NO337249B1 - Flytende veksthormonformulering - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder flytende veksthormon (GH)-formuleringer, nærmere bestemt flytende formuleringer av humant veksthormon (hGH) med forbedret kjemisk og fysisk stabilitet. De flytende veksthormon (GH)-formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse kan lagres over et forlenget tidsrom ved romtemperatur. Foreliggende oppfinnelse gjelder videre en fremgangsmåte for fremstilling av slike flytende GH-formuleringer og en presentasjonsform derav.

Oppfinnelsens bakgrunn

Humant veksthormon (hGH), også betegnet somatropin (INN) eller somatotropin, er et proteinhormon som produseres og utskilles av de somatotrope cellene i fremre hypofyselapp. Humant veksthormon spiller en nøkkelrolle i somatisk vekst i barndommen og i metabolismen hos voksne via virkningene på metabolismen av proteiner, karbohydrater og lipider.

Humant veksthormon er en enkelt polypeptidkjede på 191 aminosyrer (Bewly et al., 1972) med to disulfidbroer, én mellom Cys-53 og Cys-165, som danner en stor løkke i molekylet, og den andre mellom Cys-182 og Cys-189, som danner en liten løkke nær C-enden. DNA-sekvensen som bekreftet aminosyresekvensen ble rapportert av Martial et al. (1979). Renset hGH er et hvitt, amorft pulver i frysetørket form. Proteinet er lett løselig (konsentrasjoner > 10 mg/l) i vandige buffere ved en pH i området fra 6,5-8,5.

I løsning foreligger hGH hovedsakelig som en monomer, mens en liten andel foreligger som dimerer og oligomerer med høyere molekylvekt. Under visse betingelser kan hGH induseres til å danne større mengder av dimerer, trimerer og høyere oligomerer.

Flere derivater av hGH er kjente, innbefattet naturlig forekommende derivater, varianter og metabolske produkter, degradreingsprodukter, primært av biosyntetisk hGH, og modifiserte derivater av hGH dannet ved genetiske fremgangsmåter. Et eksempel på et naturlig forekommende derivat av hGH er GH-V, en variant av veksthormon som forefinnes i placenta. Andre medlemmer av samme genlokus er beskrevet i Chen et al. (1989).

Metionyl-hGH var den første form av hGH som ble fremstilt ved rekombinant DNA-teknologi. Denne forbindelsen er faktisk et derivat av hGH med en ekstra metioninrest i N-enden (Goeddel et al., 1979).

En naturlig forekommende variant av hGH som betegnes 20-K-hGH har blitt rapportert å foreligge i hypofysen, så vel som i blodomløpet (Lewis et al., 1978, Lewis et al., 1980). Denne forbindelsen, som mangler 15 aminosyrerester fra Glu-32 til Gln-46, oppstår ved alternativ spleising av budbringer-ribonukleinsyren (DeNoto et al., 1981). Denne forbindelsen har mange av de biologiske egenskapene til hGH, men ikke alle.

20-K-hGH dannes i hypofysen og utskilles i blodet. Proteinet utgjør tilnærmet 5 % av veksthormonproduksjonen hos voksne og tilnærmet 20 % av veksthormonproduksjonen hos barn. Proteinet har den samme vekstfremmende aktivitet som 22 kD veksthormon og har blitt rapportert å ha den samme eller høyere grad av lipolytisk aktivitet som 22 kD-formen. Proteinet bindes til veksthormonreseptorer med samme affinitet som 22 kD-veksthormonet og har en tidel av den laktogene (prolaktinlignende) bioaktivitet som 22 kD-hormonet har. I motsetning til 22 kD har 20-K-hGH svak antiinsulinaktivitet.

En rekke derivater av hGH dannes ved proteolytiske modifiseringer av molekylet. Primærreaksjonsveien for metabolismen av hGH omfatter proteolyse. Området i hGH rundt aminosyrerestene 130-150 er ekstremt utsatt for proteolyse, og flere derivater av hGH med kutt eller delesjoner i dette området har blitt beskrevet (Torlacius-Ussing, 1987). Dette området foreligger i den store løkken i hGH, og kløyving av en peptidbinding der fører til dannelsen av to kjeder som er sammenbundet via disulfidbroen mellom Cys-53 og Cys-165. Mange av disse tokjedeformene har blitt rapportert å ha forhøyet biologisk aktivitet (Singh et al., 1974). Mange derivater av humant veksthormon har blitt fremstilt kunstig ved anvendelse av enzymer. Enzymene trypsin og subtilisin, så vel som andre har blitt anvendt for modifisering av hGH i forskjellige punkter gjennom hele molekylet (Lewis et al., 1977, Graff et al., 1982). Ett slikt derivat, betegnet tokjedet anabolsk protein (2-CAP), ble dannet ved kontrollert proteolyse av hGH ved anvendelse av trypsin (Becker et al., 1989). 2-CAP ble funnet å ha biologiske egenskaper som var svært forskjellige fra egenskapene til det intakte hGH-molekyl, ved at den vekstfremmende aktivitet av hGH stort sett var bevart mens de fleste av virkningene på karbohydratmetabolismen var borte.

Asparagin- og glutaminrester i proteiner er utsatt for deamideringsreaksjoner under egnede betingelser. hGH i hypofysen har blitt vist å gjennomgå denne typen reaksjon, noe som fører til omdanning av Asn-152 til asparaginsyre og også, i mindre grad, omdanning av Gln-137 til glutaminsyre (Lewis et al., 1981). Deamidert hGH har blitt vist å ha endret følsomhet overfor proteolyse med enzymet subtilisin, noe som tyder på at deamidering kan ha fysiologisk betydning når det gjelder styring av den proteolytisk kløyving av hGH. Biosyntetisk hGH vites å degradere under visse lagringsbetingelser, noe som fører til deaminering av en annen asparaginrest (Asn-149). Dette er det primære deamideringssetet, men deamidering av Asn-152 observeres også (Becker et al., 1988). Deamidering av Gln-137 har ikke blitt rapportert for biosyntetisk hGH.

Metioninrester i proteiner er utsatt for oksidasjon, hovedsakelig til sulfoksidet. Både hypofyseavledet og biosyntetisk hGH gjennomgår sulfoksidasjoner i Met-15 og Met-125 (Becker et al., 1988). Oksidasjon av Met-170 har også blitt rapportert i hypofyse-hGH, men ikke i biosyntetisk hGH. Både desamid-hGH og Met-14-sulfoksid-hGH har blitt funnet å vise full biologisk aktivitet (Becker et al., 1988).

Avkortede former av hGH har blitt fremstilt, enten via virkningen av enzymer eller ved genetiske fremgangsmåter. 2-CAP fremstilt ved kontrollert virkning av trypsin har fått fjernet de første 8 aminosyrerestene i N-enden av hGH. Andre avkortede versjoner av hGH har blitt fremstilt ved å modifisere genet før ekspresjon i en egnet vert. De første 13 aminosyrerestene har blitt fjernet for erholdelse av et derivat med spesielle biologiske egenskaper (Gertler et al., 1986) og hvori polypeptidkjeden ikke er kløyvet.

Selv om humant veksthormon opprinnelig ble erholdt fra hypofysen fra lik var disse preparatene ikke elektroforetisk homogene, og antistoffer opptrådte i serum hos pasienter behandlet med preparater med en renhet av størrelsesorden 50 %, hvor immunogenisiteten ble tilskrevet inaktive bestanddeler. Rekombinant DNA-teknologi tillot fremstilling av en ubegrenset mengde av hGH i en rekke forskjellige systemer. Rensing av hGH fra dyrkningsmediet lettes ved nærvær av kun lave mengder av kontaminerende proteiner. Det har faktisk blitt vist at hGH kan renses i laboratorieskala ved et enkelt rensetrinn på en revers fase HPLC-kolonne (Hsiung et al. (1989)).

Rekombinant humant veksthormon, rhGH, fremstilles av Serono International S.A. som SEROSTIM<®>, og dette produktet har blitt gitt akselerert FDA-godkjenning for behandling av vekttap og avmagring hos AIDS-pasienter. SAIZEN er rekombinant humant veksthormon som er indikert for GH-mangel hos barn, for Turners syndrom hos piker samt for kronisk nyresvikt hos barn. PROTROPIN , fremstilt av Genentech, Inc. (South San Francisco, CA), avviker noe i struktur fra hGH med naturlig sekvens ved å ha en ekstra metioninrest i N-enden. Rekombinant hGH markedsføres generelt som flasker inneholdende hGH pluss ytterligere eksipienser, f.eks. glysin og mannitol, i frysetørket form. En ledsagende flaske med fortynningsmiddel leveres, noe som tillater pasienten å rekonstituere produktet til den ønskede konsentrasjon før tilførsel av dosen. Rekombinant hGH kan også markedsføres på andre velkjente måter, f.eks. som ferdigfylte sprøyter.

For at hGH skal kunne være tilgjengelig kommersielt som et terapeutisk middel, må det fremstilles stabile formuleringer. Slike formuleringer må kunne bibeholde aktiviteten over egnede lagringstidsrom og være aksepterbare for tilførsel til pasienter.

Humant GH har blitt utformet på en rekke forskjellige måter. F.eks. beskriver US patentskrift nr. 5 096 885 en stabil, farmasøytisk aksepterbar formulering av hGH som i tillegg til hGH omfatter glysin, mannitol, en buffer og om ønskelig en ikke-ionisk surfaktant, hvori det molare forhold mellom hGH og glysin er 1:50.

WO 93/19776 beskriver injiserbare formuleringer av GH som omfatter citrat som bufferforbindelse og om ønskelig vekstfaktorer som insulinlignende vekstfaktorer eller epidermal vekstfaktor, aminosyrer som glysin eller alanin, mannitol eller andre sukkeralkoholer, glyserol og/eller et konserveringsmiddel, f. eks. benzylalkohol.

WO 94/101398 beskriver en GH-formulering som inneholder hGH, en buffer, en ikke-ionisk surfaktant og om ønskelig mannitol, et nøytralt salt og/eller et konserveringsmiddel.

EP-0131864 beskriver en vandig løsning av proteiner med molekylvekt høyere enn 8500 daltons som er beskyttet mot adsorpsjon til overflater, denaturering og utføring av proteinet ved tilsetning av en overflateaktiv forbindelse som inneholder en lineær polyoksyalkylenkjede som stabiliseringsmiddel.

EP-0211601 beskriver en vekstfremmende formulering som omfatter en vandig blanding av vekstfremmende hormon og en blokkopolymer som inneholder polyoksyetylenpolyoksypropylenenheter og som har en gjennomsnittelig molekylvekt på fra tilnærmet 1100 til tilnærmet 40000, som bevarer fluiditeten av det vekstfremmende hormon og dets biologiske aktivitet etter tilførsel.

WO 97/29767 beskriver en flytende formulering som omfatter et veksthormon, trinatriumcitratdihydrat, natriumklorid, natriumhydroksid, benzylalkohol og Pluronic F-68, hvor formuleringen har en pH på 5,6.

US patentskrift nr. 5 567 677 beskriver flytende formuleringer som omfatter humant veksthormon, natriumcitrat, natriumfosfat, glysin, mannitol og om ønskelig benzylalkohol.

Farmasøytiske preparater av hGH har en tendens til å være ustabile, særlig i løsning. Kjemisk degraderte molekyler, f.eks. deamiderte eller sulfoksylerte former av hGH, opptrer, og dimerer eller aggregater med høyere molekylvekt kan dannes grunnet fysisk ustabilitet (Becker et al., 1988), Becker et al., 1987, Pearlman og Nguyen (1989)).

Som en følge av ustabiliteten av hGH i løsning foreligger farmasøytiske formuleringer av hGH generelt i frysetørket form som må rekonstitueres før bruk. Rekonstitueringen utføres vanligvis ved tilsetning av et farmasøytisk aksepterbart fortynningsmiddel, f.eks. sterilt vann for injeksjon, sterilt fysiologisk saltvann eller et egnet, sterilt, fysiologisk aksepterbart fortynningsmiddel.

Rekonstituerte løsninger av hGH lagres fortrinnsvis ved 4°C for å minimalisere kjemiske og fysiske degraderingsreaksjoner, imidlertid vil noe degradering opptre under slik lagring, som kan vare under et tidsrom på opptil 14 dager.

En farmasøytisk formulering av hGH som foreligger i flytende form, fortrinnsvis en form som bevarer stabiliteten av hGH uten dannelse av utfellinger, aggregater eller andre former for partikulært materiale over forlenget tidsrom vil være spesielt fordelaktige.

Det er følgelig et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe flytende formuleringer av veksthormon som ikke fører til dannelse av uønskede partikler og som har forlenget lagringstid.

Oppsummering av oppfinnelsen

Et først aspekt av oppfinnelsen gjelder en flytende formulering som omfatter:

a) et veksthormon eller et veksthormonfrigjørende hormon (GHRH) som stimulerer frigjøring eller forsterker aktiviteten av endogent hGH,

b) et alkalimetallsalt,

c) et alkalisk jordmetallsalt eller et pseudoalkalisk jordmetallsalt, og

d) en citrat/fosfatbuffer, hvori formuleringens pH er i området fra 5,5-5,8.

I følge et aspekt omfatter oppfinnelsen en formulering der veksthormonet er humant

veksthormon.

I følge et annet aspekt omfatter oppfinnelsen en formulering der alkalimetallsaltet er utvalgt fra gruppen som består av NaCl, KC1, Na2S04og Na2C03;fortrinnsvis NaCl eller Na2S04.

I følge et annet aspekt omfatter oppfinnelsen en formulering der alkaliske jordmetallsalt er utvalgt fra gruppen som består av CaCl2, MgCl2, MgS04og NH4CO3, fortrinnsvis MgCl2.

I følge et annet aspekt omfatter oppfinnelsen en formulering der bufferen er en natriumcitrat/natriumfosfatbuffer.

I følge et annet aspekt omfatter oppfinnelsen en formulering der bufferen foreligger i en konsentrasjon i området fra 1-100 mM, fra 5-50 mM eller fra 10-20 mM.

I følge et annet aspekt omfatter oppfinnelsen en formulering i følge oppfinnelsen som videre omfatter en surfaktant, så som en polyetylenpolypropylenglykol, fortrinnsvis Pluronic F68.

I følge et annet aspekt omfatter formuleringen i følge oppfinnelsen polyetylenpolypropylenglykol i en konsentrasjon i området fra 0,5-5 mg/ml, fra 1-2 mg/ml eller tilnærmet 1,5 mg/ml.

I følge et annet aspekt omfatter formuleringen i følge oppfinnelsen videre en stabilisator, så som sukrose, f eks sukrose i en konsentrasjon i området fra 10 mg/ml til 100 mg/ml, fra 20 mg/ml til 80 mg/ml eller tilnærmet 60 mg/ml.

I følge et annet aspekt omfatter formuleringen i følge oppfinnelsen videre et konserveringsmiddel, f eks der konserveringsmidlet er i et konsentrasjonsområde fra 1-10 mg/ml, fra 2-5 mg/ml eller tilnærmet 3 mg/ml.

I følge et aspekt av oppfinnelsen er konserveringsmidlet fenol.

I følge et aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en formulering som har en pH på 5,8 og som består av r-hGH, natriumcitrat/natriumfosfat, Na2S04, MgCl2, fenol, Pluronic F68 og om ønskelig vann for injeksjon.

I følge et aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en formulering som har en pH på 5,8 og består av r-hGH, natriumcitrat/natriumfosfat, NaCl, MgCl2, fenol, Pluronic F68 og om ønskelig vann for injeksjon.

I et andre aspekt tilveiebringes et farmasøytisk preparat omfattende formuleringen i følge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen gjelder en presentasjonsform for den flytende formuleringen ifølge oppfinnelsen der formuleringer er hermetisk lukket i steril tilstand i en beholder som er egnet for lagring før anvendelse.

Endelig gjelder oppfinnelsen anvendelse av en formulering i følge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling av GH-mangel hos barn, vekttap og avmagring av AIDS-pasienter, for Turners syndrom hos piker samt for kronisk nyresvikt hos barn. I følge et aspekt av denne anvendelsen fremstilles et medikament for monodisetilførsel. I et annet aspekt av denne anvendelsen fremstilles et medikament for flerdosetilførsel.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I samsvar med foreliggende oppfinnelse har det blitt funnet at den kjemiske og fysiske stabilitet av et veksthormon i en flytende formulering kan forhøyes ved spesifikt valg av mineralsalter. Således kan de erholdte løsninger lagres over et forlenget tidsrom, f.eks. i fra tilnærmet 1-52 uker, fra 1-16 uker eller fra 1-4 uker, fortrinnsvis ved romtemperatur.

Det har videre blitt funnet at forbedret stabilitet av veksthormon i en flytende formulering over et forlenget tidsrom kan oppnås med en sammensetning ifølge krav 1.

Foreliggende oppfinnelse gjelder således en flytende formulering som omfatter:

a) et veksthormon eller et veksthormonfrigj ørende hormon (GHRH) som stimulerer frigjøring eller forsterker aktiviteten av endogent hGH,

b) et alkalimetallsalt,

c) et alkalisk jordmetallsalt eller et pseudoalkalisk jordmetallsalt, og

d) en citrat/fosfatbuffer, hvori formuleringens pH er i området fra 5,5-5,8.

I én utførelse kan de flytende formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse

anvendes for flerdosetilførsel, hvorved formuleringen kan lagres ved romtemperatur over et tidsrom på 1 uke eller mer.

Veksthormon som kan utformes i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan være avledet fra hvilken som helst art, f.eks. storfe, gris, hund eller katt, avhengig av formuleringens påtenkte anvendelse. Fortrinnsvis kan følgende forbindelser utformes i samsvar med foreliggende oppfinnelse:

a) humant veksthormon,

b) et fragment av (a) som har agonistisk aktivitet på hGH-reseptoren,

c) en variant av (a) eller (b) som har minst 70 % sekvensidentitet med (a)

eller (b) og som har agonistisk aktivitet på hGH-reseptoren,

d) en variant av (a) eller (b) som kodes av en DNA-sekvens som hybridiserer til den komplementære sekvensen til den native DNA-sekvens som koder for (a)

eller (b) under betingelser med moderat stringens og som har agonistisk aktivitet på hGH-reseptoren, eller e) et salt eller funksjonelt derivat av (a), (b), (c) eller (d) som har agonistisk aktivitet på hGH-reseptoren.

En formulering som omfatter humant veksthormon foretrekkes i samsvar med foreliggende oppfinnelse.

Begrepet "humant veksthormon" eller "hGH" som anvendt i foreliggende oppfinnelse er ment å omfatte de naturlig forekommende og syntetiske derivatene, som bemerket ovenfor, innbefattet, men ikke begrenset til, både 20 kD- og 22 kD-humant veksthormon, GH-V og andre medlemmer av veksthormongenlokus, som beskrevet i detalj i "oppfinnelsens bakgrunn".

Det angjeldende hGH kan være naturlig forekommende humant veksthormon, eller det kan fortrinnsvis være rekombinant hGH. Rekombinant GH kan uttrykkes i hvilken som helst egnet vert, enten en prokaryot eller en eukaryot vert. E. coli er en vert som er spesielt godt egnet for ekspresjon av f.eks. hGH. Gjærceller, insektceller eller pattedyrceller er ytterligere egnet for ekspresjon av rekombinant veksthormon. hGH uttrykkes fortrinnsvis i humane celler eller dyreceller, f.eks. i kinahamsterovarie (CHO)-celler.

Begrepet "hGH" eller "veksthormon" som anvendt heri omfatter også funksjonelle derivater, fragmenter, varianter, analoger eller salter som bibeholder den biologiske aktiviteten til veksthormon, dvs. som virker som agonister på veksthormonreseptoren. Med andre ord kan de bindes til veksthormonreseptoren og utløse reseptorens signaloverføringsaktivitet.

Begrepet "funksjonelle derivater" eller "kjemiske derivater" som anvendt heri dekker derivater som kan fremstilles fra de funksjonelle gruppene som opptrer som sidekjeder på aminosyrerestene i N- eller C-enden ved midler som er kjente innen faget, og omfattes av oppfinnelsen så lenge som de forblir farmasøytisk aksepterbare og ikke ødelegger den biologiske aktiviteten til hGH som beskrevet heri, dvs. evnen til å bindes til hGH-reseptoren og utløse signaloverføring fra reseptoren, og ikke innfører toksiske egenskaper i preparater som inneholder dem. Derivater kan ha kjemiske grupper, f.eks. karbohydrat- eller fosfatrester, forutsatt at et slikt derivat bibeholder den biologiske aktiviteten til hGH og forblir farmsøytisk aksepterbart.

Derivater kan f.eks. omfatte alifatiske estere av karboksylgruppene, amider av karboksylgruppene dannet ved reaksjon med ammoniakk eller med primære eller sekundære aminer, N-acylderivater av frie aminogrupper i aminosyrerestene dannet med acylrester (f.eks. alkanoylgrupper eller karbosykliske aroylgrupper) eller O-acylderivater av frie hydroksylgrupper (f.eks. i seryl- eller treonylrester) dannet med acylrester. Slike derivater kan også f.eks. omfatte polyetylenglykolsidekjeder, som kan maskere antigene seter og forlenge molekylets levetid i kroppsvæsker.

Et veksthormon som har blitt derivatisert eller blandet med et kompleksdannende middel kan ha lang levetid. Følgelig gjelder en foretrukket utførelse av oppfinnelsen PEGylerte versjoner av humant veksthormon. Veksthormoner som er genetisk modifisert til å vise langvarig aktivitet i kroppen er også eksempler på hGH-derivater som omfattes av foreliggende oppfinnelse.

hGH som er acetylert i N-enden har blitt isolert og identifisert (Lewis et al., 1979). Det er ikke klart hvorvidt acylering fyller en regulatorisk rolle eller ganske enkelt er en renseartifakt. Det forventes imidlertid at dette molekylet viser GH-aktivitet på tilsvarende måte som andre hGH-derivater. I en foretrukket utførelse gjelder følgelig oppfinnelsen humant veksthormon som er acetylert i N-enden.

Formuleringen ifølge oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis en dimer av humant veksthormon utvalgt fra gruppen som består av en disulfiddimer sammenbundet ved disulfidbindinger mellom kjedene, en kovalent, irreversibel ikke-disulfiddimer, en ikke-kovalent dimer og blandinger av disse.

Begrepet "salter" viser heri til både salter av karboksylgrupper og til syreaddisjonssalter av aminogrupper i hGH-molekylet eller analoger derav. Salter av en karboksylgruppe kan dannes ved midler som er kjente innen faget og omfatter uorganiske salter, f.eks. natrium-, kalsium-, ammonium-, jern(III)- eller sinksalter og lignende, og salter med organiske baser, f.eks. salter dannet med aminer som trietanolamin, arginin eller lysin, piperidin, prokain og lignende. Syreaddisjonssalter omfatter f.eks. salter med mineralsyrer som saltsyre eller svovelsyre og salter med organiske syrer, f.eks. eddiksyre eller oksalsyre. Naturligvis må alle slike salter bibeholde den biologiske aktiviteten til hGH som er relevant for foreliggende oppfinnelse, dvs. evnen til å bindes til hGH-reseptoren og utløse reseptorsignalisering.

I en videre foretrukket utførelse gjelder oppfinnelsen et fragment av humant veksthormon.

Et "fragment" av veksthormonet ifølge foreliggende oppfinnelse viser til hvilken som helst undergruppe av molekylet, dvs. et kortere peptid, som bibeholder den ønskede biologiske aktivitet. Fragmenter kan lett fremstilles ved å fjerne aminosyrer fra én av endene i hGH-molekylet og analysere det resulterende molekyl for egenskaper som en hGH-reseptoragonist. Proteaser for fjerning av én aminosyre om gangen fra enten N-enden eller C-enden av et polypeptid er kjente, og følgelig omfatter det å finne fragmenter som bibeholder den ønskede biologiske aktivitet kun rutinemessig eksperimentering.

hGH-fragmenter i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan fortrinnsvis ha interne delesjoner, så lenge som delesjonen ikke påvirker den biologiske aktiviteten til hGH, dvs. binding til og utløsing av signalisering via hGH-reseptoren. Et fragment som foretrekkes ifølge oppfinnelsen mangler 15 aminosyrer fra glutaminsyre (Glu) 32 til glutaminsyre 46.

hGH-fragmenter kan videre være avkortet i C- eller N-enden. Avkortet hGH som mangler de første åtte N-terminale aminosyrerestene eller de første 13 N-terminale aminosyrerestene i humant veksthormon foretrekkes også i samsvar med foreliggende oppfinnelse.

Et kort, C-terminalt hGH-fragment har blitt rapportert å bibeholde en biologisk aktivitet forbundet med hGH, se US patentskrift nr. 5 869 452. Følgelig foretrekkes anvendelse av et C-terminalt fragment av hGH ifølge oppfinnelsen. Fragment hGH177-191, som omfatter i det minste aminosyrerestene 177-191 i hGH (LRIVQCRSVEGSCGF) foretrekkes spesielt i samsvar med foreliggende oppfinnelse. Videre foretrekkes derivater av dette peptidet, f.eks. peptidvariantene som er beskrevet i US patentskrift nr. 6 335 319 eller WO 99/12969, f.eks. sykliske peptider.

I tillegg kan polypeptidet som har slik hGH-reseptoragonistaktivitet, det være seg hGH, en analog eller variant, et salt, et funksjonelt derivat eller et fragment derav, også inneholde ytterligere aminosyrerester som flankerer hGH-polypeptidet. Så lenge som det resulterende molekyl bibeholder den hGH-reseptoragonistiske evnen til kjernepolypeptidet kan man fastslå hvorvidt slike flankerende aminosyrerester påvirker de basale og nye egenskapene til kjern epeptidet, dvs. dets reseptoragonistiske egenskaper, ved rutinemessig eksperimentering.

Et eksempel på en slik GH-variant som foretrekkes i samsvar med foreliggende oppfinnelse er metionyl-humant veksthormon (Met-hGH), som har en ekstra metioninrest i N-enden av humant veksthormon.

Varianter av hGH som foretrekkes ifølge oppfinnelsen omfatter metionyl-hGH, som er et humant veksthormon som har en ekstra metioninrest i N-enden. En videre foretrukket variant er et humant veksthormon som mangler 15 aminosyrerester fra Glu32 til Glu46.

En "variant" av det humane veksthormon ifølge foreliggende oppfinnelse viser til et molekyl som i det vesentlige ligner enten hele proteinet eller et fragment derav. En variant kan også kalles et "mutein". En variant kan f.eks. være en isoform av hGH, f.eks. en variant dannet ved alternativ spleising. (Poly)peptidvarianter kan også enkelt fremstilles ved direkte kjemisk syntese av peptidvarianten ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente innen faget. Naturligvis vil en variant av humant veksthormon ha i det minste tilsvarende hGH-reseptorbindende evne og signalutløsende aktivitet som hGH og vil følgelig forventes å ha en aktivitet som tilsvarer aktiviteten av hGH.

Aminosyresekvensvarianter av det humane veksthormon kan fremstilles ved mutasjoner i det DNA som koder for de syntetiserte humane

veksthormonderivatene. Slike varianter omfatter f.eks. delesjoner, insersjoner eller substitusjoner av aminosyrerester i aminosyresekvensen. Hvilken som helst kombinasjon av delesjoner, insersjoner og substitusjoner kan også innføres for å nå frem til den endelige konstruksjonen, forutsatt at den endelige konstruksjonen besitter den ønskede aktivitet. Det er åpenbart at mutasjoner som skal innføres i DNA som koder for peptidvarianten ikke må endre leserammen.

På genetisk nivå kan disse variantene fremstilles ved setestyrt mutagenese (som eksemplifisert av Adelman et al., 1983) av nukleotider i det DNA som koder for peptidmolekylet, slik at det dannes DNA som koder for varianten, hvoretter dette DNA uttrykkes i rekombinant cellekultur. Variantene viser typisk i det minste den samme kvalitative biologiske aktivitet som utgangspeptidet.

En "analog" av humant veksthormon ifølge foreliggende oppfinnelse viser til et ikke naturlig forekommende molekyl som i det vesentlige ligner enten hele molekylet eller et aktivt fragment derav. En analog av humant veksthormon som er anvendbart i foreliggende oppfinnelse vil vise GH-aktivitet.

De typer av substitusjoner som kan innføres i det humane veksthormonet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bygge på analyse av hyppigheten av aminosyreutbyttinger i homologe proteiner fra forskjellige arter. Basert på slik analyse kan konservative substitusjoner heri defineres som utbyttinger innen én av følgende fem grupper:

I. Små, alifatiske, upolare eller svakt polare aminosyrerester:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

II. Polare, negativt ladede aminosyrerester og deres amider:

Asp, Asn, Glu, Gin

III. Polare, positivt ladede aminosyrerester:

His, Arg, Lys

IV. Store, alifatiske, upolare aminosyrerester:

Met, Leu, Ile, Val, Cys

V. Store, aromatiske aminosyrerester:

Phe, Try, Trp.

Innenfor gruppene ovenfor anses følgende substitusjoner som "svært konservative":

Asp/Glu

His/Arg/Lys

Phe/Tyr/Trp

Met/Leu/Val

Semikonservative substitusjoner er definert som utbyttinger mellom to av gruppene (I)-(IV) ovenfor som er begrenset til supergruppe (A), som omfatter (I), (II) og (III) ovenfor, eller til supergruppe (B), som omfatter (IV) og (V) ovenfor. Substitusjoner er ikke begrenset til de genetisk kodede aminosyrene, og heller ikke til de naturlig

forekommende aminosyrer. Dersom epitopen fremstilles ved peptidsyntese kan den ønskede aminosyre anvendes direkte. Alternativt kan en genetisk kodet aminosyre modifiseres ved reaksjon med et organisk derivatiseringsmiddel som kan reagere med utvalgte sidekjeder eller aminosyrerester i endene.

Cysteinylrester får vanligvis reagere med alfa-haloacetater (og tilsvarende aminer), f.eks. kloreddiksyre eller kloracetamid, for erholdelse av karboksylmetyl- eller karboksyamidometylderivater. Cysteinylrester derivatiseres også ved reaksjon med bromtrifluoraceton, alfa-brom-beta-(5-imidazoyl)propionsyre, kloracetylfosfat, N-alkylmaleimider, 3-nitro-2-pyridyldisulfid, metyl-2-pyridyldisulfid, p-klormerkuribenzoat, 2-klormerkuri-4-nitrogenol eller klor-7-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazol.

Histidylrester derivatiseres ved reaksjon med dietylpyrokarbonat ved pH 5,5-7,0, siden dette midlet er relativt spesifikt for histidylsidekjeden. Parabromfenacylbromid er også anvendbart, denne reaksjonen utføres fortrinnsvis i C\ 1 A Æ i ra/ A ^ f\

Lysinylrester og aminoterminale rester får reagere med ravsyreanhydrid eller andre karboksylsyreanhydrider. Derivatisering med disse midlene fører til en reversering av lysinylrestenes ladning. Andre egnede reagenser for derivatisering av alfa-aminoholdige aminosyrerester omfatter imidoestere som metylpikolinimidat, pyridoksalfosfat, pyridoksal, klorborhydrid, trinitrobenzensulfonsyre, O-metylisourea, 2,4-pentandion og transaminasekatalysert reaksjon med glyoksylat.

Arginylrester modifiseres ved reaksjon med ett eller flere konvensjonelle reagenser, blant dem fenylglyoksal, 2,3-butandion og ninhydrin. Derivatisering av argininrester krever reaksjonen utføres under alkaliske betingelser, grunnet den høye pKa av guanidingruppen. Videre kan disse reagensene reagere med lysingrupper, så vel som med epsilon-aminogruppen i arginin.

Den spesifikke modifiseringen av tyrosylrester per se har blitt omfattende undersøkt, med spesiell interesse for innføring av spektral merking i tyrosylrester ved reaksjon med aromatiske diazoniumforbindelser eller tetranitrometan. Vanligvis anvendes N-acetylimidazol og tetranitrometan for dannelse av O-acetyltyrosylmolekyler henholdsvis e-nitroderivater.

Karboksylsidegrupper (aspartyl eller glutamyl) modifiseres selektivt ved reaksjon med karbodiimider (R'N-C-N-R'), f.eks. l-sykloheksyl-3-[2-morfolinyl-(4-etyl)]karbodiimid eller l-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylpentyl)karbodiimid. Videre omdannes aspartyl- og glutamylrester til asparaginyl- og glutaminylrester ved reaksjon med ammoniumioner.

Glutaminyl- og asparaginylrester deamideres ofte til de tilsvarende glutamyl- og aspartylrester. Alternativt deamideres disse restene under svakt sure betingelser. Begge former av disse aminosyrerestene omfattes av oppfinnelsen.

Eksempler på innføring av aminosyresubstitusjoner i proteiner som kan anvendes for erholdelse av analoger av hGH for anvendelse i foreliggende oppfinnelse omfatter hvilke som helst kjente fremgangsmåtetrinn, f.eks. som beskrevet i US patentskrifter RE 33,653, 4 959 314, 4 588 858 og 4 737 462, tilhørende Mark et al., 5 116 943 tilhørende Koths et al., 4 965 195 tilhørende Nåmen et al., og 5 017 691 tilhørende Lee et al., og de lysinsubstituerte proteinene som beskrives i US patentskrift nr. 4 904 584 (Shaw et al.). Ytterligere veksthorminvarianter er f.eks. beskrevet i US patentskrift nr. 6 143 523 (Cunningham et al.).

Blant forbindelser som bindes til og utløser signalisering fra den humane veksthormonreseptor som kan anvendes i samsvar med foreliggende oppfinnelse er alle de veksthormonanaloger og veksthormonetterlignende forbindelser som allerede er kjent fra litteraturen, f.eks. forbindelsene som beskrives i US patentskrifter nr. 5 851 992, 5 849 704, 5 849 700, 5 849 535, 5 843 453, 5 834 598, 5 688 666, 5 654 010, 5 635 604, 5 633 352, 5 597 709 og 5 534 617. hGH-varianten eller -analogen vil fortrinnsvis ha en kjernesekvens som er den samme som den native sekvensen eller et biologisk aktivt fragment av denne, som har en aminosyresekvens som har minst 70 % identitet med den native aminosyresekvensen og som bibeholder dennes biologiske aktivitet. Mer foretrukket har en slik sekvens minst 80 % identitet, minst 90 % identitet eller mest foretrukket minst 95 % identitet med den native sekvens.

"Identitet" gjenspeiler en sammenheng mellom to eller flere polypeptidsekvenser eller to eller flere polynukleotidsekvenser som bestemmes ved å sammenligne sekvensene. Generelt viser identitet til et nøyaktig samsvar fra nukleotid til nukleotid eller fra aminosyre til aminosyre i de to polynukleotidsekvensene henholdsvis de to polypeptidsekvensene over hele lengden av sekvensene som sammenlignes.

For sekvenser hvor det ikke foreligger et slikt nøyaktig samsvar kan "% identitet" bestemmes. Generelt sammenstilles de to sekvensene som skal sammenlignes, slik at det oppnås maksimalt samsvar mellom sekvensene. Dette kan omfatte innføring av "gap" i én eller begge sekvenser for å forbedre sammenstillingsgraden. % identitet kan bestemmes over hele lengden av sekvensene som sammenlignes (såkalt global sammensetilling), noe som er spesielt godt egnet for sekvenser med samme eller svært lik lengde, eller over kortere, definerte lengder (såkalt lokal sammenstilling), noe som er bedre egnet for sekvenser med ulik lengde.

Fremgangsmåter for sammenligning av identitet og homologi mellom to eller flere sekvenser er velkjente innen faget. Således kan f.eks. programmer som er tilgjengelige i Wisconsin Sequence Analysis Package, versjon 9.1 (Devereux J et al., 1984), f.eks. programmene BESTFIT og GAP, anvendes for å bestemme % identitet mellom to polynukleotider og % identitet og % homologi mellom to polypeptidsekvenser. BESTFIT benytter "lokal homologi"-algoritmen til Smith og Waterman (1981) og finner det beste enkeltområdet med likhet mellom to sekvenser. Andre programmer for bestemmelse av identitet og/eller likhet mellom sekvenser er også kjente innen faget, f.eks. BLAST-familien av programmer (Altschul, S. F. et al., 1990, Altschul, S. F. et al., 1997, tilgjengelig fra hjemmesiden til NCBI ved www. ncbi. nlm. nih. gov) og FASTA (Pearson, W. R., 1990, Pearson 1988).

Foretrukne endringer i varianter eller muteiner i samsvar med foreliggende oppfinnelse er hva som betegnes "konservative" substitusjoner. Konservative aminosyresubstitusjoner i veksthormonpolypeptider eller -proteiner kan omfatte synonyme aminosyrer innen en gruppe som har tilstrekkelig like fysikalsk-kjemiske egenskaper til at substitusjon mellom medlemmer av gruppen vil bevare molekylets biologiske funksjon (Grantham, 1974). Det er åpenbart at insersjoner og delesjoner av aminosyrer også kan innføres i de ovenfor definerte sekvenser uten å endre deres funksjon, særlig dersom insersjonene eller delesjonene kun omfatter noen få aminosyrer, f.eks. under 30, og fortrinnsvis under 10, og ikke fjerner eller forskyver aminosyrer som er avgjørende for en funksjonell konformasjon, f.eks. cysteinrester. Proteiner og muteiner fremstilt ved slike delesjoner og/eller insersjoner faller innenfor foreliggende oppfinnelses område.

Analoger eller varianter i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan også bestemmes i samsvar med følgende fremgangsmåte. DNA til den native sekvens er kjent innen faget og forefinnes i litteraturen (Martial et al., 1979). Polypeptider som kodes av hvilken som helst slags nukleinsyre, f.eks. DNA eller RNA, som hybridiserer til den komplementære sekvensen til det native DNA eller RNA under svært stringente eller moderat stringente betingelser anses også å omfattes av foreliggende oppfinnelse, så lenge som polypeptidet bibeholder den biologiske aktiviteten til den native sekvens.

Stringensbetingelser er en funksjon av temperaturen som anvendes i hybridiseringseksperimentet, molariteten av de monovalente kationene og prosentandelen av formamid i hybridiseringsløsningen. For å bestemme stringensgraden for et gitt sett av betingelser anvender man først ligningen til Mainkoth et al. (1984) for bestemmelse av stabiliteten av hybrider ved 100 % identitet, uttrykt som smeltetemperaturen Tm for DNA-DNA-hybridet: Tm = 81,5°C + 16,6 (LogM) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L

hvori M er molariteten av monovalente kationer, %GC er prosentandelen av G- og C-nukleotider i det angjeldende DNA, % form er prosentandelen av formamid i

hybridiseringsløsningen og L er hybridets lengde i basepar. For hver 1°C som Tm er redusert med relativt til den beregnede Tm for et hybrid med 100 % identitet er den tillatte mengde feiltilpassede basepar forhøyet med tilnærmet 1 %. Dersom Tm som anvendes i et gitt hybridiseringseksperiment ved de angitte konsentrasjoner av salt og formamid er 10°C under den Tm som er beregnet for et 100 % hybrid ifølge ligningen til Meinkoth vil hybridisering skje selv om det er opptil tilnærmet 10 % feiltilpassede basepar.

Som anvendt heri er betingelser med høy stringens betingelser som tolererer opptil tilnærmet 15 % sekvensedivergens, mens moderat stringente betingelser er betingelser som tolererer opptil tilnærmet 20 % sekvensdivergens. Uten begrensning benytter eksempler på betingelser med høy stringens (12-15°C under den beregnede Tm for hybridet) og moderat stringens (15-20°C under den beregnede Tm for hybridet) en vaskeløsning med 2 X SSC (standard saltvann-citrat) og 0,5 % SDS ved den angjeldende temperatur under den beregnede Tm for hybridet. Den endelige stringens forbundet med betingelsene skyldes hovedsakelig vaskebetingelsene, særlig dersom de benyttede hybridiseringsbetingelser er betingelser som tillater med høyere stringens fjerner så de mindre stabile hybridene. Et vanlig sett av hybridiseringsbetingelser som kan anvendes med de svært stringente til moderat stringente vaskebetingelsene som er beskrevet ovenfor, er hybridisering i en løsning av 6 X SSC (eller 6 X SSPE), 5 X Denhardts reagens, 0,5 % SDS, 100 mg/ml denaturert, fragmentert laksemelke-DNA ved en temperatur som ligger tilnærmet 20° til 25°C under Tm. Dersom blandede prober anvendes foretrekkes det å benytte tetrametylammoniumklorid (TMAC) i stedet for SSC (Ausubel, 1987-1998).

Selv om foreliggende oppfinnelse tilveiebringer rekombinante fremgangsmåter for fremstilling av de humane veksthormonderivatene kan disse derivatene også fremstilles ved konvensjonelle fremgangsmåter for proteinsyntese som er velkjente blant fagfolk.

Formuleringen ifølge oppfinnelsen omfatter polyetylenpolypropylenglykol. Denne polymeren er en ikke-ionisk surfaktant. En surfaktant kan heri også betegnes "tensioaktiv" eller et "tensioaktivt middel". I nok en ytterligere foretrukket utførelse omfatter formuleringen polyetylenpolypropylenglykol i en konsentrasjon i området fra 0,5-5 mg/ml, fra 1-2 mg/ml eller tilnærmet 1,5 mg/ml.

I en foretrukket formulering er surfaktanten en "pluronic"-polyol, f.eks. F68. Pluronic F68 foretrekkes i høy grad i samsvar med foreliggende oppfinnelse.

Ved å utforme GH med surfaktanten Pluronic® F68 (BASF, også betegnet Poloxamer 188) ble det erholdt en stabil formulering som unngår problemer forbundet med utfelling, aggregering eller dannelse av partikler av noe slag.

Pluronic F68 er en blokkopolymer av etylenoksid (EO) og propylenoksid (PO). Propylenoksidblokken (PO) ligger mellom to etylenoksid (EO)-blokker.

Pluronic-surfaktanter syntetiseres i en totrinns fremgangsmåte:

1. Det dannes en hydrofob med den ønskede molekylvekt ved kontrollert addering av propylenoksid til de to hydroksylgruppene i propylenglykol, og 2. Etylenoksid tilsettes for plassering av den hydrofobe blokken mellom hydrofile grupper.

I Pluronic F68 er prosentandelen av polyoksyetylen (hydrofil) 80 %, og molekylvekten til den hydrofobe gruppen (polyoksypropylen) er tilnærmet 1967 Da.

Typiske egenskaper ved Pluronic F68 er opplistet nedenfor:

Gjennomsnittelig molekylvekt: 8400,

Smelte/hellepunkt: 52°C,

Fysisk form ved 20°C: fast stott,

Viskositet (Brookfield) eps: 1000 [væsker ved 25°C, grøter ved 60°C og faste stoffer ved 77°C],

Overflatespenning, dyn/cm ved 25°C:

0,1 % kons.: 50,3

0,01 % kons.: 51,2

0,001 % kons.: 53,6

Interfasespenning, dyn/cm ved 25°C mot Nujol:

0,1 % kons.: 19,8

0,01 % kons.: 24,0

0,01 % kons.: 26,0

Draves-fukting, sekunder ved 25°C:

1,0 % kons.: > 360

0,1 % kons.: > 360

Skumhøyde

Ross Miles, 0,1 %, mm ved 50°C: 35

Ross Miles, 0,1 %, mm ved 26°C: 40

Dynamisk, 0,1 %, mm ved 400 ml/min.: > 600

Blakkingspunkt i vandig løsning, °C

1 % kons.: > 100

10 % kons.: > 100

HLB (hydrofil-lipofil balanse): 29

Andre polymerer med egenskaper som tilsvarer Pluronic F68 kan også anvendes i formuleringene ifølge oppfinnelsen.

Polyetylenpolypropylenglykolen kan anvendes i en konsentrasjon i området fra 0,5-5 mg/ml, fra 1-2 mg/ml eller tilnærmet 1,5 mg/ml.

Fagpersonen vil forstå at én eller flere surfaktanter kan anvendes i tillegg til polyetylenpolypropylenglykol.

Formuleringen ifølge oppfinnelsen omfatter videre et stabiliseringsmiddel. Et stabiliseringsmiddel kan også fungere som et isotonisitetsmiddel.

Et "isotonisitetsmiddel" er en forbindelse som er fysiologisk tolererbar og som innører en egnet tonisitet i en formulering, slik at man forhindrer en netto strøm av vann over cellemembraner som er i kontakt med formuleringen. Forbindelser som glyserol anvendes hyppig for slike formål i kjente konsentrasjoner. Andre egnede stabiliseringsmidler omfatter, men er ikke begrenset til, aminosyrer eller proteiner (f.eks. glysin eller albumin), salter (f.eks. natriumklorid) og sukre (f.eks. dekstrose, sukrose og laktose).

Stabiliseringsmidler (stabilisatorer) eller isotonisitetsmidler som kanskje fortrinnsvis kan anvendes i samsvar med foreliggende oppfinnelse omfatter ikke-reduserende sukre, innbefattet sukrose, trehalose, sorbose, melezitose og raffinose, mannitol, xylitol, erytritol, treitol, sorbitol og glyserol.

I en foretrukket utførelse er stabilisatoren eller isotonisitetsmidlet sukrose.

I en videre foretrukket utførelse inneholder formuleringen sukrose i en konsentrasjon i området fra 10 mg/l til 100 mg/ml, fra 20 mg/ml til 80 mg/ml eller tilnærmet 60 mg/ml.

Formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder et alkalimetallsalt, innbefattet NaCl, KC1, Na2SC>4og Na2CC>3.1 en foretrukket utførelse er alkalimetallsaltet NaCl eller Na2S04.

Formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder videre et alkalisk jordmetallsalt, innbefattet CaCb, MgCb, MgSC>4 og NH4CO3. I en foretrukket utførelse er det alkaliske jordmetallsalt MgCb.

Formuleringene ifølge oppfinnelsen omfatter videre en citrat/fosfatbuffer. En citrat/fosfatbuffer som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse kan f.eks. være natriumcitrat/natriumfosfatbuffer.

Begrepet "buffer" eller "fysiologisk aksepterbar buffer" viser til løsninger av forbindelser som vites å være sikre for farmasøytisk eller veterinærmedisinsk anvendelse i formuleringer og som har den virkning at de bibeholder eller kontrollerer formuleringens pH innenfor det pH-området som er ønsket for formuleringen.

Det foretrekkes at formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter citrat/fosfat i en konsentrasjon i området fra 1-100 mM, fra 5-50 mM eller fra 10-20 mM.

Formuleringene ifølge oppfinnelsen er flytende og omfatter følgelig et vandig fortynningsmiddel.

Begrepet "vandig fortynningsmiddel" viser til et flytende løsemiddel som inneholder vann. Vandige løsemiddelsystemer kan bestå utelukkende av vann eller bestå av vann samt ett eller flere vannblandbare løsemidler og kan inneholde oppløste stoffer, f.eks. sukre, buffere, salter eller andre eksipienser. Formuleringen kan også omfatte ett eller flere ikke-vandige løsemidler. Hyppig anvendte ikke-vandige løsemidler er kortkjedede organiske alkoholer som metanol, etanol, propanol, kortkjedede ketoner som aceton og polyalkoholer som glyserol.

Formuleringen ifølge oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis videre et konserveringsmiddel. Tilsetning av et konserveringsmiddel foretrekkes spesielt dersom veksthormon er påtenkt for flerdosetilførsel.

Et "konserveringsmiddel" er en forbindelse som kan inngå i formuleringen for i det vesentlige å begrense virkningen av bakterier på formuleringen, noe som letter fremstillingen av en formulering for f.eks. flere gangers bruk. Eksempler på mulige konserveringsmidler omfatter oktadecyldimetylbenzylammoniumklorid, heksametoniumklorid, benzalkoniumklorid (en blanding av alkylbenzyldimetylammoniumklorider hvori alkylgruppene er langkjedede forbindelser) og benzetoniumklorid. Andre typer av konserveringsmidler omfatter aromatiske alkoholer som fenol, butyl- og benzylalkohol, alkylparaben, f.eks. metyl- eller propylparaben, katechol, resorsinol, sykloheksanol, 3-pentanol og m-kresol.

Et konserveringsmiddel kan også virke som et bakteriostatisk middel. Begrepet "bakteriostatisk middel" viser til en forbindelse eller sammensetninger som tilsettes til en formulering for å fungere som et antibakterielt middel. En konservert, GH-holdig formulering ifølge foreliggende oppfinnelse oppfyller fortrinnsvis lovbestemte eller regulerende retningslinjer for konserveringens effektivitet for å være et kommersielt levedyktig produkt for flere gangers bruk (multidoseprodukt). Eksempler på bakteriostatiske midler omfatter fenol, m-kresol, p-kresol, o-kresol, klorkresol, benzylalkohol, alkylparaben (metyl-, etyl-, propyl-, butyl- og lignende), benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid, natriumdehydroacetat og timerosal.

Konserveringsmidlet foreligger fortrinnsvis i en konsentrasjon i området fra 1-10 mg/ml, fra 2-5 mg/ml eller tilnærmet 3 mg/ml.

Det foretrukne konserveringsmiddel ifølge oppfinnelsen er fenol.

I et andre aspekt gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av den flytende formuleringen som omfatter trinnet å fremstille en vandig løsning av bestanddelene i formuleringen ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen gjelder videre en fremgangsmåte for fremstilling av den flytende formuleringen som omfatter trinnet å plassere en på forhånd bestemt mengde av formuleringen i en steril beholder. En slik mengde er fortrinnsvis i milliliterområdet.

Flytende formuleringer av hGH for terapeutisk tilførsel kan også fremstilles ved å sammenblande hGH oe stabiliserinesmidler med den ønskede erad av renhet med fysiologisk aksepterbare eksipienser, buffere eller konserveringsmidler (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Osoll A. red. (1980). Aksepterbare eksipiener er eksipienser som er ikke-toksiske for pasienten i de benyttede konsentrasjoner og doser og omfatter f.eks. buffere, konserveringsmidler, antioksidanter, pH-modifiserende midler og tonisitetsmodifiserende midler.

Den flytende formuleringen av veksthormon kan også om ønskelig omfatte én eller flere andre stabiliserende eksipienter. Ytterligere stabiliserende eksipienter kan f.eks. omfatte aminosyrer som glysin eller alanin, mannitol eller andre sukkeralkoholer eller glyserol. I tillegg kan den flytende formuleringen omfatte andre vekstfaktorer, f.eks. insulinlignende vekstfaktorer eller IGF-bindende proteiner.

Den forhøyede stabilitet av hGH som oppnås med formuleringen fremstilt i samsvar med foreliggende oppfinnelse tillater bredere anvendelse av hGH-formuleringer som kan være mer konsentrerte enn de som vanligvis anvendes.

Begrepet "stabilitet" viser til den fysiske, kjemiske og konformasjonsmessige stabilitet av formuleringer av veksthormon ifølge foreliggende oppfinnelse (innbefattet opprettholdelse av biologisk aktivitet). Ustabilitet av en proteinformulering kan skyldes kjemisk degradering eller aggregering av proteinmolekylene for dannelse av høyere ordens strukturer, ved deglykosylering, modifisering av glykosylering, deamidering, oksidasjon eller hvilken som helst annen strukturell modifisering som reduserer minst en biologisk aktivitet til et GH-polypeptid som omfattes av foreliggende oppfinnelse.

Autoinjektorer er kjente innen faget, f.eks. injektoren som betegnes "Easyject , som er spesielt anvendbar for tilførsel av hGH. Kanylefri tilførsel kan også anvendes i forbindelse med foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av spesielle innretninger som er kjente innen faget.

Et videre aspekt av oppfinnelsen gjelder et farmasøytisk preparat som omfatter formuleringen ifølge oppfinnelsen. Preparater som omfattes av oppfinnelsen omfatter alle preparater som omfatter minst ett humant veksthormon eller et derivat, en analog eller en variant derav ifølge foreliggende oppfinnelse i en mengde som effektivt oppnår det påtenkte formål. Selv om individuelle behov varierer ligger bestemmelse av optimale områder for effektive mengder av hver bestanddel innenfor teknikkens stand. Typiske doser omfatter fra tilnærmet 0,001 til tilnærmet 0,1 mg/kg kroppsvekt pr. dag. Tilført til pasienter kan hGH-behandlingen tilføres samtidig med andre behandlingsformer som kan være indikert for sykdommen.

Den flytende formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse kan erholdes ved rekonstituering av en frysetørket prøve av veksthormon i et egnet fortynningsmiddel

(f.eks. vann for injeksjon) på en slik måte at formuleringen inneholder de eksipienser som er angitt ovenfor.

Begrepet "tilføre" eller "tilførsel" betyr å innføre en formulering ifølge foreliggende oppfinnelse i kroppen til en pasient med behov for dette for behandling av en sykdom eller tilstand.

I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen tilføres hGH i en daglig dose på tilnærmet 0,1-10 mg eller tilnærmet 0,5-6 mg. I én utførelse er den daglige dosen tilnærmet 0,15-0,3 mg hGH/dag, fortrinnsvis ved subkutan injeksjon. I en videre utførelse tilføres en dose på tilnærmet 1 mg humant veksthormon pr. dag til en pasient med behov for dette.

I en videre utførelse tilføres hGH i alternerende doser, hvor den første dosen er høyere enn den andre dosen. Den første dosen er fortrinnsvis 1 mg og den andre dosen tilnærmet 0,5 mg. Ukentlige doser er fortrinnsvis tilnærmet 6 mg, tilnærmet 5 mg eller tilnærmet 4,5 mg avhengig av pasientens behov.

Begrepet "pasient" betyr et pattedyr som behandles for en sykdom eller tilstand. Pasienter kan være, men er ikke begrenset til, mennesker, sauer, griser, hester, storfe, kaniner og lignende.

Formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse er egnet for mange forskjellige tilførselsskjemaer. Tilførselen kan f.eks. skje parenteralt, f.eks. subkutant, intravenøst, intramuskulært, oralt, intraperitonealt, ved aerosol, transdermalt, intratekalt eller rektalt. Dosen som tilføres avhenger av mottakerens alder, helsetilstand og kroppsvekt, typen tidligere eller samtidig behandling, om noen, behandlingens hyppighet og den ønskede virkning.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse er foretrukne tilførselsveier subkutan og intramuskulær tilførsel.

Det skal forstås at den egnede dosen av et preparat eller en formulering ifølge foreliggende oppfinnelse vil avhenge av mottakerens alder, helsetilstand og kroppsvekt, eventuell samtidig behandling, behandlingens hyppighet og den ønskede virkning. Den mest foretrukne dosen kan imidlertid skreddersys for det enkelte individ, som fagpersonen vil forstå og som fagpersonen kan bestemme uten omfattende eksperimentering. Dette omfatter typisk justering av en standarddose, f.eks. reduksjon av dosen dersom pasienten har lav kroppsvekt.

Den totale dose som er nødvendig for hver behandling kan tilføres som flere doser (flerdose) eller i en enkelt dose ("monodose").

Uttrykket "flerdoseanvendelse" er ment å omfatte anvendelse av en enkelt flaske, ampulle eller patron med GH-formulering for mer enn én injeksjon, f.eks. 2, 3, 4, 5, 6 eller flere injeksjoner. Injeksjonene kan være atskilt i tid med f.eks. et tidsrom på 6, 12, 24, 48 eller 72 timer.

Oppfinnelsen gjelder videre anvendelse av en formulering i samsvar med foreliggende oppfinnelse for endosetilførsel. I et alternativt aspekt gjelder oppfinnelsen anvendelse av en formulering i samsvar med foreliggende oppfinnelse for flerdosetilførsel.

Typiske hGH-flerdoseformuleringer av Serono (Saizen) inneholder 1,33, 3,33 eller 8 mg hGH.

Typiske hGH-flerdoseformuleringer fra Lilly (Humatrope) inneholder 6, 12 eller 24 mg hGH.

Typiske hGH-flerdoseformuleringer fra Pfizer (Genotropin) inneholder 5 eller 12 mg hGH.

Typiske hGH-flerdoseformuleringer fra Novo Nordisk (Genotropin) inneholder 5, 10 eller 15 mg hGH.

I typiske formuleringer er således hGH-mengden i en flaske 1,33, 3,33, 5, 6, 8, 10, 12, 15 eller 24 mg.

Preparatene kan tilføres alene eller sammen med andre behandlingsformer rettet mot sykdommen eller mot andre symptomer på den.

hGH-formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse kan fordeles i flasker. Begrepet "flaske" viser bredt sett til et reservoar som er egnet for å holde GH i fast eller flytende form i en innesluttet, steril tilstand. Eksempler på en flaske som anvendt heri omfatter ampuller, patroner, plastpakker eller andre former for reservoarer som er egnede for tilførsel av GH til pasienten via en sprøyte, en pumpe (innbefattet osmotisk), et kateter, et transdermalt plaster eller en pulmonal eller transmukosal spray. Flasker som er egnet for pakking av produkter for parenteral, pulmonal, transmukosal eller transdermal tilførsel er velkjente og anerkjente innen faget.

Den forhøyede stabilitet av hGH-formuleringene tillater lang tids lagring ved en egnet temperatur, f.eks. under frysepunktet (f.eks. ved -20°C) eller over frysepunktet, fortrinnsvis ved 2-8°C, mest foretrukket ved +5°C, eller til og med ved romtemperatur, f.eks. ved +25°C.

Formuleringer av hGH som skal anvendes for in vivo-tilførsel må være sterile. Dette kan lett oppnås ved f.eks. filtrering gjennom sterile filtreringsmembraner.

Terapeutiske, flytende hGH-formuleringer plasseres generelt i en beholder med en steril tilgangsåpning, f.eks. en pose for intravenøse løsninger eller en flaske med en kork som kan gjennomtrenges av en hypoderm kanyle.

Et videre aspekt av oppfinnelsen gjelder således en presentasjonsform for den flytende formulering ifølge oppfinnelsen som er hermetisk innelukket i steril tilstand i en beholder som er egnet for lagring før anvendelse.

Formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for behandling av GH-mangel hos barn, vekttap og avmagring hos AIDS-pasienter, for Turners syndrom hos piker så vel som for kronisk nyresvikt hos barn.

Selv om foreliggende oppfinnelse har blitt beskrevet i forbindelse med spesifikke utførelser av den skal det forstås at den kan modifiseres ytterligere. Foreliggende patentsøknad er ment å omfatte alle variasjoner, anvendelser eller tilpasninger av oppfinnelsen som generelt følger oppfinnelsens prinsipper og omfatter slike avvik fra den foreliggende beskrivelse som ligger innenfor kjent eller sedvanlig praksis innen det fag som oppfinnelsen tilhører og som kan benyttes på de essensielle egenskaper som er beskrevet heri ovenfor ifølge omfanget av de vedlagte krav.

Når nå oppfinnelsen er beskrevet vil den forstås lettere ved henvisning til det påfølgende eksempel på en eksemplarisk skisse av en klinisk undersøkelse, som gis for å illustrere oppfinnelsen og som ikke er ment som begrensende for foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL

Følgende to formuleringer ble analysert for stabilitet:

Den kjemiske stabilitet av formulering A og formulering B ble analysert etter lagring av prøvene ved en temperatur på 40°C over et forlenget tidsrom, dvs. etter 3 uker.

Stabiliteten av hGH ble bestemt ved RP-HPLC (revers fase-HPLC). Mengden uendret, intakt veksthormon ble her bestemt ut fra graden av endring av hovedtoppen for det humane veksthormon. Med andre ord ble graden av endring utledet fra endringen av hovedtoppen for det humane veksthormon og beregnet som prosentandel uendret r-hGH relativt til den tilsvarende topp ved tid null.

Resultater:

Formulering A:

Etter lagring av prøven i 1 måned ved 40°C utgjorde hovedtoppen målt for r-hGH 62 % av den tilsvarende topp ved tid null (dvs. at 62 % uendret r-hGH forefinnes etter 1 måneds lagring ved 40°C).

Etter 1 måneds lagring ved romtemperatur (25°C) utgjorde hovedtoppen målt for r-hGH 91 % av den tilsvarende topp ved tid null (dvs. at 91 % uendret r-hGH foreligger etter 1 måneds lagring ved 25°C).

Formulering B:

Etter 3 ukers lagring ved 40°C utgjorde hovedtoppen målt for r-hGH 69 % av den tilsvarende topp ved tid null (dvs. at 69 % uendret r-hGH foreligger etter 3 ukers lagring ved 40°C).

REFERANSER

Claims (25)

1. Flytende formulering, karakterisert vedat den omfatter a) et veksthormon eller et veksthormonfrigj ørende hormon (GHRH) som stimulerer frigjøring eller forsterker aktiviteten av endogent hGH, b) et alkalimetallsalt, c) et alkalisk jordmetallsalt eller et pseudoalkalisk jordmetallsalt, og d) en citrat/fosfatbuffer, hvori formuleringens pH er i området fra 5,5-5,8.

2. Formulering ifølge krav 1, karakterisert vedat veksthormonet er humant veksthormon.

3. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-2, karakterisert vedat alkalimetallsaltet er utvalgt fra gruppen som består av NaCl, KC1, Na2S04og Na2C03.

4. Formulering ifølge krav 3, karakterisert vedat alkalimetallsaltet er NaCl eller Na2S04.

5. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-4, karakterisert vedat det alkaliske jordmetallsalt er utvalgt fra gruppen som består av CaCl2, MgCl2, MgS04og NH4C03.

6. Formulering ifølge krav 5, karakterisert vedat det alkaliske jordmetallsalt er MgCl2.

7. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-6, karakterisert vedat bufferen er en natriumcitrat/natriumfosfatbuffer.

8. Formulering ifølge krav7, karakterisert vedat bufferen foreligger i en konsentrasjon i området fra 1-100 mM, fra 5-50 mM eller fra 10-20 mM.

9. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-8, karakterisert vedat den videre omfatter en surfaktant.

10. Formulering ifølge krav 9, karakterisert vedat surfaktanten er en polyetylenpolypropylenglykol.

11. Formulering ifølge krav 10, karakterisert vedat surfaktanten er Pluronic F68.

12. Formulering ifølge krav 9 eller 10, karakterisert vedat den omfatter polyetylenpolypropylenglykol i en konsentrasjon i området fra 0,5-5 mg/ml, fra 1-2 mg/ml eller tilnærmet 1,5 mg/ml.

13. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-12, karakterisert vedat den videre omfatter en stabilisator.

14. Formulering ifølge krav 13, karakterisert vedat stabilisatoren er sukrose.

15. Formulering ifølge krav 14, karakterisert vedat den omfatter sukrose i ne konsentrasjon i området fra 10 mg/ml til 100 mg/ml, fra 20 mg/ml til 80 mg/ml eller tilnærmet 60 mg/ml.

16. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-15, karakterisert vedat den videre omfatter et konserveringsmiddel.

17. Formulering ifølge krav 16, karakterisert vedat den omfatter konserveringsmidlet i et konsentrasjonsområde fra 1-10 mg/ml, fra 2-5 mg/ml eller tilnærmet 3 mg/ml.

18. Formulering ifølge krav 16 eller 17, karakterisert vedat konserveringsmidlet er fenol.

19. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-18, karakterisert vedat den har en pH på 5,8 og består av r-hGH, natriumcitrat/natriumfosfat, Na2SC>4, MgCb, fenol, Pluronic F68 og om ønskelig vann for injeksjon.

20. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-18, karakterisert vedat den har en pH på 5,8 og består av r-hGH, natriumcitrat/natriumfosfat, NaCl, MgCb, fenol, Pluronic F68 og om ønskelig vann for injeksjon.

21. Farmas øytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter formuleringen ifølge ethvert av kravene 1-20.

22. Presentasjonsform for den flytende formulering ifølge ethvert av kravene 1-21, karakterisert vedat den er hermetisk lukket i steril tilstand i en beholder som er egnet for lagring før anvendelse.

23. Anvendelse av en formulering ifølge ethvert av kravene 1-20 for fremstilling av et medikament for behandling av GH-mangel hos barn, vekttap og avmagring av AIDS-pasienter, for Turners syndrom hos piker samt for kronisk nyresvikt hos barn.

24. Anvendelse av en formulering ifølge krav 22, hvori medikamentet er for monodosetilførsel.

25. Anvendelse av en formulering ifølge krav 22, hvori medikamentet er for flerdosetilførsel.