PT1740213E - Formulação líquida da hormona de crescimento - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "FORMULAÇÃO LÍQUIDA DA HORMONA DE CRESCIMENTO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a formulações líquidas da hormona do crescimento (GH) e, em particular, a formulações líquidas da hormona do crescimento humana (hGH), com estabilidade química e física melhoradas. As formulações líquidas da hormona do crescimento (GH) da presente invenção podem ser armazenadas à temperatura ambiente por um período de tempo prolongado. A presente invenção refere-se ainda a um processo para a preparação das referidas formulações líquidas de GH, e a uma forma para a sua apresentação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A hormona do crescimento humana (hGH), também conhecida como somatropina (INN) ou somatotropina, é uma hormona proteica produzida e segregada pelas células somatotrópicas da pituitária anterior. A hormona do crescimento humana desempenha um papel chave no crescimento somático na infância e no metabolismo na idade adulta, através dos seus efeitos sobre o metabolismo das proteínas, carbohidratos e lípidos. A hormona do crescimento humana tem uma cadeia polipeptídica simples de 191 aminoácidos (Bewly et al, 1972), que possui duas ligações dissulfureto, uma entre Cys-53 e Cys-165, formando um grande anel na molécula, e a outra entre Cys-182 e Cys-189, formando um pequeno anel próximo do término C. A sequência de ADN que confirmou a sequência de aminoácidos foi apresentada por Martial et al (1979). A hGH purificada é um pó amorfo branco na sua forma 2 liofilizada. É facilmente solúvel (concentrações > 10 mg/L) em tampões aquosos, a um pH no intervalo entre 6,5 e 8,5.

Em solução, a hGH existe predominantemente como um monómero, com uma pequena fração como dimeros e oligómeros de alto peso molecular. Em certas condições, a hGH pode ser induzida a formar maiores quantidades de dimeros, trimeros e oligómeros superiores. São conhecidos diversos derivados de hGH, incluindo derivados de ocorrência natural, variantes e produtos metabólicos, produtos de degradação, principalmente de hGH biossintética, e derivados sintéticos de hGH produzidos por métodos genéticos. Um exemplo de um derivado de ocorrência natural da hGH é a GH-V, uma variante da hormona de crescimento que se encontra na placenta. São descritos outros membros do locus do gene em Chen et al (1989). A metionil-hGH foi a primeira forma de hGH a ser produzida por tecnologia recombinante de ADN. Este composto é na realidade um derivado de hGH que tem um resíduo adicional de metionina no seu término N (Goeddel et al, 1979).

Um variante da hGH de ocorrência natural, denominada 20-K-hGH, foi referida como ocorrendo na pituitária, bem como na corrente sanguínea (Lewis et al, 1978; Lewis et al, 1980). Este composto, a que faltam os 15 resíduos de aminoácidos de Glu-32 a Gln-46, surge de uma união de alternativa do ácido ribonucleico mensageiro (DeNoto et al, 1981) . Este composto partilha muitas das propriedades biológicas da hGH, mas não todas. A 20-K-hGH é produzida na pituitária e segregada para o sangue. Constitui cerca de 5% da produção da hormona do 3 crescimento nos adultos, e cerca de 20% da produção da hormona do crescimento nas crianças. Tem a mesma atividade de promoção do crescimento que a hormona do crescimento de 22 kD, e foi referida como tendo um grau de atividade lipolitica igual ou maior do que a forma de 22 kD. Liga-se aos recetores da hormona do crescimento com a mesma afinidade que a hormona do crescimento de 22 kD, e tem um décimo da bioatividade lactogénica (tipo prolactina) que a hormona de 22 kD. Ao contrário da 22 kD, a 20-K-hGH tem uma fraca atividade anti-insulina.

Um certo número de derivados de hGH surgem de modificações proteoliticas da molécula. A via primária para o metabolismo da hGH envolve uma proteólise. A região da hGH em torno dos resíduos 130-150 é extremamente suscetível à proteólise, e têm sido escritos diversos derivados de hGH que têm clivagens ou supressões nesta região (Thortacius-Ussing, 1987). Esta região encontra-se no anel maior da hGH, e a clivagem de uma ligação peptídica na mesma resulta na criação de duas cadeias que estão ligadas através da ligação de dissulfureto em Cys-53 e Cys-165. Muitas destas formas de cadeia dupla foram referidas como tento atividade biológica acrescida (Singh et al, 1974). Têm sido criados artificialmente muitos derivados da hormona do crescimento humana, através da utilização de enzimas. Os enzimas tripsina e subtilisina, assim como outros, têm sido utilizados para modificar a hGH em vários pontos em toda a molécula (Lewis et al, 1977; Graff et al, 1982) . Um destes derivados, denominado proteína anabólica de cadeia dupla (2-CAP), foi formado através da proteólise controlada da hGH, utilizando a tripsina (Becker et al, 1989) . Descobriu-se que a 2-CAP tem propriedades biológicas muito distintas das da molécula de hGH intacta, pelo facto de a atividade de promoção do crescimento da hGH ser maioritariamente 4 retida e serem abolidos a maior parte dos efeitos sobre o metabolismo dos carbohidratos.

Os resíduos de asparagina e de glutamina nas proteínas são suscetíveis a reações de desamidação, em condições apropriadas. Foi demonstrado que a hGH da pituitária sofre este tipo de reação, resultando na conversão da Asn-152 em ácido aspártico e também, em menor extensão, a conversão da Gln-137 em ácido glutâmico (Lewis et al, 1981). Provou-se que a hGH desamidada tem uma suscetibilidade alterada à proteólise com o enzima subtilisina, sugerindo que a desamidação pode ter importância fisiológica na orientação da clivagem proteolítica da hGH. Sabe-se que a hGH biossintética se degrada em determinadas condições de armazenagem, tendo como resultado uma desamidação numa asparagina diferente (Asn-149). Este é o sítio principal de desamidação, mas também se observa a desamidação em Asn-152 (Becker et al, 1988) . Não foi referida na hGH biossintética a desamidação em Gln-137.

Os resíduos de metionina nas proteínas são suscetíveis à oxidação, principalmente a sulfóxido. Tanto a hGH oriunda da pituitária como a biossintética sofrem sulfoxidações em Met-14 e Met-125 (Becker et al, 1988) . A oxidação em Met-170 foi também referida para a hGH da pituitária, mas não na biossintética. Verificou-se que tanto a desamido-hGH como a met-14-sulfóxido-hGH exibem atividade biológica completa (Becker et al, 1988).

Foram produzidas formas truncadas de hGH, tanto através da ação de enzimas, como por métodos genéticos. A 2-CAP, produzida por ações controladas da tripsina, tem os primeiro oito resíduos no término N da hGH removidos. Foram produzidas outras versões truncadas de hGH por modificação 5 do gene antes da expressão num hospedeiro apropriado. Os primeiro 13 resíduos foram removidos para se produzir um derivado que tem propriedades biológicas distintas (Gertler et al, 1986), em que a cadeia polipeptídica não é clivada.

Embora a hormona de crescimento humana tenha sido obtida originalmente das glândulas pituitárias de cadáveres, estas preparações não eram homogéneas eletroforeticamente, e apareciam anticorpos no soro dos pacientes tratados com preparações da ordem de 50% de pureza, sendo a imunogenicidade atribuída a componentes inativos. A tecnologia de ADN recombinante permitiu a produção de um fornecimento ilimitado de hGH numa diversidade de sistemas diferentes. A purificação da hGH a partir do meio de cultura é facilitada pela presença de apenas baixas quantidades de proteínas contaminantes. De facto, mostrou-se que a hGH pode ser purificada à escala laboratorial por um único passo de purificação numa coluna de HPLC de fase reversa (Hsiung et al, 1989). A hormona do crescimento humana recombinante, rhGH, é produzida por Serono International S. A. como SEROSTIM®, produto a que foi dada aprovação acelerada da FDA para o tratamento de perda de peso e debilitação em pacientes com SIDA. O SAIZEN® é hormona do crescimento humana recombinante indicada para a deficiência de GH em crianças, para o síndroma de Turner em raparigas, assim como para a deficiência renal crónica em crianças. A PROTROPIN®, produzida por Genetech, Inc. (South San Francisco, CA), difere ligeiramente em estrutura da sequência natural da hGH, tendo um resíduo metionina adicional no término N. A hGH recombinante é geralmente comercializada em frascos que contêm hGH mais excipientes adicionais, por exemplo, glicina e manitol, numa forma liofilizada. É fornecido um 6 frasco anexo de diluente, permitindo ao paciente reconstituir o produto até à concentração desejada, antes da administração da dose. A hGH recombinante também pode ser comercializada de outras formas bem conhecidas, tais como seringas previamente cheias.

Para que a hGH possa estar disponível comercialmente como agente terapêutico, têm que ser preparadas formulações estáveis. Estas formulações têm que ser capazes de manter a atividade durante períodos de armazenagem apropriados e ser aceitáveis para a administração a pacientes. A GH humana foi formulada numa diversidade de formas. A título de exemplo, a patente US 5,096,885 revela uma formulação estável farmaceuticamente aceitável de hGH, que, além da hGH, compreende glicina, manitol, um tampão e opcionalmente um agente tensioativo não iónico, sendo a relação molar de hGH:glicina de 1:50. O documento WO 93/19776 revela formulações injetáveis de GH, compreendendo citrato como substância tampão e opcionalmente fatores de crescimento, tais como fatores de crescimento tipo insulina ou o fator de crescimento epidérmico, aminoácidos, tais como glicina ou alanina, manitol ou outros açúcar-álcoois, glicerina e/ou um conservante, tal como o álcool benzílico. 0 documento WO 94/101398 revela uma formulação de GH que contém hGH, um tampão, um meio tensioativo não iónico e, opcionalmente, manitol, um sal neutro e/ou um conservante. A patente EP-0131864 descreve uma solução aquosa de proteínas com peso molecular superior a 8500 daltons, que foi protegida da adsorção às interfaces, contra a 7 desnaturação e contra a precipitação da proteína por adição de uma substância tensioativa que contém, como agente estabilizador, uma cadeia linear de polioxialquileno. A patente EP-0211601 revela uma formulação de promoção do crescimento, que contém uma mistura aquosa da hormona de promoção do crescimento e um copolímero de bloco contendo unidades polioxietileno-polioxipropileno e que possui um peso molecular médio de cerca de 1100 até cerca de 40 000, que mantém a fluidez da hormona de promoção do crescimento e a sua atividade biológica depois da administração. O documento WO 97/29767 revela uma formulação líquida que compreende uma hormona promotora do crescimento, citrato trissódico dihidrato, cloreto de sódio, hidróxido de sódio, álcool benzílico, Pluronic F-68, tendo a referida formulação um pH de 5,6. A patente US 5,567,677 revela formulações líquidas que contêm a hormona do crescimento humana, citrato de sódio, fosfato de sódio, glicina, manitol, e opcionalmente álcool benzílico.

As preparações farmacêuticas de hGH tendem a ser instáveis, particularmente em solução. Ocorrem espécies degradadas quimicamente, tais como formas desamidadas ou sulfoxiladas da hGH, e podem resultar da instabilidade física espécies diméricas ou espécies agregadas com pesos moleculares mais altos (Becker et al (1988); Becker et al., 1987; Pearlman e Nguyen (1989)).

Como consequência da instabilidade da hGH em solução, as formulações farmacêuticas da hGH estão geralmente na forma liofilizada, que têm que ser então reconstituídas antes da utilização. A reconstituição é realizada geralmente por adição de um diluente farmaceuticamente aceitável, tal como água esterilizada para injeções, soro fisiológico esterilizado ou um diluente fisiologicamente aceitável esterilizado, apropriado.

As soluções reconstituídas de hGH são, de preferência, conservadas a 4°C para minimizar as reações de degradação química e física, no entanto ocorrerá alguma degradação durante esta armazenagem, que se poderá estender por um período de até 14 dias.

Seria particularmente vantajosa uma formulação farmacêutica de hGH fornecida numa forma líquida, em particular uma formulação que mantivesse a estabilidade da hGH sem a formação de precipitação ou agregação, ou qualquer outra matéria granular, durante um período de tempo prolongado.

Por conseguinte, constitui um objetivo da presente invenção revelar formulações líquidas da hormona do crescimento, que não conduzam, como resultado, à formação de matéria granular indesejada e que tenham um período de armazenagem prolongada.

RESUMO DA INVENÇÃO

Um primeiro aspeto da invenção refere-se a uma formulação líquida, que compreende: a) uma hormona do crescimento, ou uma hormona que liberte a hormona do crescimento (GHRH); b) um sal de um metal alcalino; c) um sal de um metal alcalinoterroso ou um sal de um metal pseudo-alcalinoterroso; e 9 d) um tampão de citrato/fosfato, estando o pH das formulações situado no intervalo de 5,5 a 5,8.

Um segundo aspeto da invenção refere-se a um processo para a preparação da formulação liquida de acordo com a presente invenção.

Num terceiro aspeto, a invenção refere-se a uma formulação liofilizada, que é reconstituída de forma que origine a nova formulação líquida mencionada acima.

Num terceiro aspeto, a invenção refere-se à utilização de uma formulação de acordo com a invenção, para a administração como mono-dose ou multi-dose de uma hormona do crescimento.

Um quarto aspeto da invenção refere-se a uma forma de apresentação de uma formulação líquida de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, descobriu-se que a estabilidade química e física de uma hormona do crescimento numa formulação líquida pode ser aumentada através de uma escolha específica dos sais minerais. Desta forma, as soluções obtidas podem ser conservadas por um período de tempo prolongado, por exemplo, de cerca de 1 a 52 semanas, ou de 1 a 16 ou de 1 a 4 semanas, de preferência à temperatura ambiente.

Descobriu-se, além disso, que a estabilidade aumentada da hormona do crescimento na formulação líquida, por um período de tempo prolongado, pode ser obtida com uma composição de acordo com a reivindicação 1. 10

Por consequência, a invenção refere-se a uma formulação liquida, que compreende: a) uma hormona do crescimento, ou uma hormona que liberte a hormona do crescimento; b) um sal de um metal alcalino; c) um sal de um metal alcalinoterroso ou um sal de um metal pseudo-alcalinoterroso; e d) um tampão de citrato/fosfato, estando o pH das formulações situado no intervalo de 5,5 a 5,8.

Numa forma de realização, as formulações liquidas da presente invenção podem ser utilizadas para a administração multi-dose, em que a referida formulação pode ser armazenada à temperatura ambiente durante um período de uma semana ou mais. A hormona do crescimento que pode ser formulada de acordo com a presente invenção pode ser proveniente de qualquer espécie, tais como bovinos, porcinos, caninos ou felinos, consoante a utilização pretendida para a formulação.

Podem ser formuladas de acordo com a presente invenção, de preferência, as seguintes substâncias: a) a hormona do crescimento humana; b) um fragmento de (a) que tenha atividade agonística sobre o recetor de hGH; c) uma variante de (a) ou de (b) que tenha pelo menos 70% de identidade de sequência com (a) ou (b) e que tenha atividade agonística sobre o recetor de hGH; d) uma variante de (a) ou de (b) que seja coddificada por uma sequência de ADN que hibridiza para o complemento da sequência nativa de ADN que codifica (a) ou (b) em 11 condições moderadamente rigorosas e que tenha atividade agonistica sobre o recetor de hGH; ou e) um sal ou um derivado funcional de (a) , (b) , (c) ou (d) , que tenha atividade agonistica sobre o recetor de hGH. É preferida, de acordo com a presente invenção, uma formulação que contenha a hormona do crescimento humana. 0 termo "hormona do crescimento humana", ou "hGH", tal como é utilizado na presente invenção, é entendido como incluindo os derivados de ocorrência natural e sintéticos, tal como foi descrito acima, incluindo, sem limitações, tanto a hormona do crescimento humana de 20 kD como a de 22 kD, GH-V, e outros membros do locus do gene da hormona do crescimento, como foi descrito em pormenor em "antecedentes da invenção". A hGH pode ser a hormona do crescimento humana de ocorrência natural, ou pode ser, de preferência, a hGH recombinante. A hGH recombinante pode ser expressa em qualquer hospedeiro apropriado, tanto um hospedeiro procariótico como um hospedeiro eucariótico. A E. coli é um hospedeiro particularmente adequado para a expressão de hGH, por exemplo. Células de leveduras, de insetos ou de mamíferos são igualmente apropriadas para a expressão da hormona do crescimento recombinante. A hGH é de preferência expressa em células humanas ou de animais, por exemplo, em células de ovário do hamster chinês (CHO). 0 termo "hGH" ou "hormona do crescimento", tal como é aqui empregue, também inclui derivados funcionais, fragmentos, variantes, análogos, ou sais que retêm a atividade 12 biológica da hormona do crescimento, isto é, que atuam como agonistas para o recetor da hormona do crescimento. Por outras palavras, são capazes de se ligar ao recetor da hormona do crescimento, para iniciar a atividade de sinalização do recetor. 0 termo "derivados funcionais", ou "derivados químicos", tal como é aqui usado, cobre derivados que podem ser preparados a partir dos grupos funcionais que ocorrem como cadeias laterais nos resíduos dos grupos N- ou C-terminais, por meios conhecidos na técnica, e são incluídos na invenção enquanto permanecerem farmaceuticamente aceitáveis, e não destroem a atividade biológica da hGH como foi aqui descrita, isto é, a capacidade de ligação ao recetor de hGH e de iniciar a sinalização do recetor, e não conferem propriedades tóxicas às composições que os contêm. Os derivados podem ter partes químicas, tais como, resíduos carbohidrato ou fosfato, desde que um derivado desta natureza retenha a atividade biológica da hGH e permaneça farmaceuticamente aceitável.

Por exemplo, os derivados podem incluir ésteres alifáticos dos grupos carboxilo, amidas dos grupos carboxilo, por reação com amónia ou com aminas primárias ou secundárias, derivados de N-acilo ou grupos amino livres dos resíduos de aminoácidos formados com partes acilo (p. ex., grupos alcanoilo ou aroilo carbocíclicos) ou derivados de O-acilo de grupos hidroxilo livres (p. ex., o de resíduos serilo ou treonilo) formados com partes acilo. Os referidos derivados também podem incluir, por exemplo, cadeias laterais de polietileno-glicol, que podem mascarar sítios antigénicos e prolongar a permanência da molécula nos fluidos corporais. 13

Uma hormona do crescimento que foi convertida num derivado ou combinada com um agente complexante pode ser perdurável. Por conseguinte, uma variante preferida de realização da invenção refere-se a versões "PEGuiladas" da hormona do crescimento humana. As hormonas do crescimento manipuladas geneticamente para exibirem uma atividade perdurável no corpo também são exemplos de derivados de hGH inseridos no âmbito da presente invenção.

Foi isolada e identificada hGH que está acetilada no término N (Lewis et al, 1979) . Não é clarificado se a acilação tem um papel regulador ou se é simplesmente um passo da purificação. No entanto, espera-se que esta molécula exiba atividade de hGH de uma forma semelhante a outros derivados de hGH. Por conseguinte, numa forma preferida de realização, a invenção refere-se à hormona do crescimento humana que está acetilada no seu término N. A formulação de acordo com a invenção compreende, de preferência, um dimero da hormona do crescimento humana, escolhido do grupo que consiste num dimero de dissulfureto ligado através de ligações dissulfureto entre cadeias, um dimero não dissulfureto irreversível covalente, um dimero não covalente, e misturas dos mesmos. 0 termo "sais" refere-se aqui tanto a sais de grupos carboxilo como a sais de adição de ácido de grupos amino da molécula de hGH ou de um análogo da mesma. Os sais de um grupo carboxilo podem ser formados por meios conhecidos na técnica e incluem sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, de cálcio, de amónio, férricos ou de zinco, e semelhantes, e sais com bases orgânicas, tais como os que são formados, por exemplo, com aminas, tais como trietanolamina, arginina ou lisina, piperidina, procaína e 14 semelhantes. Os sais de adição de ácido incluem, por exemplo, sais com ácidos minerais, tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, e sais com ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. Como é evidente, qualquer destes sais tem que reter a atividade biológica da hGH relevante para a presente invenção, ou seja, a capacidade de se ligar ao recetor de hGH e iniciar a sinalização do recetor.

Numa outra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um fragmento da hormona do crescimento humana.

Um "fragmento" da hormona do crescimento de acordo com a presente invenção refere-se a qualquer subconjunto da molécula, ou seja, um peptídeo curto, que retém a atividade biológica desejada. Os fragmentos podem ser facilmente preparados por remoção de aminoácidos, de qualquer das extremidades da molécula de hGH e ensaiando-se o fragmento resultante quanto às suas propriedades como um agonista do recetor de hGH. São conhecidos processos para a remoção de um aminoácido de cada vez, tanto da parte N-terminal como da parte C-terminal de um polipeptídeo, e desta forma a determinação dos fragmentos que retêm a atividade biológica desejada envolve apenas experimentação de rotina.

Os fragmentos de hGH de acordo com a presente invenção podem ter, de preferência, supressões internas, desde que a supressão não afete a atividade biológica da hGH, isto é, a ligação a uma sinalização de iniciação através do recetor de hGH. Um fragmento que é preferido de acordo com a invenção é desprovido de 15 aminoácidos, desde o ácido glutâmico (Glu) 32 ao ácido glutâmico 46. 15

Os fragmentos de hGH podem ser ainda truncados nos término C ou N. São também preferidos, de acordo com a presente invenção, os hGH truncados a que faltam os primeiros oito resíduos N-terminais ou os primeiros 13 resíduos N-terminais da hormona do crescimento humana.

Foi descrito um curto fragmento C-terminal de hGH, que retém uma atividade biológica da hGH, ver US 5,869,452. Por conseguinte, é preferida, de acordo com a invenção, a utilização de um fragmento C-terminal de hGH. De acordo com a presente invenção, é particularmente preferido o fragmento hGH177-191, que compreende pelo menos os resíduos de aminoácidos 177 a 191 de hGH (LRIVQCRSVEGSCGF) . São ainda preferidos derivados deste peptídeo, tais como as variantes de peptídeos descritas nos documentos US 6,335,319 ou WO 99/12969, por exemplo, peptídeos cíclicos.

Além disso, o polipeptídeo que tem a referida atividade agonista do recetor de hGH, seja ele a hGH, um análogo ou uma variante, um sal, um derivado funcional ou um fragmento do mesmo, pode conter também resíduos adicionais de aminoácidos a flanquear o polipeptídeo de hGH. Desde que a molécula resultante mantenha a capacidade de agonista do recetor de hGH do polipeptídeo nuclear, pode determinar-se, por experimentação de rotina, se qualquer destes resíduos de flancos afeta as características básicas e novas do peptídeo do núcleo, isto é, as suas caracterí sticas de agonista do recetor.

Um exemplo de uma variante de GH desta natureza, que é preferida de acordo com a presente invenção, é a metionil-(hormona do crescimento humana) (met-hGH), que tem um resíduo metionina adicional no término N da hormona do crescimento humana. 16

As variantes de hGH, que são preferidas de acordo com a invenção, compreendem metionil-hGH, que é uma hormona do crescimento humana que tem um resíduo adicional de metionina no seu término N. Uma outra variante preferida é uma hormona do crescimento humana a que faltam 15 resíduos de aminoácidos desde Glu32 até Glu46.

Uma "variante" da hormona do crescimento humana, de acordo com a presente invenção, refere-se a uma molécula que é essencialmente semelhante quer à proteína completa, quer a um fragmento da mesma. Uma variante também pode ser denominada uma "muteína". Uma variante pode ser, por exemplo, uma isoforma de hGH, tal como uma variante criada por uma união alternativa. Os (poli)peptídeos variantes podem ser também convenientemente preparados por síntese química direta do peptídeo variante, utilizando-se métodos bem conhecidos na técnica. Como é evidente, uma variante da hormona do crescimento humana deverá ter atividades de ligação ao recetor de hGH e de iniciação de sinal pelo menos semelhantes às da hGH, e, por conseguinte, será de esperar que tenham uma atividade semelhante à hGH.

As variantes das sequências de aminoácidos da hormona do crescimento humana podem ser preparadas por mutações nos ADNs que codificam os derivados da hormona do crescimento humana sintetizados. Estas variantes incluem supressões, inserções ou substituições de resíduos na sequência de aminoácidos. Pode ser também feita qualquer combinação de supressão, inserção ou substituição para se chegar à construção final, desde que a construção final possua a atividade pretendida. Como é óbvio, as mutações que forem feitas no ADN que codifica o peptídeo variante não podem alterar a estrutura de leitura. 17

Ao nível genético, estas variantes podem ser preparadas por mutagénese dirigida ao sítio (como é exemplificado por Adelman et al, 1983) de nucleótidos no ADN que codifica a molécula de peptídeo, produzindo desta forma ADN que codifica a variante, e em seguida exprimindo o ADN na cultura da célula recombinante. As variantes exibem tipicamente, pelo menos, a mesma atividade biológica qualitativa que o peptídeo não variante.

Um "análogo" da hormona do crescimento humana de acordo com a presente invenção refere-se a uma molécula não natural que é essencialmente semelhante tanto à molécula inteira, como também a um fragmento ativo da mesma. Um análogo da hormona do crescimento humana útil na presente invenção deverá exibir atividade de hGH.

Os tipos de substituições que podem ser feitas na hormona do crescimento humana de acordo com a presente invenção podem ser baseadas na análise das frequências de permutas de aminoácidos entre uma proteína homóloga de diferentes espécies. Com base nesta análise, podem ser aqui definidas substituições conservativas como permutas dentro de um dos seguintes cinco grupos: I. pequenos resíduos alifáticos, não polares ou ligeiramente polares:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly II. resíduos polares carregados negativamente, e as suas amidas:

Asp, Asn, Glu, Gin III. resíduos polares carregados positivamente:

His, Arg, Lys grandes resíduos alifáticos, não polares: IV. 18

Met, Leu, Ile, Vai, Cys V. grandes resíduos aromáticos:

Phe, Try, Trp

Dentro dos grupos anteriores, as seguintes substituições são consideradas como sendo "altamente conservativas":

Asp/Glu His/Arg/Lys Phe/Tyr/Trp Met/Leu/Ile/Val

As substituições semi-conservativas são definidas como sendo permutas entre dois dos grupos (I) - (IV) acima, que estão limitadas ao supergrupo (A), que compreende (I), (II) e (III) acima, ou ao supergrupo (B) , que compreende (IV) e (V) acima. As substituições não estão limitadas aos aminoácidos codificados geneticamente, nem mesmo aos aminoácidos de ocorrência natural. Quando o epítopo é preparado por síntese peptídica, pode ser utilizado diretamente o aminoácido pretendido. Em alternativa, um aminoácido codificado geneticamente pode ser modificado fazendo-o reagir com um agente orgânico capaz de originar derivados, que seja capaz de reagir com cadeias laterais ou com resíduos terminais escolhidos.

Os resíduos de cisteinilo, mais comummente, são submetidos a reação com alfa-halogenoacetatos (e com as aminas correspondentes), tais como o ácido cloroacético ou a cloroacetamida, para se obterem derivados de carboxilmetilo ou carboxiamidometilo. Também são formados derivados dos resíduos de cisteinilo por reação com bromotrifluoracetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidazolil)-propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, dissulfureto de 3-nitro-2-piridilo, dissulfureto de metil-2-piridilo, p-cloro- 19 mercuriobenzoato, 2-cloromercúrio-4-nitrofenol ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazol. São formados derivados dos resíduos de histidilo por reação com procarbonato de dietilo a pH 5,5-7,0, visto que este agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidilo. O brometo de parabromofenacilo também é útil; a reação é realizada de preferência em cacodilato de sódio 0,1 M, a pH 6,0.

Os resíduos terminais de lisinilo e amino são submetidos a reação com anidrido succínico ou outros anidridos de ácidos carboxílicos. A formação de derivados com estes agentes tem o efeito de inverter a carga dos resíduos de lisinilo. Outros reagentes apropriados para a formação de derivados de resíduos que contêm alfa-aminoácidos incluem imidoésteres, tais como picolinoimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; borohidreto de cloro; ácido trinitrobenzenossulfónico; O-metil-isoureia; 2,4-pentano-diona; e a reação com glioxilato catalisada com transamínase.

Os resíduos de arginilo são modificados por reação com um ou vários reagentes convencionais, entre os quais o fenil-glioxal; 2,3-butanodiona; e ninhidrina. A formação de derivados dos resíduos de arginina exige que a ração seja realizada em condições alcalinas, em virtude do elevado valor de pKa do grupo funcional guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina, bem como com o grupo épsilon-amino de arginina. A modificação específica dos resíduos tirosilo per se foi estudada extensivamente, com particular interesse na introdução de etiquetas espetrais em resíduos tirosilo por 20 reação com compostos aromáticos de diazónio ou com tetranitrometano. Mais correntemente, são utilizados N-acetilimidazol e tetranitrometano para formar espécies 0-acetil-tirosilo e derivados em ε-nitro, respetivamente.

Os grupos laterais carboxilo (aspartilo ou glutamilo) são modificados seletivamente por reação com carbodiimidas (R'N-C-N-R'), tais como l-ciclohexil-3-[2-morfolinil-(4-etil)]-carbodiimida ou l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetil-pentil)-carbodiimida. Além disso, os resíduos aspartilo e glutamilo são convertidos em resíduos asparaginilo e glutaminilo por reação com iões amónio.

Os resíduos glutaminilo e asparaginilo são frequentemente desamidados aos correspondentes resíduos glutamilo e aspartilo. Em alternativa, estes resíduos são desamidados em condições moderadamente ácidas. Qualquer das formas destes resíduos está abrangida no âmbito da presente invenção.

Os exemplos de produção de substituições de aminoácidos em proteínas, que podem ser utilizadas para a obtenção de análogos da hGH para a utilização na presente invenção, incluem quaisquer passos de métodos conhecidos, tais como os que são apresentados nas patentes US RE 33,653; 4,959,314; 4,588,585 e 4,737,462, de Mark et al; 5,116,943 de Koths et al; 4,965, 195 de Namen et al; e 5,017,691 de Lee, et al, e proteínas substituídas por lisina apresentadas na patente US 4,904,584 (Shaw et al). Foram descritas outras variantes da hormona do crescimento, por exemplo, em US 6,143,523 (Cunningham et al.).

Entre as substâncias que se ligam ao recetor da hormona do crescimento humana, e iniciam a sinalização da mesma, que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção, 21 estão todos os análogos da hormona do crescimento, e os respetivos miméticos, já conhecidos na literatura, tais como, por exemplo, os que são apresentados nas patentes US 5,851,992; 5,849,704; 5,849,700; 5,849,535; 5,843,453; 5, 834,598; 5, 688, 666; 5, 654,010; 5, 6335, 604; 5, 633, 352; 5,597,709 e 5,534,617.

As variantes ou os análogos de hGH têm de preferência uma sequência nuclear, que é a mesma que a sequência nativa ou fragmentos biologicamente ativos da mesma, que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade com a sequência nativa de aminoácidos e que retém a atividade biológica da mesma. Mais preferivelmente, a referida sequência tem pelo menos 80% de identidade, pelo menos 90% de identidade, ou mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade com a sequência nativa. "Identidade" reflete uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos, ou duas ou mais sequências de polinucleótidos, determinadas por comparação das sequências. Em geral, identidade refere-se a uma correspondência exata de nucleótido para nucleótido, ou de aminoácido para aminoácido, dos dois polinucleótidos ou de duas sequências polipeptídicas, respetivamente, ao longo do comprimento das sequências que estão a ser comparadas.

Para as sequências em que não há uma correspondência exata, pode ser determinada uma "% de identidade". Em geral, as duas sequências a ser comparadas são alinhadas de modo a obter-se a máxima correlação entre as sequências. Isto pode incluir a inserção de "lacunas" numa ou em ambas as sequências, para favorecer o grau de alinhamento. Pode ser determinada uma "% de identidade" em todo o comprimento de cada uma das sequências a ser comparadas (o chamado alinhamento global), que é particularmente adequado para 22 sequências do mesmo comprimento ou de comprimentos muito semelhantes, ou ao longo de comprimentos pequenos e definidos (o chamado alinhamento local), que é mais apropriado para sequências de comprimentos diferentes.

Os métodos para a comparação da identidade e da homologia de duas ou mais sequências são bem conhecidos na técnica. Assim, por exemplo, os programas disponíveis em Wisconsin Sequence Analysis Package, versão 9.1 (Devereux J et al., 1984), por exemplo, os programas BESTFIT e GAP, podem ser utilizados para determinar a % de identidade entre dois polinucleótidos e a % de identidade e a % de homologia entre duas sequências de polipeptideos. 0 BESTFIT usa o algoritmo de "homologia local" de Smith e Waterman (1981) e procura a melhor região simples de semelhança entre as duas sequências. São também conhecidos na técnica outros programas para a determinação da identidade e/ou da semelhança entre sequências, por exemplo, a família de programas BLAST (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, acessível através da "home page" de NCBI em www.ncbi.nim.nih.gov) e FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

As permutas preferidas para variantes ou muteínas de acordo com a presente invenção são as que são conhecidas como substituições "conservadoras". As substituições conservadoras de aminoácidos, de polipeptideos ou de proteínas da hormona do crescimento podem incluir aminoácidos sinónimos dentro de um grupo que pode ter propriedades físico-químicas suficientemente semelhantes, de modo que a substituição entre membros do grupo conservará a função biológica da molécula (Grantham, 1974). É evidente que as inserções e as supressões de aminoácidos também podem ser feitas nas sequências acima definidas, sem alteração da sua função, em particular se as inserções e as 23 supressões envolverem apenas alguns aminoácidos, por exemplo, menos de trinta, e de preferência menos de dez, e não removerem nem deslocarem aminoácidos que são críticos para uma conformação funcional, por exemplo, resíduos de cisteína. As proteínas e as muteínas produzidas por estas supressões e/ou inserções enquadram-se no âmbito da presente invenção.

Os análogos ou variantes de acordo com a presente invenção também podem ser determinados de acordo com o seguinte processo. 0 ADN da sequência nativa é conhecido da técnica anterior e é encontrado na literatura (Martial et al, 1979). Os polipeptídeos codificados por qualquer ácido nucleico, tais como ADN ou ARN, que hibridizam com o complemento do ADN ou ARN nativo em condições altamente rigorosas ou moderadamente rigorosas, desde que o referido polipeptídeo mantenha a atividade biológica da sequência nativa, também são considerados como pertencentes ao âmbito da presente invenção.

As condições de rigor são uma função da temperatura usada na experiência de hibridização, da molaridade dos catiões monovalentes e da percentagem de formamida na solução de hibridização. Para se determinar o grau de rigor envolvido com qualquer conjunto de condições dado, utiliza-se primeiro a equação de Meinkoth et al. (1984) para determinar a estabilidade de híbridos com 100% de identidade, expressa como temperatura de fusão Tm do híbrido ADN-ADN:

Tm = 81,52C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% form) - 500/L em que M é a molaridade dos catiões monovalentes, % GC é a percentagem de nucleótidos G e C no ADN, % form é a percentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares base. Por cada 1°C que a 24

Tm é reduzida do valor calculado para um híbrido com 100% de identidade, o grau de combinação inadequada permitida é aumentado de cerca de 1%. Deste modo, se a Tm utilizada para qualquer experiência de hibridização, dada nas concentrações especificadas do sal e da formamida, for 10°C inferior à Tm calculada para um híbrido a 100%, de acordo com a equação de Meinkoth, ocorre a hibridização, mesmo que haja até cerca de 10% de combinação inadequada.

Tal como é aqui empregue, "condições altamente rigorosas" são as que são tolerantes para até cerca de 15% de divergência das sequências, ao passo que condições moderadamente rigorosas são as que são tolerantes para até cerca de 20% de divergência das sequências. Sem limitação, os exemplos de condições altamente rigorosas (12-15°C abaixo da Tm calculada do híbrido) e moderadamente rigorosas (15-20°C abaixo da Tm calculada do híbrido) usam uma solução de lavagem de 2 x SSC (padrão de citrato e soro fisiológico) e 0,5% de SDS, à temperatura apropriada abaixo da Tm calculada do híbrido. Em última análise, o rigor das condições é devido principalmente às condições de lavagem, em particular se as condições de hibridização empregues forem as que permitem que se formem híbridos menos estáveis, a par da formação dos híbridos estáveis. As condições de lavagem para grande rigor removem então os híbridos menos estáveis. Uma condição de hibridização comum, que pode ser utilizada com as condições de lavagem altamente rigorosas a moderadamente rigorosas, descritas acima, é a hibridização numa solução de 6 x SSC (ou 6 x SSPE), 5 x reagente de Denhardt's, 0,5% de SDS, 100 pg/mL de ADN de esperma de salmão fragmentado desnaturado a uma temperatura de aproximadamente 20 a 25°C abaixo da Tm. Se forem utilizadas amostras mistas, é preferível usar cloreto de tetrametil-amónio (TMAC) em vez de SSC (Ausubel, 1987-1998). 25

Embora a presente invenção forneça processos recombinantes para a preparação dos derivados da hormona do crescimento humana, estes derivados também podem ser preparados por processos convencionais da síntese de proteínas, que são bem conhecidos dos peritos na técnica. A formulação da invenção compreende polietileno-poli-propileno-glicol. Este polímero é um tensioativo não iónico. Um tensioativo também pode ser aqui designado por "meio tensioativo" ou "agente tensioativo". Numa forma de realização ainda mais preferida, a formulação compreende o polietileno-polipropileno-glicol numa concentração que varia de 0,5 a 5 mg/mL, ou dee 1 a 2 mg/mL, ou é de 1,5 mg/mL.

Numa formulação preferida, o meio tensioativo é pluronic-poliol, tal como, por exemplo, F68. 0 Pluronic F68 é altamente preferido, de acordo com a presente invenção.

Ao se formular a GH com o meio tensioativo Pluronic® F68 (BASF, também conhecido por Poloxamer 188), foi obtida uma formulação estável, que evita o problema da precipitação, agregação ou criação de matéria granular de qualquer espécie. 0 Pluronic F68 é um copolímero de bloco de unidades óxido de etileno (EO) e óxido de propileno (PO). O bloco de óxido de propileno (PO) é "ensanduichado" entre dois blocos de óxido de etileno (EO).

HO—(C HjCH CH 2CHO)y~(CH2CHaO)t- H

] 1. É criado um meio hidrófobo com o peso molecular pretendido através da adição controlada de óxido de propileno aos dois grupos hidroxilo do propileno-glicol; e 26 2. É adicionado óxido de etileno para "ensanduichar" o meio hidrófobo entre os grupos hidrofilicos.

No Pluronic F68, a percentagem de polioxietileno (hidrófilo) é de 80%, e o peso molecular do hidrófobo (polioxipropileno) é de aproximadamente 1967 Da.

As propriedades típicas do Pluronic F68 são enumeradas abaixo: peso molecular médio: 8400; ponto de fusão/fluidez: 52°C; forma física a 20°C: sólido; viscosidade (Brookfield) cps: 1000 [líquidos a 25°C, pastas a 60°C e sólidos a 77°C]; tensão superficial, dine/cm a 25°C; 0,1% conc.: 50,3 0,01% conc.: 51,2 0,001% conc.: 53,6 tensão interfacial, dine/cm a 25°C, contra nujol; 0,1% conc.: 19,8 0,01% conc.: 24,0 0,01% conc.: 26,0 molhagem de Draves, segundos a 25°C 1,0% conc.: >360 0,1% conc.: >360 altura de espuma

Ross Miles, 0,1%, mm a 50°C: 35 Ross Miles, 0,1%, mm a 26°C: 40 dinâmica, 0,1%, mm a 400 mL/min: > 600 ponto de turvação em solução aquosa, 0°C 1% conc.: >100 10% conc.: >100 27 HLB (balanço hidrófilo-lipófilo): 29

Outros polímeros que têm propriedades semelhantes ao Pluronic F68 podem ser também empregues nas formulações da invenção. 0 polietileno-polipropileno-glicol pode ser utilizado numa concentração que varia desde 0,5 a 5 mg/mL, ou de 1 a 2 mg/mL, ou é de 1,5 mg/mL.

Os peritos na técnica compreendem que, além do polietileno-polipropileno-glicol, podem ser utilizados um ou mais meios tensioativos. A formulação da invenção compreende adicionalmente um agente de estabilização. Um agente de estabilização também pode atuar como um agente de isotonicidade.

Um "agente de isotonicidade" é um composto que é tolerado fisiologicamente e que confere uma tonicidade adequada a uma formulação, para impedir o fluxo franco de água através das membranas das células que estão em contato com a formulação. Compostos tais como a glicerina, são utilizados comummente para esta finalidade, em concentrações conhecidas. Outros agentes de estabilização apropriados incluem, não estando no entanto limitados a estes, aminoácidos ou proteínas (por exemplo, glicina ou albumina), sais (por exemplo, cloreto de sódio), e açúcares (por exemplo, dextrose, sacarose e lactose).

Os agentes de estabilização (estabilizadores) ou agentes de isotonicidade que podem ser utilizados de preferência de acordo com a presente invenção incluem açúcares não redutores, incluindo a sacarose, trealose, sorbose, 28 melezitose e rafinose, o manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol e glicerina.

Numa forma de realização preferida, o estabilizador ou agente de isotonicidade é a sacarose.

Numa outra forma de realização preferida, a formulação tem sacarose numa concentração que varia de 10 mg/mL a 100 mg/mL, ou de 2 0 mg/mL a 8 0 mg/mL, ou é de cerca de 60 mg/mL.

As formulações de acordo com a presente invenção contêm um sal de metal alcalino, incluindo NaCl, KCl, Na2SC>4, Na2CC>3. Numa forma preferida de realização, o sal de metal alcalino é o NaCl ou o Na2S04.

As formulações de acordo com a presente invenção contêm ainda um sal de um metal alcalinoterroso, incluindo CaCl2, MgCl2, MgSO-j, NH4CO3. Numa forma preferida de realização, o sal de metal alcalinoterroso é o MgCl2.

As formulações da invenção compreendem ainda um tampão de citrato/fosfato. Um tampão de citrato/fosfato que pode ser utilizado na presente invenção pode ser, por exemplo, o tampão de citrato de sódio/fosfato de sódio. O termo "tampão" ou "tampão fisiologicamente aceitável" refere-se a soluções de compostos que são conhecidos como sendo seguros para uso farmacêutico ou veterinário em formulações, e que têm o efeito de manter ou controlar o pH da formulação na gama de pH pretendida para a formulação. 29 É preferido que as formulações da presente invenção contenham o citrato/fosfato numa concentração que varia entre 1 e 100 mM, ou entre 5 e 50 mM, ou entre 10 e 20 mM.

As formulações da invenção são liquidas e, por conseguinte, contêm um diluente aquoso. O termo "diluente aquoso" refere-se a um solvente liquido que contém água. Os sistemas de solventes aquosos podem consistir apenas em água, ou podem consistir em água, assim como em um ou mais solventes misciveis, e podem conter solutos dissolvidos, tais como açúcares, tampões, sais, ou outros excipientes. A formulação também pode conter um ou mais solventes não aquosos. Os solventes não aquosos correntemente utilizados são os álcoois orgânicos de cadeia curta, tais como metanol, etanol, propanol, cetonas de cadeia curta, tais como acetona, e poliálcoois, tais como a glicerina. A formulação da invenção compreende ainda, de preferência, um conservante. A adição de um conservante é especialmente preferida se a hormona do crescimento for destinada a administração multi-doses.

Um "conservante" é um composto que pode ser incluído na formulação essencialmente para reduzir a ação bacteriana sobre a mesma, facilitando desta forma a produção de uma formulação multiuso, por exemplo. Os exemplos de potenciais conservantes incluem o cloreto de octadecil-dimetil-benzil-amónio, cloreto de hexametónio, cloreto de benzalcónio (uma mistura de cloretos de alquilbenzil-dimetilamónio em que os grupos alquilo são compostos de cadeia longa), e cloreto de benzetónio. Outros tipos de conservantes incluem álcoois 30 aromáticos, tais como fenol, álcoois butilico e benzilico, alquil-parabenos, tais como metil-parabeno ou propil-parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol.

Um conservante, neste caso, também pode ser um agente bacteriostático. O termo "bacteriostático" refere-se a um composto ou a composições adicionadas a uma formulação, para atuarem como um agente antibacteriano. Uma formulação da presente invenção, contendo a GH conservada, satisfaz de preferência a diretivas legais ou reguladoras da eficácia conservadora para ser um produto multi-uso (multi-dose) comercialmente válido. Os exemplos de agentes bacteriostáticos incluem o fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzilico, alquilparabenos (metil-, etil-, propil- e butil-parabeno, e semelhantes) , cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio, desidroacetato de sódio e timerosal. 0 conservante está presente, de preferência, numa concentração que varia entre 1 e 10 mg/mL, ou entre 2 e 5 mg/mL, ou é de 3 mg/mL. O conservante preferido de acordo com a invenção é o fenol.

Num segundo aspeto, a invenção refere-se a um processo para a produção da formulação liquida, compreendendo o passo de preparação de uma solução aquosa dos componentes da formulação de acordo com a presente invenção. A invenção refere-se ainda a um processo para a produção da formulação liquida, compreendendo o passo de colocar uma quantidade predeterminada da formulação num recipiente 31 esterilizado. Tipicamente, a referida quantidade é da ordem do mililitro.

As formulações liquidas de hGH para a administração terapêutica podem ser preparadas também por combinação de hGH e de agentes de estabilização, que tenham o grau de pureza desejado, com excipientes, tampões ou conservantes fisiologicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Osoll A. Ed. (1980). Os excipientes aceitáveis são os que não são tóxicos para o paciente nas concentrações e dosagens empregues, e incluem, por exemplo, tampões, conservantes, antioxidantes, e modificadores de pH e de tonicidade. A formulação liquida da hormona do crescimento pode incluir também um ou mais de outros excipientes estabilizadores, se desejado. Os excipientes estabilizadores adicionais podem incluir, por exemplo, aminoácidos, tais como glicina ou alanina, manitol ou outros açúcar-álcoois, ou glicerina. Além disso, a formulação liquida pode incluir outros fatores de crescimento, tais como fatores de crescimento de tipo insulina ou proteínas de ligação de IGF. A estabilidade acrescida da hGH proporcionada pela formulação preparada de acordo com a presente invenção, permite uma mais ampla utilização de formulações de hGH, que podem ser mais concentradas do que as que estão em uso correntemente. O termo "estabilidade" refere-se à estabilidade física, química e de conformação de formulações da hormona do crescimento da presente invenção (incluindo a manutenção da potência biológica). A instabilidade de uma formulação de proteína pode ser causada por degradação química ou por 32 agregação das moléculas de proteína, para formarem estruturas de ordem superior, por desglicosilação, modificação de glicosilação, desamidação, oxidação ou qualquer outra modificação estrutural que reduza pelo menos uma atividade biológica de um polipeptídeo de GH incluído na presente invenção. São conhecidos na técnica auto-injetores, tais como um designado por Easyject®, que é particularmente útil para a administração da hGH. Pode ser também utilizada, em associação com a presente invenção, a administração sem agulha, empregando-se dispositivos especiais que são conhecidos na técnica.

Um outro aspeto da invenção refere-se a uma composição farmacêutica, que compreende a formulação da invenção. As composições abrangidas pelo âmbito da presente invenção incluem todas as composições que contêm pelo menos uma hormona do crescimento humana ou um derivado, um análogo ou uma variante da mesma, de acordo com a presente invenção, numa quantidade eficaz para se alcançar a sua finalidade pretendida. Embora as necessidades individuais variem, a determinação das gamas ótimas das quantidades eficazes de cada componente enquadra-se na especialidade da técnica. As doses típicas compreendem cerca de 0,001 até cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal, por dia. Quando é administrada a pacientes, a terapia com hGH pode ser ministrada em simultâneo com outras terapias que podem estar indicadas para esta doença. A formulação líquida da presente invenção pode ser obtida por reconstituição de uma amostra de hormona do crescimento liofilizada, num diluente apropriado (por exemplo, água 33 para injeções), de tal forma que a formulação contenha os excipientes identificados acima.

Os termos "ministrar", "administrar" ou "administração" significam introduzir uma formulação da presente invenção no corpo de um paciente que necessite da mesma para o tratamento de uma doença ou patologia.

Numa forma preferida de realização da invenção, a hGH é administrada numa dose diária de cerca de 0,1 a 10 mg, ou de cerca de 0,5 a 6 mg. Numa variante de realização, a dose diária é de cerca de 0,15-0,3 mg de hGH por dia, de preferência por injeção subcutânea. Numa outra variante de realização, é ministrada uma dose de cerca de 1 mg de hormona do crescimento humana por dia a um paciente que dela tenha necessidade.

Numa outra variante de realização, a hGH é ministrada em doses alternadas, sendo a primeira dose superior à segunda dose. A primeira dose é, de preferência, de cerca de 1 mg e a segunda dose é de cerca de 0,5 mg. As doses semanais são, de preferência, de cerca de 6 mg ou de cerca de 5 mg ou de cerca de 4,5 mg, consoante as necessidades do paciente. 0 termo "paciente" significa um mamífero que é tratado a uma doença ou patologia. Os pacientes têm as seguintes origens, não estando, no entanto, limitados às mesmas: humana, ovina, porcina, equina, bovina, de coelho, ou semelhantes. A formulação da presente invenção é apropriada para muitos regimes de administração diferentes. A administração pode ser, por exemplo, por via parentérica, tal como subcutânea, intravenosa, intramuscular, oral, intraperitoneal, por 34 aerossol, transcutânea, intratecal ou retal. A dose administrada depende da idade, do estado de saúde e peso do recetor, de tipos de tratamento prévios ou concorrentes, se existirem, da frequência do tratamento e da natureza do efeito desejado.

De acordo com a presente invenção, as vias de administração preferidas são as vias subcutânea e intramuscular. É compreensível que a dose apropriada de uma composição ou formulação, de acordo com a presente invenção, esteja dependente da idade, do estado de saúde e peso do recetor, do tipo de tratamento concorrente, se existir, da frequência do tratamento e da natureza do efeito desejado. No entanto, a dose de maior preferência pode ser ajustada ao paciente individual, tal como é entendida e determinável pelos peritos na técnica, sem experimentação excessiva. Isto envolve, tipicamente, o ajustamento de uma dose padronizada, por exemplo, a redução da dose se o paciente tiver um peso corporal baixo. A dose total exigida para cada tratamento pode ser administrada em múltiplas doses (multi-dose) ou numa única dose (mono-dose). A expressão "utilização em multi-dose" é entendida como incluindo a utilização de um único frasco, ampola ou cartucho da formulação de GH para mais do que uma injeção, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais injeções. As injeções podem ser espaçadas em tempo, por exemplo, por um período de 6, 12, 24, 48 ou 72 horas. A invenção refere-se ainda à utilização de uma formulação de acordo com a presente invenção para a administração 35 mono-dose. Num aspeto de alternativa, a invenção refere-se à utilização de uma formulação de acordo com a presente invenção para a administração em multi-dose.

As formulações multi-dose de hGH típicas de Serono (Saizen) contêm 1,33, 3,33 ou 8 mg de hGH.

As formulações multi-dose de hGH típicas de Lilly (Humatrope) contêm 6, 12 ou 24 mg de hGH.

As formulações multi-dose de hGH típicas de Pfizer (Genotropin) contêm 5 ou 12 mg de hGH.

As formulações multi-dose de hGH típicas de Novo Nordisk (Genotropin) contêm 5, 10 ou 15 mg de hGH.

Desta forma, em formulações típicas, a quantidade de hGH fornecida num frasco é de 1,33, 3, 33, 5, 6, 8, 10, 12, 15 ou 24 mg.

As formulações podem ser administradas isoladamente ou em conjunção com outras terapêuticas direcionadas à doença ou direcionadas a outros sintomas da mesma.

As formulações da presente invenção podem ser fornecidas em frascos. 0 termo "frasco" refere-se genericamente a um recipiente apropriado para reter a GH na forma sólida ou líquida, num estado esterilizado e embalado. Os exemplos de um frasco, tal como é aqui utilizado, incluem ampolas, cartuchos, embalagens em bolhas, ou outros destes reservatórios adequados para o fornecimento da GH ao paciente através de uma seringa, bomba (inclusive, osmótica), cateter, adesivo transcutâneo, pulmonar ou "spray" transmucosal. Os frascos 36 apropriados para a embalagem de produtos para a administração parentérica, pulmonar, transmucosal ou transcutânea são bem conhecidos e reconhecidos na técnica. A estabilidade acrescida das formulações de hGH permite uma armazenagem a longo prazo, a uma temperatura apropriada, tal como abaixo do ponto de congelação (por exemplo, a -20°C), ou acima do ponto de congelação, de preferência a 2-8°C, mais preferivelmente a +5°C, ou mesmo à temperatura ambiente, por exemplo, a +25°C.

As formulações de hGH para serem utilizadas na administração in vivo têm que ser esterilizadas. Isto pode ser, por exemplo, realizado rapidamente por filtração através de membranas de filtração esterilizadas.

As formulações terapêuticas de hGH liquida são geralmente colocadas num recipiente que tem um orifício de acesso esterilizado, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou um frasco que tem uma rolha que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica.

Por conseguinte, um outro aspeto da invenção refere-se a uma forma de apresentação de uma formulação liquida da invenção, hermeticamente fechada no estado esterilizado dentro de um recipiente apropriado para armazenagem antes da utilização.

As formulações da presente invenção podem ser utilizadas para o tratamento de deficiência de GH em crianças, perda de peso e debilitação em pacientes com SIDA, para o síndroma de Turner em raparigas, assim como em deficiência renal crónica em crianças. 37

Tendo sido agora descrita a invenção, esta será mais facilmente compreendida com referência ao exemplo que se segue de uma descrição geral de um estudo clinico exemplificativo, que é apresentado a titulo de ilustração e não é entendido como sendo limitativo da presente invenção.

EXEMPLO

As duas formulações a seguir foram avaliadas em termos da sua estabilidade:

Formulação A:

Ingredientes formulação A r-hGH (mg/mL) 8,0 citrato fosfato de sódio pH 5,8 (mM) 5, 0 sulfato de sódio (mM) 100, 0 cloreto de magnésio (mM) 50 fenol (mg/mL) 3, 0 Pluronic F68 (mg/mL) 1,5

Formulação B:

Ingredientes formulação B r-hGH (mg/mL) 8,0 citrato fosfato de sódio pH 5,57 (mM) 5, 0 cloreto de sódio (mM) 171, 0 cloreto de magnésio (mM) 5 fenol (mg/mL) 3, 0 Pluronic F68 (mg/mL) 0,2 A estabilidade química das formulações A e B foi avaliada depois de uma armazenagem das amostras a uma temperatura de 40°C durante um período de tempo prolongado, isto é, depois de 3 semanas. A estabilidade da hGH foi determinada por RP-HPLC (HPLC em fase inversa). Deste modo, a quantidade da hormona do crescimento intacta, não alterada, foi deduzida do grau de 38 variação do pico principal da hormona do crescimento humana. Por outras palavras, o grau de variação foi inferido da variação do pico principal da hormona do crescimento humana e foi calculado como percentagem de r-hGH inalterada contra o correspondente pico no instante zero.

Resultados:

Formulação A: • Depois da armazenagem da amostra durante 1 mês a 40°C, o pico principal medido para a r-hGH representa 62% do pico correspondente no instante zero (isto é, foram determinados 62% de r-hGH inalterada depois de 1 mês de armazenagem a 40°C). • Depois de 1 mês de armazenagem à temperatura ambiente (25°C), o pico principal medido para a r-hGH representa 91% do pico correspondente no instante zero (isto é, foram determinados 91% de r-hGH inalterada depois de 1 mês de armazenagem a 25°C).

Formulação B:

Depois de 3 semanas de armazenagem a 40°C, o pico principal medido para a r-hGH representa 69% do pico correspondente no instante zero (isto é, foram determinados 69% de r-hGH inalterada depois de 3 semanas de armazenagem a 40°C). 39

REFERÊNCIAS 1. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990 2. Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997 3. Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience (New York, 1987-1998) 4. Becker et al, Biotechnol. Appl. Biochem. 10:326 (1988) 5. Bewly et al, Int. J. Peptide and Protein Res. 4:281-287 (1972) 6. Chen et al, Genomics 4:479-497 (1989) 7. Devereux J et al, Nucleic Acids Res., 12, 387-395, 1984 . 8. Gertler et al, Endocrinology 118:720 (1986) 9. Goeddel et al, Nature, 281:544 (1979) 10. Graff et al, J. Biol. Chem. 257:2365 (1982) 11. Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974). 12. Hsiung et al, Biotechnology 7:267 (1989) 13. Lewis et al, Endocrinology 101:1587 (1977) 14. Lewis et al, J. Biol. Chem. 253:2679 (1978) 15. Lewis et al, Endocrinology 104:1256 (1979) 16. Lewis et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 92:511 (1980) 17. Lewis et al, J. Biol. Chem. 256:11645 (1981) 18. Martial et al, Science 205:602-607 (1979) 19. Meinkoth J, Wahl G. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports. Anal Biochem. 1984 May 1/138 (2) :267-84. 20. Pearson WR, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990 21. Pearson WR and Lipman D J, Proc Nat Acad Sei USA, 85, 2444-2448, 1988 22. Perlman and Nguyen (1989), In D. Marshak and D. Liu (eds.), Therapeutic Peptides and Proteins, Formulations, Delivery and Targeting, Current 40

Communications in Molecular Biology, Cold-Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York, pp. 23-30 23. Singh et ai, Endocrinology 94:883 (1974) 24. Smith et al, Science 260:1640-1643 (1998) 25. Smith and Waterman J Mol Biol, 147, 195-197, 1981,

Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981 26. Thorlacius-Ussing, Neuroendocrinology 43:233 (1987) 27. WO 93/19776 28. WO 94/101398 29. EP-0131864 30. EP-0211601 31. WO 97/29767 32. US-5, 567, 677.

Lisboa, 8 de Março de 2012

Claims (25)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação liquida, compreendendo a) uma hormona do crescimento, ou uma hormona que liberte a hormona do crescimento (GHRH), que estimula a libertação ou potência a atividade da hGH endógena f b) um sal de um metal alcalino; c) um sal de um metal alcalinoterroso ou um sal de um metal pseudo-alcalinoterroso; e d) um tampão de citrato/fosfato, estando o pH da formulação situado no intervalo de 5,5 a 5,8.

2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, em que a hormona do crescimento é a hormona do crescimento humana.

3. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que o sal de metal alcalino é escolhido do grupo que consiste em NaCl, KC1, Na2S04, Na2C03.

4. Formulação de acordo com a reivindicação 3, em que o sal de metal alcalino é NaCl ou Na2S04.

5. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que o sal de metal alcalinoterroso é escolhido do grupo que consiste em CaCl2, MgCl2, MgS04, NH4C03.

6. Formulação de acordo com a reivindicação 5, em que o sal de metal alcalinoterroso é MgCl2.

7. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o tampão é um tampão de citrato de sódio/fosfato de sódio. 2

8. Formulação de acordo com a reivindicação 7, em que o tampão está presente numa concentração que varia entre 1 e 100 mM, ou entre 5 e 50 mM, ou entre 10 e 20 mM.

9. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, compreendendo adicionalmente um meio tensioativo.

10. Formulação de acordo com a reivindicação 9, em que o meio tensioativo é um polietileno-polipropileno-glicol.

11. Formulação de acordo com a reivindicação 10, em que o meio tensioativo é Pluronic F68.

12. Formulação de acordo com as reivindicações 10 ou 11, compreendendo o polietileno-polipropileno-glicol numa concentração que varia entre 0,5 e 5 mg/mL, ou entre 1 e 2 mg/mL, ou é de 1,5 mg/mL.

13. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, compreendendo adicionalmente um estabilizador.

14. Formulação de acordo com a reivindicação 13, em que o estabilizador é a sacarose.

15. Formulação de acordo com a reivindicação 14, compreendendo a sacarose numa concentração que varia entre 10 mg/mL e 100 mg/mL, ou entre 20 mg/mL e 80 mg/ml, ou é de cerca de 60 mg/mL.

16. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15, compreendendo adicionalmente um conservante. 3

17. Formulação de acordo com a reivindicação 16, compreendendo o conservante numa concentração que varia entre 1 e 10 mg/mL, ou entre 2 a 5 mg/mL, ou é de 3 mg/mL.

18. Formulação de acordo com as reivindicações 16 ou 17, em que o conservante é o fenol.

19. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18, em que a referida formulação tem um pH de 5,8 e consiste em r-hGH, citrato de sódio/fosfato de sódio, Na2SC>4, MgCl2, fenol, Pluronic F68, e opcionalmente água para injeções.

20. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18, em que a referida formulação tem um pH de 5,8 e consiste em r-hGH, citrato de sódio/fosfato de sódio, NaCl, MgCl2, fenol, Pluronic F68, e opcionalmente água para inj eções.

21. Composição farmacêutica, compreendendo a formulação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 20.

22. Forma de apresentação da composição liquida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 20, hermeticamente fechada em condições de esterilização dentro de um recipiente apropriado para a armazenagem antes da utilização.

23. Utilização de uma formulação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 20, para a preparação de um medicamento para o tratamento da deficiência da hormona do crescimento em crianças, perda de peso e debilitação em pacientes com SIDA, para o síndroma de Turner em raparigas, assim como na deficiência renal crónica em crianças. 4

24. Utilização de uma formulação de acordo com a reivindicação 23, em que o medicamento é destinado para a administração mono-dose.

25. Utilização de uma formulação de acordo com a reivindicação 23, em que o medicamento é destinado para a administração multi-dose. Lisboa, 8 de Março de 2012