EA010626B1 - Жидкий состав гормона роста - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к жидкому составу, содержащему гормон роста или гормон, высвобождающий гормон роста (GHRH); полипропилен-полиэтиленгликоль; цитратно/фосфатный буфер, соль щелочного металла и соль щелочно-земельного металла, и к способу его получения.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к жидким составам гормона роста (СН) и, в частности, к жидким составам человеческого гормона роста (ЙСН) с улучшенной химической и физической устойчивостью. Жидкие составы гормона роста согласно изобретению можно сохранять в течение продолжительного времени при комнатной температуре. Настоящее изобретение также относится к способу получения таких жидких составов СН и к формам их представления.

Уровень техники изобретения

Человеческий гормон роста (11СН), известный также как соматропин (ΙΝΝ - международное непатентованное название) или соматотропин, представляет собой белковый гормон, вырабатываемый и секретируемый соматотропными клетками переднего гипофиза. Человеческий гормон роста играет ключевую роль в соматическом росте в детском возрасте и в обмене веществ у взрослых посредством его влияния на метаболизм белков, углеводов и липидов.

Человеческий гормон роста представляет собой одиночную полипептидную цепочку из 191 аминокислоты (Ве\\1у е! а1., 1972), имеющую две дисульфидные связи. одна из которых находится между Сук-53 и Сук-165, образуя в молекуле большую петлю, а другая связь образует между Сук-182 и Сук-189 маленькую петлю около С-конца. Последовательность ДНК, подтверждающая аминокислотную последовательность, была опубликована авторами Магйа1 е! а1., 1979. Очищенный 11СН представляет собой лиофилизированную форму белого аморфного порошка. Он легко растворяется (в концентрации >10 мг/л) в водных буферных растворах с уровнем рН в диапазоне от 6,5 до 8,5.

В растворе 11СН существует, преобладающим образом, в виде мономера с наличием небольшой фракции димеров и высокомолекулярных олигомеров. При некоторых условиях 11СН можно подвергать стимуляции для образования больших количеств димеров, тримеров и высших олигомеров.

Известно несколько производных ЙСН, в число которых входят встречающиеся в природе производные, вариабельные продукты и продукты метаболизма, продукты распада, прежде всего биосинтетических 11СН и произведенные генетическими методами генно-инженерные производные 11СН. Один из примеров встречающихся в природе производных 11СН представляет собой СН-У, вариант гормона роста, обнаруживаемый в плаценте. Другие члены локуса гена описаны в публикации С'йеп е! а1., 1989.

Метионил-ЬСН являлся первой формой ЙСН, полученной путем технологии рекомбинантных ДНК. Это соединение фактически представляет собой производное ЙСН, имеющее на Ν-конце один дополнительный метиониновый остаток (Соеббе1 е! а1., 1979).

Имеются публикации о том, что вариант встречающегося в природе ЙСН, называемого 20-К-йСН, выявляется в гипофизе, а также в кровотоке (ЬеМк е! а1., 1978; ЬеМк е! а1., 1980). Это соединение, в котором отсутствуют 15 аминокислотных остатков от глутаминовой кислоты С1и-32 до глутамина С1п-46, является результатом альтернативного сплайсинга информационной рибонуклеиновой кислоты (Ле№1о е! а1., 1981). Это соединение обладает многими, но не всеми биологическими свойствами 11СН.

20-К-йСН вырабатывается в гипофизе и секретируется в кровь. Его количество составляет примерно 5% выработки гормона роста у взрослых и примерно 20% выработки гормона роста у детей. Он имеет сходную активность по ускорению роста, как у гормона роста 22 КО, и по опубликованным данным, имеет равную или более высокую степень липолитической активности по сравнению с формой 22 КО. Он связывается с рецепторами гормона роста с аффинностью, равной аффинности гормона роста 22 КО, и по сравнению с гормоном роста 22 КО обладает десятой частью его лактогенной (пролактиноподобной) биоактивности. 20-К-йСН в отличие от 22 кЭ имеет слабую антиинсулиновую активность.

Ряд производных 11СН появляется в результате протеолитических модификаций молекулы. В первичный путь метаболизма 11СН входит протеолиз. Область 11СН вокруг 130-150 остатков является чрезвычайно восприимчивой к протеолизу, и описано несколько производных ЙСН, имеющих одноцепочечные разрывы или делеции в этой области (1Ъог1асшк-икктд, 1987). Эта область находится в большой петле ЙСН, и распад пептидной связи в этой области приводит к появлению двух цепей, которые связаны посредством дисульфидной связи в Сук-53 и Сук-165. Имеются публикации, что многие из этих двухцепочечных форм обладают повышенной биологической активностью (8тдй е! а1., 1974). Искусственным путем с помощью ферментов производят многие производные человеческого гормона роста. Для модификации 11СН в различных точках всей молекулы используют ферменты трипсин и субтилизин, а также другие ферменты (ЬеМк е! а1., 1977; СгаГГ е! а1., 1982). Один из таких производных, назызаемых двухцепочечным анаболическим белком (2-САР), образовывали путем регулируемого протеолиза 11СН с использованием трипсина (Вескег е! а1., 1989). Было выявлено, что 2-САР имеет биологические свойства, очень отличающиеся от свойств интактной молекулы ЙСН, так как активность по ускорению роста 11СН в значительной степени сохранялась, и влияние на углеводный обмен чаще всего отсутствовало.

При подходящих условиях аспарагиновые и глутаминовые остатки в белках являются восприимчивыми к реакциям дезаминирования. Показано, что этот тип реакции, проведенный у гипофизарного ЙСН, приводит к преобразованию аспарагина Акп-152 в аспарагиновую кислоту и также, в меньшей степени, к преобразованию С1п-137 в глутаминовую кислоту (Ьедак е! а1., 1981). Показано, что дезаминированный 11СН имеет измененную восприимчивость к протеолизу с ферментом субтилизином, и предполагается, что дезаминирование может иметь физиологическое значение для направления протеолитического рас

- 1 010626 щепления ИОН. Известно, что при определенных условиях хранения биосинтетический ИОН расщепляется, что приводит к дезаминированию другого аспарагина (Аки-149). Он представляет собой первичный очаг дезаминирования, но также отмечено дезаминирование в Акп-152 (Вескег е! а1., 1988). Сообщений о дезаминировании в биосинтетическом ИОН в О1п-137 не было.

Метиониновые остатки в белках являются восприимчивыми к окислению, прежде всего к сульфоокислению. Как вырабатываемый гипофизом, так и биосинтетический ИОН переносят сульфоокисление в метионине Ме1-14 и Ме1-125 (Вескег е! а1., 1988). Имелись сообщения об окислении в Ме1-170 в гипофизарном, но не в биосинтетическом ИОН. Выявлено, что как у дезаминированного ИОН, так и у Ме1-14 сульфоокисленного ИОН проявляется полная биологическая активность (Вескег е! а1., 1988).

Усеченные формы ИОН производили как посредством действия ферментов, так и генетическими методами. У белка 2-САР, образуемого регулирумыми воздействиями трипсина, отсекают первые восемь остатков на Ν-конце ИОН. Другие усеченные версии ИОН получают модификацией гена перед экспрессией в подходящем хозяине. Первые 13 остатков отсекают для получения производного, имеющего биологические свойства, отличающиеся тем (ОетВег е! а1., 1986), что полипептидная цепочка не расщеплена.

При том, что человеческий гормон роста первоначально получали из гипофизов трупов, эти препараты не являлись электорофоретически гомогенными, и в сыворотке пациентов, леченных препаратами, имеющими степень гомогенности порядка 50%, появлялись антитела, иммуногенность объясняли наличием неактивных компонентов. Технология рекомбинантных ДНК позволяла получать неограниченную доставку ИОН в ряде различных систем. Очистка ИОН от культуральной среды облегчается присутствием только малых количеств загрязняющих белков. Фактически было показано, что возможна очистка ИОН в лабораторном масштабе путем единственной стадии очистки на колонке для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ (Нкшпд е! а1., 1989).

Рекомбинантный человеческий гормон роста, гИОН, производится фирмой 8етопо 1п!етпа!юпа1 8.А. под товарным наименованием 8ЕРО8Т1М®. указанный продукт получил ускоренное одобрение Управления по продовольствию и лекарствам ЕЭА для лечения потери веса и истощения у больных СПИДом. 8АIΖΕN® является рекомбинантным человеческим гормоном роста, показанным при дефиците ОН у детей, при синдроме Тернера у девочек, а также хронической почечной недостаточности у детей. ΡΚΟΤΚΟΡΙΝ®, производимый Оепеп!есИ, 1пс (8ои1й 8ап Етапс18со, СА), по структуре незначительно отличающийся от природной последовательности ИОН, имеет дополнительный метиониновый остаток в Ν-конце. Обычно рекомбинантный ИОН представлен на рынке в виде флаконов, содержащих ИОН плюс дополнительные наполнители в лиофилизированной форме, например глицин и маннит. В комплект входит флакон разбавителя, что позволяет пациенту растворять продукт до желательной концентрации перед введением дозы. Рекомбинантный ИОН также может быть представлен на рынке в виде других известных форм, таких как шприц-ручки.

Для того чтобы ИОН был коммерчески доступным в качестве лекарственного препарата, необходимо изготовление устойчивых составов. Такие составы должны обладать способностью сохранять активность в течение соответствующего срока хранения и быть приемлемыми для введения пациентам.

Человеческий ОН образовывали различными способами. В способе, например, по патенту США 5096885 раскрывается устойчивый, содержащий ИОН фармацевтически приемлемый состав, дополнительно содержащий глицин, маннит, буфер и необязательно неионный сурфактант, с молярным соотношением ИОН:глицин, составляющим 1:50.

В патенте XVО 93/19776 раскрываются составы ОН для инъекций, содержащие цитрат в качестве буферного вещества и, необязательно, факторы роста, такие как инсулиноподобные факторы роста или эпидермальный фактор роста, аминокислоты, такие как глицин или аланин, маннит или другие сахарные спирты, глицерин и/или консервант, такой как бензиловый спирт.

В патенте νΟ 94/101398 раскрывается состав ОН, содержащий ИОН, буфер, неионный сурфактант и, необязательно, маннит, нейтральную соль и/или консервант.

В патенте ЕР-0131864 описан водный раствор белков с молекулярным весом, превышающим 8500 Да, имеющих защиту от поверхностной адсорбции, от денатурации и от преципитации белка путем добавления прямой полиоксиалкиленовой цепочки, содержащей в качестве стабилизирующего средства поверхностно-активное вещество.

В патенте ЕР-0211601 раскрывается состав, ускоряющий рост, который содержит водную смесь гормона, ускоряющего рост, и сополимерный блок, содержащий полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые единицы, и имеющий средний молекулярный вес от около 1100 до около 40000, который до введения сохраняет текучесть гормона, ускоряющего рост, и его биологическую активность.

В патенте νΟ 97/29767 раскрывается жидкий состав, содержащий гормон роста, двуводный тринатриевый цитрат, хлорид натрия, гидроокись натрия, бензиловый спирт, Р1итои1с Е-68, и указанный состав имеет рН 5,6.

В патенте США 5567677 раскрываются жидкие составы, содержащие человеческий гормон роста, цитрат натрия, фосфат натрия, глицин, маннит, необязательно бензиловый спирт.

- 2 010626

Фармацевтические препараты ЙСН проявляют тенденцию к неустойчивости, особенно в растворе. Появляются различные формы химического расщепления, такие как дезаминированные или сульфокисленные формы ЙСН. и по причине физической неустойчивости могут появляться димерные или агрегированные высокомолекулярные разновидности (Вескег с1 а1.. 1988; Вескег е1 а1.. 1987; Реаг1тап аиб Ыдиуеи. 1989).

Как следствие неустойчивости в растворе ЙСН обычно фармацевтические составы ЙСН представляют собой иофилизированную форму. которую перед использованием необходимо ресуспендировать. Ресуспендирование обычно осуществляют добавлением фармацевтически приемлемого разбавителя. такого как стерильная вода для инъекций. стерильный физиологический раствор или подходящий стерильный физиологически приемлемый разбавитель.

Ресуспендированные осадки ЙСН предпочтительно сохраняют при 4°С. чтобы свести к минимуму реакции химического и физического расщепления. однако некоторая степень расщепления будет наблюдаться во время такого хранения. которое может продолжаться до 14 дней.

Особое преимущество обеспечивает фармацевтический состав ЙОН в жидкой форме. в особенности состав. который сохраняет устойчивость ЙОН без образования преципитата или аггреганта или любых других твердых частиц в течение продолжительного периода времени.

В этой связи целью настоящего изобретения является создание жидких составов гормона роста. которые не образуют в результате нежелательные твердые частицы и которые имеют длительные сроки хранения.

Сущность изобретения

Первый аспект настоящего изобретения относится к жидкому составу. содержащему:

а) гормон роста. или вещество. которое стимулирует высвобождение или потенцирует активность эндогенного ЙОН;

й) соль щелочного металла;

с) соль щелочно-земельного металла или соль псевдощелочно-земельного металла и

б) цитратно/фосфатный буфер.

Второй аспект настоящего изобретения относится к способу получения жидкого состава согласно настоящему изобретению.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к сублимированному составу. который ресуспендирован таким образом. чтобы получить вышеупомянутый новый жидкий состав.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к применению состава согласно изобретению для введения гормона роста в виде монодозы или мультидозы.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к форме представления жидкого состава согласно изобретению.

Подробное описание изобретения

Согласно настоящему изобретению было выявлено. что химическая и физическая устойчивость гормона роста в жидком составе может быть повышена путем определенного выбора минеральных солей. Таким образом. полученные растворы можно сохранять в течение продолжительного времени. например от около 1 до 52 недель. или от 1 до 16 недель. или от 1 до 4 недель предпочтительно при комнатной температуре.

Дополнительно было выявлено. что можно получить повышенную устойчивость гормона роста в жидком составе в течение продолжительного времени с композицией согласно п.1 формулы изобретения.

В этой связи настоящее изобретение относится к жидкому составу. содержащему:

а) гормон роста. или вещество. которое стимулирует высвобождение или потенцирует активность эндогенного ЙОН;

й) соль щелочного металла;

с) соль щелочно-земельного металла или соль псевдощелочно-земельного металла и

б) цитратно/фосфатный буфер.

В одном варианте осуществления жидкие составы по изобретению можно использовать для введения мультидозы. в силу чего указанный состав можно сохранять при комнатной температуре на срок в 1 неделю или больше.

Г ормон роста. который можно образовать согласно настоящему изобретению. может быть получен из гормонов любых видов. таких как из бычьего. свиного. собачьего или кошачьего. в зависимости от предназначения использования состава. Веществом. стимулирующим высвобождение или потенцирующим активность эндогенного ЙОН. является. например. гормон. стимулирующий высвобождение гормона роста.

Следующие вещества можно предпочтительно образовывать согласно настоящему изобретению:

а) человеческий гормон роста;

й) фрагмент (а). обладающий агонистической активностью к рецептору ЙОН;

с) вариант (а) или (й). который имеет последовательность. идентичную по меньшей мере на 70% последовательности (а) или (й)обладающий агонистической активностью к рецептору ЙОН;

б) вариант (а) или (й). кодируемый последовательностью ДНК. которая гибридизируется с компле

- 3 010626 ментом нативной последовательности ДНК, кодирующей (а) или (Ь) при умеренно строгих условиях, и обладающий агонистической активностью к рецептору ЙОН; или

е) соль или функциональное производное (а), (Ь), (с) или (б), обладающие агонистической активностью к рецептору ЙОН.

Состав, содержащий человеческий гормон роста, является предпочтительным согласно настоящему изобретению.

К термину человеческий гормон роста, или 11СН. используемый в настоящем изобретении, как выше отмечено, относятся производные природного происхождения и синтетические производные, включающие в себя человеческий гормон роста как 20 КО, так и 22 кИ, ОН-У, и другие члены локуса гена гормона роста, но не ограничиваются вышеперечисленным, как описано подробно в разделе Уровень техники.

ЙОН может представлять собой гормон роста человека природного происхождения или он может предпочтительно являться рекомбинантным ЙОН. Рекомбинантный ОН может экспрессироваться в любом подходящем хозяине: как прокариотическом, так и эукариотическом. В особенности подходящим для экспрессии ЙОН является, например, клетка-хозяин Е.СоИ. Клетки дрожжей, насекомых или клетки млекопитающих дополнительно являются подходящими для экспрессии рекомбинантного гормона роста. Экспрессия ЙОН предпочтительно происходит в клетках человека или животного, например в клетках яичника китайского хомячка (СНО).

Используемый в настоящем изобретении термин ЙОН или гормон роста также включает в себя функциональные производные, фрагменты, варианты, аналоги или соли, сохраняющие биологическую активность гормона роста, т. е. действующие в качестве агонистов к рецептору гормона роста. Другими словами, они способны связываться с рецептором гормона роста, чтобы инициировать активность рецепторной передачи сигнала.

Используемые в настоящем изобретении термины функциональные производные или химические производные охватывают производные, которые можно изготавливать способами, известными специалистам в данной области техники, из функциональных групп, являющихся боковыми цепями на Ν- или С-концевых группах, и которые включены в настоящее изобретение при условии, что они сохраняют фармацевтическую приемлемость и не нарушают биологическую активность ЙОН, как указано в настоящем изобретении, т. е. не нарушают способность связываться с рецептором и инициировать рецепторную передачу сигнала и не придают токсических свойств композициям, их содержащим. Если производные сохраняют биологическую активность ЙОН и остаются фармацевтически приемлемыми, то эти производные могут иметь химические функциональные группы, такие как углеводородные или фосфатные остатки.

Например, производные могут включать в себя алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп путем реакции с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацил производными или свободными аминогруппами аминокислотных остатков, образованных с ацильными функциональными группами (например, алканоильной или карбоциклической ароильной группой), или О-ацильными производными свободной гидроксильной группы (например, производными из сериновых или треониновых остатков), образованными с ацильными функциональными группами. Такие производные могут также включать в себя, например, полиэтиленгликолевые боковые цепи, которые могут закрывать антигенные участки и пролонгировать присутствие молекулы в жидких тканях организма.

Гормон роста, представляющий собой дериват или комбинацию с комплексообразующим веществом, может обладать длительным действием. Поэтому предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к ПЭГилированным версиям человеческого гормона роста. Гормоны роста, созданные генно-инженерными способами для проявления продолжительной активности в организме, также представляют собой примеры производных ЙОН, входящих в объем настоящего изобретения.

Авторами (йе\\'15 е! а1., 1979) был выделен и идентифицирован ЙОН, являющийся ацетилированным на Ν-конце. Остается не ясно, служит ли ацилирование регуляторную роль или просто представляет собой артефакт очистки. Вместе с тем, предполагается, что эта молекула проявляет активность ОН путем, сходным с другими производными ЙОН. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к человеческому гормону роста, который является ацетилированным на Ν-конце.

Предпочтительно состав согласно настоящему изобретению содержит димер человеческого гормона роста, выбираемого из группы, состоящей из дисульфидного димера, связанного посредством межцепочечных дисульфидных связей, ковалентного необратимого недисульфидного димера, нековалентного димера и их смеси.

Используемый в настоящем изобретении термин соли относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислым аддитивным солям из аминогрупп молекулы ЙОН или их аналогам. Соли карбоксильной группы можно образовывать способами, известными в данной области техники, и они включают в себя неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, трехвалентного железа или цинка,

- 4 010626 и т.п., и соли органических оснований, как, например, образованные с аминами, такими как триэтиламином, аргинином или лизином, пиперидином, прокаином и т.п. Кислые аддитивные соли включают в себя, например, соли минеральных кислот, таких как, например, соляной или серной кислоты, и солями органических кислот, таких как, например, уксусной или щавелевой кислоты. Любые из указанных солей должны сохранять биологическую активность ЮН, относящегося к настоящему изобретению, т.е. способность связываться с рецептором ЮН и инициировать рецепторную передачу сигнала.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фрагменту человеческого гормона роста.

Термин фрагмент гормона роста согласно настоящему изобретению относится к любой субпопуляции молекулы, т.е. к более короткому пептиду, сохраняющему желательную биологическую активность. Фрагменты можно легко получить отсечением аминокислот с любого конца молекулы ЮН и тестированием полученного в результате фрагмента на наличие свойств агониста рецептора ЮН. Существуют известные протеазы для отсечения одной аминокислоты одновременно или с Ν- или с С-конца полипептида, и, таким образом, определение фрагментов, сохраняющих желаемую биологическую активность, представляет собой обычную рутинную задачу.

Предпочтительно фрагменты ЮН согласно настоящему изобретению могут иметь внутренние делеции при условии, что делеция не влияет на биологическую активность ЮН, т.е. на связывание и на инициацию передачи сигнала посредством рецептора ЮН. У фрагмента, являющегося предпочтительным согласно настоящему изобретению, отсутствует 15 аминокислот от глутаминовой кислоты (С1и) 32 до глутаминовой кислоты 46.

Фрагменты ЮН могут дополнительно иметь усечение на С- или Ν-концах. Усеченный ЮН, также являющийся предпочтительным согласно настоящему изобретению, не имеет первые восемь остатков на Ν-конце или первые 13 остатков на Ν-конце человеческого гормона роста.

Короткий С-концевой фрагмент ЮН, сохраняющий биологическую активность ЮН, описан в патенте США 5869452. Поэтому согласно настоящему изобретению предпочтительным является использование С-концевого фрагмента ЮН. Фрагмент ЮН 177-191, содержащий аминокислотные остатки по меньшей мере от 177 до 191 ЮН (ЬШУЦСКБУЕСЮСР) является особенно предпочтительным согласно настоящему изобретению. Дополнительно предпочтительными являются производные этого пептида, такие как пептидные варианты, описанные в патенте США 6335319 или ^099/12969, например циклические пептиды.

Дополнительно, полипептид, обладающий такой агонистической активностью рецептора ЮН, является ли это ЮН, его аналогом или вариантом, солью, функциональным производным или его фрагментом, может также содержать дополнительные аминокислотные остатки, фланкирующие полипептид ЮН. При условии, что получаемая молекула сохраняет агонистические способности рецептора ЮН основного полипептида, общепринятыми экспериментами можно определить, влияют ли какие-либо фланкирующие остатки на основные и новые свойства основного пептида, т. е. на его агонистические рецепторные свойства.

Примером такого варианта ОН, предпочтительного согласно настоящему изобретению, является метиониновый человеческий (Ме1-ЮН) гормон роста, который имеет дополнительный метиониновый остаток на Ν-конце человеческого гормона роста.

Варианты ЮН, являющиеся предпочтительными согласно настоящему изобретению, содержат метиониновый ЮН, представляющий собой человеческий гормон роста, имеющий дополнительный метиониновый остаток на Ν-конце. Дополнительный предпочтительный вариант представляет собой человеческий гормон роста, у которого отсутствует 15 аминокислотных остатков от О1и 32 до О1и 46.

Термин вариант человеческого гормона роста согласно настоящему изобретению относится к молекуле, которая является, по существу, сходной как с полным белком, так и с его фрагментом. Вариант также может иметь название мутеин. Вариант может, например, представлять собой изоформу ЮН, такую как вариант, полученный альтернативным сплайсингом. Вариантные (поли)пептиды можно легко изготавливать путем прямого химического синтеза варианта пептида, используя способы, известные в данной области техники. Вариант человеческого гормона роста обязательно будет обладать активностью связывания с ЮН рецептором и инициирования передачи сигнала, по меньшей мере сходную с активностью ЮН, и поэтому предполагается, что его активность будет сходной с активностью к ЮН.

Варианты аминокислотной последовательности человеческого гормона роста можно изготовлять путем мутаций в ДНК, которые кодируют синтезируемые производные человеческого гормона роста. Такие варианты включают в себя, например, делеции или вставки, или замены остатков в пределах аминокислотной последовательности. Также можно проводить любую комбинацию делеции, вставки и замены для получения конечной конструкции при условии, что конечная конструкция обладает желательной активностью. Очевидно, что мутации, которые будут произведены в ДНК, кодирующей вариант пептида, не должны изменять рамку считывания.

На генетическом уровне эти варианты можно изготавливать сайт-направленным мутагенезом (что приводится в качестве примера у Абе1шаи е1 а1., 1983) нуклеотидов в ДНК, кодирующей молекулу пептида, таким образом производя ДНК, кодирующую вариант, и затем экспрессируя ДНК в рекомбинант

- 5 010626 ной клеточной культуре. Варианты обычно проявляют, по меньшей мере, качественно ту же самую биологическую активность, как и невариантный пептид.

Аналог человеческого гормона роста согласно настоящему изобретению относится к искусственной молекуле, которая является, по существу, сходной как с полной молекулой, так и с ее активным фрагментом. Аналог человеческого гормона роста, полезный для настоящего изобретения, будет проявлять активность ОН.

Типы замен, которые можно проводить в человеческом гормоне роста согласно настоящему изобретению, могут быть основаны на анализе частот аминокислотных замен между гомологичным белком различных видов. На основе такого анализа в настоящем изобретении можно дать определение консервативным заменам, как обменам в пределах одной из следующих пяти групп.

I. Малые, алифатические, неполярные или незначительно полярные остатки: А1а, 8ег, Тйг, Рго, С1и.

II. Полярные, отрицательно-заряженные остатки и их амиды: Акр, Аки, С1и. С1п.

III. Полярные, положительно-заряженные остатки: Н1к, Агд, Ьук.

IV. Большие, алифатические неполярные остатки: Ме1, Ьеи, Не, Уа1, Сук.

V. Большие ароматические остатки: Рйе, Туг, Тгр.

Считается, что следующие замены в пределах вышеуказанных групп являются высоко консервативными: Акр/О1и Ηίκ/Агд/Ьук Рйе/Туг/Тгр Ме1/Ьеи/Пе^а1.

Полуконсервативные замены определяются как обмены между двумя из вышеперечисленных групп (Ί)-(Ίν), которые ограничены супергруппой (А), содержащей вышеперечисленные (I), (II), и (III), или супергруппой (В), содержащей вышеперечисленные (IV) и (V). Замены не ограничены генетически кодируемыми или даже встречающимися в природе аминокислотами. Когда эпитоп изготовляют синтезом пептида, можно непосредственно использовать желательную аминокислоту. Альтернативно, генетически кодируемую аминокислоту можно модифицировать путем ее реакции со средством получения производных органического происхождения, способным реагировать с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками.

Цистеиловые остатки наиболее часто реагируют с альфа-галоацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетоамид с получением карбоксиметиловых или карбоксиамидометиловых производных. Цистеиловые остатки также получены как дериваты путем реакции с бромтрифторацетоном, альфа-бромо-бета-(5-имидазоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, Ν-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, р-хлорртутьбензоатом, 2-хлорртуть-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом.

Гистидиловые остатки получали как дериваты реакцией с диэтилпрокарбонатом при уровне рН 5,57,0, так как это вещество является относительно специфичным для гистидиловой боковой цепи. Также полезным является парабромфенацила бромид; реакцию предпочтительно проводят в 0,1 М какодилате натрия при уровне рН 6,0.

Лизиловые и аминоконцевые остатки реагируют с янтарным или другими карбоксильными кислотными ангидридами. Получение дериватов с этими веществами обладает эффектом изменения заряда лизиловых остатков. Другие подходящие реактивы для получения дериватов остатков, содержащих альфааминокислоты, включают в себя сложные имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксаль фосфат; пиридоксаль; хлорборогидрид; тринитробензолсульфоновую кислоту; О-метилиосмочевину; 2,4-пентадион; и реакцию, катализированную трансаминазами с глиоксилатом.

Аргиниловые остатки модифицировали реакцией с одним или несколькими общепринятыми реагентами, среди которых использовали фенилглиоксаль; 2,3-бутандион и нингидрин. Получение дериватов аргиниловых остатков требует осуществления реакции в щелочных условиях из-за высокой рКа функциональной группы гуанидина. Кроме того, эти реагенты могут вступать в реакцию с лизиновыми группами, а также с аргининовой эпсилон-аминогруппой.

Специфическую модификацию тирозиловых остатков исследовали рег ке широко, проявляя особый интерес к внедрению спектральных меток в тирозиловые остатки путем реакции с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометана. Наиболее часто использовали Ν-ацетилимидазол и тетранитрометан для образования, соответственно, О-ацетилтирозиловых разновидностей и εнитропроизводных.

Карбоксильные боковые группы (аспартиловые или глутамиловые) селективно модифицировали путем реакции с карбодиимидами (Κ'Ν^-Ν-Κ), такими как 1-циклогексил-3-[2-морфолинил-(4этил)]карбодиимидом или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимидом. Дополнительно, аспартиловые и глутамиловые остатки превращали в аспарагиниловые и глутаминиловые остатки путем реакции с ионами аммония.

Глутаминиловые и аспарагиниловые остатки часто являются дезаминированными до соответствующих глутамиловых и аспартиловых остатков. Альтернативно, эти остатки являются дезаминированными при умеренно кислых условиях. Любая форма этих остатков входит в объем настоящего изобретения.

Примеры осуществления аминокислотных замен в белках, возможного для использования, для получения аналогов 11СН для использования в настоящем изобретении, включают в себя любые известные

- 6 010626 этапы способа, такие как представленные в патентах США КЕ 33653; 4959314; 4588585 и 4737462 авторами Магк е! а1.; 5116943 авторами Ко!118 е! а1.; 4965195 авторами Матеи е! а1. и 5017691 авторами Ьее е! а1., и лизинзамещенные белки, описанные в патенте США 4904584 (8йате е! а1.). Дополнительные варианты гормона роста были описаны, например, в патенте США 6143523 (Сипшидйат е! а1.).

Среди веществ, связывающихся и инициирующих передачу сигналов рецепторов человеческого гормона роста, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, находятся все аналоги гормонов роста и миметиков, известные в литературе, такие как, например, раскрытые в патентах США 5851992; 5849704; 5849700; 5849535; 5843453; 5834598; 5688666; 5654010; 5635604; 5633352; 5597709 и 5534617.

Предпочтительно вариант 11СН или аналог будут иметь основную последовательность, которая является той же самой, что и нативная последовательности или ее биологически активный фрагмент, который имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную нативной аминокислотной последовательности и сохраняющую ее биологическую активность. Более предпочтительно такая последовательность идентична по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% нативной последовательности.

Идентичность отражает взаимоотношения между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более олигонуклеотидными последовательностями, определяемыми сравнением последовательностей. В целом, идентичность относится к точному соответствию по длине сравниваемых последовательностей нуклеотида нуклеотиду или аминокислоты аминокислоте из этих двух олигонуклеотидных или двух полипептидных последовательностей соответственно.

Для последовательностей, у которых нет точного соответствия, можно определить % идентичности. В целом, совмещают две сравниваемые последовательности, чтобы получить максимальную корреляцию между последовательностями. Это может включать в себя вставку пробелов как в одну, так и в обе последовательности для увеличения степени совмещения. Можно определять % идентичности на всем протяжении каждой из сравниваемых последовательностей (так называемое общее совмещение), которое является особенно подходящим для последовательностей одинаковой или очень сходной длины, или на более коротких, определенных протяжениях (так называемое локальное совмещение), которое больше подходит для последовательностей неравной длины.

Способы сравнения идентичности и гомологичности двух или более последовательностей являются известными в данной области техники. Таким образом, можно использовать программы, доступные в версии 9.1 Висконсинского пакета анализа последовательностей ХУБсопзш Зециепсе Аиа1у818 Раскаде, уетзюп 9.1 (Эеуегеих 1. е! а1., 1984), например программы ВЕ8ТР1Т и САР, для определения % идентичности между двумя олигонуклеотидными и % идентичности и % гомологичности между двумя полипептидными последовательностями. Программа ВЕ8ТР1Т использует алгоритм локального совмещения авторов 8тйй и \Уа!егтап (1981) и выявляет лучшую единственную область подобия двух последовательностей. Другие программы для определения идентичности и/или подобия последовательностей также являются известными в данной области техники, например семейство программ ВЬА8Т (А118сйи1 8.Е. е! а1., 1990, А118сйи1 8.Е. е! а1., 1997, доступных на домашней странице ЫСВ1 в \\л\л\'.псЫ.п11п.ш11.доу). и программа ЕА8ТА (Реатзоп ν.Β., 1990; Реатзоп ν.Β., 1988).

Предпочтительными заменами для вариантов или мутеинов согласно настоящему изобретению являются замены, известные как консервативные. Консервативные аминокислотные замены полипептидов или белков гормона роста могут включать в себя синонимичные аминокислоты в пределах группы, имеющей достаточно сходные физико-химические свойства, так что замена между членами группы будет сохранять биологическую функцию молекулы (СтаиШат, 1974). Является очевидным, что в вышеуказанных последовательностях также можно осуществлять вставки и делеции аминокислот без изменения их функции, в особенности, если вставки или делеции вовлекают только несколько аминокислот, например менее 30 и предпочтительно менее 10, и аминокислоты, являющиеся необходимыми для функциональной конформации, например цистеиновые остатки, не удаляются или не переставляются. В объем настоящего изобретения входят белки и мутеины, изготовленные таким путем делеций и/или вставок.

Аналоги или варианты согласно настоящему изобретению также можно определить в соответствии со следующим способом. ДНК нативной последовательности является известной в предшествующем уровне техники и опубликована (Матйа1 е! а1., 1979). Полипептиды, кодируемые любой нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизируется с комплементом нативной ДНК или РНК при высоко строгих или умеренно строгих условиях, при условии, что полипептид сохраняет биологическую активность нативной последовательности, считаются входящими в объем настоящего изобретения.

Условия строгости являются функцией температуры, применяемой в эксперименте гибридизации, молярности моновалентных катионов и процента содержания формамида в растворе гибридизации. Для определения степени строгости, охватывающей любой заданный набор условий, один набор использует уравнение МешкоШ е! а1. (1984) для определения устойчивости гибридов со 100% идентичностью, выражаемой в виде температуры плавления Тт гибрида ДНК-ДНК:

Тт=81,5°С+16,6(_ЬодМ)+0,41 (%СС)-0,61(% форм.)-500/Ь, в котором М представляет собой молярность моновалентных катионов;

- 7 010626 %СС обозначает процент от С и С нуклеотидов в ДНК;

% форм. обозначает процент формамида в растворе гибридизации и

Ь является длиной гибрида в парах оснований.

На каждый 1°С понижения Тт от расчетной температуры для 100% идентичности гибрида количество разрешенных несовпадений увеличивается примерно на 1%. Таким образом, если Тт, применяемая для любого заданного эксперимента гибридизации при указанных концентрациях соли и формамида, является на 10°С ниже Тт, расчетной для 100% гибрида согласно уравнению МешкоШ, гибридизация будет происходить, даже если имеется до около 10% несовпадений.

Используемые в настоящем изобретении условия высокой строгости представляют собой условия, толерантные к дивергенции последовательности до около 15%, в то время как умеренно строгими условиями являются условия, толерантные к дивергенции последовательности до около 20%. Не ограничивающие объем изобретения примеры высоко строгих (на 12-15°С ниже расчетной Тт гибрида) и умеренно строгих (на 15-20°С ниже расчетной Тт гибрида) условий используют промывочный раствор 2Х 88С (стандартный цитрат солевого раствора) и 0,5% додецилсульфат натрия 8Э8 при подходящей температуре ниже расчетной Тт гибрида. Окончательная строгость условий зависит, прежде всего, от условий промывания, в особенности, если используемые условия гибридизации представляют собой условия, позволяющие образование менее устойчивых гибридов наряду с устойчивыми гибридами. Условия промывания при высокой строгости при этом удаляют менее устойчивые гибриды. Обычное условие гибридизации, которое можно использовать при условиях промывания от высоко строгих до умеренно строгих, описанных выше, представляет собой гибридизацию в растворе 6Х 88С (или 6Х 88РЕ), 5 X реактива Денхардта, 0,5% 8Ό8, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при температуре примерно на 20-25°С ниже Тт. При использовании смешанных зондов вместо 88С является предпочтительным применение тетраметиламмония хлорида (ТМАС) (Аи8иЬе1, 1987-1998).

Хотя настоящее изобретение относится к рекомбинантным способам получения производных человеческого гормона роста, эти производные также можно получить общепринятыми способами белкового синтеза, которые являются известными специалистам в данной области техники.

Состав по изобретению содержит полиэтилен-полипропилен гликоль. Этот полимер является неионным сурфактантом. В настоящем изобретении сурфактантом может называться тензиоактивный или тензиоактивное агент. В еще одном дополнительном предпочтительном варианте осуществления состав содержит полиэтилен-полипропилен гликоль в концентрации, варьирующей от 0,5 до 5 мг/мл или от 1 до 2 мг/мл или 1,5 мг/мл.

В предпочтительном составе сурфактантом является плуроновый полиол, такой как, например, Е68. Р1игошс Е68 является наиболее предпочтительным согласно настоящему изобретению.

При составлении СН с сурфактантом Р1игошс® Е68 (ВА8Е, также известным как Ро1охатег 188) получали устойчивый состав, не имевший проблем преципитации, аггрегации или образования твердых частиц любого вида.

Р1игошс Е68 представляет собой блок сополимера окиси этилена (ЕО) и окиси пропилена (РО). Блок окиси пропилена является слоем сандвича из двух блоков окиси этилена

СН_Э

НО—(СН₂СН_гО)_х-(СН₂СНО)_у-(СН₂СН₂О)_х-Н

ЕО

РО

ЕО

Плуроновые сурфактанты синтезируют двухстадийным способом.

1. Образуют гидрофоб желательного молекулярного веса путем регулируемого добавления окиси пропилена к двум гидроксильным группам пропиленгликоля.

2. Добавляют окись этилена к сэндвичу с гидрофобом между гидрофильными группами.

В Р1игошс Е68 процент полиоксиэтилена (гидрофильного) составляет 80% и молекулярный вес гидрофоба (полиоксипропилена) составляет около 1967 Да.

Ниже перечислены обычные свойства Р1игошс Е68:

Средний молекулярный вес: 8400.

Температура плавления/застывания: 52°С.

Физическое состояние при 20°С: твердое тело.

Вязкость (ВгоокйеИ), сП: 1000 [жидкости при 25°С, пасты при 60°С и твердого тела при 77°С].

Поверхностное натяжение, дин/см, при 25°С:

0,1% концентрация: 50,3;

0,01% конц.: 51,2;

0,001% конц.: 53,6.

Поверхностное натяжение, дин/см, при 25°С по сравнению с Ии)о1:

0,1% конц.: 19,8;

0,01% конц.: 24,0;

0,001% конц.: 26,0.

- 8 010626

Время смачивания по Дрейву, с, при 25°С:

1, 0% конц.: >360;

0,1% конц.: >360.

Высота пены:

Кокк МПек, 0,1%, мм при 50°С: 35;

Кокк МПек, 0,1%, мм при 26°С: 40;

в динамике, 0,1%, мм в 400 мл/мин: >600.

Температура помутнения в водном растворе, °С:

1% конц.: >100;

10% конц.: >100.

ГЛБ (гидрофильно-липофильный баланс): 29

В составах по изобретению также можно использовать другие полимеры, имеющие свойства, сходные с Р1итошс Р68.

Полиэтилен-полипропилен гликоль можно использовать в концентрации, варьирующей от 0,5 до 5 мг/мл или от 1 до 2 мг/мл или 1,5 мг/мл.

Для специалиста в данной области техники очевидно, что в дополнение к полиэтиленполипропилен гликолю можно использовать один или более дополнительных сурфактантов.

Состав по изобретению дополнительно содержит стабилизирующее средство. Стабилизирующее средство может также действовать как средство изотоничности.

Средство изотоничности является физиологически толерантным составом, который придает составу подходящую тоничность для предотвращения чистого потока воды через клеточные мембраны, находящиеся в контакте с составом. Для этих целей обычно используют соединения, такие как глицерин, в известных концентрациях. Другие подходящие стабилизирующие средства включают в себя аминокислоты или белки (например, глицин или альбумин), соли (например, хлорид натрия) и сахара (например, дектрозу, сахарозу и лактозу), но не ограничены вышеперечисленным.

Стабилизирующее средство (стабилизатор) или средства изотоничности, которые возможно предпочтительно использовать согласно настоящему изобретению, включают в себя нередуцирующие сахара, включающие в себя сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелезитозу и раффинозу, маннит, ксилит, эритрит, треит, сорбит и глицерин.

В предпочтительном варианте осуществления стабилизатором или средством изотоничности является сахароза.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления состав содержит сахарозу в концентрации, варьирующей от 10 до 100 мг/мл или от 20 до 80 мг/мл или около 60 мг/мл.

Составы согласно настоящему изобретению содержат соль щелочных металлов, включающую в себя №1С1. КС1, Ыа₂8О₄, Ыа₂СО₃. В предпочтительном варианте осуществления солью щелочного металла является №1С1 или Ыа₂8О₄.

Составы согласно настоящему изобретению дополнительно содержат соль щелочно-земельного металла, включающую в себя СаС1₂, МдС1₂, Мд8О₄, ИН₄СО₃. В предпочтительном варианте осуществления солью щелочно-земельного металла является МдС1₂.

Составы по изобретению дополнительно включают в себя цитратно/фосфатный буфер. Цитратно/фосфатный буфер, который можно использовать в объеме настоящего изобретения, может являться, например, натрий-цитратным/натрий-фосфатным буфером.

Термин буфер или физиологически приемлемый буфер относится к растворам соединений с известной безопасностью для использования в фармацевтических или ветеринарных составах и к тем, которые обладают эффектом сохранения или регуляции рН состава в желательном для состава диапазоне р^н.

Является предпочтительным, что составы по изобретению содержат цитрат/фосфат в концентрации в пределах от 1 до 100 мМ, или от 5 до 50 мМ, или от 10 до 20 мМ.

Согласно настоящему изобретению является предпочтительным, что рН состава находится в диапазоне от 5 до 7, или от 5,5 до 6,5, или около 6. Более предпочтительный рН составляет от 5,5 до 5,9.

Составы по изобретению представляют собой жидкость и поэтому содержат водный разбавитель.

Термин водный разбавитель относится к жидкому растворителю, который содержит воду. Водные системы растворителя могут состоять исключительно из воды или могут состоять из воды, а также из одного или более смешивающихся растворителей, и могут содержать растворенные растворяемые вещества, такие как сахара, буферные растворы, соли или другие эксципиенты.

Состав может также содержать один или более одного неводного растворителя. Общепринято используемые неводные растворители представляют собой короткоцепочечные органические спирты, такие как метанол, этанол, пропанол, короткоцепочечные кетоны, такие как ацетон, и поли(спирты), такие как глицерин.

Состав по изобретению предпочтительно дополнительно содержит консервант. Добавление консерванта является особенно предпочтительным, если гормон роста предназначен для мультидозного введения.

- 9 010626

Консервант является соединением, которое можно включать в состав, чтобы, по существу, уменьшить в нем бактериальное воздействие, таким образом облегчая, например, изготовление состава многократного использования. Примеры потенциальных консервантов включают в себя октадецилдиметилбензил аммония хлорид, гексаметония хлорид, бензалкония хлорид (смесь хлоридов алкилбензилдиметил аммония, в которых алкильные группы являются длинноцепочечными соединениями) и бензетония хлорид. Другие типы консервантов включают в себя ароматические спирты, такие как феноловый, бутиловый и бензиловый спирты, алкилпарабен, такой как метил- или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол.

Консервант в настоящем изобретении также может являться бактериостатическим. Термин бактериостатический относится к соединению или композициям, добавляемым к составу для действия в качестве антибактериального средства. ОН с консервантами, содержащий состав настоящего изобретения, предпочтительно соответствует установленным законом или регулирующим руководящим принципам для эффективности консервантов с тем, чтобы представлять собой коммерчески жизнеспособный продукт многократного использования (мультидоза). Примеры бактериостатиков включают в себя фенол, м-крезол, р-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил, этил, пропил, бутил и т.п.), бензалкония хлорид, бензетония хлорид, дегидроацетат натрия и тимерозал.

Предпочтительным является присутствие консерванта в концентрации в пределах от 1 до 10 мг/мл, или от 2 до 5 мг/мл, или 3 мг/мл.

Предпочтительным консервантом по изобретению является фенол.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения жидкого состава, включающему стадию подготовки водного раствора компонентов состава согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу получения жидкого состава, включающему стадию упаковки предварительно заданного количества состава в стерильный контейнер. Обычно такое количество находится в миллилитровом диапазоне.

Жидкий состав ЙОН для введения с терапевтической целью также можно получить комбинацией ЙОН и стабилизирующих средств, имеющих желательную степень чистоты, с физиологически приемлемыми наполнителями, буферами или консервантами (ЕеттЦопХ Рйагтасеийса1 8аспсс5. 1б!й Εάίίίοη, Око11 Α. Εά., 1980). Приемлемыми наполнителями являются наполнители, которые в используемых концентрациях и дозировках являются нетоксичными для пациента, и включающие в себя, например, буферы, консерванты, антиоксиданты, модификаторы уровня рН и тоничности.

Жидкий состав гормона роста, если это желательно, может также включать в себя один или большее количество других стабилизирующих наполнителей. Дополнительные стабилизирующие наполнители могут включать в себя, например, аминокислоты, такие как глицин или аланин, маннит или другие сахарные спирты, или глицерин. Дополнительно жидкий состав может включать в себя другие факторы роста, такие как инсулиноподобные факторы роста (ИФР) или ИФР-связанные белки.

Повышенная устойчивость йОН, обеспечиваемого составом, полученным согласно настоящему изобретению, позволяет более широко использовать составы йОН, которые могут являться более концентрированными, чем обычно используемые составы.

Термин устойчивость относится к физической, химической и конформационной устойчивости составов гормона роста настоящего изобретения (включая поддержание биологической силы). Неустойчивость белкового состава может быть вызвана химическим расщеплением или агрегацией белковых молекул для образования структуры высшего порядка, дегликозилированием, модификацией гликозилирования, дезаминированием, окислением или любой другой структурной модификацией, снижающей по меньшей мере одну биологическую активность полипептида ОН, включенного в настоящее изобретение.

Аутоинъекторы известны в данной области техники, как, например, аутоинъектор под наименованием Еаэдес!®, который является особенно полезным для введения ЙОН. Относительно настоящего изобретения также можно использовать безыгольное введение, используя специальные устройства, являющиеся известными в данной области техники.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей состав по изобретению. Композиции в объеме настоящего изобретения включают в себя все составы, содержащие по меньшей мере один человеческий гормон роста или его производное, аналог, или вариант согласно настоящему изобретению в количестве, эффективном для достижения заданной цели. При вариабельности индивидуальных потребностей определение оптимальных диапазонов эффективных количеств каждого компонента входит в компетенцию специалистов в данной области техники. Обычные дозировки содержат от около 0,001 до около 0,1 мг/кг массы тела в день. Назначенное пациентам лечение ЙОН можно сочетать с другими видами лечения, которые могут быть показаны при этом заболевании.

Жидкий состав по изобретению можно получать восстановлением лиофилизированного препарата гормона роста в подходящем разбавителе (например, в воде для инъекций) таким образом, что состав содержит вышеуказанные наполнители.

Термин вводят, или введение, означает, что состав по изобретению вводят в организм пациента, чтобы осуществлять лечение болезни или состояния.

- 10 010626

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ИОН вводят ежедневно в дозе от около 0,1 до 10 мг или от около 0,5 до 6 мг. В одном варианте осуществления ежедневная доза составляет около 0,15-0,3 мг ИОН в день предпочтительно при подкожном введении. В дополнительном варианте осуществления дозу человеческого гормона роста около 1 мг вводят ежедневно пациенту.

В дополнительном варианте осуществления ИОН водят в чередующихся дозах, когда первая доза выше, чем вторая доза. Предпочтительно первая доза составляет около 1 мг и вторая доза составляет около 0,5 мг. Еженедельные дозировки составляют предпочтительно около 6, или около 5 мг, или около 4,5 мг в зависимости от потребностей пациента.

Термин пациент означает млекопитающее, которому проводят лечение болезни или состояния. По происхождению пациентами являются человек, овца, свинья, лошадь, бык, кролик и т.п., но этот список не является исчерпывающим.

Состав по изобретению подходит для многих различных режимов введения. Например, введение может быть парентеральным, например подкожным, внутривенным, внутримышечным, пероральным, внутрибрюшинным, в виде аэрозоля, трансдермальным, интратекальным, или ректальным. Вводимая доза зависит от возраста, состояния здоровья и массы тела реципиента, вида предшествующего или параллельного лечения при его наличии, частоты лечения и характера желаемого эффекта.

Согласно настоящему изобретению предпочтительными путями введения являются подкожный и внутримышечные способы.

При этом понимается, что подходящая доза композиции или состава согласно настоящему изобретению будет зависеть от возраста, состояния здоровья и массы тела реципиента, вида параллельного лечения при его наличии, частоты лечения и природы желаемого эффекта. Однако наиболее предпочтительную дозу без дополнительного экспериментирования можно подогнать для индивидуального пациента, как это понимается и определяется специалистом в данной области техники. Обычно это охватывает регулирование стандартной дозы, например снижение дозы при низкой массе тела у пациента.

Суммарную дозу, требуемую для каждого лечения, можно вводить в виде многократных доз (мультидоза) или в виде единственной дозы (монодоза).

Выражение использование мультидозы имеет целью включение в него использования единственного флакона, ампулы или картриджа состава ИОН, более чем для одной инъекции, например для 2, 3, 4, 5, 6 или более инъекций. Инъекции могут быть разнесены по времени, например, на периоды в 6, 12, 24, 48 или 72 ч.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению состава согласно настоящему изобретению для введения монодозы. В альтернативном аспекте настоящее изобретение относится к применению состава согласно настоящему изобретению для введения мультидозы.

Обычные мультидозные составы ИОН компании 8егоио (δαίζοη) содержат 1,33, 3,33 или 8 мг ИОН.

Обычные мультидозные составы ИОН компании Ы11у (Ниша1горе) содержат 6, 12 или 24 мг ИОН.

Обычные мультидозные составы ИОН компании РП^ег (Оепо1горш) содержат 5 или 12 мг ИОН.

Обычные мультидозные составы ИОН компании Иоуо ИогФкк (Оепо1горш) содержат 5, 10 или 15 мг ИОН.

Таким образом, в обычных составах количество ИОН в одном флаконе составляет 1,33, 3,33, 5, 6, 8, 10, 12, 15 или 24 мг.

Композиции могут вводиться индивидуально или в комбинации с другими лекарственными препаратами против этого заболевания или против других симптомов.

Составы ИОН по изобретению можно дозировать во флаконы. К термину флакон относится широкий перечень резервуаров, подходящих для хранения ОН в твердой или жидкой форме в консервированном стерильном состоянии. Примеры используемых в настоящем изобретении флаконов включают в себя ампулы, картриджи, блистерные упаковки или другие подобные резервуары, подходящие для доставки ОН пациенту посредством шприца, помпы (включающей в себя осмотическую), катетера, трансдермального пластыря, легочного или трансмукозного аэрозоля. Флаконы, подходящие для упаковки продуктов для парентерального, легочного, трансмукозного или трансдермального введения, являются широко известными и признанными в данной области техники.

Повышенная устойчивость составов ИОН позволяет проводить продолжительное хранение при подходящей температуре, такой как температура ниже точки замерзания (например, при -20°С) или выше точки замерзания, предпочтительно при 2-8°С, наиболее предпочтительно при 5°С или даже при комнатной температуре, например при 25°С.

Составы ИОН, используемые для введения ίη νί\Ό. должны быть стерильными. Этого, например, можно легко достигнуть фильтрацией через стерильные фильтрационные мембраны.

Лекарственные препараты жидких составов ИОН обычно дозируют в контейнер, имеющий порт стерильного доступа, например, в мягкую упаковку внутривенного раствора или во флакон, имеющий стопор, который можно проколоть иглой для подкожного введения.

В этой связи дополнительный аспект настоящего изобретения относится к форме представления жидкого состава настоящего изобретения, герметично укупоренного внутрь контейнера в стерильных условиях, подходящего для хранения до использования.

- 11 010626

Составы по изобретению можно использовать для лечения дефицита ОН у детей, при потере веса и истощении у больных СПИДом, при синдроме Тернера у девочек, а также при хронической почечной недостаточности у детей.

Описание настоящего изобретения приводится в связи с конкретными вариантами осуществления, вместе с тем необходимо понимать, что оно может быть дополнительно модифицировано. Данное изобретение предназначено охватить любые вариации, использования или его адаптации, отвечающие, в целом, принципам изобретения и включающие такие отклонения от настоящего раскрытия, как входящие в объем известной специалистам в данной области техники или общепринятой практики, к которым принадлежит настоящее изобретение, и поэтому может относиться к существенным признакам, сформулированным выше, как попадающим в объем прилагаемой формулы изобретения.

Все цитируемые в настоящем изобретении ссылки, включающие в себя статьи в журналах или рефераты, опубликованные или неопубликованные в патентных заявках США или в других странах, патенты, изданные в США, или иностранные патенты, или любые другие ссылки, на которые в настоящем изобретении дается ссылка, приводятся полностью, включая все данные, таблицы, фигуры и текст, представленные в цитируемых ссылках. Дополнительно, полное содержание ссылок, цитируемых в пределах цитируемых ссылок, приводятся полностью в настоящем изобретении.

После описания настоящего изобретения оно может быть лучше понято при обращении к следующим примерам схемы иллюстративных клинических исследований, обеспечиваемых для иллюстрации, и не предназначенных ограничить объем настоящего изобретения.

Пример.

следующих состава оценивали в плане их устойчивости:

Состав А:

Компоненты	Состав А
г-ЬСН (мг/мл)	8,0
Фосфат цитрата натрия с уровнем рН 5,8 (мМ)	5,0
Сульфат натрия (мМ)	100,0
Хлорид магния (мм)	50
Фенол (мг/мл)	3,0
Р1игоп1с Е68 (мг/мл)	1,5

Состав В:

Компоненты	Состав В
г-ЬСН (мг/мл)	8,0
Фосфат цитрата натрия с уровнем рН 5,57 (мМ)	5,0
Хлорид натрия (мМ)	171,0
Хлорид магния (мм)	5
Фенол (мг/мл)	3,0
Р1игоп1с Е68 (мг/мл)	0,2

Химическую устойчивость составов А и В оценивали после хранения образцов при температуре 40°С в течение продолжительного времени, т.е. дольше 3 недель.

Устойчивость ЙОН определяли ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазовой ВЭЖХ). Таким образом, определенное количество неизмененного интактного гормона роста получали как производное человеческого гормона роста от степени замены основного пика. Другими словами, степень замены выводили от замены основного пика человеческого гормона роста и рассчитывали как процент от неизменного г-йОН по сравнению с соответствующим пиком в нулевой отметке времени.

Результаты.

Состав А.

После хранения образца в течение 1 месяца при 40°С основной пик, измеренный для т-йОН, представляет 62% от соответствующего пика в нулевой отметке времени (т.е. 62% неизмененого г-йОН выявлены после хранения в течение 1 месяца при 40°С).

После хранения образца в течение 1 месяца при комнатной температуре (25°С) основной пик, изме

- 12 010626 ренный для г-йСН. представляет 91% соответствующего пика в нулевой отметке времени (т.е. 91% неизмененого г-йСН выявлены после хранения в течение 1 месяца при 25°С).

Состав В.

После 3 недель хранения при 40°С основной пик. измеренный для г-йСН. представляет 69% соответствующего пика в нулевой отметке времени (т.е. 69% неизмененого г-йСН выявлены после 3 недель хранения при 40°С).

Ссылки

1. А1!ксйи1 8.Р. е! а1.. 1. Мо1. Вю1.. 215. 403-410. 1990.

2. А1!ксйи1 8.Р. е! а1.. Хис1ек. Ас1бк Век.. 25:389-3402. 1997.

3. ЛикиЬе1 е! а1.. Сиггеи( Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Βίο1ο§ν. Сгеепе РиЬйсайопк апб Абеу 1п!егкс1епсе (Хеи Уогк. 1987-1998).

4. Вескег е! а1.. Вю!есйпо1. Арр1. Вюсйет. 10:326 (1988).

5. Веи1у е! а1.. Ιη!. 1. Рерйбе апб Рго!ет Век. 4:281-287 (1972).

6. Сйеп е! а1.. Сепотюк 4:479-497 (1989).

7. Оеуегеих 1. е! а1.. Хис1ек Ас1бк Век.. 12. 387-395.1984.

8. СегПег е! а1.. Епбосгто1оду 118:720 (1986).

9. Соеббе1 е! а1. Ха!иге. 281:544 (1979).

10. СгаГГ е! а1.. 1. Вю1. Сйет. 257:2365 (1982).

11. Сгап!йат. 8с1епсе. νο1. 185. р. 862-864 (1974).

12. Нкшпд е! а1.. Вю!есйпо1оду 7:267 (1989).

13. Беизк е! а1.. Епбосппо1оду 101:1587 (1977).

14. Ееи1к е! а1.. 1. Вю1. Сйет. 253:2679 (1978).

15. Беизк е! а1.. Епбосппо1оду 104:1256 (1979).

16. Беи1к е! а1.. Вюсйет. Вюрйук. Век. Сотт. 92:511 (1980).

17. Беи1к е! а1.. 1. Вю1. Сйет. 256:11645 (1981).

18. Магйа1 е! а1.. 8с1епсе 205:602-607 (1979).

19. Ме1пко!й 1.. Аай1 С. НуЬпб|/а1юп οί пис1ек аабк 1ттоЬб|/еб оп койб кирройк. Апа1. Вюсйет. 1984 Мау 1; 138(2):267-84.

20. Реагкоп А.В.. Ме!йобк ш Епхуто1оду. 183. 63-99. 1990.

21. Реагкоп А.В. апб Ыртап Ό.Ι.. Ргос. Ха!. Асаб. 8сБ И8А. 85. 2444-2448. 1988.

22. Реаг1тап апб Хдиуеп (1989). 1п Ό. Магкйак апб Ό. Бш (ебк). Тйегареийс Рерйбек апб Рго!етк. Еогти1айопк. ИеЖегу апб Тагдейпд. Сиггеп! Соттишса!юпк ш Мо1еси1аг Вю1оду. Со1б-8рппд НагЬоиг БаЬога!огу. Со1б 8рппд НагЬоиг. Хеи Уогк. р 23-30.

23. 8шдй е! а1.. Епбосгшо1оду 94:883 (1974).

24. 8тйй е! а1.. 8с1епсе 260:1640-1643 (1998).

25. 8тйй апб Аа!егтап 1. Мо1. Вю1.. 147.195-197. 1981. Абνаηсек ш Аррйеб Ма!йетабск. 2.482-489. 1981.

26. Тйог1асшк-иккшд. Хеигоепбосгто1оду 43:233 (1987).

27. АО 93/19776.

28. АО 94/101398.

29. ЕР-0131864.

30. ЕР-0211601.

31. АО 97/29767.

32. И8-5567677.

Claims (27)

1. Жидкий состав. содержащий:

a) гормон роста или гормон. высвобождающий гормон роста (СНВН);

b) соль щелочного металла;

c) соль щелочно-земельного металла и

б) цитратно/фосфатный буфер.

2. Состав по п.1. в котором гормон роста представляет собой человеческий гормон роста.

3. Состав по любому из пп.1. 2. в котором соль щелочного металла выбирают из группы. состоящей из ХаС1. КС1. Ха28О4. Ха-СОБ.

4. Состав по п.3. в котором солью щелочного металла является ХаС1 или Ха₂8О₄.

5. Состав по любому из пп.1-4. в котором соль щелочно-земельного металла выбирают из группы. состоящей из СаС1₂. МдС1₂. Мд8О₄. ХН₄СО₃.

6. Состав по п.5. в котором солью щелочно-земельного металла является МдС1₂.

7. Состав по любому из пп.1-6. в котором буфер представляет собой натрий-цитратный/натрийфосфатный буфер.

8. Состав по п.7. в котором буфер находится в концентрации. варьирующей от 1 до 100 мМ. или от

- 13 010626

5 до 50 мМ, или от 10 до 20 мМ.

9. Состав по любому из пп.1-8, дополнительно содержащий сурфактант.

10. Состав по п.9, в котором сурфактантом является полиэтилен-полипропиленгликоль.

11. Состав по п.10, в котором сурфактантом является Р1игошс Р68.

12. Состав по п.9 или 10, включающий полиэтилен-полипропиленгликоль в концентрации, варьирующей от 0,5 до 5 мг/мл, или от 1 до 2 мг/мл, или 1,5 мг/мл.

13. Состав по любому из пп.1-2, дополнительно содержащий стабилизатор.

14. Состав по п.13, в котором стабилизатором является сахароза.

15. Состав по п.14, содержащий сахарозу в концентрации, варьирующей от 10 до 100 мг/мл, или от 20 до 80 мг/мл, или около 60 мг/мл.

16. Состав по любому из пп.1-15, имеющий рН в диапазоне от 5 до 7, или от 5,5 до 6,5, или около 6.

17. Состав по п.16, в котором рН находится в диапазоне 5,5-5,8.

18. Состав по любому из пп.1-17, дополнительно содержащий консервант.

19. Состав по п.18, содержащий консервант в концентрации, варьирующей от 1 до 10 мг/мл, или от 2 до 5 мг/мл, или 3 мг/мл.

20. Состав по п.18 или 19, в котором консервантом является фенол.

21. Состав по любому из пп.1-20, имеющий рН 5,8 и состоящий из г-йСН, натрий-цитрата/натрийфосфата, Να₂8ϋ₄. МдС1₂, фенола, Р1игошс Р 68 и необязательно воды для инъекций.

22. Состав по любому из пп.1-21, имеющий рН 5,8 и состоящий из г-йСН, натрий-цитрата/натрийфосфата, №С1, МдС1₂, фенола, Р1цгошс Р 68 и необязательно воды для инъекций.

23. Фармацевтическая композиция, содержащая состав по любому из пп.1-22.

24. Форма представления жидкого состава по любому из пп.1-22, герметично укупоренная в стерильных условиях в контейнер, подходящий для хранения до использования.

25. Применение состава по любому из пп.1-22 для получения лекарственного средства для лечения дефицита ОН у детей, при потере веса и истощении у больных СПИДом, при синдроме Тернера у девочек, а также при хронической почечной недостаточности у детей.

26. Применение состава по п.25, в котором лекарственное средство предназначено для введения монодозы.

27. Применение состава по п.25, в котором лекарственное средство предназначено для введения мультидозы.