CN1938416A - 生产液态曲的方法 - Google Patents
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Abstract
用于生产发酵食品和饮料的液态米曲，特别是可用来酿造精馏酒精的表现出高葡糖淀粉酶活性和耐酸的α－淀粉酶活性的液态米曲。提供了制备用于生产发酵食品和饮料的液态米曲的方法，其特征在于，在含有作为培养投配原料的下列任一种物质的液态培养基中培养米曲霉：表面包有粗皮的谷物，表面仅仅除去了粗皮(谷壳等)的谷物，未加工的豆类作物或者表面包有外皮的球茎，以及混杂的谷物苋类和/或昆诺阿藜。通过该方法，可同时实现葡糖淀粉酶和耐酸的α－淀粉酶的均衡的大量形成和具有酿造精馏酒精等所需的酶活性的液态米曲的生产。通过该液态米曲的应用，可有效地生产发酵食品和饮料例如精馏酒精。
Description
技术领域
本发明涉及制备用于生产发酵食品和饮料的液态曲、特别是具有酿造烧酒(日本蒸馏酒)所需的酶活性的液态曲的方法。
背景技术
关于用来生产酒精饮料的曲，有固态曲，将它培养，于是将霉菌的孢子接种到蒸煮等处理后的原料中，然后培养；以及液态曲，将它培养，于是通过将原料和其它营养物加到水中制备了液态培养基，然后用霉菌的孢子、预先培养的菌丝等接种到该液态培养基中，接着培养。
在酒精饮料或者发酵食品和饮料，例如清酒、烧酒、酱油、发酵的豆瓣酱和甜味清酒的常规生产中，已广泛地应用通过固态培养法制备的所谓固体曲。固态培养法是这样一种培养法：通过它将霉曲菌例如Aspergillus kawachii、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)散布在固体原料例如蒸煮过的谷物上，使霉曲菌在固体表面生长。
例如，关于烧酒的生产，已广泛地应用Aspergillus kawachii、泡盛曲霉等。然而，由于固态培养法是其中原料和曲分散不均匀的培养体系，难于使诸如温度、水含量和各种营养物这样的因素均匀化。因此，培养可能很复杂而难于控制。此外，曲的生产往往在敞开状态下进行。在该情况下，应当小心控制质量以防其它细菌污染。所以，它不适合大规模生产。
相反，液态培养法容易受培养控制和质量控制，所以它适合有效的生产。然而，存在的一个问题例如是，达不到酿造烧酒所需的足够的酶活性。因此，几乎没有这样的实例：其中，通过霉曲菌的液态培养获得的培养产物真正地用作烧酒曲。这里，通过液态培养法获得的“培养产物”表示通过液态培养法获得的培养产物自身(下文还称为“液态曲”)以及培养液、霉、其浓缩物、或其干燥产物。
在发酵食品和饮料例如烧酒等的生产中，之所以不应用通过液态培养法获得的培养产物的一个主要原因是，人们已知在液态培养中霉曲菌生产酶例如淀粉酶或纤维素酶的行为远远不同于固态培养中的行为，而且已知它的生产率是总体下降的(参见非专利文献1)。
通常，在包括烧酒在内的酒精饮料的生产中，通过两类平行发酵产生了酒精。因此，来自霉曲菌的解糖酶，它影响对霉曲菌的葡萄糖供给，特别是葡糖淀粉酶(下文有时缩写为GA)和酸稳定的α-淀粉酶(下文有时缩写为ASAA)都是酒精发酵中的关键酶。然而，已知通过液态培养法获得的培养产物中的葡糖淀粉酶的活性异常低，而且它的生产行为也远远不同于固态培养中的生产行为(参见非专利文献2)。
作为改善霉曲菌的葡糖淀粉酶活性的方法，已报导了两种方法，一种在对菌丝的生长给予应激力的同时培养霉曲菌(参见专利文献1)，而另一种将焙烤谷物加到霉曲菌培养基中(参见专利文献2)。专利文献1中公开的方法在多孔膜上或者内含的固定剂中进行培养，它具有孔隙以表达编码葡糖淀粉酶的新基因glaB，从而增强酶活性。所以，该方法需要严格控制或特殊的培养装置，因而它不切实际。另外，专利文献2中公开的方法是在液态培养基中培养霉曲菌的方法，它应用焙烤谷物作为至少一部分的原料。所以，所述方法需要附加的焙烤谷物生产步骤。
因此，本发明的发明人提供了一项涉及应用液态培养基培养霉曲菌的方法的发明，所述培养基几乎不含霉曲菌可分解的糖类(参见专利文献3)。根据该发明，可以方便地和廉价地获得具有糖解酶例如葡糖淀粉酶的高活性的霉曲菌培养产物，它可用于酒精饮料或发酵食品和饮料的生产。
另一方面，最近开始了关于酸稳定的α-淀粉酶的分子生物学分析(参见非专利文献3)。在该情况中，报导如下：白霉曲菌具有两种不同的淀粉酶基因，它们分别负责两种不同的特性：酸不稳定的α-淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶。但是，各基因的表达行为彼此很不相同。在液态培养中，能以足够的量产生酸不稳定的α-淀粉酶，而几乎不能产生酸稳定的α-淀粉酶(酿造烧酒的一种关键酶)。
在烧酒的生产中，在低pH环境下酿造以防烧酒糖化醪腐败。但是，酸不稳定的α-淀粉酶对烧酒酿造中的糖酵解不发挥作用，因为酸不稳定的α-淀粉酶在低pH条件下被迅速地灭活。因此，关于烧酒的生产，重要的是通过霉曲菌的液态培养，以高产率生产酸稳定的α-淀粉酶，它可能对烧酒酿造中的糖酵解发挥作用。
过去，有报导研究了液态培养中的霉曲菌生产酸稳定的α-淀粉酶的行为。该方法应用了包含蛋白胨和柠檬酸盐缓冲液的合成培养基并且需要100小时或更久的培养时间。因此，很难说它是生产适合实际烧酒酿造的液态曲的方法(参见非专利文献4)。
专利文献1：JP-A11-225746
专利文献2：JP-A2001-321154
专利文献3：JP-A2003-265165
非专利文献1：Iwashita K.等：Biosci.Biotechnol.Biochem.(生物科学，生物技术与生物化学)，62，1938-1946(1998)，Yuichi Yamane等：由日本酿造协会发表，99，84-92(2004)
非专利文献2：Hata Y.等：J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工程杂志)，84，532-537(1997)，Hata Y.等：Gene(基因)，207，127-134(1998)，Ishida H.等：J.Ferment.Bioeng.，86，301-307(1998)，Ishida H.等：Curr Genet.(现代遗传学)，37，373-379(2000)
非专利文献3：Nagamine K.等：Biosci.Biotechnol.Biochem.，67，2194-2202(2003)
非专利文献4：Sudo S.等：J.Ferment.Bioeng.，76，105-110(1993)，Sudo S.等：J.Ferment.Bioeng.，77，483-489(1994)，ShigetoshiSudo等：由日本酿造协会发表，89，768-774(1994)
发明公开
本发明要解决的问题
然而，在专利文献3的方法中，通过在由添加几乎不可分解的糖而制备的液态培养基中、而不是利用原料例如谷物等制备的普通液态培养基中培养霉曲菌而获得具有高葡糖淀粉酶活性的霉曲菌。
此外，本领域已公开了通过在液态培养基中培养霉曲菌而获得具有高葡糖淀粉酶活性的霉曲菌培养产物的技术。但是，没有公开这项技术，即，通过在液态培养基中培养霉曲菌，获得具有酸稳定的α-淀粉酶(酒精发酵中的另一种关键酶)的高活性的液体曲。酸稳定的α-淀粉酶通常被说成是一种不能在液态培养基中产生的酶，所以一直没有开发具有高活性的酸稳定的α-淀粉酶的液态曲。
本发明的目的是提供一种可用于制备发酵食品和饮料的液态曲，特别是在烧酒酿造的酒精发酵中作为关键酶的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的活性高的液态曲，以及在液态培养基中培养霉曲菌而制备液态曲的方法；所述液态培养基并非是添加特殊的糖类等或是使用经烘烤处理的原料的所谓特殊液态培养基，而是使用未精碾的谷物，即包有外壳的谷物或者表面仅仅除去了外壳(谷壳等)的谷物，未加工的豆类或薯类，或者某些各类混杂的谷物作为原料。
解决问题的方法
作为致力于解决上述问题的研究的结果，本发明的发明人发现了，在如前所述用于生产发酵食品和饮料的液态曲的制备中，可通过在液态培养基中培养霉曲菌而生产具有增强的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶活性的液态曲，所述培养基含有作为原料的包有外壳的谷物或者表面仅仅除去了外壳(谷壳等)的谷物，未加工的豆类或薯类，或者某些各类混杂的谷物，苋类和/或昆诺阿藜。此外，通过具有增强的酶活性的液态曲适合酿造烧酒这一发现而完成了本发明。
换句话说，本发明提供了下列内容：
(1)制备用于生产发酵食品或饮料的液态曲的方法，它包括：
在含有作为原料、选自下组的物质的液态培养基中培养霉曲菌：表面包有外壳的谷物，表面仅仅除去了外壳(谷壳等)的谷物，表面包有外皮的未加工的豆类或薯类，以及苋类和/或昆诺阿藜。
(2)根据(1)制备液态曲的方法，其中，所述表面包有外壳的谷物是未精碾的谷物或者精碾比率等于或多于至少外壳保留在谷粒表面程度的谷物。
(3)根据(1)或(2)制备液态曲的方法，其中，所述谷物是大麦。
(4)根据(3)制备液态曲的方法，其中，所述大麦的精碾比率为90％或更大。
(5)根据(1)或(2)制备液态曲的方法，其中，所述谷物是稻、小麦、荞麦、稗、粟、黍、高粱或玉米。
(6)根据(1)制备液态曲的方法，其中，所述表面仅仅除去了外壳(谷壳等)的谷物是未精碾的稻。
(7)根据(1)制备液态曲的方法，其中，所述表面包有外皮的未加工的豆类或薯类是大豆、赤豆或甘薯。
(8)根据(1)～(7)任一项的制备液态曲的方法，它包括：
在含有所述原料的液态培养基中培养的霉曲菌的培养产物中至少同时产生和积累葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶。
(9)生产发酵食品或饮料的方法，它包括：
应用通过(1)～(8)任一项的方法获得的液态曲生产发酵食品或饮料。
(10)根据(9)生产发酵食品或饮料的方法，其中，生产发酵食品或饮料的所有步骤都是在液相中进行的。
(11)根据(9)或(10)生产发酵食品或饮料的方法，其中，发酵食品或饮料的生产是在免受外界影响的防护下的液相中进行的。
(12)根据(9)～(11)任一项的生产发酵食品或饮料的方法，其中，发酵食品或饮料的生产是通过将另一种原料加到液态曲中生产原始糖化醪而进行的。
(13)根据(9)～(12)任一项的生产发酵食品或饮料的方法，其中，所述发酵食品或饮料是烧酒。
(14)一批用来生产发酵食品或饮料的液态曲，所述液态曲具有葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性、是通过(1)～(8)任一项的制备液态曲的方法获得的。
(15)根据(1)～(7)任一项的制备液态曲的方法，其中，在液态曲的生产过程(其中在含有所述原料的液态培养基中培养霉曲菌)中，通过抑制来自原料中的淀粉的糖释放到培养体系中的速率而调节液态曲的酶活性。
本发明的效果
根据本发明，可通过在含有前述各种原料的液态培养基中培养霉曲菌而生产这样的液态曲，即其中，同时以高产率生产酿造烧酒所需的酶，例如葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶。液态培养与固态培养相比可以严格地控制培养情况，所以，可廉价而有效地生产具有稳定质量的液态曲。
此外，当应用本发明制备的液态曲时，可达到与应用常规固态曲的烧酒糖化醪相同的发酵度。这样生产的烧酒具有与应用固态曲生产的烧酒基本相同的品质而没有感观变差。
另外，本发明应用的原料是未精碾的、未加工的、或者被精碾到至少外皮保留在表面上的程度。所以，可预期原料利用率或收获率的改善。
此外，当应用本发明制备的液态曲生产烧酒时，有可能在液相中进行所有的步骤，这不同于应用固态曲的常规烧酒生产。因此，可提供与常规体系相比有效而稳定的烧酒生产体系。
附图简述
图1是一幅图，它表示利用含有未精碾的大麦的液态培养基的霉曲菌培养中粗大麦的用量与葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的生成量之间的关系。
图2是一幅图，它表示利用含有精碾的大麦的液态培养基的霉曲菌培养中精碾大麦的用量与葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的生成量之间的关系。
图3是一幅图，它表示应用粗大麦制备的液态曲生产大麦烧酒的发酵过程。
图4是一幅图，它表示应用荞麦(荞麦属)制备的液态曲生产稻烧酒的发酵过程。
图5是一幅图，它表示应用小米(Setaria)(粟)制备的液态曲生产稻烧酒的发酵过程。
图6是一幅图，它表示应用稗制备的液态曲生产稻烧酒的发酵过程。
图7是一幅图，它表示应用黍制备的液态曲生产稻烧酒的发酵过程。
图8是一幅图，它表示应用高粱制备的液态曲生产稻烧酒的发酵过程。
图9是一幅图，它表示应用各种曲生产烧酒的发酵过程。
图10是一幅图，它表示利用得自应用大豆的液态培养基培养的霉曲菌培养物的液态曲生产烧酒的发酵过程。
图11是一幅图，它表示利用得自应用赤豆的液态培养基培养的霉曲菌培养物的液态曲生产烧酒的发酵过程。
实施本发明的最佳方式
下文将具体地描述本发明。
本发明生产液态曲的方法包括如下步骤：在液态培养基中培养霉曲菌，所述液态培养基是通过添加如前述的原料例如谷物、豆类、薯类和某些混杂的谷物而制备的；以及生产具有增强的葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性的液态曲。换句话说，应用各种原料培养了霉曲菌。所以，原料中的淀粉的糖化作用耗用很长时间，同时抑制糖释放到培养体系中的速率，可使液态曲的酶活性的增大。另外，同时产生葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶并且以均衡的方式积累。
在本发明中，用作原料的谷物可包括大麦、稻、小麦、荞麦、稗、粟、黍、高粱和玉米。那些原料可被设定成未精碾的产品或者具有一定的精碾比率(等于或大于至少外壳保留在谷粒表面程度)的产品。例如，当谷物是大麦时，应用精碾比率为100％的未精碾谷物，或者假定将未精碾谷物的精碾比率定义为100％，应用的谷物是具有通过从未精碾谷物的精碾比率扣除大麦壳的比率(通常是7～8％)确定的精碾比率的那些谷物，即，精碾比率约为92％～93％的那些谷物。
文中，术语“精碾比率”表示谷物精碾后残留的谷物比率。例如，术语“90％的精碾比率”表示谷物的表层部分的10％左右的壳被刨去了。此外，在本发明中，术语“粗大麦”包括具有90％及以上的精碾比率的大麦，从未精碾的大麦到麦粒表面带有残留的壳的精碾大麦。另外，术语“壳”表示覆盖谷粒表面的外表部分。
术语“未精碾的稻”，它是用作原料的、仅仅除去了表皮的谷物，表示仅仅除去了谷壳的稻植物。
此外，在本发明中，用作原料的豆类和薯类可包括大豆、赤豆和甘薯。那些原料仅仅经历了洗去外皮泥土的步骤，而根本没有经历任何加工，包括切削、压碎等。
在本发明中，用作原料的苋类是属于苋科(Amaranthaceae)的苋属(Amaranthus)的植物的通称。在谷物中，苋类具有更高的蛋白质含量，并且赖氨酸(它是氨基酸之一)含量等于大豆的含量。另外，苋类是营养谷物，它与精碾稻相比包含大量钙、铁和纤维。原产国扩展到南/中美洲国家、印度、喜马拉雅山脉和尼泊尔的特定地区。另一方面，昆诺阿藜是Agatha科的一年生草本植物，主要是在高原例如位于秘鲁南部和玻利维亚西部的安第斯山脉栽培的。昆诺阿藜富含矿物质、维生素、蛋白质和膳食纤维。
作为原料的苋类和昆诺阿藜可单独用或组合用。这些原料可直接用于制备液态培养基而不用经历预处理例如磨碎或压碎。
将上述原料与水混合而制备液态培养基。为制备液态培养基，可选定原料的掺合比以便适合在培养霉曲菌期间选择性地产生葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶并且积累它们。
例如，当大麦用作原料时，通过将1～20％(w/vol)的粗大麦加到水中而制备液态培养基。另外，当未精碾的大麦用作粗大麦时，更优选地，制备添加了8～10％(w/vol)的粗大麦的液态培养基。当95％精碾的大麦作为粗大麦用作原料时，更优选地，添加了1～4％(w/vol)的原料的液态培养基。
其次，当除去了谷壳的未精碾的稻用作原料时，制备在一定体积的水中添加了1％(w/vol)～20％(w/vol)、优选5％(w/vol)～13％(w/vol)、更优选8％(w/vol)～10％(w/vol)的未精碾的稻的液态培养基。
当豆类用作原料时，制备在一定体积的水中添加了1～10％(w/vol)的豆类，优选添加了8～10％(w/vol)的大豆或者添加1～2％(w/vol)的赤豆的液态培养基。当薯类用作原料时，制备在一定体积的水中添加了1～10％(w/vol)的薯类的液态培养基。
其次，当苋类用作原料时，制备在一定体积的水中添加了1.5％(w/vol)～15％(w/vol)、优选2％(w/vol)～10％(w/vol)、更优选2％(w/vol)～8％(w/vol)的苋类的液态培养基。其次，当昆诺阿藜用作原料时，制备在一定体积的水中添加了1.5％(w/vol)～7％(w/vol)、优选2％(w/vol)～6％(w/vol)、更优选2％(w/vol)～4％(w/vol)的昆诺阿藜的液态培养基。
按照这种方式，可以随意选定要掺合的各原料量，因为最适合掺合的那些量取决于应用的原料的精碾程度，应用的霉曲菌的种类，原料的类别等。
在添加了适当量上述各原料的液态培养基中培养霉曲菌而以均衡的方式生产高含量的酶：葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶，产生的液态曲具有的酶活性足以用于烧酒的酿造。当应用的原料量超过它的上限时，培养基的粘度升高，那么对于霉曲菌的需氧培养所需的氧或空气的供给变得不足。所以，它不是优选的，这是由于培养产物的氧含量的减小使培养难于进展。另一方面，当应用的原料量达不到下限时，就不能以高产率生产目标酶。
在培养以前可将原料中包含的淀粉糊化。糊化淀粉的方法可根据任何常规方法进行，包括蒸煮法和焙烧法，但不特别地限于这些方法。在如下述液态培养基的灭菌步骤中，当通过在高温和高压下灭菌而在糊化温度或更高温度下加热淀粉时，通过这种处理还可同时进行淀粉的糊化。
除了上述原料外，优选在液态培养基中适当地添加有机化合物、无机盐等作为营养物。对那些添加剂没有特别限制，只要它们通常可用于培养霉曲菌即可。有机化合物的实例包括米糠、麦麸、玉米浆、豆饼和脱脂大豆。无机盐的实例包括水溶性化合物例如铵盐、硝酸盐、钾盐、酸式磷酸盐、钙盐和镁盐。可同时应用两种或更多种有机化合物和/或无机盐。对它们的添加量没有特别限制，只要那些量可促进霉曲菌生长即可。有机化合物的添加量优选约0.1～5％(w/vol)，而无机盐的量优选约0.1～1％(w/vol)。如果需要的话，这样获得的霉曲菌液态培养基可经历灭菌处理，而且对这种处理的程序没有特别限制。例如，它可以是高温和高压灭菌法，并且在121℃的温度下进行15分钟。
将灭菌后的液态培养基冷却到培养温度，然后将霉曲菌接种入液态培养基。本发明中应用的霉曲菌是一种能产生糖解酶的霉曲菌，优选是一种能产生葡糖淀粉酶并且能产生酸稳定的α-淀粉酶的霉曲菌，而且其实例包括以Aspergillus kawachii为代表的白曲菌；以泡盛曲霉和黑曲霉为代表的黑曲菌；还有以米曲霉和酱油曲霉为代表的黄曲菌。接种入培养基的霉曲菌的形态是任意的。可应用它的孢子或菌丝。
那些霉曲菌可作为单一菌株培养物或者两种或更多种同种或异种菌株的混合培养物应用。能应用预培养中获得的孢子或菌丝的任一种。但是，优选应用菌丝，这是由于它的对数生长需要更短的时间。对接种入液态培养基的霉曲菌的量没有特别限制，但孢子的量可在每ml液态培养基约1×104～1×106个的范围内。对于菌丝，每ml液态培养基优选接种约0.1～10％。
霉曲菌的培养温度优选是25～45℃、更优选是30～40℃，但没有特别限制，只要它不影响生长即可。如果培养温度低，随着霉曲菌的生长变慢，培养物往往被杂菌污染。所以，培养时间优选在24～72小时范围内。培养装置可以是能进行液态培养的任何装置。然而，对于霉曲菌来说，需要进行需氧培养。于是，应当在可将氧或空气充入培养基的需氧条件下进行培养。此外，优选搅拌培养基以致原料、氧和霉曲菌可在培养基中均匀地分布。对于搅拌条件和通气的量来说，只要是能保持达到需氧培养环境的条件，任何条件均可，并且可根据培养装置、培养基的粘度等适当地选择。
通过上述培养方法进行的培养能够以均衡的方式同时产生酶：葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶，产生具有用来酿造烧酒的酶活性的液态曲。此外，上述培养法中获得的液态曲可以是通过将培养产物经历离心分离等而获得的培养基、它的浓缩物、它的干燥产物等，以及自身的培养产物。
通过本发明的制备方法获得的液态曲等可用于生产酒精饮料或者发酵食品和饮料。例如，在生产清酒的情况下，在制备酵母醪或任何其它的糖化醪的阶段可应用液态曲等代替固态曲。在生产烧酒时，在制备糖化醪时可应用液态曲等代替固态曲。在生产酱油时，在堆积阶段可应用液态曲等代替固态曲。在生产味噌时，在糖化阶段可应用液态曲等代替固态曲。在生产甜味清酒时，在制备酵母醪或任何其它糖化醪的阶段可应用液态曲等代替固态曲。
此外，当应用从上述液态曲或培养产物获得的培养基或其浓缩物来生产酒精饮料或者发酵食品和饮料时，所有步骤都可在液相中进行。作为进行酒精饮料的生产的方法，其中，所有步骤都在液相中进行，例如，当进行烧酒的生产时，使用玉米、小麦、稻、马铃薯、甘蔗等作为其它原料，然后在约80℃下加热，通过与耐热的酶制剂一起溶解而液化。此后，添加上述液态曲和酵母，使糖化醪经历酒精发酵，接着按照蒸馏方法在常压或减压下蒸馏等。
实施例
虽然下文将参照实施例等更具体地描述本发明，但本发明并不限于这些实施例等。
<实验例1>[在液态曲的生产中粗大麦用量的讨论]
如表1所示那样改变作为原料的粗大麦的比率，制备了5种液态培养基。在每种液态培养基中，培养了霉曲菌以生产液态曲。
首先，将粗大麦加到添加了0.2％(w/vol)硝酸钾和0.3％(w/vol)磷酸二氢钾的水中，将粗大麦的量调节到1、2、4、8和10％(w/vol)，制备了5种液态培养基。对于每一种液态培养基，在将制备的100ml液态培养基放入500ml带有挡板的烧瓶中并且高压灭菌之后，将预先在液态培养基中培养的白曲菌(Aspergillus kawachii IFO4308)接种，于是将它的量调节到液态培养基的1％(v/vol)。顺便提一下，将国产的未精碾的二棱大麦用作粗大麦。
然后在37℃的温度和100rpm的振荡速率下进行48小时的培养。培养完毕，测定每个所得培养产物中产生的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的量。从根据大麦用量的液态培养基中培养获得的培养产物所产生的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的量如表1和图1所示。顺便提一下，在葡糖淀粉酶的酶活性测定中应用糖化力分级量化盒(由日本的Kikkoman生产)。此外，为了测定酸稳定的α-淀粉酶的活性，稍微改动了<非专利文献3>中描述的方法，通过用酸处理培养产物而灭活酸不稳定的α-淀粉酶，然后应用α-淀粉酶测定盒(由日本的Kikkoman生产)来测定酸稳定的α-淀粉酶。更具体地说，在1ml培养液中添加9ml的100mM醋酸缓冲液(pH3)，在37℃下经历酸处理达1小时，接着用α-淀粉酶测定盒(由日本的Kikkoman生产)来测定。
另一方面，就对照组来说，将国产的二棱大麦精碾而使精碾比率达到70％的大麦(下文称为精碾的大麦)用作原料。以与实验组相同的方法制备了液态培养基并且在相同的条件下培养。培养完毕，同样测定每个所得培养产物中产生的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的量。从根据精碾大麦用量的液态培养基中培养获得的培养产物所产生的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的量如表1和图2所示。
[表1]
原料用量和酶生成量
| 实验组 | 对照组 | ||||
| 粗大麦用量 | GA(U/ml) | ASAA(U/ml) | 精碾大麦用量 | GA(U/ml) | ASAA(U/ml) |
| 1％ | 72.4 | 3.1 | 1％ | 58.8 | 1.2 |
| 2％ | 101.8 | 4.5 | 2％ | 102.6 | 3.4 |
| 4％ | 127.1 | 7.3 | 4％ | 66.2 | 4.2 |
| 8％ | 187.6 | 12.0 | 8％ | 17.5 | 11.2 |
| 10％ | 217.3 | 14.0 | 10％ | 10.3 | 10.7 |
| 16％ | 201.5 | 12.3 | 16％ | 10.0 | 9.7 |
| 20％ | 185.3 | 10.5 | 20％ | 8.8 | 8.9 |
*GA：葡糖淀粉酶
ASAA：酸稳定的α-淀粉酶
如表1和图1所示，证实了对于那些应用粗大麦培养的培养产物来说，葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的生成量同时均衡地随粗大麦用量的增大而增大，而且与应用精碾的大麦作为对照组的情况相比，酶的生成量也急剧增大。具体地说，在添加了10％(w/vol)粗大麦的液态培养基中，产生了217.3U/ml的葡糖淀粉酶和14.0U/ml的酸稳定的α-淀粉酶，并且同时获得了足够在酿造烧酒中应用的酶活性(供参考，生产烧酒所需葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的酶活性是：对葡糖淀粉酶要求100U/ml或更高，对酸稳定的α-淀粉酶要求10U/ml或更高)。
另一方面，就应用精碾的大麦的对照组来说，虽然添加了2％(w/vol)精碾的大麦的液态培养基中葡糖淀粉酶活性是最大值，而添加了8％(w/vol)精碾的大麦的液态培养基中酸稳定的α-淀粉酶活性是最大值，但是没有同时以高产率产生两种酶的情况，如表1和图2所示。
如前所述，在添加了1～20％(w/vol)粗大麦的液态培养基中培养了霉曲菌，于是同时以高产率、均衡地产生葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶。特别是，添加8～10％(w/vol)粗大麦(未精碾的)可以生产这种液态曲，即其中，同时获得了足够烧酒酿造中应用的酶活性。
在含粗大麦的液态培养基中培养霉曲菌同时以高产率和均衡地产生了葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶。这可能归因于粗大麦作为原料的应用，它的表面包有一层壳，由于这层壳而减小了来自原料中的淀粉的糖例如葡萄糖的释放，并且能用培养物中较低浓度的糖来培养，于是更可能产生例如葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶这样的酶。
<实施例1>[应用粗大麦生产液态曲]
首先，将粗大麦加到添加了0.2％(w/vol)硝酸钾和0.3％(w/vol)磷酸二氢钾的水中，将粗大麦的量调节到10％(w/vol)，制备了液态培养基。然后，将制备的100ml该液态培养基放入500ml带有挡板的烧瓶中并且高压灭菌之后，将预先在液态培养基中培养的白曲菌(Aspergillus kawachii IFO4308)接种，于是将它的量调节到液态培养基的1％(v/vol)。顺便提一下，将国产的未精碾的二棱大麦用作粗大麦。
然后在37℃的温度和100rpm的振荡速率下进行48小时的培养。培养完毕，当测定每个所得培养产物中产生的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的量时，产生了217.3U/ml的葡糖淀粉酶和14.0U/ml的酸稳定的α-淀粉酶，并且同时获得了足够烧酒酿造中应用的酶活性。
<实施例2>[应用粗大麦制备的液态曲生产大麦烧酒]
用实施例1中通过添加10％(w/vol)粗大麦制备的液态培养基中的培养获得的液态曲(葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶增加了的培养产物)进行烧酒生产。
也就是说，应用了500ml从实施例1中通过添加10％(w/vol)粗大麦制备的液态培养基中培养获得的液态曲，并且按照表2中所示的糖化组合将1,328.6g的全大麦糖化。发酵温度保持在25℃，进行了三步糖化，其中，第一步、第二步和第三步糖化分别进行5、2和13天。顺便提一句，作为另外的大麦，使用精碾70％的国产二棱大麦，将它用水洗涤，接着浸泡60分钟，沥干30分钟，然后蒸煮35分钟。由于从液态曲带来的大麦量(50.0g)在第一步糖化中不够发酵，将262.9g另外的大麦糖化，所以提供了与固态曲的糖化时相同量的大麦。将烧酒酵母(鹿儿岛酵母)用作酵母，并且将50μL在30℃的YPD培养基中静态培养48小时的烧酒酵母接种。
[表2]
| 实验组(大麦液态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲大麦(g) | 50.0 | - | - | 50.0 |
| 另外的大麦(g) | 262.9 | 507.9 | 507.9 | 1278.6 |
| 液态曲(ml) | 500.0 | - | - | 500.0 |
| 糖化用水(mL) | 321.4 | 765.7 | 272.9 | 1360.0 |
| 90％乳酸(mL) | 1.4 | - | - | 1.4 |
另外，关于对照糖化(用固态曲糖化)，应用固态曲的曲大麦根据表3中所示的糖化组合进行烧酒的生产。在生产固态曲的方法中，应用了70％精碾的大麦并且洗涤，接着浸泡40分钟，沥干30分钟，以及蒸煮40分钟。然后让所得大麦冷却到40℃，让每kg精碾的大麦接种1g种曲(白曲菌；Aspergillus kawachii IFO4308)并且在40℃和95％的相对湿度下培养24小时，在35℃和95％的相对湿度下培养6小时，以及在30℃和90％的相对湿度下培养18小时。顺便提一句，发酵条件等与上述本发明的糖化(用液态曲糖化)中的相同。
[表3]
| 对照组(大麦固态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲大麦(g) | 312.9 | - | - | 312.9 |
| 另外的大麦(g) | - | 507.9 | 507.9 | 1015.7 |
| 糖化用水(mL) | 500.0 | 765.7 | 594.3 | 1860.0 |
将发酵进程与作为对照的用固态曲的糖化对比，表示在图3中。图3清楚地表明，与应用固态曲的对照糖化相比，应用液态曲的糖化显示几乎相同的发酵进程。此外，获得的最终糖化醪的酒精浓度相同，即，对于应用液态曲和固态曲的两种糖化时都是17.8％。
然后，通过8名评委小组成员利用记分系统(评估等级是1～5；1：良好到5：差)对于这样获得的烧酒进行了感观评价：在减压下蒸馏获得的最终糖化醪，对它添加水而将酒精浓度调节到25％。平均记分如表4所示。
[表4]
对烧酒的感观评价(酒精度：25％)
| 记分 | |
| 采用本发明的糖化(用液态曲糖化) | 3.0 |
| 对照糖化(用固态曲糖化) | 3.0 |
结果，观察到两种烧酒之间的烧酒品质几乎没有差异，所以证实了，液态曲的应用也能生产具有与应用固态曲的烧酒品质相同的烧酒。
从上述结果可见，根据本发明，在添加了1～20％(w/vol)粗大麦的液态培养基中培养了霉曲菌，于是同时均衡地产生葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶。特别是，添加8～10％(w/vol)粗大麦(未精碾的)可以生产这种液态曲，即其中，同时获得了足够烧酒的酿造中应用的酶活性。因此，该液态曲的应用可以生产具有与应用固态曲生产的烧酒品质相同的烧酒。另外，可在简单的液态培养基中生产具有高葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶活性的液态曲，而不用特别的培养装置和通过特定的培养工程方法严格控制培养。此外，与固态培养相比，通过轻易地进行针对在液态培养基中生产曲的特别严格的控制，有可能稳定地生产高质量的曲。另外，曲的液化不但能通过糖化醪的流化来简化发酵控制，而且节省劳力和提高生产曲的操作效率，结果，它是节省劳力和提高生产烧酒的操作效率的方法。
<实施例3>[应用荞麦制备的液态曲生产稻烧酒]
1.生产固态曲的方法
应用了精碾90％的稻并且洗涤，接着浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。然后让所得稻冷却到40℃，对每kg精碾稻接种1g种曲(白曲菌；Aspergillus kawachii IFO4308)并且在40℃和95％的相对湿度下培养24小时，在35℃和95％的相对湿度下培养6小时，以及在30℃和90％的相对湿度下培养18小时。
2.生产液态曲的方法
(1)预培养方法：将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergillus kawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种入预培养基中并且在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
(2)主培养方法：将40g荞麦、1.0g硝酸钾、1.5g磷酸二氢钾和500ml水装入2,000ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。向该主培养基中接种5ml预培养液并且在37℃和100rpm振荡下培养48小时，于是产生荞麦液态曲。此时液态曲的酶活性关于GA活性是112.4U/ml，而关于ASAA活性是10.4U/ml。
3.生产稻烧酒的方法
(1)应用的酵母：烧酒酵母(鹿儿岛酵母)
(2)糖化组合：糖化组合如表5和表6所示。应用了精碾90％的稻，而且应用了洗涤后接着经历下列处理的精碾稻：浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。实验组是两个实验组：1)用固态曲糖化，以及2)用荞麦液态曲糖化。对两个实验组来说，以相同的量调配全稻和糖化用水的量。接种50μl在30℃的YPD培养基中静态培养了48小时的酵母。
(3)发酵条件：25℃，恒定
(4)蒸馏条件：减压蒸馏
[表5]
| 实验组(荞麦液态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲荞麦(g) | 40.0 | - | - | 40.0 |
| 另外的稻(g) | 311.3 | 507.6 | 507.6 | 1326.5 |
| 糖化用水(ml) | 594.0 | 765.4 | 265.6 | 1625.0 |
| 液态曲(ml) | 500.0 | - | 0.0 | 500.0 |
| 90％乳酸(ml) | 1.4 | - | - | 1.4 |
[表6]
| 对照组(固态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲稻(g) | 311.3 | - | - | 311.3 |
| 另外的稻(g) | - | 507.6 | 507.6 | 1015.2 |
| 糖化用水(ml) | 594.0 | 765.4 | 765.6 | 2125.0 |
将发酵进程与作为对照的固态曲的糖化对比，表示在图4中。从图4清楚可见，应用荞麦液态曲的糖化与应用固态曲的对照糖化相比表现了几乎相似的发酵进程。此外，获得的最终糖化醪的酒精浓度几乎相同，即，关于采用固态曲的糖化组和采用荞麦液态曲的糖化组分别是19.1％和18.9％。
然后，当通过记分系统以1～5的等级(1：良好到3～5：差)由6名专家小组成员对通过根据减压蒸馏法蒸馏用固态曲的糖化组和用荞麦液态曲的糖化组获得的烧酒糖化醪生产的烧酒进行感观评价时，在用固态曲的糖化组和用荞麦液态曲的糖化组之间没有很大差异。这表明，荞麦液态曲的应用也能生产具有足够品质的烧酒。此外，如表7中所示，荞麦液态曲的糖化组得到的评价是，具有“荞麦味”，证实了荞麦液态曲的应用能赋予稻烧酒“荞麦”风味。
[表7]
| 感观评价的结果 | ||
| 记分(平均分) | 评价 | |
| 固态曲 | 3.0 | 极好的 |
| 荞麦液态曲 | 2.8 | 醇香的，有荞麦味 |
<实施例4>[应用粟制备的液态曲生产稻烧酒]
1.生产固态曲的方法
应用了精碾90％的稻并且洗涤，接着浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。然后让所得稻冷却到40℃，对每kg精碾稻接种1g种曲(白曲菌；Aspergillus kawachii IFO4308)并且在40℃和95％的相对湿度下培养24小时，在35℃和95％的相对湿度下培养6小时，以及在30℃和90％的相对湿度下培养18小时。
2.生产液态曲的方法
(1)预培养方法：将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergillus kawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种入预培养基中并且在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
(2)主培养方法：将40g粟、1.0g硝酸钾、1.5g磷酸二氢钾和500ml水装入2,000ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。向该主培养基中接种5ml预培养液并且在37℃和100rpm振荡下培养48小时，于是产生粟液态曲。此时液态曲的酶活性关于GA活性是101.3U/ml，而关于ASAA活性是11.0U/ml。
3.生产稻烧酒的方法
(1)应用的酵母：烧酒酵母(鹿儿岛酵母)
(2)糖化组合：糖化组合如表8和表9所示。应用了精碾90％的稻，而且应用了洗涤后接着经历下列处理的精碾稻：浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。实验组是两实验组：1)用固态曲糖化，以及2)用粟液态曲糖化。对两实验组来说，以相同的量调配全稻和糖化用水的量。接种50μl在30℃的YPD培养基中静态培养了48小时的酵母。
(3)发酵条件：25℃，恒定
(4)蒸馏条件：减压蒸馏
[表8]
| 实验组(粟液态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲粟(g) | 40.0 | - | - | 40.0 |
| 另外的稻(g) | 311.3 | 507.6 | 507.6 | 1326.5 |
| 液态曲(ml) | 500.0 | - | - | 500.0 |
| 糖化用水(mL) | 594.0 | 765.4 | 265.6 | 1625.0 |
| 90％乳酸(mL) | 1.4 | - | - | 1.4 |
[表9]
| 对照组(固态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲稻(g) | 311.3 | - | - | 311.3 |
| 另外的稻(g) | - | 507.6 | 507.6 | 1015.2 |
| 糖化用水(mL) | 594.0 | 765.4 | 765.6 | 2125.0 |
将发酵进程与作为对照的固态曲的糖化对比，表示在图5中。从图5清楚可见，应用粟液态曲的糖化与应用固态曲的对照糖化相比表现了几乎相似的发酵进程。此外，获得的最终糖化醪的酒精浓度相同，即，关于固态曲的糖化组和粟液态曲的糖化组都是19.1％。
然后，当通过记分系统以1～5的等级(1：良好到3～5：差)由6名专家小组成员对通过根据减压蒸馏法蒸馏用固态曲的糖化组和用粟液态曲的糖化组的烧酒糖化醪而生产的烧酒进行感观评价时，在用固态曲的糖化组和用粟液态曲的糖化组之间没有很大差异。这表明，粟液态曲的应用也能生产具有足够品质的烧酒。此外，如表10中所示，粟液态曲的糖化组得到的评价是，具有“醇香的风味”，启示了生产
具有与生产固态曲的常规方法不同的烧酒品质的稻烧酒的可能性。
[表10]
| 感观评价的结果 | ||
| 记分(平均分) | 评价 | |
| 固态曲 | 3.0 | 极好的 |
| 粟液态曲 | 3.0 | 醇香的 |
<实施例5>[应用稗制备的液态曲生产稻烧酒]
1.生产固态曲的方法
应用了精碾90％的稻并且洗涤，接着浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。然后让所得稻冷却到40℃，对每kg精碾稻接种1g种曲(白曲菌；Aspergillus kawachii IFO4308)并且在40℃和95％的相对湿度下培养24小时，在35℃和95％的相对湿度下培养6小时，以及在30℃和90％的相对湿度下培养18小时。
2.生产液态曲的方法
(1)预培养方法：将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergillus kawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种入预培养基中并且在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
(2)主培养方法：将40g稗、1.0g硝酸钾、1.5g磷酸二氢钾和500ml水装入2,000ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。向该主培养基中接种5ml预培养液并且在37℃和100rpm振荡下培养48小时，于是产生稗液态曲。此时液态曲的酶活性关于GA活性是113.0U/ml，而关于ASAA活性是10.2U/ml。
3.生产稻烧酒的方法
(1)应用的酵母：烧酒酵母(鹿儿岛酵母)
(2)糖化组合：糖化组合如表11和表12所示。应用了精碾90％的稻，而且应用了洗涤后接着经历下列处理的精碾稻：浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。实验组是两实验组：1)用固态曲糖化，以及2)用稗液态曲糖化。对两实验组来说，以相同的量调配全稻和糖化用水的量。接种50μl在30℃的YPD培养基中静态培养了48小时的酵母。
(3)发酵条件：25℃，恒定
(4)蒸馏条件：减压蒸馏
[表11]
| 实验组(稗液态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲稗(g) | 40.0 | - | - | 40.0 |
| 另外的稻(g) | 311.3 | 507.6 | 507.6 | 1326.5 |
| 液态曲(ml) | 500.0 | - | - | 500.0 |
| 糖化用水(mL) | 594.0 | 765.4 | 265.6 | 1625.0 |
| 90％乳酸(mL) | 1.4 | - | - | 1.4 |
[表12]
| 对照组(固态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲稻(g) | 311.3 | - | - | 311.3 |
| 另外的稻(g) | - | 507.6 | 507.6 | 1015.2 |
| 糖化用水(mL) | 594.0 | 765.4 | 765.6 | 2125.0 |
将发酵进程与作为对照的用固态曲的糖化对比，表示在图6中。从图6清楚可见，应用稗液态曲的糖化与应用固态曲的对照糖化相比表现了几乎相似的发酵进程。此外，获得的最终糖化醪的酒精浓度几乎相同，即，关于固态曲的糖化组和稗液态曲的糖化组分别是19.1％和18.8％。
然后，当通过记分系统以1～5的等级(1：良好到3～5：差)由6名专家小组成员对通过根据减压蒸馏法蒸馏用固态曲的糖化组和用稗液态曲的糖化组的烧酒糖化醪生产的烧酒进行感观评价时，在用固态曲的糖化组和用稗液态曲的糖化组之间没有很大差异。这表明，稗液态曲的应用也能生产具有足够品质的烧酒。此外，如表13中所示，稗液态曲的糖化组得到的评价是，具有“醇香的风味”，启示了生产具有与生产固态曲的常规方法不同的烧酒品质的稻烧酒的可能性。
[表13]
| 感观评价的结果 | ||
| 记分(平均分) | 评价 | |
| 固态曲 | 3.0 | 极好的 |
| 稗液态曲 | 3.0 | 醇香的 |
<实施例6>[应用黍制备的液态曲生产稻烧酒]
1.生产固态曲的方法
应用了精碾90％的稻并且洗涤，接着浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。然后让所得稻冷却到40℃，对每kg精碾稻接种1g种曲(白曲菌；Aspergillus kawachii IFO4308)并且在40℃和95％的相对湿度下培养24小时，在35℃和95％的相对湿度下培养6小时，以及在30℃和90％的相对湿度下培养18小时。
2.生产液态曲的方法
(1)预培养方法：将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergillus kawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种入预培养基中并且在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
(2)主培养方法：将40g黍、1.0g硝酸钾、1.5g磷酸二氢钾和500ml水装入2,000ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。向该主培养基中接种5ml预培养液并且在37℃和100rpm振荡下培养48小时，于是产生黍液态曲。此时液态曲的酶活性关于GA活性是90.3U/ml，而关于ASAA活性是8.5U/ml。
3.生产稻烧酒的方法
(1)应用的酵母：烧酒酵母(鹿儿岛酵母)
(2)糖化组合：糖化组合如表14和表15所示。应用了精碾90％的稻，而且应用了洗涤后接着经历下列处理的精碾稻：浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。实验组是两实验组：1)用固态曲的糖化，以及2)用黍液态曲的糖化。对两实验组来说，以相同的量调配全稻和糖化用水的量。接种50μl在30℃的YPD培养基中静态培养了48小时的酵母。
(3)发酵条件：25℃，恒定
(4)蒸馏条件：减压蒸馏
[表14]
| 实验组(黍液态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲黍(g) | 40.0 | - | - | 40.0 |
| 另外的稻(g) | 311.3 | 507.6 | 507.6 | 1326.5 |
| 液态曲(ml) | 500.0 | - | - | 500.0 |
| 糖化用水(mL) | 594.0 | 765.4 | 265.6 | 1625.0 |
| 90％乳酸(mL) | 1.4 | - | - | 1.4 |
[表15]
| 对照组(固态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲稻(g) | 311.3 | - | - | 311.3 |
| 另外的稻(g) | - | 507.6 | 507.6 | 1015.2 |
| 糖化用水(mL) | 594.0 | 765.4 | 765.6 | 2125.0 |
将发酵进程与作为对照的用固态曲的糖化对比，表示在图7中。从图7清楚可见，应用黍液态曲的糖化与应用固态曲的对照糖化相比表现了几乎相似的发酵进程。此外，获得的最终糖化醪的酒精浓度几乎相同，即，关于用固态曲的糖化组和用黍液态曲的糖化组分别是19.1％和18.8％。
然后，当通过记分系统以1～5的等级(1：良好到3～5：差)由6名专家小组成员对通过根据减压蒸馏法蒸馏用固态曲的糖化组和用黍液态曲的糖化组的烧酒糖化醪生产的烧酒进行感观评价时，在用固态曲的糖化组和用黍液态曲的糖化组之间没有很大差异。这表明，黍液态曲的应用也能生产具有足够品质的烧酒。此外，如表16中所示，黍液态曲的糖化组得到的评价是，具有“温和的甜味”，启示了生产具有与生产固态曲的常规方法不同的烧酒品质的稻烧酒的可能性。
[表16]
| 感观评价的结果 | ||
| 记分(平均分) | 评价 | |
| 固态曲 | 3.0 | 极好的 |
| 黍液态曲 | 2.9 | 甜的，温和的 |
<实施例7>[应用高粱制备的液态曲生产稻烧酒]
1.生产固态曲的方法
应用了精碾90％的稻并且洗涤，接着浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。然后让所得稻冷却到40℃，对每kg精碾稻接种1g种曲(白曲菌；Aspergillus kawachii IFO4308)并且在40℃和95％的相对湿度下培养24小时，在35℃和95％的相对湿度下培养6小时，以及在30℃和90％的相对湿度下培养18小时。
2.生产液态曲的方法
(1)预培养方法：将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergillus kawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种入预培养基中并且在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
(2)主培养方法：将40g高粱、1.0g硝酸钾、1.5g磷酸二氢钾和500ml水装入2,000ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。向该主培养基中接种5ml预培养液并且在37℃和100rpm振荡下培养48小时，于是产生高粱液态曲。此时液态曲的酶活性关于GA活性是111.2U/ml，而关于ASAA活性是10.5U/ml。
3.生产稻烧酒的方法
(1)应用的酵母：烧酒酵母(鹿儿岛酵母)
(2)糖化组合：糖化组合如表17和表18所示。应用了精碾90％的稻，而且应用了洗涤后接着经历下列处理的精碾稻：浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。实验组是两实验组：1)用固态曲的糖化，以及2)用高粱液态曲的糖化。对两实验组来说，以相同的量调配全稻和糖化用水的量。接种50μl在30℃的YPD培养基中静态培养了48小时的酵母。
(3)发酵条件：25℃，恒定
(4)蒸馏条件：减压蒸馏
[表17]
| 实验组(高粱液态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲高粱(g) | 40.0 | - | - | 40.0 |
| 另外的稻(g) | 311.3 | 507.6 | 507.6 | 1326.5 |
| 液态曲(ml) | 500.0 | - | - | 500.0 |
| 糖化用水(mL) | 594.0 | 765.4 | 265.6 | 1625.0 |
| 90％乳酸(mL) | 1.4 | - | - | 1.4 |
[表18]
| 对照组(固态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲稻(g) | 311.3 | - | - | 311.3 |
| 另外的稻(g) | - | 507.6 | 507.6 | 1015.2 |
| 糖化用水(mL) | 594.0 | 765.4 | 765.6 | 2125.0 |
将发酵进程与作为对照的用固态曲的糖化对比，表示在图8中。从图8清楚可见，应用高粱液态曲的糖化与应用固态曲的对照糖化相比表现了几乎相似的发酵进程。此外，获得的最终糖化醪的酒精浓度相同，即，关于用固态曲的糖化组和用高粱液态曲的糖化组都是19.1％。
然后，当通过记分系统以1～5的等级(1：良好到3～5：差)由6名专家小组成员对通过根据减压蒸馏法蒸馏用固态曲的糖化组和用高粱液态曲的糖化组的烧酒糖化醪生产的烧酒进行感观评价时，在用固态曲的糖化组和用高粱液态曲的糖化组之间没有很大差异。这表明，高粱液态曲的应用也能生产具有足够品质的烧酒。此外，如表19中所示，高粱液态曲的糖化组得到的评价是，具有“类似谷物的甜味”，而且启示了生产具有与生产固态曲的常规方法有明显区别的稻烧酒的可能性。
[表19]
| 感观评价的结果 | ||
| 记分(平均分) | 评价 | |
| 固态曲 | 3.0 | 极好的 |
| 高粱液态曲 | 3.0 | 类似谷物的甜味 |
<实施例8>[应用玉米生产液态曲]
(1)预培养方法：将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergillus kawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种到预培养基上，然后在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
(2)主培养方法：将1～8g玉米、0.2g硝酸钾、0.3g磷酸二氢钾和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。在该主培养基中接种1ml预培养液并且在37℃和100rpm振荡下培养48小时。通过实施例1中所述方法测定了培养后培养物的上清液中产生的酶的量，即，葡糖淀粉酶(GA)的活性和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性。结果列于表20。
从表20清楚可见，在应用了4％或更高玉米量的实验组中，超过了酿造烧酒所需酶活性的靶值，即，100U/ml葡糖淀粉酶。另一方面，酸稳定的α-淀粉酶的靶值是10U/ml。证实了酶生成量即使没有达到靶值也往往随玉米用量的增大而增大。
如上所述，在本研究中，ASAA活性不能超过它的靶值。但是，显示了同时产生GA酶和ASAA酶的能力。因此，很可能通过优化培养条件而使酶的生产率增大到靶值的水平。另外，例如，在应用8％玉米液态曲的烧酒糖化中，如果将曲的比率增大到大于通常配方，预计完全有可能生产烧酒。
[表20]
| 玉米用量 | 酶活性(U/ml) | |
| GA | ASAA | |
| 1％ | 61.9 | 1.4 |
| 2％ | 66.4 | 1.7 |
| 4％ | 135.7 | 3.8 |
| 8％ | 114.2 | 4.2 |
<实施例9>[应用粗大麦生产液态曲]
(1)预培养方法：将8g精碾65％的大麦和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将黑曲菌(泡盛曲霉IFO4388)的种曲孢子以1×106个/ml接种到预培养基上，然后在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
(2)主培养方法：将1～8g粗大麦(95％精碾的大麦)、0.2g硝酸钾、0.3g磷酸二氢钾和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。在该主培养基上接种1ml预培养液并且在37℃和100rpm振荡下培养48小时。通过实施例1中所述方法测定了培养后培养物的上清液中产生的酶的量，即，葡糖淀粉酶(GA)的活性和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性。结果列于表21。
从表21清楚可见，在应用了4％用量粗大麦的实验组中，分别超过了酿造烧酒所需酶活性的靶值，即，葡糖淀粉酶的100U/ml和酸稳定的α-淀粉酶的10U/ml。因此，即使应用了黑曲菌，也能证实就像白曲菌的情况那样以高产率生产酶的效果。
[表21]
| 粗大麦用量 | 酶活性(U/ml) | |
| GA | ASAA | |
| 1％ | 27.9 | 2.6 |
| 2％ | 41.5 | 2.0 |
| 4％ | 136.5 | 10.0 |
| 8％ | 7.1 | 0.1 |
<实施例10>[应用未精碾的稻(有谷壳的稻)生产液态曲]
(1)预培养方法：将8g精碾90％的稻(食用稻)和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergiilus kawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种到预培养基上，然后在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
(2)主培养方法：将1～8g未精碾的稻(有谷壳的稻)、0.2g硝酸钾、0.3g磷酸二氢钾和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。顺便说一句，应用的未精碾的稻是没有脱粒的具有外壳(谷壳)的谷物。在该主培养基上接种1ml预培养液，然后在37℃和100rpm振荡下培养48小时。通过实施例1中所述方法测定了培养后培养物的上清液中产生的酶的量，即，葡糖淀粉酶(GA)的活性和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性。结果列于表22。
从表22清楚可见，在应用了4％用量未精碾稻的实验组中，分别超过了酿造烧酒所需酶活性的靶值，即，葡糖淀粉酶的100U/ml和酸稳定的α-淀粉酶的10U/ml。因此，即使应用了有外壳(谷壳)的稻，也可证实就像粗大麦的情况那样以高产率生产酶的效果。
[表22]
| 未精碾稻(有谷壳的稻)的用量 | 酶活性(U/ml) | |
| GA | ASAA | |
| 1％ | 29.2 | 0.8 |
| 2％ | 39.3 | 1.8 |
| 4％ | 140.4 | 11.5 |
| 8％ | 89.0 | 5.2 |
<实施例11>[应用未精碾的稻(有谷壳的稻)生产液态曲]
(1)预培养方法：将8g精碾90％的稻(食用稻)和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将黑曲菌(泡盛曲霉IFO4388)的种曲孢子以1×106个/ml接种到预培养基上，然后在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
(2)主培养方法：将1～8g未精碾的稻(有谷壳的稻)、0.2g硝酸钾、0.3g磷酸二氢钾和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。顺便说一句，应用的未精碾的稻是没有脱粒的具有外壳(谷壳)的谷物。在该主培养基中接种1ml预培养液，然后在37℃和100rpm振荡下培养48小时。通过实施例1中所述方法测定了培养后培养物的上清液中产生的酶的量，即，葡糖淀粉酶(GA)的活性和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性。结果列于表23。
从表23清楚可见，在应用了8％用量的未精碾稻的实验组中，分别超过了酿造烧酒所需酶活性的靶值，即，葡糖淀粉酶的100U/ml和酸稳定的α-淀粉酶的10U/ml。因此，即使应用了有外壳(谷壳)的稻和黑曲菌，证实也可以高产率生产两种酶的效果。
[表23]
| 未精碾稻(有谷壳的稻)的用量 | 酶活性(U/ml) | |
| GA | ASAA | |
| 1％ | 14.3 | 1.4 |
| 2％ | 19.3 | 1.4 |
| 4％ | 40.3 | 3.9 |
| 8％ | 100.0 | 10.5 |
<实施例12>[应用没有谷壳的未精碾的稻生产液态曲]
1.预培养方法：
将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergilluskawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种入预培养基中，然后在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
2.主培养方法：
将1～10g没有谷壳的未精碾的稻、0.2g硝酸钾、0.3g磷酸二氢钾和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，在该主培养基中接种1ml预培养液，然后在37℃和100rpm振荡下培养48小时。
另一方面，作为对照组，将1～10g精碾90％的稻、0.2g硝酸钾、0.3g磷酸二氢钾和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，在该主培养基上接种1ml预培养液，然后在37℃和100rpm振荡下培养48小时。
培养完毕后，测定了各培养物的上清液中葡糖淀粉酶(GA)的活性和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性。顺便提一句，在葡糖淀粉酶(GA)的酶活性测定中应用糖化力分级量化盒(由日本的Kikkoman生产)。酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)活性的测定稍微改良了<非专利文献3>中描述的方法，通过用酸处理培养产物而灭活酸不稳定的α-淀粉酶，然后应用α-淀粉酶测定盒(由日本的Kikkoman生产)来测定酸稳定的α-淀粉酶。更具体地说，在1ml培养液中添加9ml 100mM醋酸缓冲液(pH3)，在37℃下经历酸处理达1小时，接着用α-淀粉酶测定盒(由日本的Kikkoman生产)来测定。
3.结果
结果如表24中所示。在上述研究中，约100U/ml的葡糖淀粉酶和约10U/ml的酸稳定的α-淀粉酶对于酿造烧酒所需的酶活性来说足够了。当对照组中应用了精碾稻时，此时GA和ASAA两者没有同时超过它们的靶值。但是，当实验组中应用了未精碾的稻时，GA和ASAA两者往往以均衡的方式产生。特别是，应用8％或更高的未精碾稻时超过了靶酶活性。结果，说明了未精碾的稻与精碾稻相比适合作为液态曲的原料。
[表24]
| 实验组 | 对照组 | ||||
| 未精碾的稻的用量 | 酶活性(U/ml) | 精碾稻的用量 | 酶活性(U/ml) | ||
| GA | ASAA | GA | ASAA | ||
| 1％ | 52.9 | 2.6 | 1％ | 19.8 | 1.1 |
| 2％ | 64.0 | 4.0 | 2％ | 31.9 | 2.0 |
| 4％ | 101.8 | 9.3 | 4％ | 51.3 | 4.3 |
| 8％ | 112.7 | 15.6 | 8％ | 56.5 | 10.3 |
| 10％ | 136.2 | 18.7 | 10％ | 52.1 | 11.2 |
<实施例13>[应用没有谷壳的未精碾的稻制备的液态曲生产烧酒]
1.生产固态曲的方法
应用了精碾90％的稻并且洗涤，接着浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。然后让所得稻冷却到40℃，对每kg精碾稻接种1g种曲(白曲菌；Aspergillus kawachii IFO4308)并且在40℃和95％的相对湿度下培养6小时，以及在30℃和90％的相对湿度下培养18小时。
2.生产液态曲的方法
(1)预培养方法：将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergillus kawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种入预培养基中并且在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
(2)主培养方法：将40g没有谷壳的未精碾的稻、1.0g硝酸钾、1.5g磷酸二氢钾和500ml水装入2,000ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。在该主培养基上接种5ml预培养液，然后在37℃和100rpm振荡下培养48小时。
另一方面，作为对照组，将40g精碾90％的稻、1.0g硝酸钾、1.5g磷酸二氢钾和500ml水装入2,000ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。在该主培养基上接种5ml预培养基液体，然后在37℃和100rpm振荡下培养48小时，从而产生稻液态曲。
3.生产稻烧酒的方法
(1)应用的酵母：烧酒酵母(鹿儿岛酵母)
(2)糖化组合：糖化组合如表25和表27所示。应用了精碾90％的稻，而且应用了洗涤后接着经历下列处理的精碾稻：浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。实验组(实验组和对照组)是三个实验组：1)用固态曲的糖化，2)用未精碾稻液态曲的糖化，以及3)用稻液态曲的糖化。对所有实验组来说，以相同的量调配全稻和糖化用水的量。接种50μl在30℃的YPD培养基中静态培养了48小时的酵母。
(3)发酵条件：25℃，恒定
(4)蒸馏条件：减压蒸馏
[表25]
| 实验组(未精碾稻液态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲稻(g) | 40.0 | - | - | 40.0 |
| 另外的稻(g) | 271.3 | 507.6 | 507.6 | 1286.5 |
| 糖化用水(ml) | 594.0 | 765.4 | 265.6 | 1625.0 |
| 液态曲(ml) | 500.0 | - | - | 500.0 |
| 90％乳酸(ml) | 1.4 | - | - | 1.4 |
[表26]
| 对照组(1)(精碾稻液态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲稻(g) | 40.0 | - | - | 40.0 |
| 另外的稻(g) | 271.3 | 507.6 | 507.6 | 1286.5 |
| 糖化用水(ml) | 594.0 | 765.4 | 265.6 | 1625.0 |
| 液态曲(ml) | 500.0 | - | - | 500.0 |
| 90％乳酸(ml) | 1.4 | - | - | 1.4 |
[表27]
| 对照组(2)(固态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲稻(g) | 311.3 | - | - | 311.3 |
| 另外的稻(g) | - | 507.6 | 507.6 | 1015.2 |
| 糖化用水(ml) | 594.0 | 765.4 | 765.4 | 2125.0 |
4.结果和讨论
发酵进程如图9中所示。从该图清楚可见，应用固态曲的糖化组与应用未精碾稻液态曲的糖化组显示几乎相似的发酵进程。然而，应用精碾稻液态曲的糖化组的发酵进程较差。此外，获得的最终糖化醪的酒精浓度几乎相同，即，对于用固态曲的糖化组是19.1％，而对于用未精碾稻液态曲的糖化组是18.9％。相比之下，用稻液态曲的糖化组中最终的糖化醪的酒精浓度是12.5％，远低于前两组。
然后，当通过记分系统以1～5的等级(1：良好到3～5：差)由6名专家小组成员对通过根据减压蒸馏法蒸馏用固态曲的糖化组和用未精碾稻液态曲的糖化组的烧酒糖化醪生产的烧酒进行感观评价时，如表28中所示，在用固态曲的糖化组和用未精碾稻液态曲的糖化组之间没有很大差异。但是，液态曲的组得到的评价是，具有“清新和醇香的风味”。表明可得到清新风味的稻烧酒，证实了未精碾稻液态曲的应用也能生产具有与应用固态曲时相同品质的稻烧酒。
[表28]
| 感观评价的结果 | ||
| 记分(平均分) | 评价 | |
| 固态曲 | 3.0 | 极好的 |
| 未精碾稻液态曲 | 2.8 | 极好的，清新，醇香 |
<实施例14>[应用没有谷壳的未精碾稻生产液态曲]
1.预培养方法
将8g精碾90％的稻(食用稻)和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将黑曲菌(泡盛曲霉IFO4388)的种曲孢子以1×106个/ml接种在预培养基上并且在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
2.主培养方法
将1～8g没有谷壳的未精碾的稻、0.2g硝酸钾、0.3g磷酸二氢钾和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，在该主培养基上接种1ml预培养液并且在37℃和100rpm振荡下培养48小时。
培养完毕后，通过实施例12中描述的方法测定了培养物的上清液中葡糖淀粉酶(GA)的活性和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性。
3.结果
结果如表29中所示。在上述研究中，约100U/ml的葡糖淀粉酶和约10U/ml的酸稳定的α-淀粉酶足可满足酿造烧酒所需的酶活性靶值。从表29清楚可见，在未精碾稻的用量是8％的实验组中，GA和ASAA的活性分别超过它们的靶值。即使应用了黑曲菌，也证实了像应用白曲菌的情况那样以高产率生产酶的效果。此外，当进一步增大未精碾稻的量时，可预期就像应用白曲菌的情况那样以高产率生产酶的相同效果。
[表29]
| 未精碾稻的用量 | 酶活性(U/ml) | |
| GA | ASAA | |
| 1％ | 23.0 | 0.1 |
| 2％ | 33.0 | 0.2 |
| 4％ | 89.0 | 8.2 |
| 8％ | 132.7 | 10.6 |
<实施例15>[应用大豆生产液态曲]
1.预培养方法
将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergilluskawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种在预培养基上，然后在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
2.主培养方法
将1～10g大豆、0.2g硝酸钾、0.3g磷酸二氢钾和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。在该主培养基中接种1ml预培养液，然后在37℃和100rpm振荡下培养48小时。培养后，测定了培养物的上清液中葡糖淀粉酶(GA)的活性和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性。顺便提一句，在葡糖淀粉酶(GA)的酶活性测定中应用糖化力分级量化盒(由Kikkoman生产的)。酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)活性的测定稍微改良了<非专利文献3>中描述的方法，通过用酸处理培养产物而灭活酸不稳定的α-淀粉酶，然后应用α-淀粉酶测定盒(由日本的Kikkoman生产)来测定酸稳定的α-淀粉酶。更具体地说，在1ml培养液中添加9ml 100mM醋酸缓冲液(pH3)，在37℃下经历酸处理达1小时，接着用α-淀粉酶测定盒(由日本的Kikkoman生产)来测定。
3.结果
结果如表30中所示。在上述研究中，酿造烧酒所需的酶活性的靶值是约100U/ml的葡糖淀粉酶和约10U/ml的酸稳定的α-淀粉酶。从该表清楚可见，GA的活性和ASAA的活性都随大豆用量的增大而增大。应用8％或更多的大豆分别超过了酶活性的靶值。因此，说明了大豆适合作为原料。
[表30]
| 大豆用量 | 酶活性(U/ml) | |
| GA | ASAA | |
| 1％ | 43.6 | 2.3 |
| 2％ | 48.0 | 2.7 |
| 4％ | 84.5 | 9.3 |
| 8％ | 110.8 | 11.3 |
| 10％ | 103.7 | 10.8 |
<实施例16>[应用大豆制备的液态曲生产稻烧酒]
1.生产固态曲的方法
应用了精碾90％的稻并且洗涤，接着浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。然后让所得稻冷却到40℃，对每kg精碾稻接种1g种曲(白曲菌；Aspergillus kawachii IFO4308)并且在40℃和95％的相对湿度下培养24小时，在35℃和95％的相对湿度下培养6小时，以及在30℃和90％的相对湿度下培养18小时。
2.生产液态曲的方法
(1)预培养方法：将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergillus kawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种入预培养基中并且在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
(2)主培养方法：将40g大豆、1.0g硝酸钾、1.5g磷酸二氢钾和500ml水装入2,000ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。向该主培养基中接种5ml预培养液并且在37℃和100rpm振荡下培养48小时，于是产生大豆液态曲。
3.生产稻烧酒的方法
(1)应用的酵母：烧酒酵母(鹿儿岛酵母)
(2)糖化组合：糖化组合如表31和表32所示。应用了精碾90％的稻，而且应用了洗涤后接着经历下列处理的精碾稻：浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。实验组是两实验组：1)用固态曲的糖化，以及2)用大豆液态曲的糖化。对两实验组来说，以相同的量调配全稻和糖化用水的量。接种50μl在30℃的YPD培养基中静态培养了48小时的酵母。
(3)发酵条件：25℃，恒定
(4)蒸馏条件：减压蒸馏
[表31]
| 实验组(大豆液态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲大豆(g) | 40.0 | - | - | 40.0 |
| 另外的稻(g) | 311.3 | 507.6 | 507.6 | 1326.5 |
| 糖化用水(ml) | 594.0 | 765.4 | 265.6 | 1625.0 |
| 液态曲(ml) | 500.0 | - | - | 500.0 |
| 90％乳酸(ml) | 1.4 | - | - | 1.4 |
[表32]
| 对照组(固态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲稻(g) | 311.3 | - | - | 311.3 |
| 另外的稻(g) | - | 507.6 | 507.6 | 1015.2 |
| 糖化用水(ml) | 594.0 | 765.4 | 765.6 | 2125.0 |
4.结果和讨论
发酵进程如图10中所示。从该图清楚可见，对照组的应用稻固态曲的糖化组与实验组的应用大豆液态曲的糖化组显示几乎相似的发酵进程。此外，获得的最终糖化醪的酒精浓度几乎相同，即，对于用稻固态曲的糖化组是19.1％，而对于用大豆液态曲的糖化组是18.7％。
然后，当通过记分系统以1～5的等级(1：良好到3～5：差)由6名专家小组成员对通过根据减压蒸馏法蒸馏用稻固态曲的糖化组和用大豆液态曲的糖化组的烧酒糖化醪生产的烧酒进行感观评价时，如表33中所示，在用稻固态曲的糖化组和用大豆液态曲的糖化组之间没有很大差异。这表明，大豆液态曲的应用也能生产具有足够品质的烧酒。此外，大豆液态曲的糖化组得到的评价是，具有“极好的风味”，启示了生产具有与生产固态曲的常规方法有明显区别的烧酒的可能性。
[表33]
| 感观评价的结果 | ||
| 记分(平均分) | 评价 | |
| 固态曲 | 3.0 | 醇香 |
| 大豆液态曲 | 2.6 | 极好的，清新 |
<实施例17>[应用赤豆生产液态曲]
1.预培养方法
将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergilluskawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种在预培养基上，然后在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
2.主培养方法
将1～10g赤豆、0.2g硝酸钾、0.3g磷酸二氢钾和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。在该主培养基上接种1ml预培养液，然后在37℃和100rpm振荡下培养48小时。培养后，通过实施例15中所述方法测定了培养物的上清液中葡糖淀粉酶(GA)的活性和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性。
3.结果
结果如表34中所示。如前所述，酿造烧酒所需的酶活性的靶值是约100U/ml的葡糖淀粉酶和约10U/ml的酸稳定的α-淀粉酶。如表中所示，当赤豆用量是2％时，GA的活性和ASAA的活性分别达到最大值。另外，当赤豆用量是1～2％时，超过了各酶活性的靶值。结果，说明了赤豆适合作为液体曲的原料。
[表34]
| 赤豆用量 | 酶活性(U/ml) | |
| GA | ASAA | |
| 1％ | 126.7 | 11.3 |
| 2％ | 138.2 | 12.9 |
| 4％ | 85.4 | 10.8 |
| 8％ | 67.7 | 9.4 |
| 10％ | 59.0 | 8.9 |
<实施例18>[应用赤豆制备的液态曲生产稻烧酒]
1.生产固态曲的方法
应用了精碾90％的稻并且洗涤，接着浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。然后让所得稻冷却到40℃，对每kg精碾稻接种1g种曲(白曲菌；Aspergillus kawachii IFO4308)并且在40℃和95％的相对湿度下培养24小时，在35℃和95％的相对湿度下培养6小时，以及在30℃和90％的相对湿度下培养18小时。
2.生产液态曲的方法
(1)预培养方法：将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergillus kawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种入预培养基中并且在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
(2)主培养方法：将10g赤豆、1.0g硝酸钾、1.5g磷酸二氢钾和500ml水装入2,000ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。向该主培养基中接种5ml预培养液并且在37℃和100rpm振荡下培养48小时，于是产生赤豆液态曲。
3.生产稻烧酒的方法
(1)应用的酵母：烧酒酵母(鹿儿岛酵母)
(2)糖化组合：糖化组合如表35和表36所示。应用了精碾90％的稻，而且应用了洗涤后接着经历下列处理的精碾稻：浸泡15分钟，沥干10分钟，以及蒸煮30分钟。实验组是两实验组：1)用固态曲的糖化，以及2)用赤豆液态曲的糖化。对两实验组来说，以相同的量调配全稻和糖化用水的量。接种50μl在30℃的YPD培养基中静态培养了48小时的酵母。
(3)发酵条件：25℃，恒定
(4)蒸馏条件：减压蒸馏
[表35]
| 实验组(赤豆液态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲赤豆(g) | 10.0 | - | - | 10.0 |
| 另外的稻(g) | 311.3 | 507.6 | 507.6 | 1326.5 |
| 糖化用水(ml) | 594.0 | 765.4 | 265.6 | 1625.0 |
| 液态曲(ml) | 500.0 | - | - | 500.0 |
| 90％乳酸(ml) | 1.4 | - | - | 1.4 |
[表36]
| 对照组(固态曲) | ||||
| 第一步 | 第二步 | 第三步 | 总计 | |
| 曲稻(g) | 311.3 | - | - | 311.3 |
| 另外的稻(g) | - | 507.6 | 507.6 | 1015.2 |
| 糖化用水(ml) | 594.0 | 765.4 | 765.6 | 2125.0 |
4.结果和讨论
发酵进程如图11中所示。从该图清楚可见，应用稻固态曲的糖化组与应用赤豆液态曲的糖化组显示几乎相似的发酵进程。此外，获得的最终糖化醪的酒精浓度几乎相同，即，对于用稻固态曲的糖化组是19.1％，而对于用赤豆液态曲的糖化组是19.2％。
然后，当通过记分系统以1～5的等级(1：良好到3～5：差)由6名专家小组成员对通过根据减压蒸馏法蒸馏用固态曲的糖化组和用赤豆液态曲的糖化组的烧酒糖化醪生产的烧酒进行感观评价时，如表37中所示，在用固态曲的糖化组和用赤豆液态曲的糖化组之间没有很大差异。这表明，赤豆液态曲的应用也能生产具有足够品质的烧酒。此外，赤豆液态曲的糖化组得到的评价是，具有“饱满的风味和甜味”，启示了生产具有与生产固态曲的常规方法有明显区别的烧酒的可能性。
[表37]
| 感观评价的结果 | ||
| 记分(平均分) | 评价 | |
| 固态曲 | 3.0 | 醇香 |
| 赤豆液态曲 | 2.8 | 饱满的，赤豆样的甜味 |
<实施例19>[应用甘薯生产液态曲]
1.预培养方法
将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergilluskawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种在预培养基上并且在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
2.主培养方法
稍微洗涤新鲜甘薯(约20g)的表面，然后，没有任何加工例如去蒂和削皮，与1.0g硝酸钾、1.5g磷酸二氢钾和500ml水一起直接装入2,000ml带有挡板的烧瓶中，并且在121℃下高压灭菌15分钟。然后，在该主培养基上接种1ml预培养液并且在37℃和约80rpm轻度振荡下(以防甘薯压碎)培养48小时。
通过与实施例15中相同的方法测定了培养后的培养物上清液中葡糖淀粉酶(GA)的活性和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性。
3.结果
结果如表38中所示。如上所述，酿造烧酒所需的酶活性的靶值是约100U/ml的葡糖淀粉酶和约10U/ml的酸稳定的α-淀粉酶。
从表38清楚可见，同时产生了两种酶GA和ASAA。即使ASAA不能超过酶活性的靶值，但预计有望通过优化液态曲的培养条件例如通氧条件来增大酶活性。另外，即使它是本发明的甘薯液态曲，完全可能通过增大烧酒的制造中曲的比率来生产烧酒。
[表38]
| 甘薯 | 酶活性(U/ml) | |
| GA | ASAA | |
| 108.6 | 5.5 | |
<实施例20>[应用苋类生产液态曲]
1.预培养方法
将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergilluskawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种在预培养基上，然后在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
2.主培养方法
将1～8g苋类、0.2g硝酸钾、0.3g磷酸二氢钾和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。在该主培养基上接种1ml预培养液，然后在37℃和100rpm振荡下培养48小时。培养后，测定了培养物的上清液中葡糖淀粉酶(GA)的活性和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性。顺便提一句，在葡糖淀粉酶(GA)的酶活性测定中应用糖化力分级量化盒(由日本的Kikkoman生产)。酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)活性的测定稍微改良了<非专利文献3>中描述的方法，通过用酸处理培养产物而灭活酸不稳定的α-淀粉酶，然后应用α-淀粉酶测定盒(由日本的Kikkoman生产)来测定酸稳定的α-淀粉酶。更具体地说，在1ml培养液中添加9ml 100mM醋酸缓冲液(pH3)，在37℃下经历酸处理达1小时，接着用α-淀粉酶测定盒(由日本的Kikkoman生产)来测定。
3.结果
结果如表39中所示。从前述研究可知，酿造烧酒所需的酶活性的靶值分别是约100U/ml的葡糖淀粉酶和约10U/ml的酸稳定的α-淀粉酶。从该表清楚可见，应用2％或更多的苋类，两种酶GA和ASAA的酶活性都超过其靶值。因此，说明了苋类适合作为制备液态曲的原料。
[表39]
| 苋类用量 | 酶活性(U/ml) | |
| GA | ASAA | |
| 1％ | 108.6 | 5.5 |
| 2％ | 125.7 | 11.0 |
| 4％ | 112.4 | 13.5 |
| 8％ | 125.0 | 13.4 |
<实施例21>[应用昆诺阿藜生产液态曲]
1.预培养方法
将8g精碾90％的稻和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。冷却后，将白曲菌(Aspergilluskawachii IFO4308)的种曲孢子以1×106个/ml接种在预培养基上，然后在37℃和100rpm振荡下培养24小时。
2.主培养方法
将1～8g昆诺阿藜、0.2g硝酸钾、0.3g磷酸二氢钾和100ml水装入500ml带有挡板的烧瓶中并且在121℃下高压灭菌15分钟。在该主培养基上接种1ml预培养液，然后在37℃和100rpm振荡下培养48小时。培养后，通过实施例20中所述方法测定了培养物的上清液中葡糖淀粉酶(GA)的活性和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性。
3.结果
结果如表40中所示。从前述研究可知，酿造烧酒所需的酶活性的靶值分别是约100U/ml的葡糖淀粉酶和约10U/ml的酸稳定的α-淀粉酶。从该表清楚可见，当昆诺阿藜的用量是2～4％时，可以均衡的方式生产两种酶。因此，说明了昆诺阿藜可以有效地作为制备液态曲的原料。
[表40]
| 昆诺阿藜的用量 | 酶活性(U/ml) | |
| GA | ASAA | |
| 1％ | 132.7 | 7.3 |
| 2％ | 126.8 | 10.6 |
| 4％ | 123.5 | 11.1 |
| 8％ | 88.2 | 18.1 |
工业适用性
本发明提供了应用下列物质廉价而有效地生产稳定质量的液态曲的方法：表面包有外壳的谷物，表面除去了外壳(谷壳等)的谷物，表面包有外皮的豆类或薯类，或苋类和/或昆诺阿藜或混杂的谷物。此外，所述液态曲优选用来生产发酵食品和饮料。另外，能以均衡的方式以高产率生产葡糖淀粉酶和耐酸的α-淀粉酶这两种酶。所以，它适合生产酒精饮料例如烧酒。
Claims (15)
1.一种制备用于生产发酵食品或饮料的液态曲的方法，它包括在含有作为原料、选自下组的任一物质的液态培养基中培养霉曲菌：表面包有外壳的谷物；表面仅仅除去了外壳(例如谷壳)的谷物；表面包有外皮的未加工的豆类或薯类；以及苋类和/或昆诺阿藜。
2.权利要求1的制备液态曲的方法，其中，所述表面包有外壳的谷物是未精碾的谷物或者精碾比率等于或大于至少外壳保留在谷粒表面程度的谷物。
3.权利要求1或2的制备液态曲的方法，其中，所述谷物是大麦。
4.权利要求3的制备液态曲的方法，其中，所述大麦的精碾比率为90％或更大。
5.权利要求1或2的制备液态曲的方法，其中，所述谷物是稻、小麦、荞麦、稗、粟、黍、高粱或玉米。
6.权利要求1的制备液态曲的方法，其中，所述表面仅仅除去了外壳(例如谷壳)的谷物包括未精碾的稻。
7.权利要求1的制备液态曲的方法，其中，所述表面包有外皮的未加工的豆类或薯类包括大豆、赤豆或甘薯。
8.权利要求1～7任一项的制备液态曲的方法，它包括，在含有所述原料的液态培养基中培养的霉曲菌的培养产物中至少同时生成和积累葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶。
9.一种生产发酵食品或饮料的方法，它包括，应用通过权利要求1～8任一项的方法获得的液态曲生产发酵食品或饮料。
10.权利要求9的生产发酵食品或饮料的方法，其中，生产发酵食品或饮料的所有步骤都是在液相中进行的。
11.权利要求9或10的生产发酵食品或饮料的方法，其中，发酵食品或饮料的生产是在免受外界影响的防护下的液相中进行的。
12.权利要求9～11任一项的生产发酵食品或饮料的方法，其中，发酵食品或饮料的生产是通过将另一种原料加到液态曲中生产原始糖化醪而进行的。
13.权利要求9～12任一项的生产发酵食品或饮料的方法，其中，所述发酵食品或饮料是烧酒。
14.一组用来生产发酵食品或饮料的液态曲，所述液态曲具有葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性、是通过权利要求1～8任一项的制备液态曲的方法获得的。
15.权利要求1～7任一项的制备液态曲的方法，其中，在含有所述原料的液态培养基中培养霉曲菌的液态曲生产过程中，通过抑制来自原料中的淀粉的糖类释放到培养体系中的速率而调节液态曲的酶活性。
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