ved konvensjonelle proteinsyntesemetoder som er velkjent for de med kunnskap på området.

Formuleringen i henhold til oppfinnelsen omfatter polyetylen-polypropylenglykol. Denne polymer er en ikke-ionisk surfaktant. En surfaktant kan heri også bli kalt "tensioaktiv" eller "tensioaktivt middel". I enda en ytterligere foretrukket utforming omfatter formuleringen polyetylen-polypropylenglykol i en konsentrasjon som varierer fra 0,5-5 mg/ml eller 1-2 mg/ml eller 1,5 mg/ml.

I en foretrukket formulering er surfaktanten en pluronic polyol, så som f.eks. F68. Pluronic F68 er meget foretrukket i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Ved å formulere GH med surfaktanten Pluronic<®>F68 (BASF, også kjent som Poloxamer 188) ble det oppnådd en stabil formulering som unngikk problemene med utfelling, aggregering og dannelse av enhver type partikkelstoff.

Pluronic F68 er en blokkopolymer av etylenoksid (EO) og propylenoksid (PO). Propylenoksidblokken (PO) er lagt som et smørbrød mellom to etylenoksid (EO) blokker.

Pluronicsurfaktanter blir syntetisert i en totrinnsprosess:

1. En hydrofob av ønsket molekylvekt blir dannet ved kontrollert tilsetting av propylenoksid til de to hydroksylgruppene til propylenglykol; og 2. Etylenoksid blir tilsatt slik at hydrofobet blir liggende i lag mellom hydrofile grupper.

I Pluronic F68 er prosentandelen av polyoksyetylen (hydrofil) 80 %, og molekylvekten til hydrofoben (polyoksypropylen) er ca. 1967 Da.

Typiske egenskaper til Pluronic F68 er opplistet nedenfor:

Gjennomsnittelig molekylvekt: 8400;

Smelte/hellepunkt: 52°C;

Fysisk form ved 20°C: fast;

Viskositet (Brookfield) eps: 1000 [flytende ved 25°C, pasta ved 60°C og fast ved 77°C];

Overflatetensjon, dyn/cm ved 25°C:

Kons. 0,1 %: 50,3

Kons. 0,01 %: 51,2

Kons. 0,001 %: 53,6

Grensesnittensjon, dyn/cm ved 25°C versus Nujol;

Kons. 0,1 %: 19,8

Kons. 0,01 %: 24,0

Kons. 0,001 %: 26,0

Draves fukting, sekunder 25°C

Kons. 1,0%:>360

Kons. 0,1 %:>360

Skumhøyde

Ross Miles, 0,1 %, mm ved 50°C: 35

Ross Miles, 0,1 %, mm ved 26°C: 40

Dynamisk, 0,1 %, mm ved 400 ml/min.: > 600

Blakkingspunkt i vandig oppløsning, °C

Kons. 1 %: > 100

Kons. 10 % > 100

HLB (hydrofil-lipofil balanse): 29

Andre polymerer som har egenskaper lik Pluronic F68 kan også anvendes i formuleringen i henhold til oppfinnelsen.

En person med kunnskap på området vil forstå at én eller flere surfaktanter kan anvendes i tillegg til polyetylen-polypropylenglykol.

Formuleringen i henhold til oppfinnelsen omfatter videre et stabiliseringsmiddel. Et stabilisertingsmiddel kan også kalles et isotonisitetsmiddel.

Et "isotonisitetsmiddel" er en forbindelse som blir fysiologisk tolerert og som gir en egnet tonisitet til en formulering for å forhindre netto gjennomstrømning av vann over cellemembranene som er i kontakt med formuleringen. Forbindelser så som glyserin blir vanligvis brukt for slike hensikter ved kjente konsentrasjoner. Andre egnede isotonisitetsmidler inkluderer men er ikke begrenset til aminosyrer eller proteiner (f.eks. glysin eller albumin), salter (f.eks. natriumklorid), og sukre (f.eks. dekstrose, sukrose og laktose).

I formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes sukrose som stabiliserings- eller isotonisitetsmiddel.

I en ytterligere foretrukket utforming har formuleringen sukrose i en konsentrasjon som varierer fra 10 mg/ml til 100 mg/ml eller 20 mg/ml til 80 mg/ml eller ca. 60 mg/ml.

Formuleringen i henhold til oppfinnelsen omfatter ytterligere en sitratbuffer. En sitratbuffer som kan anvendes med foreliggende oppfinnelse kan f.eks. være natriumsitrat.

Betegnelsen "buffer" eller "fysiologisk akseptabel buffer" refererer seg til oppløsninger av forbindelser som er kjent for å være sikre for farmasøytisk eller veterinær bruk i formuleringer og som har den virkning at de opprettholder eller kontrollerer pH-verdien til formuleringen i pH-området som er ønsket for formuleringen. Akseptable buffere for å kontrollere pH ved en moderat sur pH til en moderat basisk pH inkluderer men er ikke begrenset til slike forbindelser som fosfat, acetat, sitrat, arginin, TRIS og histidin. "TRIS" refererer seg til 2-amino-2-hydroksymetyl-l,3-propandiol og til ethvert farmakologisk akseptabelt salt derav.

Det er foretrukket at formuleringen omfatter sitrat i en konsentrasjon som varierer fra 1-100 mM eller fra 5-50 mM eller fra 10-20 mM.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er det foretrukket at pH til formuleringen er i området fra 5-7 eller 5,5-6,5 eller på eller rundt 6. Mer fortrinnsvis er pH 5,9.

Formuleringen i henhold til oppfinnelsen kan ytterligere omfatte et vandig fortynningsmiddel.

Betegnelsen "vandig fortynningsmiddel" refererer seg til et flytende oppløsningsmiddel som inneholder vann. Vandige oppløsningsmiddelsystemer kan bare bestå av vann eller kan bestå av vann pluss én eller flere blandbare opp løsningsmidler, og kan inneholde oppløste stoffer så som sukre, buffere, salter eller andre eksipienter.

Formuleringen kan også omfatte én eller flere ikke-vandige opp løsningsmidler. Vanlig benyttet ikke-vandig oppløsningsmiddel er kortkjedede organiske alkoholer, så som metanol, etanol, propanol, kortkjedede ketoner, så som aceton, og polyalkoholer, så som glyserol.

Formuleringen i henhold til oppfinnelsen kan fortrinnsvis ytterligere omfatte et preserverende middel. Tilsetting av et preserverende middel er spesielt foretrukket hvis veksthormon er ment for flerdoseadministrering.

Et "preserverende middel" er en forbindelse som kan inkluderes i formuleringen for essensielt å redusere den bakterielle virkningen derpå, f.eks. for å fasilitere produksjon av en fleranvendelsesformulering. Eksempler på potensielle preserverende midler inkluderer oktadesyldimetylbenzylammoniumklorid, heksametoniumklorid, benzalkoniumklorid (en blanding av alkylbenzyldimetylammoniumklorider i hvilke alkylgruppene er langkjedede forbindelser), og benzetoniumklorid. Andre typer av preserverende midler inkluderer aromatiske alkoholer så som fenol, butyl, og benzylalkohol, alkylparabener så som metyl- eller propylparaben, katekol, resorcinol, sykloheksanol, 3-pentanol og m-kresol.

Et preserverende middel kan også være bakteriostatisk heri. Betegnelsen "bakteriostatisk" refererer seg til en forbindelse eller sammensetninger tilsatt en formulering for å virke som et antibakterielt middel. En preservert GH- inneholdende formulering i henhold til foreliggende oppfinnelse møter fortrinnsvis lovmessige eller regulatoriske retningslinjer for effektiviteten til preserveringsmidlet at det skal være et kommersielt gjennomførbart flerbruksprodukt. Eksempler på bakteriostatiske midler inkluderer fenol, m-kresol, p-kresol, o-kresol, klorkresol, benzylalkohol, alkylparaben (metyl, etyl, propyl, butyl og liknende), benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid, natriumdehydroacetat og timerosal.

Fortrinnsvis er det preserverende middel til stede i en konsentrasjon som varierer fra 1-10 mg/ml eller fra 2-5 mg/ml eller 3 mg/ml.

Det foretrukne preserveringsmidlet i henhold til oppfinnelsen er fenol.

I en annen side angår oppfinnelsen en fremgangsmåte til fremstilling av den flytende formuleringen som omfatter trinnet å fremstille en vandig oppløsning av komponenten i henhold til formuleringen i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Flytende formulering av hGH for terapeutisk administrering kan også fremstilles ved å kombinere hGH og stabiliseringsmidler som har den ønskede grad av renhet med fysiologisk akseptable eksipienter, buffere eller preserveringsmidler (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Osol A. red. (1980). Akseptable eksipienter er de som er ikke-toksiske for pasienten i de anvendte konsentrasjoner og doser, og inkluderer f.eks. buffere, preserveringsmidler, antioksidanter, pH- og tonisitetsmodifiserende midler.

Den flytende formuleringen av veksthormon kan også inkludere én eller flere andre stabiliserende eksipienter hvis ønsket. Ytterligere stabiliserende eksipienter kan inkludere f.eks. aminosyrer så som glysin eller alanin, mannitol eller andre sukkeralkoholer, eller glyserol. I tillegg kan den flytende formuleringen inkludere andre vekstfaktorer så som insulinliknende vekstfaktorer eller IGF-bindende proteiner.

Den økede stabiliteten til hGH tilveiebrakt ved formuleringen fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse tillater en bredere anvendelse av hGH-formuleringene som kan være mer konsentrert enn de vanligvis brukt i fravær av stabiliserende midler. F.eks. reduserer også hGH flytende formuleringer insidensen av overflateindusert denaturering av hGH som skjer under aerosolisering eller nålløs injeksjon av en hGH-formulering.

Betegnelsen "stabilitet" refererer seg til den fysikalske, kjemiske og konformasjonelle stabilitet av formuleringer av veksthormon i foreliggende oppfinnelse (inkludert opprettholdelse av biologisk kraft). Instabilitet av en proteinformulering kan forårsakes av kjemisk degradering eller aggregering av proteinmolekylene til å danne polymerer av høyere orden, ved deglykosylering, modifikasjon av glykosylering, oksidering eller enhver annen struktur, modifikasjon som reduserer minst én biologisk aktivitet til et GH-polypeptid inkludert i foreliggende oppfinnelse.

Autoinjektorer er kjent på området, så som den kalt Easyject<®>, som er spesielt nyttig for administrering av hGH. Nålløs administrering kan også benyttes i sammenheng med foreliggende oppfinnelse, ved å bruke spesielle anordninger som er kjent på området.

Farmasøytisk sammensetninger som omfatter formuleringen i henhold til oppfinnelsen kan fremstilles. Slike sammensetninger inkluderer hele sammensetningen som omfatter minst ett humant veksthormon eller derivat, analog eller variant derav i henhold til foreliggende oppfinnelse i en mengde som er effektiv til å utføre sin tenkte hensikt. Mens individuelle behov varierer er bestemmelse av optimale områder for effektive mengder av hver komponent innenfor fagområdet. Typiske doser omfatter ca. 0,001 til ca. 0,1 mg/kg kroppsvekt pr. dag. Når det administreres til pasienter kan hGH-terapien administreres sammen med andre terapier som kan være angitt i denne sykdommen.

Betegnelsen "administrere" eller "administrering" betyr å innføre en formulering i henhold til foreliggende oppfinnelse i kroppen til en pasient med behov derav for å behandle en sykdom eller tilstand.

hGH kan for eksempel bli administrert i en daglig dose på ca. 0,1-10 mg eller ca. 0,5-6 mg. Ytterligere foretrukket er en dose på ca. 1 mg humant veksthormon pr. person pr. dag.

hGH kan også bli administrert i alternerende doser, hvor den første dose er høyere enn den andre dose. Fortrinnsvis er den første dose på ca. 1 mg og den andre dose på ca. 0,5 mg. Ukentlige doser er fortrinnsvis ca. 6 mg eller ca. 5 mg eller ca. 4,5 mg, avhengig av pasientens behov. Betegnelsen "pasient" betyr et pattedyr som er behandlet for en sykdom eller tilstand. Pasienter er, men er ikke begrenset til, følgende oppfinnelse: human, fugl, svin, hund, storfe, kanin og liknende.

Formuleringen i henhold til foreliggende oppfinnelse er egnet for mange forskjellige administrasjonsregimer. F.eks. kan administrering være parenteral, så som subkutan, intravenøs, intramuskulær, oral, intraperitoneal, aerosol, transdermal, intratekal eller rektale ruter. Den administrerte dose avhenger av alder, helse og vekt hos resipienten, type av tidligere eller samtidig behandling, og hvis noen behandlingsfrekvens og typen av virkning som er ønsket.

Foretrukne administrasjonsruter de subkutane og intramuskulære ruter. En ytterligere foretrukket administrasjonsrute er den orale rute.

Det er forstått at den egnede dosen til en formulering i henhold til foreliggende oppfinnelse vil avhenge av alder, helse og vekt til resipienten, type sammenfallende behandling, hvis noen, behandlingsfrekvens, og typen av den ønskede effekt. Den mest foretrukne dosen kan imidlertid skreddersys til det individuelle individ, slik som det er forstått og kan bestemmes av én med kunnskap på området, uten unødvendig eksperimentering. Dette involverer typisk justering av en standarddose, f.eks. reduksjon av dosen hvis pasienten har en lav kroppsvekt.

Den totale dosen nødvendig for hver behandling kan administreres i flere doser (flerdose) eller i en enkel dose ("monodose").

Uttrykket "flerdosebruk" er ment å inkludere anvendelse av en enkel medisinflaske, ampulle eller patron med GH-formulering i mer enn én injeksjon, f.eks. 2, 3, 4, 5, 6 eller flere injeksjoner. Injeksjonen kan spres ut over tid, f.eks. med en periode på 6, 12, 24, 48 eller 72 timer.

Derfor kan en formulering i henhold til foreliggende oppfinnelse bli benytte for monodoseadministrering, eller for flerdoseadministrering. Typiske mengder av hGH formulert i henhold til oppfinnelsen er 8 eller 10 eller 12 mg/ml for endoseadministrering, eller 0,8 eller 2 eller 4 mg/ml for flerdoseadministrering.

Sammensetninger kan administreres alene eller sammen med andre terapeutika rettet på sykdommen eller rettet på andre symptomer derav.

hGH-formuleringene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan fordeles i små medisinflasker. Betegnelsen "liten medisinflaske" refererer seg bredt til et reservoar egnet for å holde GH i fast eller flytende form inneholdt i steril tilstand. Eksempler på en medisinflaske som brukt heri inkluderer ampuller, patroner, blisterforpakninger eller andre reservoarer egnet for levering av GH til pasienten gjennom sprøyte, pumpe (inkludert osmotisk), kateter, transdermal plaster, pulmonær eller transmukosal spray. Medisinflasker egnet for å pakke produkter for parenteral, pulmonal, transmukosal eller transdermal administrering er velkjent og anerkjent på området.

Den økede stabiliteten til hGH-formuleringer tillater langtids lagring ved en egnet temperatur, så som under frysepunktet (ved f.eks. -20°C) eller over frysepunktet, fortrinnsvis ved 2-8°C, mest fortrinnsvis ved +5°C, eller til og med ved romtemperatur, f.eks. ved +25°C.

Formuleringer av hGH som skal anvendes for in vivo administrering må være sterile. Dette kan f.eks. lett utføres ved filtrering gjennom sterile filtrasjonsmembraner.

Terapeutiske hGH flytende formuleringer blir generelt plassert i en beholder som har en steril tilgangsåpning, f.eks. en intravenøs oppløsningspose eller ampulle som har en kork som kan gjennomtrenges av en hypoderm injeksjonsnål.

Derfor angår en ytterligere side av oppfinnelsen den flytende formuleringen i henhold til oppfinnelsen hermetisk innelukket i steril tilstand i en beholder egnet for lagring før anvendelse.

Mens denne oppfinnelsen er blitt beskrevet sammen med spesifikke utforminger derav skal det forstås at det er mulig med ytterligere modifikasjoner. Denne søknaden er ment å dekke enhver variasjon, anvendelse eller tilpasning av oppfinnelsen ved å følge, generelt oppfinnelsens prinsipp å inkludere slike avvik fra den foreliggende beskrivelse som kommer innenfor kjent eller vanlig praksis innenfor området som oppfinnelsen hører under og som kan anvendes til essensielle trekk som er fremsatt tidligere og som følger ved området til de vedlagte krav.

Referanse til kjente fremgangsmåtetrinn, konvensjonelle fremgangsmåtetrinn, kjente fremgangsmåter eller konvensjonelle fremgangsmåter er ikke på noen måte en innrømmelse at noen side, beskrivelse eller utforming av foreliggende oppfinnelse er beskrevet, lært eller foreslått i den relevante teknikk.

Den foregående beskrivelse av de spesifikke utforminger vil slik totalt bringe tilsyne den generelle typen av oppfinnelsen som andre kan, ved å anvende kunnskap innenfor teknikken (inkludert innholdet av de siterte referanser), lett modifisere og/eller tilpasse for forskjellige anvendelser av slike utforminger, uten unødvendig eksperimentering, uten å avvike fra den foreliggende oppfinnelses generelle idé. Derfor er slike tilpasninger og modifiseringer ment å være innenfor betydningen av et område av ekvivalenter av de beskrevne utforminger, basert på læren og styringen presentert heri. Det skal også forstås at frasene eller terminologien heri er hensikten å beskrive og ikke for å begrense, slik at terminologien eller frasiologien i den foreliggende beskrivelse skal fortolkes av fagmannen i lys av læren og den styring presentert heri, i kombinasjon med kjennskapen til én med vanlig kunnskap på området.

Idet oppfinnelsen nå er beskrevet vil den lettere forstås ved referanse til følgende eksempel på en eksempel klinisk undersøkelsesoppskrift som er tilveiebrakt for å illustrere og ikke ment for å begrense foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1: Karakterisering av degradering av hGH

Siden Riggin-testen ikke er spesifikk for hver degraderingsform (en enkel topp kan inneholde mer enn ett degraderingsprodukt), ble en utstrakt karakterisering av degraderingsprofilen til r-hGH flytende formulering utført.

STRATEGI

Strategien for undersøkelsen ble delt i to faser, som beskrevet nedenfor:

Første fase:

1. Isolering av alle topper fra Riggins fremgangsmåte, fra en flytende utviklingsformulering lagret 6 måneder ved 25°C, parti PDOI/573D6H.

2. Karakterisering av toppene ved massespektrometri av hele molekylet.

3. Karakterisering av de mest forekommende toppene ved peptidkartlegging koblet til massespektrometri.

Andre fase:

1. Toppenekarakteriserti første fase av undersøkelsen ble anvendt for å utvikle alternative kromatografiske fremgangsmåter, hver spesifikk for en gitt degraderingsrute (én for desamidoformer, én for oksiderte former, én for N-trunkerte former, etc). 2. Etter oppsetting av fremgangsmåtene ble disse anvendt for å bestemme innholdet av hvert degraderingsprodukt i to r-hGH flytende formuleringsprøver, begge lagret ved 4°C så vel som utsatt for stressende betingelser ved å lagre dem 6 dager ved 40°C:

• Saizen flytende parti SJC201 6 dager ved 40°C

• Saizen flytende parti SJC201 18 måneder ved 4°C

• Serostim monodose flytende parti E4C101 6 dager ved 40°C

• Serostim monodose flytende parti E4C101 18 måneder ved 4°C

Disse prøvene ble analysert mot en frysetørket formulering nær ved utløpsdato, Saizen frysetørket parti B921A.

Partiene ble også testet ved peptidkartlegging koblet til massespektrometri, for fullt ut å karakterisere molekylene.

3. Fra de oppnådde data ble degraderingsrutene etablert.

RESULTATER

Karakteriseringen tillot å bestemme at degraderingsformene av r-hGH er som følger: • Iso-Asp 130 (hoved) og Iso-Asp 107 (sekundær), avledet fra isomerisering av asparaginsyrer.

• Deamidering av enten Asn 149 eller 152, og på Asn 99.

• Suksinimidmellomprodukter av enten Asp-isomerisering eller Asn-deamidering (hovedsakelig suksinimid av Asp 130).

• Des-Phe-Pro r-hGH avledet fra tapet av to N-terminale aminosyrer.

• Oksidering, hovedsakelig på metionin 14.

• De følgende fremgangsmåter ble uttrykt:

• RP-HPLC i TF A for oksiderte former

• Ioneutbyttekromatografi for desamidoformer

• Peptidkartlegging for både iso-Asp 130 og iso-Asp 107

• HI-HPLC for Des-Phe-Pro r-hGH

• Mens suksinimidformene er kvantifiserbare ved Riggins (hoveddelen er suksinimid av Asp 130).

Mengden av de graderings former detektert i prøvene er vist i tabell A.

Ved å sammenligne dataene ovenfor kan det fastslås at de viktigste degraderingsrutene til r-hGH i flytende formulerigner er:

• Deamidering

• Isomerisering av asparaginsyrer

• Tap av de to N-terminale aminosyrer.

Oksidering øker ikke ved lagring ved 40°C i 6 dager.

Eksempel 2: hGH flytende formuleringer for enkeltdoseadministrering Innledning

En flytende formulering av r-hGH ble utviklet som presenterer en enklere farmasøytisk presentasjon enn et lyofilisert produkt. En gradvis utviklingstilnærming ble tatt for å sikre sikkerheten til de nye flytende formuleringene av r-hGH. Utstrakt karakterisering av degraderingsprofilen ble utført så vel som undersøkelser av generell toksisitet og lokal tolererbarhet for denne nye formuleringen. I tillegg ble en sammenlignende biotilgjengelighetsundersøkelse utført for å demonstrere bioekvivalens mellom den nye flytende formuleringen og den lyofiliserte formulering som for tiden er godkjent.

Som del av den farmasøytiske utvikling ble egnetheten og stabiliteten til formuleringen vurdert for følgende parametere:

• pH og buffere

• Ionisk styrke av bufferen

• Eksipienter

Stabiliteten til kandidatformuleringen ble deretter undersøkt i en valgt beholder for å bestemme fremstillingsprosessen, overfyll og lukkesystemet for beholderen.

Etter denne utviklingen ble legemiddelproduktet presentert som en vandig oppløsning av rekombinant humant veksthormon i sitratbuffer ved pH 5,85, sukrose og Poloxamer 188 fylt i 3 ml glasspatroner. Legemiddelproduktet ble formulert i en konsentrasjon på 12,0 mg/ml og tilbudt i en 3 ml nominell kapasitetpatron med bromobutylkork. Patronene er fylt med 0,5 r-hGH-oppløsning for injeksjon for å levere 6,0 mg r-hGH til pasienten.

Komponenter i legemiddelproduktet

Legemiddelproduktet ble presentert som en enkeldose vandig oppløsning av Somatropin (rekombinant humant veksthormon, r-hGH) i sitratbuffer, sukrose og Poloxamer 188 fylt i 3 ml type I glasspatron.

Legemiddelproduktet ble formulert i en konsentrasjon på 12,0 mg/ml for å levere 6,0 mg/dose av r-hGH til pasienten når 0,5 ml av oppløsningen blir administrert.

Legemiddelstoff

Kompatibiliteten til legemiddelstoffet med formuleringseksipienter Kompatibiliteten av legemiddelstoffet med formuleringseksipienter ble evaluert ved å ta i betraktning eksperimenter gjort under utvikling av r-hGH lyofilisert formulering så vel som under preliminære screeningsundersøkelser rettet mot undersøkelse av gjennomførbarheten av presentasjonen av det flytende produkt. Disse eksperimentene viste at: • r-hGH hoveddegraderingsprodukt er den deamiderte form og denne er strengt korrelert til pH. En pH rundt 6,0 minimaliserer slik degradering; • Oppløseligheten er en ytterligere kritisk parameter påvirket av pH, nærvær av bakteriostatiske midler og mekanisk stress. For å unngå utfelling av r-hGH er det nødvendig å finne en egnet likevekt blant formuleringskomponentene.

Seleksjon av buffermiddel

Seleksjon av buffermiddel ble evaluert ved å ta i betraktning følgende:

• Virkning av buffermiddelkonsentrasjonen på deamideringshastigheten; • Virkning av buffermiddelkonsentrasjonen på proteinoppløseligheten;

• Virkning av buffermiddelkonsentrasjonen på pH-stabiliteten.

Flere oppløsninger som inneholder legemiddelstoffet og buffer (acetat og sitronsyre) ble fremstilt og utsatt for ristestresstester for å indusere r-hGH-utfelling; de samme oppløsninger blir også lagret ved +25 +2°C for å akselerere degradasj onsruten.

Resultatene viste det følgende:

• Buffermiddelkonsentrasjonen har en relevant innflytelse på r-hGH-deamidering; særlig er degraderingen høyere ved høyere konsentrasjon; • Buffermiddelkonsentrasjonen har en relevant innflytelse på r-hGH- solubiliseringen; særlig er solubiliseringen lavere ved høyere konsentrasjon;

• Anvendelse av sitronsyre som surgjørende middel sammenlignet med en 10 mM acetatbuffer stabiliserer bedre pH tett til 6,0.

Seleksjon av eksipienter

Kompatibiliteten av legemiddelstoffet med to forskjellige eksipienter (sukrose og mannitol) ble vurdert ved å undersøke deres innflytelse på r-hGH-oppløselighet og deamideringshastighet.

Flere oppløsninger som inneholder buffersystem og sukrose eller mannitol ble fremstilt og utsatt for ristende stresstester for å indusere r-hGH-utfelling, de samme oppløsninger ble også lagret ved +25 +2°C for å akselerere degraderingsruten.

Eksperimentelle resultater viste at:

• Enten sukrose eller mannitol forbedrer r-hGH-oppløselighet; • Tilsetting av mannitol eller sukrose til formuleringen øker lett degradering av r-hGH testet ved RP-HPLC (fig. 1).

Fig. 1 viser RP-HPLC-resultater etter 4 ukers lagring ved +25+2°C av r-hGH flytende formuleringer som inneholder mannitol eller sukrose eller ingen eksipient.

Seleksjon av en surfaktant

Flere formuleringer som inneholder buffersystemer, isotonisitetsmiddel (sukrose eller mannitol) og surfaktanter (tensioaktive midler) under evaluering (Polysorbat 20 eller Poloxamer 188) ble fremstilt og utsatt for ristende stresstester (mekanisk stresstest utført ved å bruke en Vortex) som indiserer r-hGH-utfelling. To konsentrasjoner av surfaktant ble testet under denne preliminære vurderingen; én høy konsentrasjon på 1,0 mg/ml og én lav konsentrasjon på 0,01 mg/ml. Deretter ble formuleringene visuelt inspisert. De samme oppløsninger ble lagret ved +25+2°C for å akselerere degraderingsruten.

Resultater viste følgende:

• Den høyere tensioaktive middelkonsentrasjonen testet (1,0 mg/ml) forbedret signifikant proteinoppløseligheten selv om noe positiv virkning ble observert ved å tilsette en lavere mengde, så som 0,01 mg/ml; • Tilsetting av et tensioaktivt middel (Poloxamer 188 eller Polysorbat 20 ved 1,0 eller 0,01 mg/ml) til formuleringen øket lett degradering av r-hGH (fig. 2); • Poloxamer 188 og Polysorbat 20 forbedret r-hGH-oppløseligheten likt.

Fig. 2 viser RP-HPLC-resultater etter 4 ukers lagring ved +25+2°C av r-hGH flytende formuleringer som inneholder tensioaktive midler ved forskjellige konsentrasjoner og ingen tensioaktive midler.

Under en parallell utvikling av en flytende multidose formulering ble det observert at Polysorbat 20 induserer dannelse av en hvit gjennomskinnelig suspensjon i nærvær av bakteriostatiske midler så som m-kresol og fenol. På grunn av denne virkning ble Poloxamer 188 valgt som den foretrakkede surfaktanten.

Total konklusjon fra screeningsundersøkelser:

Konklusjonen fra preformuleringsundersøkelser kan oppsummeres som følger:

• Buffermiddelkonsentrasjonen har en innflytelse på r-hGH-deamidering og solubilisering; (en bufferpolaritet større enn 20 mM induserer en høyere degradering av molekylet) • Anvendelse av sitronsyre som surgjøringsmiddel i kontrast til en 10 mM acetatbuffer stabiliserer bedre pH tett til 6,0; • Enten sukrose eller mannitol forbedrer r-hGH-solubilitet og øker lett degradering av r-hGH; • Nærvær av en surfaktant i en konsentrasjon på minst 1,0 mg/ml forbedrer signifikant proteinoppløseligheten; • Poloxamer 188 og Polysorbat 20 forbedrer r-hGH-oppløseligheten; • Fra en parallell undersøkelse rettet på å utvikle en flytende multidosepresentasjon ble inkompatibilitet mellom Polysorbat 20 og bakteriostatiske midler, så som fenol eller m-kresol observert og begrenser dets anvendelse.

Kandidatformuleringer

Fra de tidligere screeningsundersøkelser ble fem kandidatformuleringer fremstilt i laboratorieskala og utsatt for akselererte (+25+2°C) og langtids (5 + 3°C) stabilitet. En prøve av hver formulering ble fylt i 3 ml glasspatroner utstyrt med halobutyl lukkesystem.

Sammensetningen til de fem formuleringene er beskrevet i følgende tabell 1.

Laboratorieskalapartier og stabilitetsresultater

De følgende tabeller 2 og 3 rapporterer resultatene oppnådd ved testing av formuleringene ved de mest relevante stabilitetsindikerende parametere (r-hGH- innhold, beslektede proteiner, dimerer og stoffer med høy molekylvekt, partikkelstoffer og pH).

RP-HPLC-data for beslektede proteiner ble statistisk analysert ved lineær regresjon. De oppnådde resulatter viste følgende: • De acetatbufrede formuleringer ved 8,0 og 12,0 mg/ml har en degraderingshastighet større enn formuleringen som inneholder sitronsyre eller sitratbuffer; dette ekskluderte bruken av acetat som buffer for r-hGH-formuleringen (fig-3); • Regresjonslinjer for kandidatformulering #3, #4 og #5 viste en homogen helning og homogen krysning; • Sitratbuffer og sitronsyre er like med hensyn på degraderingshastighet; • r-hGH-konsentrasjonen spiller ikke noen relevant rolle for slik degradering (fig. 4). Årsakene til den forskjellige degraderingshastighet til laboratorieskalakandidatformuleringene skyldes forskjell i pH blant formuleringene. De acetatbufrede formuleringer, så vel som formuleringen som inneholder sitronsyre som surgjørende middel, viser en signifikant økning av denne parameter etter 1 måneds lagring (fig. 5 (stabilitet ved +25°C) og fig. 6 (stabilitet ved +4°C)). Slektskapet mellom pH og deamideringshastigheten er velkjent og den er den viktigste kontrollparameter for å redusere denne degraderingen. Formulering med sitratbuffer har en stabil pH som kunne forklare grunnen til dens bedre stabilitet sammenlignet med de andre.

I tillegg var SE-HPLC for r-hGH-innholdresultatet statistisk analysert ved en lineær regresjonsmodell. Resultatene viste følgende: • Ingen statistisk signifikante forskjeller mellom laboratorieskalapartiene og ingen statistisk signifikant tendens ble observert over stabilitetsperioden. I tabell 4 og 5 er de statistiske resultatene rapportert.

Videre ble ingen forskjeller mellom kandidatformuleringer observert for parameterpartikkelstoffet.

Konklusjon

Stabilitetsundersøkelsen på de 5 kandidatformuleringene konfirmerte den viktige rollen til pH ved kontroll av r-hGH degraderingshastighet. Den følgende formulering ble derfor valgt for produksjon på en pilotskala:

EKSIPIENTER

Formuleringen utviklet som beskrevet ovenfor har bestemt eksipientene som er nødvendig for å stabilisere en flytende r-hGH-formulering. Disse eksipienter er beskrevet under for å forklare:

• funksjonen

• den selekterte konsentrasjonen

• tøyeligheten med farmakopoetiske monografer

Sukrose

Funksjonen til sukrose er å skape en isoton omgivelse og stabilisere proteinet. Konsentrasjonen av sukrose valgt fra det endelige produkt er 60,0 mg/ml.

Sukrose anvendt er overenstemmende med USP og Ph.Eur.

Sitratbuffer

10 mM sitronsyre blir justert til pH 5,8-6,2 ved tilsetting av

natriumhydroksidoppløsning som reduserer dannelsen av deamidert protein mens maks adekvat oppløselighet opprettholdes.

Sitratbuffer er overenstemmende med Ph.Eur. og USP.

Poloxamer 188

Poloxamer 188 ble brukt for å øke oppløseligheten til r-hGH og for å unngå dannelsen av partikkelstoff.

Konsentrasjonen på 1,5 mg/ml ble selektert siden denne er den mest effektive til å forsterke oppløseligheten av slike proteiner.

Poloxamer 188 anvendt er overenstemmende med USP og Ph.Eur.

Vann for injeksjoner

Alle eksipienter er fullt oppløselige i WFI i de krevde konsentrasjoner.

WFI brukt er overenstemmende med USP og Ph.Eur.

Eksempel 4; Utvikling av formulering

Etter egnede preformuleringsundersøkelser og vurdering av stabilitetsresultatene tilgjengelig på laboratorieskalapartier, ble den endelige formuleringen valgt.

Fysikalsk- kjemiske og biologiske egenskaper

Virkning av pH

Basert på undersøkelsene utført for å bestemme pH-virkningen ble det observert at pH er en signifikant parameter for r-hGH-stabilitet. Særlig er et pH-område mellom 5,8-6,2 i stand til å minimalisere deamideringen, som er én av de viktigste degraderingsruter til r-hGH.

Effekt av ionestyrke

Eksperimentene utført demonstrerte at den økede molariteten til buffersystemet tilstede i den flytende formuleringen kan indusere en høyere degraderingshastighet detektert ved RP-HPLC og likeledes redusere r-hGH-oppløseligheten og indusere utfelling. Buffersystemet ble derfor selektert ved en konsentrasjon på 10 mM for å optimalisere pH mens de negative virkningene på r-hGH-stabilitet ble minimalisert.

Aggregering ( dimerer og HMW- stoffer)

De eksperimentelle undersøkelsene utført viste at r-hGH presentert i flytende formulering er usannsynlig til å danne aggregater under lagringen ved akselererte (+25+2°C) eller langtids (+5±3°C) betingelser.

Biologisk aktivitet

In vivo biologisk aktivitet (vektøkning i hypofysektomiserte rotter) ble testet ved bioassay. De spesifikke aktivitetsresultatene for både de nylig utviklede flytende formuleringene så vel som den lyofiliserte formuleringen møtte de etablerte aksepteringskriteriene for spesifikk aktivitet.

Degraderingsprofil

Utstrakt karakterisering ble utført for å sammenligne degraderingsprofilen til den nydannede flytende formuleringen med degraderingsprofilen til den for tiden godkjente lyofiliserte formulering. De oppnådde resultater demonstrerte at den samme degraderingsprofilen til r-hGH ble oppnådd under lagring, med høyere mengder av beslektede proteiner identifisert ved RP-HPLC for den flytende formuleringen.

Eksempel 5; Utvikling av fremstillingsprosess

Fremstillingsprosessen av denne flytende formuleringen består av følgende trinn:

• Sammensetning av den flytende formuleringen; • Prefiltrasjon gjennom 0,45 membran; • Steril filtrering gjennom 0,22 membran; • Oppfylling i patron;

• Krymping av hver patron.

Dette er en standard fremstillingsprosess (se også flytskjema på følgende side) for denne farmasøytiske formen. Det mest kritiske prosesstrinnet er sterilisering ved aseptisk filtrasjon. Under utvikling av den flytende monodoseformuleringen ble det observert at den sammensatte legemiddelproduktoppløsning presenterte noe lett opalisering før filtrering. Denne opaliseringen er sannsynligvis forårsaket av noe utfelling av nativ r-hGH i sammenheng med den lave oppløseligheten til dette molekylet ved en lett sur pH. For å unngå at den sterile filtrasjonen gjennom en 0,22 membran representerer et vanskelig og risikabelt trinn under fremstillingsproduktet for legemidlet, ble det tilføyd en prefiltrasjon gjennom en 0,45 (am membran.

Undersøkelsen ble derfor utført med den hensikt å undersøke om tilsetting av et prefiltrasjonstrinn var egnet for å gjøre oppløsningen klar før sterilfiltrasjon når man tar i betraktning at begrensningene relatert til fremstillingsutstyret var:

• Filtrasjonsforhold ikke mer enn 15 g/cm<2>

• Nitrogentrykk ikke større enn 1,5 atm.

Sammensetningen av formuleringen brukt til å undersøke prefiltrasjonstrinnet er rapportert i tabell 6.

Undersøkelsesresultatene er som følger:

• 17 g/cm av sammensetningen kan filtreres på 0,45 membran ved 1

atm.

• 31 g/cm2 av prefiltratet kan filtreres på 0,22 membran ved 1 atm.

Undersøkelsen konkluderte med at innføring av et prefiltrasjonstrinn ved å bruke 0,45^m membran, med et nitrogentrykk på 1 atm., er egnet til å klargjøre r-hGH flytende sammensetningsoppløsning før sterilfiltrering gjennom et 0,22 membran. Filtrasjonsgraden på 15 g/cm<2>foreslått av legemiddelproduktfabrikkanten er også egnet for å utføre prefiltrasjonen av den sterile filtrering. Flytskjemaet oppsummerer pilotskalafremstillingsprosessen.

Eksempel 6; Utvikling av flytende GH-formulering for flerdoseadministrering Kompatibilitet av legemiddelstoffet med eksipienter

Resultatene er oppsummert nedenfor:

• r-hGH hoveddegraderingsprodukt er den deamiderte form og denne er korrelert til pH. pH-verdier rundt 6,0 minimaliserer slik degradering; • Oppløseligheten er en ytterligere kritisk parameter påvirket av pH, nærvær av bakteriostatiske midler og mekanisk stress; • For å unngå utfelling av r-hGH er det nødvendig å finne en egnet likevekt mellom formuleringskomponenter.

Utveksling av buffermiddel

Seleksjon av buffermiddel som tilsettes den flytende formuleringen ble evaluert ved å ta følgende i betraktning: • Virkning av buffermiddelkonsentrasjonen på deamideringshastigheten; • Virkning av buffermiddelkonsentrasjonen på proteinoppløseligheten;

• Virkning av buffermiddelkonsentrasjonen på pH-stabilitet.

Flere oppløsninger som inneholder legemiddelstoff på 6,0 og 12,0 mg/ml og buffer (acetat og sitronsyre) ble fremstilt og utsatt for ristestresstester for å indusere r-hGH-utfelling; de samme oppløsningene ble også lagret ved +40+2°C for å akselerere degraderingsruten.

Resultatene viste følgende:

• Buffermiddelkonsentrasjonen har en relevant innflytelse på r-hGH-deamidering, særlig er degraderingen høyere jo høyere molariteten er; • Buffermiddelkonsentrasjonen har en relevant innflytelse på r-hGH-oppløsning, særlig i høyere molaritet, lavere oppløselighet; • Anvendelse av sitronsyre som surgjørende middel i forhold til en 10 mM acetatbuffer stabiliserer bedre pH tett til 6,0.

Seleksjon av isotonisitetsmidler

Kompatibiliteten av legemiddelstoffet med to forskjellige isotonisitetsmidler (sukrose og mannitol) ble evaluert ved å vurdere deres innflytelse på r-hGH-oppløselighet og deamideringshastighet.

Flere oppløsninger som inneholder buffersystemer ved 6,0 og 12,0 mg/ml og sukrose eller mannitol ble fremstilt og utsatt for riste stresstester for å indusere r-hGH-utfelling; de samme oppløsninger ble også lagret ved +40+2°C for å akselerere degraderingsruten.

Resultatene viste følgende:

• Enten sukrose eller mannitol forbedrer r-hGH-oppløselighet; • Tilsetting av mannitol eller sukrose til formuleringen øker lett degradering av r-hGH.

Seleksjon av en surfaktant

Flere formuleringer på 6,0 og 12,0 mg/ml ble fremstilt og utsatt for ristestresstester for å indusere r-hGH-utfelling; de samme oppløsninger ble også lagret ved +25+2°C for å akselerere degraderingsruten.

Resultatene viste følgende:

• Den høyere surfaktantkonsentrasjonen testet (1,0 mg/ml) forbedret signifikant proteinoppløseligheten til og med hvis noe positiv virkning ble observert ved å tilsette en lavere mengde så som 0,01 mg/ml; • Tilsetting av surfaktant til formuleringen øket lett degraderingen av r-hGH; • Poloxamer 188 og Polysorbat 20 forbedret likt r-hGH-oppløseligheten.

Seleksjon av et bakteriostatisk middel

Flere formuleringer på 0,8 mg/ml av r-hGH som inneholdt 0,9 % benzylalkohol eller 0,3 % fenol ble fremstilt og utsatt for bakteriostatisk

effektivitetsscreeningsundersøkelser. M-kresol ble ikke testet på grunn av dets inkompatibilitet med surfaktanter.

Resultatene viste følgende:

• Både 0,9 % benzylalkohol og 0,3 % fenol møtte kriteriene B i Eu.Ph.

Total konklusjon fra preformuleringsundersøkelsene

Konklusjonen fra preformuleringsundersøkelsene kan oppsummeres som følger:

• Buffermiddelkonsentrasjonen har en effekt på r-hGH-deamidering og oppløselighet; • Anvendelse av sitronsyre som surgjøringsmiddel i forhold til en 10 mM acetatbuffer stabiliserer bedre pH nær til 6,0; • Enten sukrose eller mannitol forbedrer r-hGH-oppløselighet og forbedrer lett degraderingen av r-hGH; • Nærvær av en surfaktant i en konsentrasjon på minst 1,0 mg/ml forbedrer signifikant proteinoppløseligheten selv om noe positiv virkning ble observert ved å tilsette en lavere mengde så som 0,01 mg/ml; • Tilsetting av et tensioaktivt middel til formuleringen øker lett degraderingen av r-hGH; • Poloxamer 188 og Polysorbat 20 forbedrer likt r-hGH-oppløselighet; • M-kresol er ikke kompatibel med surfaktanter; • 0,9 % benzylalkohol og 0,3 % fenol møtte kriteriene B i Eu.Ph.

Stabilitetsundersøkelser for kandidatformuleringer

Fra de tidligere preformuleringsundersøkelsene ble åtte kandidatformuleringer på 0,8 mg/ml og 4,0 mg/ml av r-hGH som inneholder både acetat og sitronsyre som buffermiddel og benzylalkohol eller fenol som bakteriostatisk middel fremstilt i laboratorieskala utsatt for akselerert (+25+2°C) og langtids (5+3°C) stabilitetstester. Prøver av hver formulering ble fylt på 3 ml glasspatroner utstyrt med en West Pharmaceutical brombutyl 4023/50 korker. Under stabilitetstesten av det første settet av åtte kandidater ble det besluttet å fremstille én ytterligere formulering på 0,8 mg/ml som inneholdt 10 mM sitratbuffer og fenol. Sammensetningen til de ni formuleringer er beskrevet i følgende tabeller.

Stabilitetsresultater for kandidatformuleringer

Stabilitetsdata for kandidatformuleringer er tilgjengelige fra opptil seks måneders akselererte betingelser ved +25+2°C og 12 måneders langtids ved +5+3°C (se vedlagte tabeller).

Resultatene viser følgende:

• Formuleringer som inneholder acetatbuffer er mindre stabile enn formuleringer som inneholder sitronsyre eller sitratbuffer; • Formulering som inneholder sitratbuffer stabiliserer bedre oppløsningens pH; • Den eneste degraderingsruten observert over stabilitetsperioden er deamidering av r-hGH som er detekterbar ved RP-HPLC; • Formuleringer som inneholder 0,9 % benzylalkohol viste ikke-homogen adferd og ble av denne grunn kastet. Dette er sannsynligvis relatert til urenheter tilstede i forskjellige partier av benzylalkohol; • Proteinkonsentrasjonen innvirker ikke på degraderingshastigheten; • Den estimerte degraderingshastioghet ved +5+3°C i sitratbufret og sitronsyreformuleringer er sammenlignbare (0,7-0,8 %/måned), mens formuleringen som inneholder acetatbuffer har en degraderingshastighet på ca. 1,1 %/måned.

På basis av ovenstående resultater ble det bestemt å selektere formuleringen som inneholder sitratbuffer og fenol for teknologioverføring til produksjonsstedet.

Eksempel 7; Spesifikk formulering for flertallsdoseadministrering

De følgende formuleringer for flertallsdoseadministrering ble testet for stabilitet og oppløselighet.

Formuleringer 6-8 (for flerdoseadministrering) var som vist i tabell 9:

Stabilitetsdataene til disse tre formuleringene ved +25°C og +5°C, som målt ved prosentandel degraderte proteiner ved RP-HPLC, er vist i henholdsvis fig. 7 og fig. 8.

De følgende konklusjoner kan trekkes fra dette eksperimentet:

• 0,5 % fenolformulering presenterte rikelig partikkelstoff med påfølgende reduksjon i proteininnhold; • Ingen reduksjon i proteininnhold over stabiliteten ved +5°C for 0,9 % BA og 0,25 % fenolformuleringer; • Signifikant økning i pH under lagring ved +25°C og +5°C (fra 6,0 til 6,4-6,5); • Ingen økning i stoffer med høy molekylvekt; • Intet partikulært stoff i 0,9 % BA og 0,25 % fenoloppløsning.

Formuleringer 9-17 (for flerdoseadministrering):

Stabilitetsdataene til disse tre formuleringene ved +25°C og +5°C, som målt ved prosentandel av degraderte proteiner med RP-HPLC, er vist i henhold til fig. 9 og fig. 10. pH-variasjonene ved +25°C over en periode på 6 måneder er vist i fig. 11.

Følgende konklusjoner kan trekkes av denne serien av eksperimenter:

• Ingen reduksjon i proteininnhold over stabiliteten ved +5°C

• Signifikant variasjon av pH over stabiliteten ved +5°C og +25°C for acetat-og sitronsyreformuleringer - ikke signifikant for sitratbufferformulering • Ingen økning av stoffer med høy molekylvekt over stabiliteten ved +5°C

• Intet partikkelstoff i oppløsning.

REFERANSER

1. Altschul S F et al, J Mol Bioi, 215,403-410,1990

2. Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402,1997

3. Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and

Wiley Intersctence (New York, 1987-1998)

4. Becker et al, Biotechnol. Appl. Biochem. 10:326 (1988)

5. Bewly et al, Int J. Peptjde and Protein Res. 4:281-287 (1972)

6. Chen etat, Genomlcs 4:479-497 (1989)

7. Devereux J et at, Nucleic Acids Res, 12,387-395,1984.

8. GerUer et ai, Endocrinology 118:720 (1986)

9. Goeddel et ai Nature, 281:544 (1979)

10. Graff et al, J. Biol. Chem. 257:2365 (1982)

11. Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974).

12. Hsiung et al, Biotechnology 7:267 (1989)

13. Jorgensson et al, Pharmacol. Toxicol. 63:129 (1988)

14. Lewis et al, Endocrinology 101:1587 (1977)

15. Lewis et al, J. Biol. Chem. 253:2679 (1978)

16. Lewis et al, Endocrinology 104:1256 (1979)

17. Lewis et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 92:511 (1980)

18. Lewis et al, J. Bioi. Chem. 256:11645 (1981)

19. Marlial et al, Science 205:602-607 (1979)

20. Meinkoth J, Wahl G. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports.Anal Biochem. 1984 May 1;138(2):267-84.

21. Moore et al, Endocrinology 122:2920 (1988)

22. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183,63-99,1990

23. Pearson W R and Lipman D J, Proe Nat Acad Sei USA, 85,2444-2448,1988 24. Peariman and Nguyen (1989), In D. Marshak and D. Liu (eds), Therapeutic Peptides and Proteins, Formulations, Detivery and Targeting, Current Communications in Molecular Biology, Cold-Spring Harbour Laboratory, Cold SpringHarbour, New York, pp 23-30

25. Singh et al, Endocrinology 94:883 (1974)

26. Smith et al, Science 260:1640-1643 (1998) 27. Smith and Waterman J Mol Biol, 147,195-197, 1981, Advances in Applied

Mathematics, 2,482-489,1981

28. Thoriacius-Ussing, Neuroendocrinology 43^33 (1987)

29. WO 93/19776 30. WO 94/101398 31. EP-0131864 32. EP-0211601 33. WO 97/29767 34. US-5,567,677

Claims

1. Flytende formulering, karakterisert vedat den omfatter a) et veksthormon, eller et veksthormonfrigjørende hormon; b) polyetylen-polypropylenglykol; c) en sitratbuffer; og d) sukrose som stabilisator i en konsentrasjon fra 10 mg/ml til 100 mg/ml, eller 20 mg/ml til 80 mg/ml, eller omtrent 60 mg/ml.

2. Formulering som angitt i krav 1, karakterisert vedat veksthormonet er humant veksthormon.

3. Formulering som angitt i ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat den omfatter sitrat i en konsentrasjon som varierer fra 1-100 mM eller fra 5-50 mM eller fra 10-20 mM.

4. Formulering som angitt i ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat den har en pH i området 5-7, eller 5,5-6,5 eller ca. 6.

5. Formulering som angitt i ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat den omfatter polyetylen-polypropylenglykol i en konsentrasjon som varierer fra 0,5-5 mg/ml, eller 1-2 mg/ml eller 1,5 mg/ml.

6. Formulering som angitt i ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat polyetylen-polypropylenglykolen er en pluronisk polyol.

7. Formulering som angitt i krav 6, karakterisert vedat den pluroniske polyolen er Pluronic F68.

8. Formulering som angitt i ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter et preserverende middel.

9. Formulering som angitt i krav 8, karakterisert vedat den omfatter det preserverende middel i en konsentrasjon som varierer fra 1-10 mg/ml, eller 2-5 mg/ml eller 3 mg/ml.

10. Formulering som angitt i krav 8 eller 9, karakterisert vedat det preserverende middel er fenol.

11. Formulering som angitt i ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat den har en pH på 5,9 og består av r-hGH, sukrose, Poloxamer 188, sitronsyre og/eller sitratbuffer og eventuelt vann for injeksjon.

12. Formulering som angitt i ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat den har en pH på 5,9 og består av r-hGH, sukrose, Poloxamer 188, sitronsyre, fenol og eventuelt vann for injeksjon.

13. Formulering som angitt i ethvert av kravene 1-12,karakterisert vedat den er hermetisk lukket i en steril tilstand i en beholder som er egnet for lagring før anvendelse.

14. Fremgangsmåte til fremstilling av en flytende formulering som angitt i ethvert av de foregående krav, karakterisert vedat den omfatter trinnet for å fremstille en vandig oppløsning av komponentene i (a)-(d).