CN1894423A - 检测多核苷酸的系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测目标多核苷酸是否存在或存在含量的方法。多核苷酸、目标核酸类似物和染料组合起来形成混合物。将染料的光学性能与类似混合物中染料光学性能变化速率所特有的参照值相比，以确定光学性能的相对变化速率，所述类似混合物含有已知量的目标多核苷酸/核酸类似物杂交体。混合物中染料光学性能的相对变化速率与样品中是否存在特定的目标多核苷酸或存在的量相关。

Description

检测多核苷酸的系统

相关申请

本发明要求于2003年5月20日提交的美国临时申请60/471827作为优先权，该临时申请通过引用的方式被整个包括进本文中。

技术领域

本发明涉及用于检测多核苷酸的方法、组合物和分析系统。

技术背景

人们强烈需要对多核苷酸进行鉴定及定量。目前用于对目标多核苷酸进行鉴定的现有方法依赖于聚合酶链式反应(PCR)、NASBA、TMA或bDNA等方法，所述目标多核苷酸例如是与以下相关的：病原体、病原感染、与疾病和紊乱相关的人类基因、经遗传修饰的生物(GMO)、生物战争试剂、兽医应用和农业应用。上述方法需要熟练的技术人员和专门的设备。因此，人们强烈需要对目标多核苷酸进行检测、鉴定和定量的方便而经济的方法。本发明达到了这一目的和其它目的。

发明内容

在一个方面，本发明涉及检测样品中目标多核苷酸是否存在或存在含量的方法。在进一步的方面，一种方法包括如下步骤：

将核酸类似物(其能以序列特异性的方式，与目标多核苷酸的目标核酸序列结合)与染料(有或没有目标多核苷酸/核酸类似物杂交体存在的情况下，其光学性能的变化速率(rate of change)会有所不同)组合起来，产生混合物。将混合物中染料光学性能的变化速率与类似混合物中染料光学性能变化速率所特有的参照值相比较，以确定光学性能的相对变化速率，所述类似混合物含有已知量的目标多核苷酸/核酸类似物杂交体。混合物中染料光学性能的相对变化速率与样品中是否存在特定的目标多核苷酸或存在的量相关。

在另一个方面，方法包括如下步骤：将肽核酸(PNA)(其能以序列特异性的方式，与目标多核苷酸的目标核酸序列结合)与染料(有或没有目标多核苷酸/PNA杂交体存在的情况下，其光学性能的变化速率会有所不同)组合起来，产生混合物。将混合物中染料光学性能的变化速率与类似混合物中染料光学性能变化速率所特有的参照值相比，以确定光学性能的相对变化速率，所述类似混合物含有已知量的目标多核苷酸/PNA杂交体。混合物中染料光学性能的相对变化速率与样品中是否存在特定的目标多核苷酸或存在的量相关。

在其它方面，核酸类似物可以是锁核酸(locked nucleic acid，LNA)、苏糖核酸(threose nucleic acid)或连接有金属的核酸。

有或没有目标多核苷酸/核酸类似物杂交体存在的情况下，以及当向混合物提供轻微刺激时，染料光学性能的变化速率会有所不同。

样品可以是组织、细胞收集物、细胞裂解物、经纯化的多核苷酸或经分离的多核苷酸、病毒、环境样品、工业样品、医学样品、食物样品、农业样品、兽医样品、农业牲畜样品、水样品、土壤样品、空气样品、与生物武器试剂相关的样品或与农业战争试剂相关的样品。

在一个方面，目标多核苷酸可以是DNA。在一些变化的情况下，目标多核苷酸可以从全细胞DNA、核DNA、线粒体DNA、核糖体DNA、叶绿体DNA或病毒DNA、质粒DNA、人工DNA、表观基因组(epigenomic)DNA、表观遗传化(epigenetic)DNA、体外扩增出的DNA或嵌合DNA获得。

在另一方面，目标多核苷酸可以是RNA。在一些变化的情况下，RNA可以从核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、带盔甲RNA(armored RNA)、病毒RNA、小分子RNA(micro RNA)、siRNA、人工RNA或嵌合RNA获得。

目标多核苷酸可以从任何生物中获得。在一种实施方式中，该生物可以是人。在另一种实施方式中，该生物可以是病原体。在又一种实施方式中，目标多核苷酸可以来自病原体，例如病毒、细菌或真菌。关于此类病毒或细菌的非限制性的例子包括Bacillus anthracis、Clostridiumbotulinum、Brucellae、Vibrio cholera、Clostridium perfringes、Ebola病毒、Yersinia pesits、Coxiella burnetii、天花病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒。

核酸类似物可以与目标核酸序列部分互补。或者，核酸类似物可以与目标核酸序列精确互补。

核酸类似物的长度可以大于大约4个核酸碱基和/或小于大约24个核酸碱基。在另一种变化中，核酸类似物的长度还可以是大约12个核酸碱基。

核酸类似物或目标多核苷酸可以被固定于固体基底(substrate)上。固定可以通过非共价相互作用来进行，例如生物素和链亲合素(streptavidin)之间的作用。在另一种变化中，核酸类似物可与生物素共价结合。在又一种变化中，非共价相互作用可以是抗原/抗体相互作用。核酸类似物或目标多核苷酸还可以与固体基底共价结合。

在另一个方面，染料是青色素(cyanine)染料。青色素染料的例子是碘化3’，3’-二乙基硫杂羰花青、碘化3’，3’-二乙基硫杂二羰花青和碘化3’，3’-二乙基硫杂三羰花青。

较之不存在核酸类似物/目标多核苷酸杂交体的情况，在存在有核酸类似物/目标多核苷酸杂交体的时候，染料可以具有更高的光学性能变化速率。或者，较之不存在核酸类似物/目标多核苷酸杂交体的情况，在存在有核酸类似物/目标多核苷酸杂交体的时候，染料可以具有更低的光学性能变化速率。

染料的光学性能变化速率可以通过对染料的光学性能进行测量来测定。此类光学性能的例子包括吸光度、荧光、反射率或化学发光。可在一个或多个时间点对光学性能进行测量。

在又一个方面，在多个时间点对染料的光学性能进行测量。在另一个方面，仅在一个时间点对光学性能进行测量。

在另一个方面，本发明涉及对样品中生物进行检测的方法，所述方法通过对样品中是否存在目标多核苷酸或存在含量进行检测来进行，其中，目标多核苷酸是否存在或存在的量能表明该生物是否存在或存在的量。

在另一个方面，本发明涉及对样品中一类生物进行检测的方法，所述方法通过对样品中是否存在目标多核苷酸或存在含量进行检测来进行，其中，目标多核苷酸是否存在或存在的量能表明该类生物是否存在或存在的量。

在又一个方面，本发明涉及对样品中生物的某些株系(strain)进行检测的方法，所述方法通过对样品中是否存在目标多核苷酸或存在含量进行检测来进行，其中，目标多核苷酸是否存在或存在的量能表明该种类是否存在或存在的量。

在另一个方面，本发明涉及对样品中经过遗传修饰的生物(GMO)进行检测的方法，所述方法通过对样品中是否存在目标多核苷酸或存在含量进行检测来进行，其中，目标多核苷酸是否存在或存在的量能表明该经过遗传修饰生物是否存在或存在的量。

本发明还涉及对受试对象(subject)是否存在疾病状态进行检测的方法，所述方法通过对样品中是否存在目标多核苷酸或存在含量进行检测来进行，其中，目标多核苷酸是否存在或存在的量能表明该疾病状态。

本发明还涉及对受试对象是否存在遗传变异进行检测的方法，所述方法通过对样品中是否存在目标多核苷酸或存在含量进行检测来进行，其中，目标多核苷酸是否存在或存在的量能表明该遗传变异。

在又一个方面，本发明涉及对病原体引起的宿主的感染进行检测的方法，其中，目标多核苷酸是否存在或存在含量(其中目标核酸是核糖核酸(RNA))，其中，目标多核苷酸是否存在或存在的量能对初病原体引起的宿主感染进行鉴定。

在又一个方面，本发明涉及对样品中单核苷酸多态性(SNP)进行检测的方法，所述方法通过对样品中是否存在目标多核苷酸或存在含量进行检测来进行，其中，目标多核苷酸是否存在或存在的量能表明SNP是否存在或存在的量。

在又一个方面，本发明涉及对样品中遗传序列进行检测的方法，所述方法通过对样品中是否存在目标多核苷酸或存在含量进行检测来进行，其中，目标多核苷酸是否存在或存在的量能表明该遗传序列是否存在或存在的量。

在又一个方面，本发明涉及对样品中体外扩增的序列进行检测的方法，所述方法通过对样品中是否存在目标多核苷酸或存在含量进行检测来进行，其中，目标多核苷酸是否存在或存在的量能表明该体外扩增的序列是否存在或存在的量。

在又一个方面，本发明涉及对样品中碱基对改变进行检测的方法，所述方法通过对样品中是否存在目标多核苷酸或存在含量进行检测来进行，其中，目标多核苷酸是否存在或存在的量能表明该碱基对改变是否存在或存在的量。

本发明还涉及对两份或多份样品中目标多核苷酸进行检测的方法，所述方法通过如下步骤来进行：利用第一种核酸类似物分子，在多位点设备的第一个位点对第一份样品中的目标多核苷酸进行检测；利用第二种核酸类似物分子，在多位点设备的第二个位点对第二份样品中的目标多核苷酸进行检测。在一种实施方式中，核酸类似物分子被固定于固体基底上。本方法包括在两份或多份样品中对两条或多条目标核苷酸序列进行检测。或者，样品可被固定于固体基底上。

本发明还涉及用于检测目标多核苷酸的试剂盒。试剂盒可以包括：一种或多种包括目标多核苷酸的样品、与目标多核苷酸的目标核酸序列至少部分互补的一种或多种核酸类似物以及一种或多种染料。可选地，试剂盒可以包括刺激的来源。试剂盒可以包括用于使用试剂盒的说明书。

附图说明

图1示出了使用PNA的分析系统的示意图。

图2显示了DNA分子和样品PNA分子之间的结构区别。

图3是光激活的基于PNA的分析系统的示意图。

图4示出了光激活的分析系统。

图5示出了将不同浓度的目标多核苷酸暴露给PNA和光刺激之后碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青染料的发射率(emission)对时间的图。

图6示出了：对于不同DNA浓度而言，碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青染料的发射率的百分比变化。

图7比较了用不同波长的光刺激的情况下，样品中碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青染料的发射率的百分比变化。

图8对来自GMO大豆的DNA和来自非GMO大豆的DNA样品中的染料发射率百分比变化进行了比较。

图9示出了用混合波长光源时对于不同待测DNA浓度的分析灵敏度。每行表示：在不同DNA浓度下，暴露给光刺激后，染料的发射率的百分比变化。PNA是N’CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys(SEQ ID NO：1)，多核苷酸序列是5’CTACGGGAGGCAGCAGTG 3’(SEQ ID NO：2)。

图10示出了：在目标多核苷酸的不同浓度下，碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青发射率出现20％的变化的时间。

图11示出了在DNA样品和具有不同浓度的RNA的样品中，染料发射率的百分比变化。

图12对存在或不存在deli wash背景的情况下，含有PNA和DNA的样品中，碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青的发射率的百分比变化的比较。

图13示出了PNA“楔子”(“wedges”)的加入。

图14A-D比较了对一系列样品应用不同波长之后的发射率。

图15示出了用通用细菌PNA探针的情况下，被固定的反应对时间的图。

图16示出了人类SRY检测。

图17图示了对核酸类似物进行的光激活的、表面固定的检测。

图18A-D示出了引入多核苷酸/核酸类似物杂交体的不同方案。

图19示出了不同波长的光刺激的作用。

图20示出了对不同浓度的大豆DNA的检测。

图21示出了光学性能的百分比变化对GMO阳性大豆基因组数量的图。

图22示出了不同浓度的tween 20的效果。

图23示出了对于不同浓度的tween20而言发射率的百分比变化。

图24比较了具有不同浓度tween 20的液体形式中，用PNA探针进行的反应和用LNA探针进行的反应。

图25示出了用PNA对LNA的反应中，发射率的百分比变化。

图26示出了用不同数量的病毒RNA对丙型肝炎病毒进行的检测。

图27示出了暴露给光刺激后一分钟时血浆的不同拷贝的发射率。

图28示出了用对HCV或细菌具有特异性的核酸类似物及细菌的情况下发射率的百分比变化。

图29示出了用短核酸类似物或用短核酸类似物的组合的情况下发射率的百分比变化。

发明详述

本发明提供了用核酸类似物来检测具有目标核酸序列的多核苷酸的方法、组合物和分析系统。

I.普通技术

如无另外指明，本发明的应用中使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、免疫学、蛋白质动力学和质谱方面的传统技术，这些都是本领域已知的技术。此类技术在文献中也有完整阐述，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，third edition(Sambrooket al.，2000)Cold Spring Harbor Press；Molecular Cloning：A LaboratoryManual，second edition(Sambrook et al.，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Methods in MolecularBiology，Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis，ed.，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths，and D.G.Newell，eds.，1993-8)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller and M.P.Calos，eds.，1987)；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987 including supplements through May 1，2004)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis et al.，eds.，1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan et al.，eds.，1991)；and Short Protocolsin Molecular Biology(Wiley and Sons，1999)；上述所有文献都通过引用的方式被全文包括在本文中。此外，如无特别指明，通常按照厂商给出的方案，来使用通过商业途径可获得的分析试剂盒和试剂。

II.定义

术语“目标核酸序列”通常指通过本发明的方法、组合物和分析系统检测到的核酸序列。目标核酸序列的全部或部分可通过序列特异性杂交与核酸类似物分子结合。目标核酸序列可以是任何长度的，但是，通常，其长度小于1Kb，小于500个碱基，小于24个碱基或者小于12个碱基。在另一种实施方式中，目标核酸序列的长度可以是10、12、14或18个碱基。在其它实施方式中，目标核酸的长度可以是至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个碱基。本发明的目标核酸序列可以包括蛋白质编码序列和非编码序列(例如，调控序列、内含子等)。

术语“多核苷酸”指核苷酸的任何长度的聚合形式，其可以是脱氧核糖核酸或核糖核酸或其类似物。下述是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酸性酶(ribozyme)、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、核酸探针、引物和扩增得到的DNA。多核苷酸可以含有经过修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在聚合之前或之后被进一步地修饰，例如与标记组分结合。多核苷酸可以是扩增得到的更长的多核苷酸区域。

术语“目标多核苷酸”指包括目标核酸序列的多核苷酸。

术语“核酸类似物”包括具有一个或多个不同于鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的碱基，和/或在RNA主链上的磷酸核糖或DNA主链上的磷酸去氧核糖上具有一处或多处不同的任何核酸类似物。“核酸类似物”包括但不限于：肽核酸(PNA)，锁核酸(LNA)(例如Trendsin Biotechnology 21：74-81，2003所公开的)，连接有金属的核酸，经修饰的多核苷酸(例如经蒽醌修饰的)(如Yamana et al.，2003所公开的)，苏糖核酸(TNA)(例如Chaput et al.，Journal of the American ChemicalSociety，125，856-857，(2003)所公开的)以及嵌合核酸。

术语“肽核酸”或“PNA”包括下述任何核酸类似物，所述核酸类似物中，核酸的去氧核糖磷酸主链已被合成的类肽主链所取代，包括，例如，n-(2-氨基-乙基)-甘氨酸单元，例如，非限制性地，如图2所示(Nielsen et al.，1991)以及U.S.Patent Nos.5,786,461、6,357,163、6,107,470、5,773,571；6,441,130，6,451,968；6,228,982；5,641,625；5,766,855；5,736,336；5,719,262；5,714,331；5,719,262和6,414,112中所公开的。嘌呤和嘧啶碱基可以通过任何共价键连接结合，包括，例如，亚甲基羰基连接。本文中所使用的PNA分子可以在PNA主链和核酸碱基(nucleobase)之间具有其它原子。上述类似物包括，例如，D-赖氨酸链、环形结构(例如环戊烷或吡咯烷环)和/或手性取代结构，包括U.S.Patent No.6,403,763、U.S.Patent Application No.US 2003/0162699和U.S.PatentApplication No.US 2003/0157500中所述的PNA分子。PNA主链可以包括肽主链上的取代或延伸。PNA可以包括基于肽的核酸模仿物(PENAM)(例如，例如U.S.Patent NO.5,705,333中所公开的)、具有不常见的手性中心的原子(例如D-手性中心和潜手性中心)以及PNA主链上的原子取代。

术语“核酸类似物/多核苷酸杂交体”和“多核苷酸/核酸类似物杂交体”是同义的，它们指以序列特异性方式杂交的核酸类似物和多核苷酸。

术语“PNA/多核苷酸杂交体”和“多核苷酸/PNA杂交体”是同义的，它们指以序列特异性方式杂交的PNA和多核苷酸。

“互补的”指：单链核酸类似物分子具有以碱基特异性方式与多核苷酸结合的能力。可合成核酸类似物分子，以结合目标多核苷酸，例如全长多核苷酸链或其一部分。“互补的”核酸类似物分子可以具有一个或多个单个碱基对的错配、添加和/或缺失，但仍能够在选定的杂交条件下与目标多核苷酸结合。在一种实施方式中，互补的序列可以通过Watson-Crick方式(A-T或A-U及C-G)杂交。在另一种实施方式中，互补的序列可以通过核酸类似物和多核苷酸核酸碱基之间的Hoogstein碱基配对进行杂交。

“精确互补的”指：单链核酸类似物分子具有与目标核酸序列结合的能力，且不含错配。如果在核酸类似物和目标多核苷酸之间具有单个碱基对的错配，那么核酸类似物分子就并非与目标多核苷酸精确互补的。

术语“速率”指变化(例如组合物或化合物性能的变化)。速率可以比速率常数的形式表示。可通过在一段时间内进行测量来确定速率。可通过测量对速率进行描述，通过在过程中两个不同的时间点进行测量(例如，特定刺激、组分加入等之前或之后)，或在至少三个、至少四个或至少五个时间点进行测量来确定速率。可用定量或定性(例如，变化是“快”或“慢”的)的形式来表述速率。可通过对化合物的性能与相对值的比较来确定速率，或者通过其它方法来确定。

本文中使用的术语“相对速率”指：与另一过程的速率相比较的一种过程的速率。“相对速率”可以是大致的(例如，一种过程的速率可以比另一过程的速率“更快”或“更慢”)或定量的(例如，比较对两种过程测量出的速率)。

本文中使用的术语“染料”指具有可被测量的光学性能的化合物，或者可以转化为具有可被测量的光学性能的化合物的化合物。可被测量的光学性能包括但不限于：颜色、吸光度、荧光、反射率或化学发光。染料在某些条件下可以展示出光学性能，例如结合上多核苷酸/核酸类似物杂交体时，或未结合上多核苷酸/核酸类似物杂交体时。

“带盔甲RNA^TM”指：由于RNA被细菌噬菌体蛋白质包裹上外壳从而对核糖核酸酶具有抗性的RNA。在例如U.S.Pat.Nos.6,399,307、6,214,982、5,939,262、5,919,625和5,677124中，有对“带盔甲RNA^TM”的进一步描述。

本文中使用的“非特异性载体多核苷酸”指非目标多核苷酸分子，其能增加核酸类似物与特异性目标多核苷酸之间的结合亲合力和/或提高分析系统的灵敏度。

本文中使用的术语“核酸类似物结合位点”指一个或多个核酸类似物分子与固体支持物结合的位点。

本文中使用的术语“PNA结合位点”指一个或多个PNA分子与固体支持物结合的位点。

“样品”指任何类型的液体样品(例如，血液、血清、水或尿液)和/或任何类型的固体样品(例如，细胞、食物、水、空气、泥土或谷物)和/或任何类型的空气传播样品。

术语“受试对象”指动物，例如脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人。术语“受试对象”还指植物。

术语“病原体”指任何会导致疾病、紊乱和/或病理状态和/或症状的介质。举例而言，病原体可以是自然界中发现的、实验室中产生的生物(或其伴随的毒素)，其会导致生物体中疾病的出现，或病理状态或症状的发展，使得生物失去能力、虚弱和/或死亡。病原体包括但不限于：病毒、细菌、真菌、真核生物和/或原核生物，以及生物武器试剂、传染性疾病、水传播的(water borne)病原体和食物病原体。

术语“生物武器试剂”指自然界中发现的或实验室中产生的下述任何生物(或其伴随的毒素)，其被主要用于在另外的活的生物体中导致疾病、使其失去能力或使其死亡。生物武器试剂的例子包括但不限于：致病细菌、真菌、原生动物、立克次体和病毒。

本文中使用的“感染(infection)”指宿主中存在病原体。感染可以是潜伏的或发作的。在一种实施方式中，病原体的存在由宿主多核苷酸和/或多肽表达的变化所指示。感染可以通过下述途径发生，其包括但不限于空气传播的唾沫、直接接触、动物和昆虫载体和受污染的食物或饮料。

本文中使用的术语“宿主应答多核苷酸”指：在应答刺激(例如病原体感染和/或接触)的宿主中，有所改变的多核苷酸或其表达有所改变的多核苷酸。

本文中使用的术语“宿主”指动物和植物。动物可以是哺乳动物。哺乳动物的例子包括人类、非人类灵长类、畜牧动物、体育竞技动物(sportanimal)、小鼠和大鼠。植物的例子包括但不限于农业作物。

III.检测多核苷酸的方法

本发明提供了用核酸类似物来检测具有目标核酸序列的多核苷酸的方法、组合物和分析系统。在一种实施方式中，(i)含有、被认为含有、或预期不含有目标多核苷酸的样品，(ii)能以序列特异性方式与多核苷酸的目标核酸序列结合的核酸类似物和(iii)存在和不存在多核苷酸/核酸类似物杂交体的情况下，其光学性能变化速率会有所不同的染料，被组合起来产生混合物。该混合物还可以包括非特异性载体多核苷酸，例如但不限于：非特异性植物DNA、酵母DNA、鲑鱼精DNA或tRNA。将混合物中染料光学性能的变化速率与类似混合物中染料光学性能变化速率所特有的参照值相比，以确定光学性能的相对变化速率，所述类似混合物含有已知量(包括量为零的情况)的多核苷酸/核酸类似物杂交体。混合物中染料光学性能的相对变化速率与样品中是否存在特定的目标多核苷酸或存在的含量相关。

在一个方面，本发明提供了用肽核酸(PNA)分子来检测具有目标核酸序列的多核苷酸的方法、组合物和分析系统。在一种实施方式中，(i)含有、被认为含有、或预期不含有目标多核苷酸的样品，(ii)能以序列特异性方式与多核苷酸的目标核酸序列结合的肽核酸(PNA)和(iii)存在和不存在多核苷酸/PNA杂交体的情况下，其光学性能变化速率会有所不同的染料，被组合起来产生混合物。该混合物还可以包括非特异性载体多核苷酸，例如但不限于：非特异性植物DNA、酵母DNA、鲑鱼精DNA或tRNA。将混合物中染料光学性能的变化速率与类似混合物中染料光学性能变化速率所特有的参照值相比，以确定光学性能的相对变化速率，所述类似混合物含有已知量(包括量为零的情况)的多核苷酸/PNA杂交体。混合物中染料光学性能的相对变化速率与样品中是否存在特定的目标多核苷酸或存在的含量相关。

参照值可以是具有已知特征的组合物或化合物的性能所特有的值。例如，在多种实施方式中，可用不含多核苷酸/核酸杂交体、含有一定量(例如，已知量)的多核苷酸/核酸杂交体、多核苷酸/核酸杂交体含量为零的混合物，或其中一种或多种组分(例如，核酸类似物、目标多核苷酸或染料)不存在的反应混合物，来确定参照值。进一步的关于参照值的非限制性的例子包括未暴露给光刺激的混合物的光学性能所特有的值，或，在另外一种实施方式中，已暴露给光刺激的混合物的光学性能所特有的值。上述例子用于阐述，而非意欲限制本发明，在本申请文件的指导下，其它的例子对于操作者来说也是显而易见的。应当认识到，可经实验来确定参照值，但这并非必须(例如，如果知道，在不存在目标多核苷酸/核酸类似物杂交体的情况下，含有染料的组合物的光学性能不发生变化，或者最小限度地变化，可对参照值进行计算或推理，可不对其进行测量)。参照值可以是恒定值。虽然在某些情况下，同时对“对照”样品和测试样品进行分析是方便的，但并非必须要如此操作。可在一个时间点对参照值进行测定，该值被记录下来在较后的时间点进行比较。应当理解到，上述例子仅用于阐述，而非加以限制。本申请文件中示出了多种不同的参照值。

在一个方面，参照值是不含多核苷酸/核酸类似物杂交体的类似混合物的染料光学性能变化速率所特有的。在一种实施方式中，参照值可以是在所有组分组合于混合物之前的染料的光学性能所特有的。在另一种实施方式中，参照值可以是标准值。对于将混合物暴露给光刺激的实施方式而言，参照值可以是使用光刺激前染料光学性能所特有的。应当清楚地认识到，无须同时对样品、核酸类似物和染料混合物中染料的光学性能进行测定。此外，还应理解，参照值可以是恒定的值。

参考特定的实施例将有助于理解本发明。实施例1和图4种示出了本发明的使用PNA的基于液体的方法。在微离心管中混合10μM与花菜花叶病毒35S启动子互补的PNA分子(35S PNA)和1μM 35S启动子DNA(35S DNA)，加入150μM染料。将所述的管暴露于光刺激，在超过1分钟的时间段内观察到了颜色变化(图4)；即染料光学性能发生变化。在对照管中，目标核苷酸不存在，甚至在24小时后，颜色仍为粉红色(无光刺激)，表明光学性能变化速率非常低。当35S PNA不存在(管3)或没有特异性目标时(管1)，在管中几乎观察不到光学性能(该情况下，即颜色变化)的变化。

图1中示出了另一种使用PNA探针的实施例。A)将带有与一种或多种目标多核苷酸序列互补的PNA序列的离散点的膜带置于裂解/杂交管1中。B)将样品加入到裂解/杂交缓冲液中，对混合物在＞95℃上加热3分钟，以及C)冷却至室温。D)将该膜带转移至新的管(管2)中，其中含有用于温育的洗涤缓冲液。移去未结合的DNA、RNA和其它细胞残余物。E)将所述膜带转移至含有检测染料的新的管(管3)，对其进行大约1分钟的温育。F)将所述的管在洗涤缓冲液中进行简单的洗涤(管4)，去除残余的未结合的染料。G)在该膜系统中，染料仅与PNA/目标多核苷酸复合物结合。基于杂交图案，可确定出特定目标多核苷酸是否存在。通过与已知的图案卡进行比较，可确定物质是否存在并对其进行鉴定。

图22中示出了另一个实施例。在微离心管中混合10μM与目标核酸序列互补的PNA分子和1μM目标多核苷酸。加入2μM染料和不同量的tween 20。将微离心管暴露于光刺激，在超过10分钟的时间段内观察到光学性能的变化(图22)。当超过1.0％的tween 20存在时，对于含有染料而不含目标多核苷酸/核酸类似物杂交体的样品来说，仅观察到光学性能的很小的变化。当将含有目标多核苷酸/核酸杂交体的样品暴露给光刺激时，染料的荧光(或其它光学性能)发生改变。通过观察荧光(或其它光学性能)的变化对是否存在目标多核苷酸或其存在的量进行检测。应当认识到，可通过单次测量来测知是否存在目标多核苷酸或其存在的量。

在另一种实施方式中，可将多种核酸类似物序列组合于混合物中，以通过多元技术(multiplexing)来检测多种目标多核苷酸。可在美国专利5582989中发现涉及已知核酸分析系统的多元反应。

不打算受限于特定的机理或理论的情况下，在一个方面，核酸类似物/多核苷酸杂交体可以催化涉及染料的化学反应。染料与作为催化位点的核酸类似物/多核苷酸杂交体的小沟(minor groove)结合。光刺激的使用向混合物中增加了能量，导致核酸类似物/多核苷酸杂交体中染料的光学性能以较之不存在核酸类似物/多核苷酸杂交体的情况下更快的速率变化。例如，使用光刺激时，碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青变得澄清(turns clear)。染料光学性能变化速率较高对应于样品中目标多核苷酸的存在量增加。

下述部分更为详细地描述了本发明。

A.设计核酸类似物序列

为用于本发明，可对核酸类似物进行设计，使其与目标多核苷酸的核酸序列互补或精确互补。在一种实施方式中，除接头、氨基酸和标记之外，核酸类似物长度大于大约4个核苷酸，并且小于大约24个核酸碱基。在其它实施方式中，核酸类似物长度可以为5-100、8-60或10-25个核酸碱基。在另一种实施方式中，除接头、氨基酸和标记之外，核酸类似物的长度可以是10、12、14或18个碱基。在其它实施方式中，目标核酸的长度可以是至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个碱基。核酸类似物可被设计为含有与目标多核苷酸不互补的区域，例如在多核苷酸末尾延伸出去的序列。

可用多种不同的方法来设计核酸类似物分子的序列。非限制性地举例而言，核酸类似物分子可被设计为具有基于已知引物的序列，所述引物是用于基于PCR的扩增以及对特定目标序列的检测的。核酸类似物分子还可被设计为与多核苷酸的任何目标核酸序列互补或精确互补。举例而言，核酸类似物分子的序列可以基于PCR引物的序列，所述引物用于检测与病原体相关的多核苷酸、宿主中病原体的存在与否、疾病基因或遗传情况。核酸类似物分子还可与下述序列互补或精确互补，所述序列包括：编码蛋白质活性或功能结构域的全部或部分序列，编码完整蛋白质的全部或部分序列或非编码序列(例如，调控序列、内含子等)。

在一种实施方式中，核酸类似物可被用于区分具有精确互补序列的多核苷酸和具有单个碱基错配的多核苷酸。非限制性地举例而言，用于本发明的核酸类似物可被设计为用以检测单核苷酸多态性(SNPs)。核酸类似物/多核苷酸杂交受到碱基错配的影响。根据本发明的方法，加入染料后，目标序列(例如SNP)和核酸类似物之间的单个碱基错配导致染料光学性能变化速率不同，这是较之不具有错配的核酸类似物而言的。对用于诊断目的的对SNPs的鉴定方法和其它方法是本领域内公知的。

在另一种实施方式中，核酸类似物可被设计为用于检测一类生物是否存在或存在的量。生物的类指，所有这些生物都具有与核酸类似物序列互补或精确互补的一条或多条序列。可基于核酸序列的互补性将此类生物与其它生物区分开来。

在一种实施方式中，核酸类似物分子具有小于大约60％的嘌呤含量，并在一排中最多具有4个嘌呤碱基或三个鸟嘌呤碱基。富含嘌呤的核酸类似物分子倾向于聚集，在水溶液中溶解度很低。对核酸类似物分子加以选择，以避免具有反向重复、发卡结构和回文结构的自身互补的序列，或使其最小化。

核酸类似物分子可以任何方向与多核苷酸杂交，但是反平行(anti-parallel)的方向是优选的。反平行是用于反义和DNA探针类型应用的优选构型。当核酸类似物的方向为反平行时，核酸类似物探针的N-末端等同于DNA的5’末端。N’和5’都用于本文中。

在本文的指导下，本领域技术人员将会认识到，除本文特别列出的核酸类似物之外，其它核酸类似物(包括未来发现或发展出的核酸类似物)也可用于本发明的方法。在本文所述的分析条件下能形成多核苷酸/核酸类似物杂交体的核酸类似物适于本发明的方法，其能影响到光学性能变化的速率。

可用若干筛选方法中的任何方法，来鉴定适合用于本发明方法中的核酸类似物。在一种方法中，非限制性地举例而言，在能形成核酸类似物/多核苷酸杂交体的条件下，将含有候选核酸类似物(可选地，以不同浓度存在的)的样品，与具有互补序列的多核苷酸组合。在一种实施方式中，然后加入染料。然后对染料光学性能的变化速率进行测定。将该速率与不存在核酸类似物/多核苷酸杂交体时染料光学性能变化速率所特有的参照值进行比较。在另一种实施方式中，参照值是不存在多核苷酸的情况所特有的。在又一种实施方式中，参照值是存在目标多核苷酸(单链或双链的)的情况所特有的。应当认识到，加入的顺序不是关键因素，组分可按照另外的顺序加入。

在另一种实施方式中，参照值是多核苷酸浓度不为零的情况所特有的。在该种实施方式中，相对参照值(例如，存在双链多核苷酸但不存在核酸类似物/多核苷酸杂交体)而言，光学性能随时间以不同速率变化的核酸类似物/多核苷酸杂交体被选用于本发明所要求保护的方法。光学性能的相对变化速率与特定多核苷酸是否存在或者存在的量相关。

B.肽核酸(PNAs)

在一个方面，核酸类似物是PNAs。PNA通过序列特异性杂交，与目标多核苷酸中的目标核酸序列的全部或部分杂交。或者，条件变化使得单个碱基对的改变被区分出来。

PNA分子能与目标多核苷酸迅速杂交。PNA对多核苷酸的杂交不依赖于盐浓度(Demidov et al.，1994)。PNA对核酸酶和蛋白酶的攻击具有抗性，相对于传统的DNA而言，其能以更高的特异性与多核苷酸结合。短探针可用于序列特异性高的情况(Ray and Norden，2000)。此外，PNA/多核苷酸杂交体较之相应的DNA/多核苷酸杂交体具有更高的热稳定性，PNA/多核苷酸杂交体的熔点对离子强度相对不敏感，在低盐浓度(＜10mM NaCl)和中等盐浓度(500mM NaCl)显示出相等的热稳定性。在低盐浓度下PNA/多核苷酸杂交体形成的能力是显著的，因为dsDNA和rRNA的内部结构在盐浓度低于200mM时会被显著去稳定。因此，可对分析条件进行选择，选出偏向于对目标核酸进行破坏而仍能促进PNA分子的强烈杂交的条件(Stefano and Hyldig-Nielsen，1997)。PNA/多核苷酸杂交会受到碱基错配的严重影响，PNA分子在仅有单个错配的水平下仍能保持对序列差异的分辨。

例如，可从Eurogentec(UK)、Blue Heron Biotechnology(Bothell，WA)和Applied Biosystems Inc.(ABI)购得PNA分子，或通过本领域已知的方法对PNA分子进行合成。

C.杂交条件

通常，对杂交条件的设计和/或选择受若干参数的影响，其例如但不限于：核酸类似物分子与目标多核苷酸互补的程度、将要使用的核酸类似物分子以及目标多核苷酸本身的长度。优选的杂交条件能使下述情况的一种或多种发生：核酸类似物与目标多核苷酸高效结合，RNA或DNA二级结构最小化，RNA的降解最小化，以及，一个或多个碱基对的变化得以被分辨，或一个或多个碱基对的变化被包含进来。

杂交反应可在不同“严谨度”条件下进行。影响杂交反应严谨度的条件众所周知，并在本领域中公开过。例如，见Molecular Cloning，ALaboratory Manual，third edition(Sambrook et a1.2000)，Cold Spring HarborPress。相关条件的例子包括但不限于：盐浓度、pH(缓冲液)和温度。使用低盐浓度的杂交条件通常会增加DNA的不稳定性和PNA/多核苷酸的稳定性。可以使用的缓冲液的例子包括但不限于，Na₃PO₄、NaHSO₄、K₂HPO₄、K₂SO₄或CaSO₄。举例而言，缓冲液的摩尔浓度范围在大约10mM至大约0.5M之间，pH在大约4至大约10之间，或在大约7至大约10之间，例如大约7.0或大约7.5。举例而言，可使用大约0.5mM至0.5M之间的Na₃PO₄，例如，2.5mM，其pH在大约至大约10之间，或在大约7至大约10之间，例如大约7.0或大约7.5。

作为示例的条件的例子包括但不限于(以严谨度逐渐增加的顺序)：温育温度为25℃、37℃、50℃和68℃；缓冲液浓度为10X SSC、6XSSC、4X SSC、1X SSC、0.1X SSC(其中SSC是0.15M NaCl和15mM如本文所述的任何缓冲液)以及使用其它缓冲液体系的其等同条件；甲酰胺浓度为0％、25％、50％和75％；温育时间从5分钟至24小时，1个、2个或多个洗涤步骤；洗涤温育时间为1、2或15分钟；洗涤溶液为6XSSC、1X SSC、0.1X SSC或去离子水。在优选的实施方式中，杂交和洗涤条件都在高严谨度下进行。举例而言，杂交可在下述条件下进行：50％甲酰胺、4X SSC，接着在50℃用2x SSC/甲酰胺和1x SSC进行洗涤。

缓冲液可以含有离子或其他化合物，或不同的缓冲能力。或者，缓冲液中的成分可以具有稳定化能力；例如可使三体DNA稳定的新霉素或其它氨基糖苷(Arya et al，2003)或增强三体稳定性的二酰亚胺萘(Gianolioand McLaughlin，2001)或萘基喹啉(Keppler et al，1999)。

D.染料

可使用一种或多种染料来测定是否存在多核苷酸或其存在的量，其中，存在核酸类似物/多核苷酸杂交体的情况与已知浓度的核酸类似物/多核苷酸杂交体的情况相比，所述染料光学性能变化速率不同。在一个方面，光学性能可以是颜色、吸光度、荧光、反射率或化学发光方面的变化。还可在分析期间的单个或多个时间点对光学性能进行测量。

可将染料光学性能变化的速率与含有已知量的核酸类似物/多核苷酸杂交体或多核苷酸/PNA杂交体的混合物中染料光学性能变化速率所特有的参照值相比，以确定光学性能的相对变化速率。参照值可以是定性的或近似的值(例如，存在或不存在颜色)。或者，参照值可以是用数字表示的值。如另一个实施例所示，可在对样品中染料光学性能变化速率的测定之前、期间或之后，对参照值进行测量。在另一个实施例中，参照值可以是恒定的，例如速率常数。参照值还可以是不存在目标多核苷酸或多核苷酸/核酸类似物杂交体的情况下(即，核酸类似物/多核苷酸杂交体的量已知为零)光学性能的变化速率。

在一些情况下，存在核酸类似物/多核苷酸杂交体时，染料的光学性能的变化速率要比不存在核酸类似物/多核苷酸杂交体时高。因此，通过光学性能较之参照值的相对变化速率的增加，可检测到多核苷酸的存在或其存在的量。存在有核酸类似物/DNA杂交体的情况下其光学性能变化会更为迅速的染料的例子包括：羰花青染料，其是多环芳香化合物。这些染料在可见光范围内具有强烈的吸收，优先与溶液中的核酸类似物/多核苷酸杂交体结合，结合之后颜色会有所改变。羰花青染料的例子包括但不限于碘化3，3’-二乙基硫杂青色素、碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青、碘化3，3’-二乙基硫杂二羰花青和碘化3，3’-二乙基硫杂三羰花青。

在一种示例性的实施方式中，本文所述的分析条件下，存在有目标核酸和互补PNA时，光刺激使得3’，3’-二乙基硫杂羰花青从桃红色(hotpink)变得澄清(clear)。不存在目标核酸时，染料的变化速率较慢。存在目标核酸和互补PNA时，光刺激还会降低染料的荧光发射。不存在光刺激时，存在目标核酸时，染料立刻从桃红变回暗粉色(dull pink)，并且，存在目标核酸时，染料的荧光发射立刻减少。

在本文所述的分析条件下，存在目标核酸时，3，3’-二乙基硫杂二羰花青从蓝色变为紫色。

在本文所述的分析条件下，存在目标核酸时，3，3-二乙基硫杂三羰花青保持为水蓝色，不存在目标核酸时，其变得澄清。

在其它情况下，存在核酸类似物/多核苷酸杂交体时，染料光学性能变化速率要比不存在核酸类似物/多核苷酸杂交体时慢。因此，可以通过光学性能的相对变化速率的降低来检测出多核苷酸是否存在或存在的量，所述相对变化速率的降低是较之不存在核酸类似物/多核苷酸杂交体的情况下速率所特有的参照值而言的。

染料可以选自，例如，能以若干种方法中的任何方法与核酸结合的分子。有用的染料包括：小沟结合物、大沟结合物、嵌入物(intercalator)以及与其它多核苷酸结合的分子、其衍生物或其结合物(conjugates)。可用于本发明方法中的一些染料与核酸类似物/多核苷酸杂交体的小沟结合。这些染料包括羰花青染料，例如：碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青、碘化3，3’-二乙基硫杂二羰花青和碘化3，3’-二乙基硫杂三羰花青。例子包括但不限于：溴化乙锭(Fiebig et al，1999)、荧光素、吩噻嗪染料(例如亚甲基蓝(Wagner，2002)，DAPI(Kapuscinski，1995))、噻唑橙(Boger and Tse，2001，Carreon et al，2004)、Hoechst 33258(Adhikary et al，2003，Maiti et al，2003，Morozkin et al，2003，Tanious et al.，2004，Tawar et al，2003)、SYBR Green II(Morozkin et al.，2003)、BEBO、BETO、BOXTO、BO、BO-PRO、TO-PRO，YO-PRO(Karlsson et al.，2003，Eriksson et al，2003)、PicoGreen(Toluand Myers，2003)、TO-PRO-3(Sovenyhazy et al，2003)、二青色素染料(Schaberle et al，2003)、甲基绿-派洛宁Y(Prento and Lyon，2003)、溴化乙锭和吖啶橙(Johnson et al，2003，Lauretti et al，2003，Luedtke et al，2003)、中性红(Wang et al，2003)、BO(Karlsson et al，2003)、单lexitropsins及双lexitropsins和喷他脒(Pentamidine)(Puckowska et al，2004)、2-(甲基硫杂)苯基水杨基醛亚胺Schiff碱铜(II)(Reddy et al，2004)、双功能铂(II)复合物(Ma and Che，2003)、双(9-氨基吖啶-4-羧基酰胺)(Wakelin et al，2003)、二咪唑吖啶酮(Tarasov et al，2003)、平行或反平行羧基酰胺小沟结合物(Boutorine et al，2003)、具有小沟结合物的寡(2′-O-甲基核糖核苷酸)结合物(Novopashina et al，2003)、吡咯咪唑多胺(Briehn et al，2003，Dervan andEdelson，2003，Reddy et al，2003，Renneberg and Dervan，2003)、吡咯(Huanget al，2000)、二吡咯(Carrasco et al.，2003)、钌复合物(Kuwabara et al，2003)、铊(Ouameur et al，2003)、芳香二脒(Nguyen et al，2002)、教酒菌素(Chartreusin)(Barcelo et al，2002)、铂复合物(Silverman et al，2002)、S-3-硝基-2-吡啶亚磺酰-N-乙酰基-半胱氨酸(Shim et al，2004)、甲基磺酸酯(Varadarajan et al，2003)、肽双嵌入物(bis-intercalator)(Guelev et al，2001)、金属嵌入物(Proudfoot et al，2001)、2，2′-联二萘(Kondo et al，2004)、嵌入核酸(Christensen and Pedersen，2002，Nielsen et al，2004)、钌(II)复合物(Liu etal，2004)、环状多胺新三烯/铜(II)复合物(Biver et al，2004)、2，6-二磺酸蒽醌(Wong and Gooding，2003)、二茂铁基蒽、二茂铁和其它萘二酰亚胺衍生物(Gianolio and McLaughlin，2001，Takenaka et al，2002，Tok and Fenker，2001)、阿霉素(Patolsky et al，2002，Xiao et al，2003)、吖啶-9-基硫脲(Baruahand Bierbach，2003)、萘二酰亚胺(Nojima et al，2001，Nunez et al，2000)、米托葱醌(mitoxantrone)(Wang et al，2003)、白叶藤碱和新白叶藤碱(Guittat etal，2003)、与亚氨基二乙酸相连的聚酰胺(Woods et al，2002)、树枝状多胺结合物(Brana et al，2002)、双嵌入物delta-delta[mu-C49cpdppz)(2)-(phen)(4)Ru(2)](Onfelt et al，200l，Onfelt et al，2002)、地特诺(ditercalinium)(Berge et al，2002)、8-甲氧补骨脂素(Arabzadeh et al，2002)、道诺霉素和玫瑰树碱(ellipticine)(Reha et al，2002)、1，4，5，8-萘四羧基二酰亚胺(Guelev et al，2002)、白叶藤碱(Lisgarten et al，2002)、AMAC(Ferry et al，2001)、(-)-6-[[(氨基烷基)氧]甲基]-4-去甲氧基-6，7-二去氧柔红霉酮(1)(Dienes and Vogel，1996)、NLCQ-1(Papadopoulou et al，2000)、YOYO-1(Wong et al，2001)、DACA(Hicks et al，2001)、环金属化Rh(III)(Kisko and Barton，2000)、CI-958(Dees et al，2000)，pyrazoloacridine(Pelley et al，2000)、顺二氯铂(II)复合物(Perrin et al，2000)、咪唑吖啶酮(Mazerski and Muchewicz，2000)、咔唑(Sajewicz and Dlugosz，2000)、5，11-二甲基-5H-吲哚[2，3-b]喹啉(Osiadacz etal，2000)、YOYO-3、纺锤菌素、SN6999、A3和SN6113(Kirschstein et al，2000)、唑黄(Inoue et al，1999)、铑(III)的5，6-屈醌二亚胺复合物(chrysenequinone diimine)(Jackson and Barton，2000)、尼罗蓝(Chen et al，1999)、usambarensine(Dassonneville et al，1999)、3-甲氧基苯并蒽酮(Yanget al，1999)、1，8-二羟基蒽醌(Mueller and Stopper，1999)、环丙吡咯并吲哚(cyclopropapyrroloindole)(Dempcy et al，1999)、蒽(Ostaszewski et al，1998)、吡咯里嗪(pyrrolizine)和咪唑(Atwell et al，1998)、蒽环复合物(Milano et al，1998)、杂二聚体(例如，噻唑橙-噻唑蓝，噻唑橙-溴乙非啶和荧光素-溴乙非啶(Benson et al，1993a，Benson et al 1993b)。此外，公司(例如Molecular Probes)出售与本发明兼容的多种类型的核酸染剂。Journal ofthe American Chemical Society 125：4132-4145(2003)和BioconjugateChemistry 13：387-391(2002)中，可发现其它类别的青色素染料和具有状态反应的(state reactive)染料。其它染料的例子包括但不限于：三铜(II)复合物(Dhar et al，2003)、偏端霉素A(Hiraku et al，2002，Woods et al，2002)、吲哚[2，3-b]-quinolizinium溴(Viola，2002)、海鞘素(ecteinascidins)(Anthoneyand Twelves，2001)、金属氨络物(Barry et al，2002)或2-苯基喹啉-碳水化合物杂合体(Toshima et al，1999)。在某些实施方式中，染料不是会促进分裂的化合物。

染料还可以包括孔雀绿、红色双砷化合物染料和荧光素。在某些实施方式中，染料不是孔雀绿、红色双砷化合物染料和荧光素。

本领域技术人员将认识到，可对染料加以筛选，以确定出可以在本发明方法中使用的那些染料。可结合核酸类似物/多核苷酸杂交体，并展示出光学性能随时间的变化(可选地，在被提供了刺激之后)的那些染料可被容易地鉴定和选择出。

本领域的技术人员在本申请文件的指导下将认识到，除了本文所列出的染料外，其它染料(包括未来发现或发展出的染料)也可用于本发明的方法。在本文所述的分析条件下，存在和不存在目标多核苷酸/核酸类似物杂交体的情况下，其光学性能变化速率不同的染料是适合用于本发明的。

可使用若干筛选方法中的任何方法来鉴定出合适的染料。非限制性地举例而言，将含有核酸类似物的样品与具有互补序列的多核苷酸在能形成核酸类似物/多核苷酸杂交体的条件下组合。在一种实施方式中，然后加入候选染料，可选地，为不同浓度的。加入的顺序并不重要，组分可按照其它顺序加入。然后对光学性能随时间变化的速率进行测定。将该速率与不存在核酸类似物/多核苷酸杂交体的情况下染料光学性能变化速率所特有的参照值进行比较。在一种实施方式中，参照值是不存在多核苷酸的情况所特有的。在一种实施方式中，参照值是存在多核苷酸(单链的或双链的)的情况所特有的。在另一种实施方式中，参照值是多核苷酸含量非零的情况所特有的。较之参照值，展示出其光学性能以不同速率随时间变化的现象的染料可被选用于本发明所要求保护的方法。光学性能的相对变化速率与特定多核苷酸是否存在或存在的量相关。

E.光刺激

光刺激可被提供给样品、核酸类似物和染料混合物，可与混合物的产生同时提供，或者可在混合物产生后的特定时刻提供。光刺激导致染料光学性能变化速率的变化。

光刺激可以是可见光谱中的，或者是可见光谱以外的。光刺激可以是多种波长的白光。或者，光刺激可以是特定波长的，或是具有波长范围的。光刺激也可以具有特定强度。

光源是本领域已知的。不同的光源会导致不同的反应速率，因为光源的强度或波长不同。光源的例子包括(以反应速率升高的顺序排列)Sylvania Cool White T8-CW、General Electric T8-C50和Fritz Aurora50/50。其它光源包括Sylvania dulux S9W CF9DS/蓝和Osram F9TT/50K，它们都能导致比General Electric T8-C50更快的光刺激反应速率。

本领域技术人员将认识到，针对特定染料、或特定核酸类似物、多核苷酸以及染料混合物，不用进行过多实验，就能确定出最优的光刺激。还可针对特定混合物测试出单独的一套温度和浓度条件。

IV.形成目标多核苷酸/核酸类似物杂交体

可用多种杂交流程来进行对目标多核苷酸的检测分析。在一种形式中，可以通过目标多核苷酸与核酸类似物直接杂交，形成目标多核苷酸/核酸类似物杂交体，来鉴定多核苷酸序列。

在一种形式中，核酸类似物可以是PNA。PNA/PNA的距离(distance)与DNA/DNA距离和PNA/DNA距离有所不同。PNA/PNA与PNA/DNA双链杂交体的具体结构已被NMR和X-射线晶体分析给出。PNA/PNA双链杂交体具有非常宽且深的大沟，以及非常窄且浅的小沟，该双链体具有非常大的每周为18个碱基对的螺距(pitch)以及非常大的螺距高度(57.6)。就DNA/DNA双链杂交体而言，规范的B型螺旋(helix)具有每周为10个碱基对的螺距，螺距高度为34，而PNA/DNA双链杂交体具有每周13个碱基对的螺距，螺距高度为42。因为PNA/DNA双链杂交体的碱基对较之DNA双螺旋具有不同的几何学特性，人们认为，PNA/DNA双链杂交体的堆积(stacking)相互作用的强度与DNA/DNA双链杂交体不同。10、12和16mer的PNA/DNA双链杂交体的CD谱暗示了这些双链杂交体的不同的碱基构型。

染料与核酸类似物/多核苷酸杂交体的结合位点可对反应是否进行产生影响，这取决于染料。例如，与杂交体的大沟或小沟结合的染料可能需要杂交体含有一定量的碱基对，以进行有效结合。碱基对的最小数目可由本领域技术人员很容易地确定。

在一个方面，目标核酸类似物分子与部分互补的核酸类似物互补。核酸类似物同时与核酸类似物分子及目标多核苷酸杂交，如图18A所示。这可在一步或多步过程中完成。在一步过程中，目标多核苷酸和核酸类似物于一个步骤中组合。在多步过程中，目标多核苷酸和核酸类似物依序组合。

在另一个方面，可通过形成分支反应的十字架型结构，来检测目标多核苷酸的存在，其例子如图18B所示。在该形式中，目标多核苷酸与两种中间产物多核苷酸杂交，后二者是与目标多核苷酸部分互补的。中间产物多核苷酸形成带分支的结构，其与目标多核苷酸和最初的核酸类似物分子杂交。可对中间产物多核苷酸的目标杂交区域进行设计，使其短到不能令染料与核酸类似物分子单独结合，但是又要足够长以便能在杂交时结合核酸类似物分子。然后对染料光学变化速率加以测定。在一种实施方式中，单个核酸类似物分子可以是用于所有分析中的通用核酸类似物，已针对染料光学性能有效变化对其进行了最优化。通用核酸类似物可被用于任何目标核酸，中间产物序列可被改动。可将该流程改造为使用被固定的核酸类似物的形式。

在另一种形式中，多种核酸类似物分子在目标多核苷酸的相邻区域形成核酸类似物/多核苷酸杂交体。在该形式中，每种核酸类似物分子都短到不能令染料结合并导致染料光学性能的速率变化，但是多种核酸类似物分子可以提供足够大到能获得光学性能变化速率的区域。如图18C所示，作为单个分子的目标多核苷酸可与三条与相邻序列杂交的单独的核酸类似物分子结合，形成核酸类似物/多核苷酸双链体。但是，如果中心核酸类似物分子不能杂交，如图18D所示，可能就不会观察到光学性能的变化。在这种形式中，核酸类似物分子中的一种可被固定。

V.对目标多核苷酸进行定量

本发明的方法、组合物和分析系统可被用于对样品中目标多核苷酸进行定量。在一种实施方式中，可通过下述方法对目标多核苷酸的含量进行检测：配制核酸类似物分子的一系列稀释液，加入各种含量的目标多核苷酸样品，将样品与已知浓度的对照品进行比较。在另一种实施方式中，可通过如下方法来对目标多核苷酸的含量进行检测：配制目标多核苷酸的一系列稀释液，加入各种含量的核酸类似物分子，将样品与已知浓度的对照品进行比较。

或者，可通过基于时间的动力学分析，来检测目标多核苷酸的含量。对组合起来的混合物中染料的测量可以以规律间隔进行于对混合物的制备之后，或应用光刺激之后。可在混合物组合起来后，或应用光刺激后，于特定时间来对染料进行检测。时间可以是任何的时间段，例如，针对光学性能变化的总的时间，或光学性能已发生了某个百分比的变化所需的时间，该百分比例如但不限于，大约20％。可对反应体系进行冷冻(进一步的变化被停止)，例如，通过加入溶剂来进行，例如，20％甲醇、15％异丙醇、15％ DMSO或10％丁醇。

反应还可以包括一个范围内的缓冲液和溶剂。上述缓冲液和溶剂包括磷酸缓冲液、水、0.1％ SDS、0.1％ Triton X、0.1％ Tween-20、3％丁醇、10％甲醇、10％异丙醇、10％ DMSO、1X血液裂解缓冲液(0.15MNH₄Cl、10mM NaHCO₃、0.1mM EDTA pH7.4)和蔗糖裂解缓冲液(0.32M蔗糖、10mM Tris、1％ Triton-X-100、5mM MgCl₂)。

可在暴露给光刺激后再测定样品中多核苷酸的量。可在暴露给光刺激之前就开始对染料光学性能的变化进行测量，用作为起始光学性能。暴露给光刺激之后，可在特定的时间(例如，取30秒的间隔)来进行测量。可按上文所述对反应体系进行冷冻(进一步的变化被停止)。

可通过多种方法来观察到由于暴露给光刺激所造成的样品变化。光学性能的变化可作为颜色、吸光度、荧光、反射率、化学发光或其组合的变化被观察到。或者，可用读出装置(reader)来读出光学性能的变化。可以用分光光度计，例如Tecan Genios或者Tecan Safire来测量该变化。特定的波长可被观察到，例如，通过滤光器来进行。阳性对照展示出了较阴性试验更快的吸光度变化。其可作为变化速率的差异，或在设定时间处变化的差异被测量到。如果使用光刺激，并观察荧光性能，那么提供给样品的光刺激就比观察到的发射光具有更高的能量(更低的波长)。激发可以在，例如535nm处，发射光可以在590nm处读出。荧光可作为变化速率的差异，或在设定时间处变化的差异被测量到。

此外，混合物可以具有发生于暴露给光刺激之前的变化。该差异可以在分光光度分析系统、荧光发射系统或化学发光系统中被观察到。

VI.分析形式

A.基于液体的分析系统

如实施例1-4所示，用于检测目标多核苷酸的方法和分析系统可以是基于液体的。样品、能以序列特异性方式与多核苷酸的目标核酸序列结合的核酸类似物、存在和不存在核酸类似物/多核苷酸杂交体时期光学性能变化速率会有所不同的染料被组合起来，产生液体溶液中的混合物。将混合物中染料光学性能的变化速率与类似混合物中染料光学性能的变化速率所特有的参照值进行比较，以测定光学术性的相对变化速率，所述类似混合物中含有已知量的核酸类似物/多核苷酸杂交体。混合物中染料光学性能的相对变化速率与样品中特定多核苷酸是否存在或存在的量相关，这样来测定样品中是否存在多核苷酸或存在的量。

本发明的方法和分析系统还可被制备于任何容器中，例如微离心管、试管和通过表面张力装有液体的芯片。本发明的方法和分析系统还可被制备于多孔板中。所述的板可以含有任何数量的孔。在一种形式中，使用96孔板。在另一种形式中，使用384孔板。当分析实验以微孔形式进行时，液体保留于微滴定板的每个孔中。

B.基于固体支持物的分析系统

本发明的方法和分析系统可以是基于固体的(例如，一种或多种组分被固定于固体支持物上)。最为常见地，核酸类似物或目标多核苷酸被固定。可以在其上连接核酸类似物或目标多核苷酸的固体支持物有很多种类型，其包括但不限于：铸膜(cast membranes)(硝酸纤维素、尼龙)、陶瓷制品、痕迹刻蚀膜(TEM)、聚偏二氟乙烯、胶乳、顺磁性珠粒、所有类型的塑料支持物、玻璃；支持物基质上的粉状硅土或矾土。如果使用栅格模式，核酸类似物分子/固体支持物就形成了微阵列。在另一种变化中，可对核酸类似物或目标多核苷酸分子进行共价修饰，以使其包括连接部分，例如生物素或酰胺键，其被固定到膜上。在又一种变化中，可通过与一条或多条序列进行序列特异性杂交来固定核酸类似物或目标多核苷酸分子。

图17示出了对核酸类似物进行的光刺激激活的、表面固定的检测的示意图。A)链亲合素孔。B)将生物素化的核酸类似物加入到孔中，并允许其连接到支持物上。C)对该孔进行洗涤，移去过量的核酸类似物。D)加入样品多核苷酸，特定序列目标连接到互补的核酸类似物上。E)洗去非特异性多核苷酸和过量的多核苷酸。F)加入染料，暴露给光刺激。

将核酸类似物分子连接到支持物上的任何手段都被包括于本发明中。在一个方面，核酸类似物可以直接连接到膜上。核酸类似物可以是PNA(例如，A Giger，Lester A，Kleiber J，and Orum H，1998，PNA arraytechnology in molecular diagnostics.Nucleotides and Nucleoside，17(1717-1724))。可简单地将核酸类似物的(水)溶液施加到带电荷或经化学修饰的过滤器，并对其进行空气干燥。然后将过滤器用于杂交。

在另一个方面，经过生物素标记的核酸类似物分子可被连接到涂有链亲合素的表面上，例如珠粒或孔(见，例如，Chandler，D.P.，Stults，J.R.，Anderson，K.K.，Cebula，S.，Schuck，B.L.，and Brockman，F.J.2000.AffinityCapture and Recovery of DNA at Femtomolar Concentrations with PeptideNucleic Acid Probes.Analytical Biochem.283：241-249)。经过生物素标记的核酸类似物分子与经过链亲合素标记的胶乳或聚碳酸酯珠粒混合。生物素与链亲合素紧密结合，使得核酸类似物分子可以以非定向的方式与珠粒结合。然后将珠粒施加到不带电荷的膜上，所述的膜具有比珠粒直径大25-30％的孔径。珠粒被捕获于网孔中，因此制得了“结合有核酸类似物分子的”局部区域。用标准的9-芴甲氧羰基(Fmoc)蛋白质合成化学方法，可在固体支持物上，例如聚丙烯膜上，对核酸类似物分子进行直接合成(见，例如，Matysiak S.，Reuthner F.，and Hoheisel JD.2001 Automatingparallel peptide synthesis for the production of nucleic acid analog library arrays，BioTechniques 31：896-904)。

在另一个方面，通过将含有核酸类似物分子的水溶液直接施加到玻璃或其它支持物上并使其经历空气干燥，可将核酸类似物分子固定到玻璃或其它固体支持物上。

在一种变化中，核酸类似物分子被设计为能产生正电荷，其可以与带有负电荷的膜连接。例如，在核酸类似物分子的5’或3’末端的带正电荷的赖氨酸或甘氨酸可被用于将核酸类似物分子连接到带负电荷的尼龙膜上。带负电荷的膜会抵制与核酸类似物不互补和/或不精确互补的任何核酸，因此使得非特异性结合最小化。

可以通过基于固体支持物的系统来检测任何目标多核苷酸，或目标多核苷酸的组。在这种情况下，固体支持物含有多种核酸类似物分子，其被固定于固体支持物上。固体支持物上还可以包括对照核酸类似物，其不能形成核酸类似物/多核苷酸杂交体分子，不能杂交。

基于固体支持物的分析系统可被用于检测至少一种目标多核苷酸。在其它的变化中，基于固体支持物的分析系统检测或测量至少大约8种、至少大约10种、至少大约20种、至少大约30种、至少大约40种、至少大约50种或至少大约60种不同的目标多核苷酸的表达。在另一种变化中，基于固体支持物的系统检测及区分60或更多种的目标多核苷酸。

非限制性地举例而言，图3中示出了使用膜作为固体支持物的基于固体支持物的分析系统。该分析用于检测目标多核苷酸的存在。该系统允许在数分钟内对小量特定目标多核苷酸进行鉴定和/或定量，并给出可见信号(例如，粉红色变澄清的速率)，而无需大量设备即可进行。在非常迅速的样品裂解、杂交和引入染料后，提供光刺激，观察膜上带颜色图案的变化速率。膜上带颜色条带的图案的变化速率使得使用者易于确定目标多核苷酸的存在与否及对其进行鉴定。可选地，可在装有小电池的手持式仪器中来进行该方法或其变化。在自动机器人系统中，所有步骤都可由机器完成，无需人力介入。

基于固体支持物的分析系统可以处于微滴定板的装置中。本领域已知的任何微滴定板都可使用。在此类分析系统中，分析系统的组件可以用于保留液体。在一种形式中，使用96孔板。在另一种形式中，使用384孔板。当分析是微滴定板的形式时，所有组分(除了与固体表面结合的那些)以液体形式保留于微滴定板的每个孔中。

VII.目标多核苷酸和目标多核苷酸的来源

目标多核苷酸可以是任何多核苷酸，包括天然存在的、合成的或扩增出的。其它类型的多核苷酸可以是单链的或双链的。目标多核苷酸的非限制性例子包括DNA、RNA、调控RNA、mRNA、调控小分子RNA、siRNA、人工RNA和嵌合RNA。目标多核苷酸的其它非限制性例子包括表观基因组DNA、表观遗传化DNA、体外扩增出的DNA或嵌合DNA。目标多核苷酸可以含有SNPs，可通过本文公开的方法对其进行鉴定和定量。

本文描述的方法、系统和分析具有多种用途。这些用途的非限制性例子包括：对生物、病原体(例如食物来源的病原体、环境病原体、水传播的病原体或农业恐怖攻击中包含的病原体)进行检测和定量。其它非限制性的用途包括：疾病诊断(例如对性传播疾病的诊断)、对带来抗生物抗性的基因进行检测、对有效药物应答中涉及到的基因进行检测、对经遗传修饰的生物进行检测以及对非本地植物或动物进行检测。另外的非限制性的应用包括农业应用和兽医应用。

下面描述的例子用于阐述而非用于限制。

A.病原体

在一个方面，本发明涉及用于检测病原体是否存在和/或宿主是否被病原体感染的方法、组合物和分析系统。通常，通过对样品中目标多核苷酸进行分析来检测病原体是否存在和/或宿主中是否存在病原体。更具体地，本发明涉及用于分析目标多核苷酸的方法、物质组合物和分析系统，其是通过与核酸类似物分子进行序列特异性杂交以及加入染料形成混合物来实现的。然后对染料光学性能的变化速率进行观察，以检测目标多核苷酸是否存在或存在的量。

可通过本发明的方法和分析系统检测到的病原体或宿主中存在的病原体的例子包括但不限于：Staphylococcus epidermidis、Escherichia coli、具有甲氧苯青霉素抗性的Staphylococcus aureus(MSRA)、Staphylococcusaureus、Staphylococcus hominis、Enterococcus faecalis、Pseudomonasaeruginosa、Staphylococcus capitis、Staphylococcus warneri、Klebsiellapneumoniae、Haemophilus influnzae、Staphylococcus simulans、Streptococcus pneumoniae和Candida albicans。

另外的例子包括但不限于：Bacillus anthracis(炭疽病)、Clostridiumbotulinum(肉毒杆菌中毒)、Brucellae(普鲁氏菌病)、Vibrio cholera(霍乱)、Clostridium perfringens(气性坏疽、梭菌性肌炎、坏死性肠炎)、Ebola病毒(埃博拉出血热)、Yersinia pesits(瘟疫)、Coxiellaburnetii(Q热)和天花病毒(天花)。在一种优选的变化中，对由Bacillus anthracis造成的感染进行检测。

针对Bacillus anthracis的宿主应答多核苷酸的例子包括但不限于：Mock M，Mignot T.Anthrax toxins and the host：a story of intimacy.CellMicrobiol.2003 Jan；5(1)：15-23.和Reed DS，Smoll J，Gibbs P，Little SF.Related Articles，Links Mapping of antibody responses to the protective antigenof Bacillus anthracis by flow cytometric analysis.Cytometry.2002 Sep 1；49(1)：1-7公开的那些，或者很容易由本领域已知的方法获得的那些。

可基于其目标多核苷酸，将病原体与其它病原体区分开来。特定的病原体具有特定的目标多核苷酸，这是不会在其它病原体中发现的。核酸类似物分子被设计为：与用于鉴定特定病原体的一种或多种目标多核苷酸互补或精确互补。当与病原体的目标多核苷酸接触时，核酸类似物分子会与含有目标多核苷酸的多核苷酸杂交，而不会与不含目标多核苷酸的多核苷酸杂交。因此可将含有目标多核苷酸的特定病原体与不含目标多核苷酸的病原体区分开。

此外，可以区分开相同病原体的不同株系。相同病原体的不同株系具有不同的多核苷酸序列。通常，这种差异小到只涉及单个的核苷酸。核酸类似物分子被设计为：与用于鉴定病原体特定株系的一种或多种目标多核苷酸互补或精确互补。当与病原体的目标多核苷酸接触时，核酸类似物分子会与含有目标多核苷酸的多核苷酸杂交，而不会与不含目标多核苷酸的多核苷酸杂交。当目标多核苷酸是特异于特定病原体株系的时候，核酸类似物分子会与该病原体株系含有的目标多核苷酸杂交，而不会与不同株系的目标多核苷酸杂交。

下面列出了具有临床重要性的病原体的例子，以及用于基于PCR的检测的对照的例子。核酸类似物分子可被设计为具有特定病原体PCR引物序列的序列，并可与本文所述的本发明的多种实施方式组合使用。

在一种实施方式中，病原体可以是Staphylococcus epidermidis。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Staphylococcus epidermidis的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Francois，P.，D.Pittet，M.Bento，B.Pepey，P.Vaudaux，D.Lew，and J.Schrenzel.2003.Rapid Detection of Methicillin-ResistantStaphylococcus aureus Directly from Sterile or Nonsterile Clinical Samples by aNew Molecular Assay.J Clin Microbiol 41(1)：254-60.，Fitzpatrick，F.，H.Humphreys，E.Smyth，C.A.Kennedy，and J.P.O′Gara.2002.Environmentalregulation of biofilm formation in intensive care unit isolates of Staphylococcusepidermidis.J Hosp Infect 52(3)：212-8.和Yugueros，J.，A.Temprano，B.Berzal，M.Sanchez，C.Hernanz，J.M.Luengo，and G.Naharro.2000.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-encoding gene as a usefultaxonomic tool for Staphylococcus spp.J Clin Microbiol 38(12)：4351-5)。

病原体可以是Escherichia coli。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Escherichia coli的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Heller，L.C.，C.R.Davis，K.K.Peak，D.Wingfield，A.C.Cannons，P.T.Amuso，and J.Cattani.2003.Comparison of Methods for DNA Isolation from Food Samples forDetection of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli by Real-Time PCR.ApplEnviron Microbiol 69(3)：1844-6.，Rahman，H.2002.Multiplex PCR fordetection of stx genes of Escherichia coli.Indian J Med Res 115：251-4.和Frahm，E.，and U.Obst.2003.Application of the fluorogenic probe technique(TaqMan PCR)to the detection of Enterococcus spp.and Escherichia coli inwater samples.J Microbiol Methods 52(1)：123-31)。

病原体可以是具有甲氧苯青霉素抗性的Staphylococcus aureus(MSRA)。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Staphylococcus aureus(MSRA)的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如(van Leeuwen，W.B.，C.van Pelt，A.Luijendijk，H.A.Verbrugh，and W.H.Goessens.1999.Rapid detection ofmethicillin resistance in Staphylococcus aureus isolates by the MRSA-screenlatex agglutination test.J Clin Microbiol 37(9)：3029-30.，Francois，P.，D.Pittet，M.Bento，B.Pepey，P.Vaudaux，D.Lew，and J.Schrenzel.2003.RapidDetection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Directly from Sterileor Nonsterile Clinical Samples by a New Molecular Assay.J Clin Microbiol 41(1)：254-60和Tsuruoka，M.，and I.Karube.2003.Rapid hybridization at highsalt concentration and detection of bacterial DNA using fluorescencepolarization.Comb Chem High Throughput Screen 6(3)：225-34)。

病原体可以是Candida。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Candida的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如(Ahmad，S.，Z.Khan，A.S.Mustafa，and Z.U.Khan.2002.Seminested PCR for diagnosis of candidemia：comparison withculture，antigen detection，and biochemical methods for species identification.JClin Microbiol 40(7)：2483-9和Tirodker，U.H.，J.P.Nataro，S.Smith，L.LasCasas，and K.D.Fairchild.2003.Detection of fungemia by polymerasechain reaction in critically ill neonates and children.J Perinatol 23(2)：117-22)。

病原体可以是Candida albicans。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Candida albicans的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如White，P.L.，A.Shetty，and R.A.Barnes.2003.Detection of seven Candida species using the Light-Cycler system.J Med Microbiol 52(Pt 3)：229-38.，Grijalva，M.，R.Horvath，M.Dendis，J.Erny，and J.Benedik.2003.Molecular diagnosis of culture negativeinfective endocarditis：clinical validation in a group of surgically treated patients.Heart 89(3)：263-8.和Willinger，B.，A.Obradovic，B.Selitsch，J.Beck-Mannagetta，W.Buzina，H.Braun，P.Apfalter，A.M.Hirschl，A.Makristathis，and M.Rotter.2003.Detection and identification of fungi from fungus balls ofthe maxillary sinus by molecular techniques.J Clin Microbiol 41(2)：581-5.)。

病原体可以是Staphylococcus aureus。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Staphylococcus aureus的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Francois，P.，D.Pittet，M.Bento，B.Pepey，P.Vaudaux，D.Lew，and J.Schrenzel.2003.Rapid Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Directly fromSterile or Nonsterile Clinical Samples by a New Molecular Assay.J ClinMicrobiol 41(1)：254-60.，Palomares，C.，M.J.Torres，A.Torres，J.Aznar，andJ.C.Palomares.2003.Rapid detection and identification of Staphylococcusaureus from blood culture specimens using real-time fluorescence PCR.DiagnMicrobiol Infect Dis 45(3)：183-9.和Xu，J.，B.C.Millar，J.E.Moore，K.Murphy，H.Webb，A.J.Fox，M.Cafferkey，and M.J.Crowe.2003.Employment of broad-range 16S rRNA PCR to detect aetiological agents ofinfection from clinical specimens in patients with acute meningitis--rapidseparation of 16S rRNA PCR amplicons without the need for cloning.J ApplMicrobiol 94(2)：197-206.)。

病原体可以是Staphylococcus hominis。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Staphylococcus hominis的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Marsou，R.，M.Bes，Y.Brun，M.Boudouma，L.Idrissi，H.Meugnier，J.Freney，and J.Etienne.2001.Molecular techniques open up new vistas for typing ofcoagulase-negative staphylococci.Pathol Biol(Paris)49(3)：205-15.，Yugueros，J.，A.Temprano，B.Berzal，M.Sanchez，C.Hernanz，J.M.Luengo，and G.Naharro.2000.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-encoding gene as auseful taxonomic tool for Staphylococcus spp.J Clin Microbiol 38(12)：4351-5.和Wieser，M.，and H.J.Busse.2000.Rapid identification of Staphylococcusepidermidis.Int J Syst Evol Microbiol 50 Pt 3：1087-93.)。

病原体可以是Enterococcus faecalis。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Enterococcus faecalis的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Hudson，C.R.，P.J.Fedorka-Cray，M.C.Jackson-Hall，and L.M.Hiott.2003.Anomalies inspecies identification of enterococci from veterinary sources using a commercialbiochemical identification system.Lett Appl Microbiol 36(4)：245-50.，Donabedian，S.M.，L.A.Thal，E.Hershberger，M.B.Perri，J.W.Chow，P.Bartlett，R.Jones，K.Joyce，S.Rossiter，K.Gay，J.Johnson，C.Mackinson，E.Debess，J.Madden，F.Angulo，and M.J.Zervos.2003.Molecularcharacterization of gentamicin-resistant Enterococci in the United States：evidence of spread from animals to humans through food.J Clin Microbiol 41(3)：1109-13.和Gauduchon，V.，L.Chalabreysse，J.Etienne，M.Celard，Y.Benito，H.Lepidi，F.Thivolet-Bejui，and F.Vandenesch.2003.Moleculardiagnosis of infective endocarditis by PCR amplification and direct sequencingof DNA from valve tissue.J Clin Microbiol 41(2)：763-6.)。

病原体可以是Pseudomonas aeriginosa。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Pseudomonas aeriginosa的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Corbella，M.E.，and A.Puyet.2003.Real-Time Reverse Transcription-PCR Analysis ofExpression of Halobenzoate and Salicylate Catabolism-Associated Operons inTwo Strains of Pseudomonas aeruginosa.Appl Environ Microbiol 69(4)：2269-75.，Agarwal，G.，A.Kapil，S.K.Kabra，R.Chandra，B.Das，and S.N.Diwedi.2002.Phenotypic & genotypic variants of Pseudomonas aeruginosa isolatedfrom children with cystic fibrosis in India.Indian J Med Res 116：73-81.和Dabrowski，W.，U.Czekajlo-Kolodziej，D.Medrala，and S.Giedrys-Kalemba.2003.Optimisation of AP-PCR fingerprinting discriminatory power for clinicalisolates of Pseudomonas aeruginosa.FEMS Microbiol Lett 218(1)：51-7.)。

病原体可以是Staphylococcus capitis。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Staphylococcus capitis的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Wieser，M.，and H.J.Busse.2000.Rapid identification of Staphylococcus epidermidis.Int JSyst Evol Microbiol 50 Pt 3：1087-93.和Martineau，F.，F.J.Picard，P.H.Roy，M.Ouellette，and M.G.Bergeron.1996.Species-specific and ubiquitous DNA-based assays for rapid identification of Staphylococcus epidermidis.J ClinMicrobiol 34(12)：2888-93.)。

病原体可以是Staphylococcus warneri。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Staphylococcus warneri的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Wieser，M.，and H.J.Busse.2000.Rapid identification of Staphylococcus epidermidis.Int JSyst Evol Microbiol 50 Pt 3：1087-93.和Sashihara，T.，H.Kimura，T.Higuchi，A.Adachi，H.Matsusalci，K.Sonomoto，and A.Ishizalci.2000.A novelantibiotic，nukacin ISK-1，of Staphylococcus warneri ISK-1：cloning of thestructural gene and identification of the structure.Biosci Biotechnol Biochem 64(11)：2420-8.)。

病原体可以是Klebsiella pneumoniae。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Klebsiella pneumoniae的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Perez-Perez，F.J.，and N.D.Hanson.2002.Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR.J Clin Microbiol 40(6)：2153-62，Steward，C.D.，J.K.Rasheed，S.K.Hubert，J.W.Biddle，P.M.Raney，G.J.Anderson，P.P.Williams，K.L.Brittain，A.Oliver，J.E.McGowan，Jr.，and F.C.Tenover.2001.Characterization of clinical isolates of Klebsiellapneumoniae from 19  laboratories using the National Committee for ClinicalLaboratory Standards extended-spectrum beta-lactamase detection methods.JClin Microbiol 39(8)：2864-72.和Carter，J.S.，and D.J.Kemp.2000.Acolorimetric detection system for Calymmatobacterium granulomatis.SexTransm Infect 76(2)：134-6.)。

病原体可以是Haemophilus influnzae。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Haemophilus influnzae的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Shoma，S.，M.Rahman，and M.Yasmin.2001.Rapid detection of Haemophilus influenzae typeb in Bangladeshi children with pneumonia and meningitis by PCR and analysisof antimicrobial resistance.J Health Popul Nutr 19(4)：268-74.，Corless，C.E.，M.Guiver，R.Borrow，V.Edwards-Jones，A.J.Fox，and E.B.Kaczmarslci.2001.Simultaneous detection of Neisseria meningitidis，Haemophilusinfluenzae，and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis andsepticemia using real-time PCR.J Clin Microbiol 39(4)：1553-8.和Carter，J.S.，and D.J.Kemp.2000.A colorimetric detection system for Calymmatobacteriumgranulomatis.Sex Transm Infect 76(2)：134-6.)。

病原体可以是Staphylococcus simulans。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Staphylococcus simulans的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Yugueros，J.，A.Temprano，B.Berzal，M.Sanchez，C.Hernanz，J.M.Luengo，and G.Naharro.2000.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-encoding gene as auseful taxonomic tool for Staphylococcus spp.J Clin Microbiol 38(12)：4351-5和Szweda，P.，R.Pladzylc，R.Kotlowslci，and J.Kur.2001.Cloning，expression，and purification of the Staphylococcus simulans lysostaphin usingthe intein-chitin-binding domain(CBD)system.Protein Expr Purif 22(3)：467-71.)。

病原体可以是Streptococcus pneumoniae。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定Streptococcus pneumoniae的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如xu，J.，B.C.Millar，J.E.Moore，K.Murphy，H.Webb，A.J.Fox，M.Cafferkey，and M.J.Crowe.2003.Employment of broad-range 16S rRNA PCR to detectaetiological agents of infection from clinical specimens in patients with acutemeningitis--rapid separation of 16S rRNA PCR amplicons without the need forcloning.J Appl Microbiol 94(2)：197-206.，Greiner，O.，P.J.Day，P.P.Bosshard，F.Imeri，M.Altwegg，and D.Nadal.2001.Quantitative detection ofStreptococcus pneumoniae in nasopharyngeal secretions by real-time PCR.JClin Microbiol 39(9)：3129-34.和Corless，C.E.，M.Guiver，R.Borrow，V.Edwards-Jones，A.J.Fox，and E.B.Kaczmarski.2001.Simultaneous detectionof Neisseria meningitidis，Haemophilus influenzae，and Streptococcuspneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-timePCR.J Clin Microbiol 39(4)：1553-8.)。

病原体可以是冠状病毒(一种RNA病毒)，用于检测SARS。冠状病毒的序列可被发现于，例如Center for Disease Control网站上。这些目标多核苷酸的例子被公开于现有技术中。(见，例如Ksiazek，T.G.，D.Erdman，C.S.Goldsmith，S.R.Zaki，T.Peret，S.Emery，S.Tong，C.Urbani，J.A.Comer，W.Lim，P.E.Rollin，S.F.Dowell，A.E.Ling，C.D.Humphrey，W.J.Shieh，J.Garner，C.D.Paddock，P.Rota，B.Fields，J.DeRisi，J.Y.Yang，N.Cox，J.M.Hughes，J.W.LeDuc，W.J.Bellini，and L.J.Anderson.2003.A NovelCoronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome.N Engl JMed 16：16；Drosten，C.，S.Gunther，W.Preiser，S.Van Der Werf，H.R.Brodt，S.Becker，H.Rabenau，M.Panning，L.Kolesnikova，R.A.Fouchier，A.Berger，A.M.Burguiere，J.Cinatl，M.Eickmann，N.Escriou，K.Grywna，S.Kramme，J.C.Manuguerra，S.Muller，V.Rickerts，M.Sturmer，S.Vieth，H.D.Klenk，A.D.Osterhaus，H.Schmitz，and H.W.Doerr.2003.Identification of a NovelCoronavirus in Patients with Severe Acute Respiratory Syndrome.N Engl J Med10：10)。

病原体可以是Bordetella pertussis或百日咳(whopping cough)。这些目标多核苷酸的例子被公开于现有技术中(Doucet-Populaire，F.，N.Bourgeois，0.Charara，M.Bellaiche，F.Richardin，J.L.Salomon，L.Berardi-Grassias，J.C.Ghnassia，and P.Foucaud.2002.[Routine use of geneamplification for pertussis diagnosis in children].Arch Pediatr 9(11)：1145-52；Lingappa，J.R.，W.Lawrence，S.West-Keefe，R.Gautom，and B.T.Cookson.2002.Diagnosis of community-acquired pertussis infection：comparison of bothculture and fluorescent-antibody assays with PCR detection usingelectrophoresis or dot blot hybridization.J Clin Microbiol 40(8)：2908-12)。

病原体可以是Phytophthora ramorum(栎树猝死病的成因)。这些目标多核苷酸的例子被公开于现有技术中(见，例如Levy，L.，and V.Mavrodieva.2003.Evaluation of the PCR Detection and DNA isolationmethods for use in the Phytophthora ramorum.National Pilot Survey，vol.2003，可从the Purdue University网站获得；McPherson，B.A.，D.M.Rizzo，M.Garbelotto，P.Svihra，D.L.Wood，A.J.Storer，N.M.Kelly，N.Palkovsky，S.A.Tjosvold，R.B.Standiford，and S.T.Koike.2002.Sudden Oak Death inCalifornia，vol.2003.Home & Landscape，可从the University of California atDavis网站获得)。

病原体可以是诺沃克(norwalk)病毒。这些目标多核苷酸的例子被公开于现有技术中(见，例如Khan，A.S.，C.L.Moe，R.I.Glass，S.S.Monroe，M.K.Estes，L.E.Chapman，X.Jiang，C.Humphrey，E.Pon，J.K.Iskander，andet al.1994.Norwalk virus-associated gastroenteritis traced to ice consumptionaboard a cruise ship in Hawaii：comparison and application of molecularmethod-based assays.J Clin Microbiol 32(2)：318-22；Herwaldt，B.L.，J.F.Lew，C.L.Moe，D.C.Lewis，C.D.Humphrey，S.S.Monroe，E.W.Pon，and R.I.Glass.1994.Characterization of a variant strain of Norwalk virus from a food-borne outbreak of gastroenteritis on a cruise ship in Hawaii.J Clin Microbiol 32(4)：861-6)。

病原体可以是HIV。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定HIV的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Smith，K.M.，K.A.Crandall，M.L.Kneissl，and B.A.Navia.2000.PCR detection of host and HIV-1 sequences from archival braintissue.J Neurovirol 6(2)：164-71；Cuchacovich，R.，S.Quinet，and A.M.Santos.2003.Applications of polymerase chain reaction in rheumatology.Rheum DisClin North Am 29(1)：1-20，v；Cunningham，P.，D.Marriott，C.Harris，S.Hancock，A.Carr，and D.Cooper.2003.False negative HIV-1 proviral DNApolymerase chain reaction in a patient with primary infection acquired inThailand.J Clin Virol 26(2)：163-9)。

病原体可以是Mycobacterium tuberculosis。核酸类似物可被设计为：具有与用于鉴定tuberculosis的PCR引物相似或相同的序列或序列片段。这些PCR引物的例子被公开于现有技术中。(见，例如Torres，M.J.，A.Criado，M.Ruiz，A.C.Llanos，J.C.Palomares，and J.Aznar.2003.Improvedreal-time PCR for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance inMycobacterium tuberculosis clinical isolates.Diagn Microbiol Infect Dis 45(3)：207-12；Bhattacharya，B.，K.Karak，A.G.Ghosal，A.Roy，S.Das，P.Dandapat，D.Khetawat，D.K.Mondal，S.Bhattacharya，and S.Chakrabarti.2003.Development of a new sensitive and efficient multiplex polymerase chainreaction(PCR)for identification and differentiation of different mycobacterialspecies.Trop Med Int Health 8(2)：150-7；Kafwabulula，M.，K.Ahmed，T.Nagatake，J.Gotoh，S.Mitarai，K.Oizumi，and A.Zumla.2002.Evaluation ofPCR-based methods for the diagnosis of tuberculosis by identification ofmycobacterial DNA in urine samples.Int J Tuberc Lung Dis 6(8)：732-7)。

在另一种实施方式中，核酸类似物被设计为：能与病原体整个组所共有的目标多核苷酸结合。例如，可将核酸类似物设计为用于检测细菌(BP6)、革兰氏阳性细菌(BP19)、革兰氏阴性细菌(BP3)和真菌(FP8)。用于BP6、BP19、BP3和FP8的核酸类似物的序列的例子如下所示。

BP6   oI2018     5′gaaSSMYcYaacacYtagcact(SEQ ID No：3)

      oI2019     5′tacaaMgagYYgcWagacSgYgaS(SEQ ID NO：4)

BP19  oI2021     5′gcagYWaacgcattaagcact(SEQ ID NO：5)

      oI2022     5′acgacacgagctgacgacaa(SEQ ID NO：6)

BP3   oI2003     5′tctagctggtctgagaggatgac(SEQ ID NO：7)

      oI2004     5′gagttagccggtgcttcttct(SEQ ID NO：8)

FP8   O12055     5′cctgcggcttaatttgactca(SEQ ID NO：9)

      O12057     5′tagcgacgggcggtgtgta(SEQ ID NO：10)

核酸类似物可被用于临床应用，用于诊断败血症的微生物成因，或者用于其它应用，其中，产品的微生物含量对于判断其保质期或稳定性很重要，或者是用于要对其灭菌情况进行评判的其它产品。

目标多核苷酸可以是特异于核糖体RNA序列的，例如E.coli中的16SRNA。核糖体RNA含有对其生物来说所特有的特定序列。通过使用与核糖体RNA序列特有的目标多核苷酸互补或精确互补的核酸类似物序列，可基于其核糖体RNA序列鉴定出病原体。不同病原体或病原体株系所特有的核糖体RNA序列可被发现于，例如(Dinshaw J.Patel，Asif K.Suri，Feng Jiang，Licong Jiang，Pei FanR.Ajay Kumar and Sylvie Nonin，Structure，Recognition and Adaptive Binding in RNA Aptamer Complexes J.Mol.Biol.(1997)272，645-664)。

B.宿主应答多核苷酸

目标多核苷酸还可以是宿主应答多核苷酸。宿主被病原体感染后，宿主基因可能会应答于病原体，表达发生差异，从而产生一种mRNA表达模式(基因表达图，gene expression profile)。其表达模式与特定病原体感染相关的宿主基因被称为针对该诱因的“诊断标志基因”。典型地，mRNA从样品中的白细胞获得。对宿主应答和被改变的基因表达图进行鉴定的方法可被发现于，例如，1)Das，R.，Mendis，C.，Yan，Z.，Neill，R.，Boyle，T.，and Jett，M.(1998)Alterations in gene expression show unique patterns inresponse to agents.在Proceeings of the 21st Army Science Conference，F-P9和Mendis，C.，Das，R.，Yang，D.，and Jett，M.(1998)Identification of alterations ingene expression in response to Staphylococcal enterotoxin B(SEB)usingdifferential display(DD).在the ASCB 38th Annual Meeting，San Francisco，CA。

用于检测基因表达状况的方法已被发展，用于诊断多种医学条件，例如，如Eberwine et al.的U.S.5,723,290、Friend et al.的U.S.6,218,122、Yarramilli et al.的WO 99/10536和Prashar et al.的WO 99/57130所述。简言之，该方法涉及：获得与选定条件相关的选定的细胞中的mRNA表达水平，将其与用构建的对照获得的相关水平进行比较。然后基于对mRNA表达水平的比较来进行诊断。可通过本领域公知的若干技术中的任何一种，从细胞中分离出mRNA，但是通常是，对细胞进行裂解，然后富集或纯化出RNA。然后通过本领域已知的任何方法来获知基因表达图，这些方法包括但不限于由Prashar et al.在WO 97/05286；Liang et al.在Science 257：967-971(1992)；Ivanova et al.在Nucleic Acids Res.23：2954-2959(1995)和Prashar et al.在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：659-663(1996)所公开的方法。典型地，上述技术使用northern分析、FRET检测、寡核苷酸阵列杂交、cDNA阵列杂交、cDNA测序、cDNA指纹等来获知基因表达图。通常，基因表达图指各种mRNA表达的示意图，例如，可发现于对被标记的cDNA片段进行的自动放射照相中的，所述cDNA片段产生自细胞总mRNA，其是通过平板凝胶(slab gel)电泳、毛细管凝胶电泳、HPLC以及其它分离方法，基于大小尺寸分离出来的。

本发明的分析系统和方法提供了另一种对mRNA表达进行判断的方法。如下文进一步所述，对mRNA表达的水平(即基因表达图)进行比较，或者，通过对宿主应答mRNA与其互补或精确互补核酸类似物杂交情况的判断，来检测诊断标志基因的mRNA表达变化。

C.食物来源的病原体和环境病原体

本发明可用于检测任何食物来源的病原体和环境病原体。食物来源的病原体包括但不限于：Listeria、Campylobacter、E.coli和Salmonella。用本文公开的核酸类似物方法可以很容易地对食物来源的特定病原体进行检测。例如，可以容易地将Listeria与Salmonella分开。此外，可对食物来源的病原体的特定株系，例如L.monocytogenes的特定株系，进行检测。

通过本发明的方法，可对与食物来源的病原体相关的任何目标多核苷酸进行鉴定。如上所述，可对特定病原体和病原体株系所特有的目标多核苷酸进行鉴定。本发明可用于检测与Listeria、Campylobacter、E.coli和Salmonella相关的目标多核苷酸。例如，可用本文公开的方法来检测的特定Listeria基因包括：hly(李斯特溶素O，listeriolysin O)和iap(侵入相关蛋白)基因和mRNA(分别为HLYPNA和IAPPNA)。

可用本发明的方法，对具有与Salmonella spp相应的多核苷酸序列的目标多核苷酸进行检测。特异于Salmonella spp的序列是本领域已知的(见，例如Perez-Perez，F.J.，and N.D.Hanson.2002.Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplexPCR.J Clin Microbiol 40(6)：2153-62.，Oliveira，S.D.，C.R.Rodenbusch，M.C.Ce，S.L.Rocha，and C.W.Canal.2003.Evaluation of selective and non-selective enrichment PCR procedures for Salmonella detection.Lett ApplMicrobiol 36(4)：217-21.和Strapp，C.M.，A.E.Shearer，and R.D.Joerger.2003.Survey of retail alfalfa sprouts and mushrooms for the presence ofEscherichia coil O157：H7，Salmonella，and Listeria with BAX，and evaluationof this polymerase chain reaction-based system with experimentallycontaminated samples.J Food Prot 66(2)：182-7.)。

在另一种实施方式中，可对具有与Escherichia coli相应的多核苷酸序列的目标多核苷酸进行检测。特异于Escherichia coli的序列是本领域已知的(见，例如Heller，L.C.，C.R.Davis，K.K.Peak，D.Wingfield，A.C.Cannons，P.T.Amuso，and J.Cattani.2003.Comparison of Methods for DNAIsolation from Food Samples for Detection of Shiga Toxin-ProducingEscherichia coli by Real-Time PCR.Appl Environ Microbiol 69(3)：1844-6.，Rahman，H.2002.Multiplex PCR for detection of stx genes of Escherichia coli.Indian J Med Res 115：251-4.和Frahm，E.，and U.Obst.2003.Application ofthe fluorogenic probe technique(TaqMan PCR)to the detection of Enterococcusspp.and Escherichia coli in water samples.J Microbiol Methods 52(1)：123-31.)。

在另一种实施方式中，可对具有与Campylobacter spp.相应的多核苷酸序列的目标多核苷酸进行检测。特异于Campylobacter spp.的序列是本领域已知的(见，例如Carter，J.S.，and D.J.Kemp.2000.A colorimetricdetection system for Calymmatobacterium granulomatis.Sex Transm Infect 76(2)：134-6.，Moreno，Y.，S.Botella，J.L.Alonso，M.A.Ferrus，M.Hernandez，and J.Hernandez.2003.Specific detection of Arcobacter and Campylobacterstrains in water and sewage by PCR and fluorescent in situ hybridization.ApplEnviron Microbiol 69(2)：1181-6.和Bang，D.D.，A.Wedderkopp，K.Pedersen，and M.Madsen.2002.Rapid PCR using nested primers of the 16S rRNA andthe hippuricase(hip O)genes to detect Campylobacter jejuni and Campylobactercoli in environmental samples.Mol Cell Probes 16(5)：359-69.)。

在又一种实施方式中，可对具有与Bacillus spp.相应的多核苷酸序列的目标多核苷酸进行检测。特异于Bacillus spp.的序列是本领域已知的(见，例如Mantynen，V.，and K.Lindstrom.1998.A rapid PCR-based DNAtest for enterotoxic Bacillus cereus.Appl Environ Microbiol 64(5)：1634-9.，Schraft，H.，and M.W.Griffiths.1995.Specific oligonucleotide primers fordetection of lecithinase-positive Bacillus spp.by PCR.Appl Environ Microbiol61(1)：98-102.和Ley，B.E.，C.J.Linton，D.M.Bennett，H.Jalal，A.B.Foot，and M.R.Millar.1998.Detection of bacteraemia in patients with fever andneutropenia using l6S rRNA gene amplification by polymerase chain reaction.Eur J Clin Microbiol Infect Dis 17(4)：247-53)。

还可对具有与Pseudomonas spp.相应的多核苷酸序列的目标多核苷酸进行检测。特异于Pseudomonas spp.的序列是本领域已知的(见，例如Xu，J.，B.C.Millar，J.E.Moore，K.Murphy，H.Webb，A.J.Fox，M.Cafferkey，andM.J.Crowe.2003.Employment of broad-range 16S rRNA PCR to detectaetiological agents of infection from clinical specimens in patients with acutemeningitis--rapid separation of 16S rRNA PCR amplicons without the need forcloning.J Appl Microbiol 94(2)：197-206，Ley，B.E.，C.J.Linton，D.M.Bennett，H.Jalal，A.B.Foot，and M.R.Millar.1998.Detection of bacteraemiain patients with fever and neutropenia using 16S rRNA gene amplification bypolymerase chain reaction.Eur J Clin Microbiol Infect Dis 17(4)：247-53和Johnsen，K.，O.Enger，C.S.Jacobsen，L.Thirup，and V.Torsvik.1999.Quantitative selective PCR of 16S ribosomal DNA correlates well with selectiveagar plating in describing population dynamics of indigenous Pseudomonas spp.in soil hot spots.Appl Environ Microbiol 65(4)：1786-8)。

还可对具有与Enterococcus spp.相应的多核苷酸序列的目标多核苷酸进行检测。特异于Enterococcus spp.的序列是本领域已知的(见，例如Hudson，C.R.，P.J.Fedorka-Cray，M.C.Jackson-Hall，and L.M.Hiott.2003.Anomalies in species identification of enterococci from veterinary sources usinga commercial biochemical identification system.Lett Appl Microbiol 36(4)：245-50，Donabedian，S.M.，L.A.Thal，E.Hershberger，M.B.Perri，J.W.Chow，P.Bartlett，R.Jones，K.Joyce，S.Rossiter，K.Gay，J.Johnson，C.Mackinson，E.Debess，J.Madden，F.Angulo，and M.J.Zervos.2003.Molecularcharacterization of gentamicin-resistant Enterococci in the United States：evidence of spread from animals to humans through food.J Clin Microbiol 41(3)：1109-13.和Vakulenko，S.B.，S.M.Donabedian，A.M.Voskresenskiy，M.J.Zervos，S.A.Lerner，and J.W.Chow.2003.Multiplex PCR for detection ofaminoglycoside resistance genes in enterococci.Antimicrob Agents Chemother47(4)：1423-6)。

目标多核苷酸还可具有与E.coli O157相应的多核苷酸序列。特异于E.coli O157的序列是本领域已知的(见，例如Pan TM，Chen LM，Su YC.Identification of Escherichia coli O157：H7 by multiplex PCR with primersspecific to the hlyA，eaeA，stx1，stx2，fliC and rfb genes，J Formos Med Assoc.2002 Sep；101(9)：66l-4；Bopp DJ，Sauders BD，Waring AL，Ackelsberg J，Dumas N，Braun-Howland E，Dziewulski D，Wallace BJ，Kelly M，Halse T，Musser KA，Smith PF，Morse DL，Limberger RJ.Detection，Isolation，andMolecular Subtyping of Escherichia coli O157：H7 and Campylobacter jejuniAssociated with a Large Waterborne Outbreak，J Clin Microbiol.2003 Jan；41(1)：174-80；Ibekwe AM，Grieve CM.Detection and quantification ofEscherichia coli O157：H7 in environmental samples by real-time PCR，J ApplMicrobiol.2003；94(3)：421-31)。

目标多核苷酸还可具有与Listeria spp.和L.monocytogenes相应的多核苷酸序列。特异于Listeria spp.和L.monocytogenes的序列是本领域已知的(见，例如Volokhov D，Rasooly A，Chumakov K，Chizhikov V.Identificationof Listeria species by microarray-based assay.J Clin Microbiol.2002 Dec；40(12)：4720-8；Cocolin L，Rantsiou K，Iacumin L，Cantoni C，Comi G.Directidentification in food samples of Listeria spp.and Listeria monocytogenes bymolecular methods.Appl Environ Microbiol.2002 Dec；68(12)：6273-82；Shearer AE，Strapp CM，Joerger RD.Evaluation of a polymerase chain reaction-based svstem for detection of Salmonella enteritidis，Escherichia coli O157：H7，Listeria spp.，and Listeria monocytogenes on fresh fruits and vegetables.J FoodProt.2001 Jun；64(6)：788-95；Bubert A，Hein I，Rauch M，Lehner A，Yoon B，Goebel W，Wagner M.Detection and differentiation of Listeria spp.by a singlereaction based on multiplex PCR.Appl Environ Microbiol.1999 Oct；65(10)：4688-92；Jung YS，Frank JF，Brackett RE，Chen J.Polymerase chain reactiondetection of Listeria monocytogenes on frankfurters using oligonucleotideprimers targeting the genes encoding internal AB.J Food Prot.2003 Feb；66(2)：237-41和Pangallo D，Kaclikova E，Kuchta T，Drahovska H.Detection ofListeria monocytogenes by polymerase chain reaction oriented to inlB gene.New Microbiol.2001 Oct；24(4)：333-9)。

可对具有与大肠菌(coliform)相应的多核苷酸序列的目标多核苷酸进行检测。特异于大肠菌的序列是本领域已知的(见，例如Casas N，SunenE.Detection of enteroviruses，hepatitis A viruS and rotaviruses in sewage bymeans of an immunomagnetic capture reverse transcription-PCR assay.Microbiol Res.2002；157(3)：169-7；Schvoerer E，Ventura M，Dubos O，Cazaux G，Serceau R，Goumier N，Dubois V，Caminade P，Fleury HJ，LafonME Qualitative and quantitative molecular detection of enteroviruses in waterfrom bathing areas and from a sewage treatment plant；Res Microbiol.2001 Mar；152(2)：179-86.Bernhard AE，Field KG.Identification of nonpoint sources offecal pollution in coastal waters by using host-specific 16S ribosomal DNAgenetic markers from fecal anaerobes.Appl Environ Microbiol.2000 Apr；66(4)：1587-94)。

在另一种实施方式中，可对具有与Vibrio cholerae和V.parahaemolyticus相应的多核苷酸序列的目标多核苷酸进行检测。特异于Vibrio cholerae和V.parahaemolyticus的序列是本领域已知的(见，例如Myers ML，Panicker G，Bej AK.PCR Detection of a Newly Emerged PandemicVibrio parahaemolyticus O3：K6 Pathogen in Pure Cultures and Seeded Watersfrom the Gulf of Mexico.Appl Environ Microbiol.2003 Apr；69(4)：2194-200；Blackstone GM，Nordstrom JL，Vickery MC，Bowen MD，Meyer RF，DePaolaA.Detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in oyster enrichments byreal time PCR.J Microbiol Methods.2003 May；53(2)：149-155和Lyon WJ.TaqMan PCR for detection of Vibrio cholerae O1，O139，non-O1，and non-O139 in pure cultures，raw oysters，and synthetic seawater.Appl EnvironMicrobiol.2001 Oct；67(10)：4685-93)。

在又一种实施方式中，可对具有与霉菌相应的多核苷酸序列的目标多核苷酸进行检测。特异于霉菌的序列是本领域已知的(见，例如Zur G，Shimoni E，Hallerman E，Kashi Y.Detection of Alternaria fungal contaminationin cereal grains by a polymerase chain reaction-based assay.J Food Prot.2002Sep；65(9)：1433-40；Jimenez L，Smalls S，Ignar R.Use of PCR analysis fordetecting low levels of bacteria and mold contamination in pharmaceuticalsamples.J Microbiol Methods.2000 Aug；41(3)：259-65；and Vanittanalcom N，Vanittanakom P，Hay RJ.Rapid identification of Penicillium marneffei by PCR-based detection of specific sequences on the rRNA gene，J Clin Microbiol.2002May；40(5)：1739-42)。

目标多核苷酸还可具有与Legionella相应的多核苷酸序列。特异于Legionella的序列是本领域已知的(见，例如Aoki S，Hirakata Y，MiyazakiY，Izumikawa K，Yanagihara K，Tomono K，Yamada Y，Tashiro T，Kohno S，Kamihira S.Detection of Legionella DNA by PCR of whole-blood samples in amouse model.J Med Microbiol.2003 Apr；52(Pt 4)：325-9；Raggam RB，Leitner E，Muhlbauer G，Berg J，Stocher M，Grisold AJ，Marth E，Kessler HH.Qualitative detection of Legionella species in bronchoalveolar lavages andinduced sputa by automated DNA extraction and real-time polymerase chainreaction.Med Microbiol Immunol(Berl).2002 Oct；191(2)：119-25和Alexiou-Daniel S，Stylianakis A，Papoutsi A，Zorbas I，Papa A，Lambropoulos AF，Antoniadis A.Application of polymerase chain reaction for detection ofLegionella pneumophila in serum samples.Clin Microbiol Infect.1998 Mar；4(3)：144-148)。

还可通过对食物来源的病原体的感染的应答来检测宿主应答mRNA。

D.水传播的病原体

本文公开的方法还提供了一种快速且敏感的试验方法，用于判断水传播的病原体存在与否以及存在的量。水传播的病原体包括细菌、病毒和原生动物。水传播的病原体的例子包括：Enterococci、E.coli、Bacillusspp.、Psuedomonas spp、Cryptosporidium和Giardia。水传播的病原体可以从任何水样中获得，其包括但不限于：游泳池、有水的公园、井、家庭饮用水、水库、海滩、湖泊、海洋、鱼和贝类养殖场、农业用水、透析用水、医药补充用水、水处理设备、邮轮、航天飞机污水和瓶装水。

用本文公开的方法可以很容易地对水传播的病原体进行检测。举例而言，可对特定株系进行检测。例如，可与其它株系区分开并检测到的Enterococci的特定株系包括Enterococci avium、E.casseliflavus、E.cecorum、E.columbae、E.dispar、E.durans、E.faecium、E.faecalis、E.gallinarum、E.hirae、E.malodoratus、E.mundtii、E.pseudovium、E.raffinosus、E.saccharolyticus和E.sulfurous。

通过本发明的方法可对任何与水传播的病原体相关的多核苷酸进行鉴定。本发明可用于检测与Enterococcus spp.，E.coli，Bacillus spp.和Psuedomonas spp.相关的基因，其已被描述(见，例如Escherichia coli：Heller，L.C.，C.R.Davis，K.K.Peak，D.Wingfield，A.C.Cannons，P.T.Amuso，and J.Cattani.2003，Comparison of Methods for DNA Isolation fromFood Samples for Detection of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli by Real-Time PCR.Appl Environ Microbiol 69(3)：1844-6.；Rahman，H.2002.Multiplex PCR for detection of stx genes of Escherichia coli.Indian J Med Res115：251-4.和Frahm，E.，and U.Obst.2003.Application of the fluorogenicprobe technique(TaqMan PCR)to the detection of Enterococcus spp.andEscherichia coli in water samples.J Microbiol Methods 52(1)：123-31.Bacillusspp：Mantynen，V.，and K.Lindstrom.1998.A rapid PCR-based DNA test forenterotoxic Bacillus cereus.Appl Environ Microbiol 64(5)：1634-9.，Schaft，H.，and M.W.Griffiths.1995.Specific oligonucleotide primers for detection oflecithinase-positive Bacillus spp.by PCR.Appl Environ Microbiol 61(1)：98-102.和Ley，B.E.，C.J.Linton，D.M.Bennett，H.Jalal，A.B.Foot，and M.R.Millar.1998.Detection of bacteraemia in patients with fever and neutropeniausing 16S rRNA gene amplification by polymerase chain reaction.Eur J ClinMicrobiol Infect Dis 17(4)：247-53.Pseudomonas spp：Xu，J.，B.C.Millar，J.E.Moore，K.Murphy，H.Webb，A.J.Fox，M.Cafferkey，and M.J.Crowe.2003.Employment of broad-range 16S rRNA PCR to detect aetiological agents ofinfection from clinical specimens in patients with acute meningitis-rapidseparation of 16S rRNA PCR amplicons without the need for cloning.J ApplMicrobiol 94(2)：197-206.，Ley，B.E.，C.J.Linton，D.M.Bennett，H.Jalal，A.B.Foot，and M.R.Millar.1998.Detection of bacteraemia in patients with feverand neutropenia using 16S rRNA gene amplification by polymerase chainreaction.Eur J Clin Microbiol Infect Dis 17(4)：247-53.和Johnsen，K.，O.Enger，C.S.Jacobsen，L.Thirup，and V.Torsvik.1999.Quantitative selectivePCR of 16S ribosomal DNA correlates well with selective agar plating indescribing population dynamics of indigenous Pseudomonas spp.in soil hotspots.Appl Environ Microbiol 65(4)：1786-8.Enterococcus spp：Hudson，C.R.，P.J.Fedorka-Cray，M.C.Jackson-Hall，and L.M.Hiott.2003.Anomalies inspecies identification of enterococci from veterinary sources using a commercialbiochemical identification system.Lett Appl Microbiol 36(4)：245-50.，Donabedian，S.M.，L.A.Thal，E.Hershberger，M.B.Perri，J.W.Chow，P.Bartlett，R.Jones，K.Joyce，S.Rossiter，K.Gay，J.Johnson，C.Mackinson，E.Debess，J.Madden，F.Angulo，and M.J.Zervos.2003.Molecularcharacterization of gentamicin-resistant Enterococci in the United States：evidence of spread from animals to humans through food.J Clin Microbiol 41(3)：1109-13.，and Vakulenko，S.B.，S.M.Donabedian，A.M.Voskresenskiy，M.J.Zervos，S.A.Lerner，and J.W.Chow.2003.Multiplex PCR for detectionof aminoglycoside resistance genes in enterococci.Antimicrob AgentsChemother 47(4)：1423-6)。例如，可通过本文公开的方法进行检测的特定的Enterococci基因包括Enterococci中保守的16S核糖体RNA序列。

还可通过其对水传播病原体造成的感染的应答，来检测宿主应答mRNA。

E.农业恐怖攻击

核酸类似物可被设计为：具有用于对农业恐怖攻击中涉及的病原体进行基于PCR的检测的引物的序列。下面列出了具有临床重要性的病原体的例子，以及用于基于PCR的检测的参照的例子。核酸类似物可被设计为：具有特定PCR引物序列的序列，并可与本文所述的发明的很多种实施方式组合使用。

核酸类似物可被设计为，例如，具有用于对Toxoplasma gondii进行基于PCR的检测的引物的序列或其片段。Toxoplasma gondii具有非常低的宿主特异性，可能会感染几乎所有的哺乳动物。已有报道称其来自鸟类，事实上其已被发现于世界上每一个国家。与Apicomplexa中的大多数一样，Toxoplasma(弓形虫)是专性的细胞内寄生虫。在感染了Toxoplasma的人类中的大多数中，该疾病是没有症状的。但是，在某些条件下，弓形虫病能导致严重的病理，包括肝炎、肺炎、失明和严重的神经紊乱。用于对Toxoplasma gondii进行基于PCR的检测的引物是本领域内已知的(见，例如Aspinall，T.V.，D.Marlee，J.E.Hyde，and P.F.Sims.2002.Prevalence ofToxoplasma gondii in commercial meat products as monitored bv polymerasechain reaction--food for thought？Int J Parasitol 32(9)：1193-9.，Aspinall，T.V.，E.C.Guy，K.E.Roberts，D.H.Joynson，J.E.Hyde，and P.F.Sims.2003.Molecular evidence for multiple Toxoplasma gondii infections in individualpatients in England and Wales：public health implications.Int J Parasitol 33(1)：97-103.，Fuentes，I.，J.M.Rubio，C.Ramirez，and J.Alvar.2001.Genotypiccharacterization of Toxoplasma gondii strains associated with humantoxoplasmosis in Spain：direct analysis from clinical samples.J Clin Microbiol39(4)：1566-70.和Warnekulasuriya，M.R.，J.D.Johnson，and R.E.Holliman.1998.Detection of Toxoplasma gondii in cured meats.Int J Food Microbiol 45(3)：211-5.)。

在另一种实施方式中，核酸类似物可被设计为，具有用于对Shingellaspp(一种革兰氏阴性细菌)进行基于PCR的检测的引物的序列或其片段。用于对Shingella spp进行基于PCR的检测的引物是本领域内已知的(Hartman，A.B.，Essiet，II，D.W.Isenbarger，and L.E.Lindler.2003.Epidemiology of Tetracycline Resistance Determinants in Shigella spp.andEnteroinvasive Escherichia coli：Characterization and Dissemination of tet(A)-1.J Clin Microbiol 41(3)：1023-32.，Lampel，K.A.，and P.A.Orlandi.2002.Polymerase chain reaction detection of invasive Shigella and Salmonellaenterica in food.Methods Mol Biol 179：235-44.，Wang，R.F.，W.W.Cao，andC.E.Cerniglia.1997.A universal protocol for PCR detection of 13 species offoodborne pathogens in foods.J Appl Microbiol 83(6)：727-36.和Lampel，K.A.，J.A.Jagow，M.Trucksess，and W.E.Hill.1990.Polymerase chain reactionfor detection of invasive Shigella flexneri in food.Appl Environ Microbiol 56(6)：1536-40.)。

在又一种实施方式中，核酸类似物可被设计为，具有用于对Cyclospora cayetanensis进行基于PCR的检测的引物的序列或其片段。Cyclospora cayetanensis是由一个细胞组成的寄生虫，其非常之小，不用显微镜无法看见。由Cyclospora感染导致的人类疾病(即，环孢子虫病)的第一个已知例子被报道于1979年。在80年代中期开始有对此情况的更为经常的报道。在最近若干年，在美国和加拿大都已报道过环孢子虫病的爆发。Cyclospora分布于被受感染粪便污染过的水或食物中。环孢子虫病的爆发与各种生鲜制品有关。Cyclospora经过肠道运动排出后需要一段时间(数天或数周)才能具有感染性。因此，Cyclospora不太可能从一个人直接传染给另一个人。

用于对Cyclospora cayetanensis进行基于PCR的检测的引物是本领域内已知的(见，例如，Eberhard，M.L.，N.J.Pieniazek，and M.J.Arrowood.1997.Laboratory diagnosis of Cyclospora infections.Arch Pathol Lab Med 121(8)：792-7.，Pieniazek N.J.，S.B.Slemenda，A.J.da Silva，E.M.Alfano，and M.J.Arrowood.1996.PCR confirmation of infection with Cyclospora cayetanensis.Emerg Infect Dis 2(4)：357-9.，Quintero-Betancourt，W.，E.R.Peele，and J.B.Rose.2002.Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis：a review oflaboratory methods for detection of these waterborne parasites.J MicrobiolMethods 49(3)：209-24.和Varma，M.，J.D.Hester，F.W.Schaefer，3rd，M.W.Ware，and H.D.Lindquist.2003.Detection of Cyclospora cayetanensis using aquantitative real-time PCR assay.J Microbiol Methods 53(1)：27-36.)。

F.疾病诊断

本文中公开的方法还提供了对是否存在基因(例如，疾病等位基因)或改变的基因表达进行快速且灵敏的诊断测试的方法。被检测的基因序列可以是遗传疾病、紊乱和易感体质所涉及的。目标多核苷酸的一个例子包括：包括突变、多态性、添加或缺失在内的特定基因组序列。目标多核苷酸的另一个例子是：在特定疾病或紊乱中基因表达会发生改变(例如正调或负调表达)的多核苷酸序列。疾病和紊乱相关的基因的例子包括但不限于：癌症、囊肿性纤维化和Down’s综合征以及与多态性和突变相关的疾病所涉及的基因。还可对遗传性血色病、因子11和因子V以及用于组织移植的HLA基因型进行鉴定。

核酸类似物可被设计为：具有用于对癌症或细胞增殖变化所涉及的目标多核苷酸进行基于PCR的检测的引物的序列或其片段。癌症或细胞增殖变化所涉及的目标多核苷酸可被检测。癌症中涉及的许多基因都是本领域内已知的。

在一种实施方式中，核酸类似物可被设计为：具有用于对胰腺癌进行基于PCR的检测的引物的序列或其片段。用于对胰腺癌(例如，DPC4缺失)进行基于PCR的检测的引物是本领域内已知的(见，例如Barbera，V.M.，M.Martin，L.Marinoso，A.Munne，A.Carrato，F.X.Real，and M.Fabre.2000.The 18q21 region in colorectal and pancreatic cancer：independent loss ofDCC and DPC4 expression.Biochim Biophys Acta 1502(2)：283-96，Bartsch，D.，P.Barth，D.Bastian，A.Ramaswamy，B.Gerdes，B.Chaloupka，Y.Deiss，B.Simon，and A.Schudy.1999.Higher frequency of DPC4/Smad4 alterations inpancreatic cancer cell lines than in primary pancreatic adenocarcinomas.CancerLett 139(1)：43-9和Bartsch，D.，S.A.Hahn，K.D.Danichevslsi，A.Ramaswamy，D.Bastian，H.Galehdari，P.Barth，W.Schmiegel，B.Simon，andM.Rothmund.1999.Mutations of the DPC4/Smad4 gene in neuroendocrinepancreatic tumors.Oncogene 18(14)：2367-71)。

在另一种实施方式中，核酸类似物可被设计为：具有用于对子宫颈癌进行基于PCR的检测的引物的序列或其片段。用于对子宫颈癌进行基于PCR的检测的引物。对应于子宫颈癌相关基因的全部或部分的目标多核苷酸也可被鉴定(见，例如Si，H.X.，S.W.Tsao，C.S.Poon，L.D.Wang，Y.C.Wong，and A.L.Cheung.2003.Viral load of HPV in esophageal squamous cellcarcinoma.Int J Cancer 103(4)：496-500，Si，H.X.，S.W.Tsao，C.S.Poon，L.D.Wang，Y.C.Wong，and A.L.Cheung.2003.Viral load of HPV inesophageal squamous cell carcinoma.Int J Cancer 103(4)：496-500和Castle，P.E.，M.Schiffman，P.E.Gravitt，H.Kendall，S.Fishman，H.Dong，A.Hildesheim，R.Herrero，M.C.Bratti，M.E.Sherman，A.Lorincz，J.E.Schussler，and R.D.Burk.2002.Comparisons of HPV DNA detection byMY09/11 PCR methods.J Med Virol 68(3)：417-23)。

核酸类似物可被设计为：具有用于对乳腺癌进行基于PCR的检测的引物的序列或其片段。用于对乳腺癌进行基于PCR的检测的引物。可将目标多核苷酸选为：具有对应于乳腺癌相关基因的全部或部分的序列的多核苷酸(见，例如Min，C.J.，L.Tafra，and K.M.Verbanac.1998.Identification ofsuperior markers for polymerase chain reaction detection of breast cancermetastases in sentinel lymph nodes.Cancer Res 58(20)：4581-4，Abbaszadegan，M.R.，J.P.Struewing，K.M.Brown，J.V.Snider，F.Goodsaid，R.Gore-Langton，and M.R.Hughes.1997.Automated detection of prevalent mutationsin BRCA1 and BRCA2 genes，using a fluorogenic PCR allelic discriminationassay.Genet Test 1(3)：171-80和Tamura，G.，C.Maesawa，Y.Suzuki，M.Kashiwaba，M.Ishida，K.Saito，and R.Satodate.1994.Improved detection ofloss of heterozygosity at retinoblastoma gene locus in human breast carcinoma.Pathol Int 44(1)：34-8)。

核酸类似物可被设计为：具有用于对黑色素瘤进行基于PCR的检测的引物的序列或其片段。用于对黑色素瘤进行基于PCR的检测的引物。可将目标多核苷酸选为：具有对应于黑色素瘤相关基因的全部或部分的序列的多核苷酸。例如，目标多核苷酸可以包括CDKN2突变。(见，例如Gonzalgo，M.L.，C.M.Bender，E.H.You，J.M.Glendening，J.F.Flores，G.J.Walker，N.K.Hayward，P.A.Jones，and J.W.Fountain.1997.Low frequencyof p16/CDKN2A methylation in sporadic melanoma：comparative approachesfor methylation analysis of primary tumors.Cancer Res 57(23)：5336-47，Chan，J.，E.S.Robinson，J.Atencio，Z.Wang，S.Kazianis，L.D.Coletta，R.S.Nairn，and J.R.McCarrey.2001.Characterization of the CDKN2A and ARF genes inUV-induced melanocytic hyperplasias and melanomas of an opossum(Monodelphis domestica).Mol Carcinog 31(1)：16-26和Pollock，P.M.，J.Welch，and N.K.Hayward.2001.Evidence for three tumor suppressor loci onchromosome 9p involved in melanoma development.Cancer Res 61(3)：1154-61)。

此外，核酸类似物可被设计为：具有用于对直肠癌进行基于PCR的检测的引物的序列或其片段。用于对直肠癌进行基于PCR的检测的引物。可将目标多核苷酸选为：具有对应于直肠癌相关基因的全部或部分的序列的多核苷酸(见，例如Aoki S.，Y.Takagi，M.Hayakawa，K.Yamaguchi，M.Futamura，K.Kunieda，and S.Saji.2002.Detection of peritonealmicrometastases by reverse transcriptase-polymerase chain reaction targetingcarcinoembryonic antigen and cytokeratin 20 in colon cancer patients.J ExpClin Cancer Res 21(4)：555-62.，Shtoyerman-Chen，R.，E.Friedman，A.Figer，M.Carmel，Y.Patael，P.Rath，H.H.Fidder，S.Bar-Meir，and L.Theodor.2001.The I1307K APC polymorphism：prevalence in non-Ashkenaii Jews andevidence for a founder effect.Genet Test 5(2)：141-6.和Smith，W.M.，N.J.Van Orsouw，E.A.Fox，R.D.Kolodner，J.Vijg，and C.Eng.1998.Accurate，high-throughput″snapshot″detection of hMLH1 mutations by two-dimensionalDNA electrophoresis.Genet Test 2(1)：43-53.)。

核酸类似物可被设计为：具有用于对视网膜母细胞瘤进行基于PCR的检测的引物的序列或其片段。用于对视网膜母细胞瘤进行基于PCR的检测的引物。可将目标多核苷酸选为：具有对应于视网膜母细胞瘤相关基因的全部或部分的序列的多核苷酸(见，例如Acikbas，I.，I.Keser，S.Kilic，H.Bagci，G.Karpuzoglu，and G.Luleci.2002.Detection of LOH of the RB 1 genein bladder cancers by PCR-RFLP.Urol Int 68(3)：189-92，Tamura，G.，C.Maesawa，Y.Suzuki，M.Kashiwaba，M.Ishida，K.Saito，and R.Satodate.1994.Improved detection of loss of heterozygosity at retinoblastoma gene locus inhuman breast carcinoma.Pathol Int 44(1)：34-8和Lohmann，D.，B.Horsthemke，G.Gillessen-Kaesbach，F.H.Stefani，and H.Hofler.1992.Detection of small RB1 gene deletions in retinoblastoma by multiplex PCR andhigh-resolution gel electrophoresis.Hum Genet 89(1)：49-53)。

在又一种实施方式中，核酸类似物可被设计为：具有用于对血友病进行基于PCR的检测的引物的序列或其片段。用于对血友病进行基于PCR的检测的引物。可将目标多核苷酸选为：具有对应于血友病相关基因的全部或部分的序列的多核苷酸(见，例如Mannucci，P.M.2002.Ham-wasserman lecture：hemophilia and related bleeding disorders：a story of dismayand success.Hematology(Am Soc Hematol Educ Program)：1-9和Citron，M.，L.Godmilow，T.Ganguly，and A.Ganguly.2002.High throughput mutationscreening of the factor VIII gene(F8C)in hemophilia A：37 novel mutations andgenotype-phenotype correlation.Hum Mutat 20(4)：267-74)。

具有对应于苯丙酮尿症(PKU)相关基因的序列的目标多核苷酸可被选择(见，例如Pronina，N.，S.Giannattasio，P.Lattanzio，R.Lugovska，P.Vevere，and A.Kornejeva.2003.The molecular basis of phenylketonuria inLatvia.Hum Mutat 21(4)：398-9，Sueoka，H.，M.Nagao，and S.Chiba.2000.Rapid mutation screening of phenylketonuria by polymerase chain reaction-linked restriction enzyme assay and direct sequence of the phenylalaninehydroxylase gene：clinical application in northern Japan and northern China.Genet Test 4(3)：249-56，and Eisensmith，R.C.，A.A.Goltsov，and S.L.Woo.1994.A simple，rapid，and highly informative PCR-based procedure for prenataldiagnosis and carrier screening of phenylketonuria.Prenat Diagn 14(12)：1113-8.).Alford，R.L.，T.Ashizawa，J.Jankovic，C.T.Caskey，and C.S.Richards.1996.Molecular detection of new mutations，resolution of ambiguous resultsand complex genetic counseling issues in Huntington disease.Am J Med Genet66(3)：281-6，Vnencak-Jones，C.L.2003.Fluorescence PCR and GeneScananalysis for the detection of CAG repeat expansions associated withHuntington′s disease.Methods Mol Biol 217：101-8和Panagopoulos，I.，C.Lassen，U.Kristoffersson，and P.Aman.1999.A novel PCR-based approach forthe detection of the Huntington disease associated trinucleotide repeat expansion.Hum Mutat 13(3)：232-6)。

具有对应于Huntington’s症相关基因的序列的目标多核苷酸可被选择，例如，由于增加的CAG重复(见，例如Alford，R.L.，T.Ashizawa，J.Jankovic，C.T.Caskey，and C.S.Richards.1996.Molecular detection of newmutations，resolution of ambiguous results and complex genetic counselingissues in Huntington disease.Am J Med Genet 66(3)：281-6，Vnencak-Jones，C.L.2003.Fluorescence PCR and GeneScan analysis for the detection of CAGrepeat expansions associated with Huntington′s disease.Methods Mol Biol 217：101-8和Panagopoulos，I.，C.Lassen，U.Kristoffersson，and P.Aman.1999.Anovel PCR-based approach for the detection of the Huntington diseaseassociated trinucleotide repeat expansion.Hum Mutat 13(3)：232-6.)。

具有对应于血友病相关基因的序列的目标多核苷酸可被选择(见，例如Mannucci，P.M.2002.Ham-wasserman lecture：hemophilia and relatedbleeding disorders：a story of dismay and success.Hematology(Am SocHematol Educ Program)：1-9和Citron，M.，L.Godmilow，T.Ganguly，and A.Ganguly.2002.High throughput mutation screening of the factor VIII gene(F8C)in hemophilia A：37 novel mntations and genotype-phenotype correlation.Hum Mutat 20(4)：267-74.)。

具有对应于Tay-Sach’s症相关基因的序列的目标多核苷酸可被选择(见，例如Rice，J.E.，J.A.Sanchez，K.E.Pierce，and L.J.Wangh.2002.Real-time PCR with molecular beacons provides a highly accurate assay fordetection of Tay-Sachs alleles in single cells.Prenat Diagn 22(12)：1130-4，Tamasu，S.，H.Nishio，H.Ayaki，M.J.Lee，M.Mizutori，Y.Takeshima，H.Nakamura，M.Matsuo，T.Maruo，and K.Sumino.1999.Prenatal diagnosis of aJapanese family at risk for Tay-Sachs disease.Application of a fluorescentcompetitive allele-specific polymerase chain reaction(PCR)method.Kobe JMed Sci 45(6)：259-70，and Sermon，K.，W.Lissens，Z.P.Nagy，A.VanSteirteghem，and I.Liebaers.1995.Simultaneous amplification of the two mostfrequent mutations of infantile Tay-Sachs disease in single blastomeres.HumReprod 10(8)：2214-7.)。

具有对应于多发性硬化(Multiple Schlorosis，MS)相关基因的序列的目标多核苷酸可被选择(见，例如Lauwers，S.，Y.Vander Heyden，and B.Rombaut.2002.Screening and optimisation of an ELISA method for thequantitative detection of enterovirus specific RT-PCR products by means of atwo-level experimental design.J Pharm Biomed Anal 29(4)：659-68，Perron，H.，J.A.Garson，F.Bedin，F.Beseme，G.Paranhos-Baccala，F.Komurian-Pradel，F.Mallet，P.W.Tuke，C.Voisset，J.L.Blond，B.Lalande，J.M.Seigneurin，and B.Mandrand.1997.Molecular identification of a novel retrovirus repeatedlyisolated from patients with multiple sclerosis.The Collaborative ResearchGroup on Multiple Sclerosis.Proc Natl Acad Sci USA 94(14)：7583-8和Kuhne，B.S.，and P.Oschmann.2002.Quantitative real-time RT-PCR usinghybridization probes and imported standard curves for cytokine gene expressionanalysis.Biotechniques 33(5)：1078，1080-2，1084各处.)。

目标多核苷酸可选用：具有对应于Burkitt’s淋巴瘤相关基因的序列的多核苷酸(见，例如Wu，Y.，Y.Chen，J.Xu，and L.Lu.2002.Anticanceractivities of curcumin on human Burkitt′s lymphoma.Zhonghua Zhong Liu ZaZhi 24(4)：348-52，Basso，K.，E.Frascella，L.Zanesco，and A.Rosolen.1999.Improved long-distance polymerase chain reaction for the detection of t(8；14)(q24；q32)in Burkitt′s lymphomas.Am J Pathol 155(5)：1479-85和Asada，M.，T.Miyashita，F.Bessho，N.Kobayashi，and S.Mizutani.1991.Malignant celldetection in Burkitt′s lymphoma using third-complementarity-determiningregion(CDRIII)，clone-specific probe developed by sequencing DNA fromstored slides.Jpn J Cancer Res 82(7)：848-53)。

目标多核苷酸可选用：具有对应于囊性纤维化相关基因的序列的多核苷酸(见，例如Tomaiuolo，R.，M.Spina，and G.Castaldo.2003.Moleculardiagnosis of cystic fibrosis：comparison of four analytical procedures.ClinChem Lab Med 41(1)：26-32，Gonzalez-Gonzalez，M.C.，M.Garcia-Hoyos，M.J.Trujillo，M.Rodriguez de Alba，I.Lorda-Sanchez，J.Diaz-Recasens，E.Gallardo，C.Ayuso，and C.Ramos.2002.Prenatal detection of a cystic fibrosismutation in fetal DNA from maternal plasma.Prenat Diagn 22(10)：946-8和Corbetta，C.，M.Seia，A.Bassotti，A.Ambrosioni，A.Giunta，and R.Padoan.2002.Screening for cystic fibrosis in newborn infants：results of a pilotprogramme based on a two tier protocol(IRT/DNA/IRT)in the Italianpopulation.J Med Screen 9(2)：60-3.)。

目标多核苷酸可选用：具有对应于青少年期发病的糖尿病相关基因的序列的多核苷酸(见，例如Knerr，I.，R.Repp，J.Dotsch，N.Gratzki，J.Hanze，T.Kapellen，and W.Rascher.1999.Quantitation of gene expression by real-time PCR disproves a ″retroviral hypothesis″for childhood-onset diabetesmellitus.Pediatr Res 46(1)：57-60，Lauwers，S.，Y.Vander Heyden，and B.Rombaut.2002.Screening and optimisation of an ELISA method for thequantitative detection of enterovirus specific RT-PCR products by means of atwo-level experimental design.J Pharm Biomed Anal 29(4)：659-68和Salminen，K.，K.Sadeharju，M.Lonnrot，P.Vahasalo，A.Kupila，S.Korhonen，J.Ilonen，O.Simell，M.Knip，and H.Hyoty.2003.Enterovirus infections areassociated with the induction of beta-cell autoimmunity in a prospective birthcohort study.J Med Virol 69(1)：91-8.)。

目标多核苷酸可选用：具有对应于Parkinson’s症相关基因的序列的多核苷酸(见，例如Hoenicka，J.，L.Vidal，B.Morales，I.Ampuero，F.J.Jimenez-Jimenez，J.Berciano，T.del Ser，A.Jimenez，P.G.Ruiz，and J.G.deYebenes.2002.Molecular findings in familial Parkinson disease in Spain.ArchNeurol 59(6)：966-70.；Lucking，C.B.，and A.Brice.2003.SemiquantitativePCR for the detection of exon rearrangements in the Parkin gene.Methods MolBiol 217：13-26；Le，W.D.，P.Xu，J.Jankovic，H.Jiang，S.H.Appel，R.G.Smith，and D.K.Vassilatis.2003.Mutations in NR4A2 associated with familialParkinson disease.Nat Genet 33(1)：85-9.；and Foroud，T.，S.K.Uniacke，L.Liu，N.Panl&lt；ratz，A.Rudolph，C.Halter，C.Shults，K.Marder，P.M.Conneally，and W.C.Nichols.2003.Heterozygosity for a mutation in the parkingene leads to later onset Parkinson disease.Neurology 60(5)：796-801)。

目标多核苷酸可选用：具有对应于Alzheimer′s症相关基因的序列的多核苷酸(见，例如Maresh，G.A.，D.Erezyilmaz，C.E.Murry，D.Nochlin，and A.D.Snow.1996.Detection and quantitation of perlecan mRNA levels inAlzheimer′s disease and normal aged hippocampus by competitive reversetranscription-polymerase chain reaction.J Neurochem 67(3)：1132-44和Smith，M.J.，R.J.Gardner，M.A.Knight，S.M.Forrest，K.Beyreuther，E.Storey，C.A.McLean，R.G.Cotton，R.Cappal，and C.L.Masters.1999.Early-onsetAlzheimer′s disease caused by a novel mutation at codon 219 of the presenilin-1gene.Neuroreport 10(3)：503-7)。

目标多核苷酸可选用：具有对应于血栓症相关基因的序列的多核苷酸(见，例如Sanders Sevall，J.2000.Factor V Leiden genotyping using real-time fluorescent polymerase chain reaction.Mol Cell Probes 14(4)：249-53；Ferreira-Gonzalez，A.，L.M.Fisher，C.M.Lehman，M.H.Langley，D.H.Lofland，Q.Xia，N.X.Nguyen，D.Modesto，J.B.Willoughby，D.S.Wilkinson，and C.T.Garrett.1997.Detection of a common mutation in factor V generesponsible for resistance to activate protein C causing predisposition tothrombosis.J Clin Lab Anal 11(6)：328-35；Warshawsky，I.，C.Hren，L.Sercia，B.Shadrach，S.R.Deitcher，E.Newton，and K.Kottke-Marchant.2002.Detection of a novel point mutation of the prothrombin gene at position 20209.Diagn Mol Pathol 11(3)：152-6.)。

目标多核苷酸可选用：具有对应于结核病易感性相关基因的序列的多核苷酸(见，例如Bellamy R.Susceptibility to mycobacterial infections：theimportance of host genetics.Genes Immun.2003 Jan；4(1)：4-11；Awomoyi AA，Marchant A，Howson JM，McAdam KP，Blackwell JM，Newport MJ.Interleukin-10，polymorphism in SLC11A1(formerly NRAMP1)，andsusceptibility to tuberculosis.J Infect Dis.2002 Dec 15；186(12)：1808-14.Bellamy R.NRAMP1 and susceptibility to tuberculosis.Int J Tuberc Lung Dis.2002 Sep；6(9)：747)。

目标多核苷酸可选用：具有对应于人类免疫缺陷病毒(HIV)相关基因的序列的多核苷酸(见，例如Ifergan I，Bernard NF，Bruneau J，Alary M，Tsoukas CM，Roger M.Allele frequency of three functionally activepolymorphisms of the MDR-1 Gene in high-risk HIV-negative and HIV-positiveCaucasians.AIDS.2002 Nov 22；16(17)：2340-2和Farzan M，Mirzabekov T，Kolchinsky P，Wyatt R，Cayabyab M，Gerard NP，Gerard C，Sodroski J，Choe H.Tyrosine sulfation of the amino terminus of CCR5 facilitates HIV-1 entry.Cell.1999 Mar 5；96(5)：667-76)。本文中的方法还提供了一种快速且灵敏的诊断检验的方法，其用于在其它遗传分析中检验是否存在基因或基因表达有所改变。例如，这可用于确定人类样品的同一性，例如，在亲子鉴定、计算机法医学中，或用于匹配有亲缘关系或无亲缘关系的器官捐赠者。诊断也可开展于非人类样品中，例如用于确定牛的家系。

G.性传播疾病

核酸类似物可被设计为：具有用于对导致性传播疾病(STD)的病原体进行基于PCR的检测的引物的序列或序列片段。下面列出了具有临床重要性的STD的例子，以及用于基于PCR的检测的参照的例子。核酸类似物可被设计为：具有特定PCR引物序列的序列，并可与本文所述的本发明的很多种实施方式组合使用。

在一种实施方式中，核酸类似物被设计为：具有用于对衣原体进行基于PCR的检测的引物的序列。很多此类引物都是本领域内已知的(见，例如Koumans，E.H.，C.M.Black，L.E.Markowitz，E.Unger，A.Pierce，M.K.Sawyer，and J.R.Papp.2003.Comparison of methods for detection ofChlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae using commercially availablenucleic acid amplification tests and a liquid pap smear medium.J Clin Microbiol41(4)：1507-11；Puolakkainen，M.，E.Hiltunen-Back，T.Reunala，S.Suhonen，P.Lahteenmaki，M.Lehtinen，and J.Paavonen.1998.Comparison of performancesof two commercially available tests，a PCR assay and a ligase chain reaction test，in detection of urogenital Chlamydia trachomatis infection.J Clin Microbiol 36(6)：1489-93；Betsou F，Beaumont K，Sueur JM，Orfila J.Construction andevaluation of internal control DNA for PCR amplification of Chlamydiatrachomatis DNA from urine samples.J Clin Microbiol.2003 Mar；41(3)：1274-6；Knox J，Tabrizi SN，Miller P，Petoumenos K，Law M，Chen S，Garland SM.Evaluation of self-collected samples in contrast to practitioner-collected samplesfor detection of Chlamydia trachomatis，Neisseria gonorrhoeae，andTrichomonas vaginalis by polymerase chain reaction among women living inremote areas.Sex Transm Dis.2002 Nov；29(11)：647-54；Mygind T，BirkelundS，Birlcebaek N，Oestergaard L，Jensen J，Christiansen G.Determination of PCRefficiency in chelex-100 purified clinical samples and comparison of real-timequantitative PCR and conventional PCR for detection of Chlamydia pneumoniae.BMC Microbiol.2002 Jul 9；2(1)：17)。

在另一种实施方式中，核酸类似物被设计为：具有用于对梅毒螺旋体(Treponema pallidum)进行基于PCR的检测的引物的序列。用于通过基于PCR的分析对梅毒螺旋体进行鉴定的引物的例子是本领域内已知的(见，例如Centurion-Lara，A.，C.Castro，J.M.Shaffer，W.C.Van Voorhis，C.M.Marra，and S.A.Lukehart.1997.Detection of Treponema pallidum by asensitive reverse transcriptase PCR.J Clin Microbiol 35(6)：1348-52；Martin，A.A.，H.Liu，M.Y.Sutton，B.Steiner，A.Pillay，and L.E.Markowitz.2001.Amplification of the DNA polymerase I gene of Treponema pallidum fromwhole blood of persons with syphilis.Diagn Microbiol Infect Dis 40(4)：163-6；Orton，S.L.，H.Liu，R.Y.Dodd，and A.E.Williams.2002.Prevalence ofcirculating Treponema pallidum DNA and RNA in blood donors withconfirmed-positive syphilis tests.Transfusion 42(1)：94-9)。

在另一种实施方式中，核酸类似物被设计为：具有用于对HIV进行基于PCR的检测的引物的序列。用于通过基于PCR的分析对HIV进行鉴定的引物的例子是本领域内已知的(见，例如Gibney，L.，M.Macaluso，K.Kirk，M.S.Hassan，J.Schwebe，S.H.Vermund，and P.Choudhury.2001.Prevalence of infectious diseases in Bangladeshi women living adjacent to atruck stand：HIV/STD/hepatitis/genital tract infections.Sex Transm Infect 77(5)：344-50；Spinillo，A.，M.Debiaggi，F.Zara，R.Maserati，F.Polatti，and A.DeSantolo.2001.Factors associated with nucleic acids related to humanimmunodeficiency virus type 1 in cervico-vaginal secretions.Bjog 108(6)：634-41)。

在又一种实施方式中，核酸类似物被设计为：具有用于对人乳头瘤病毒(HPV)进行基于PCR的检测的引物的序列。用于通过基于PCR的分析对HPV进行鉴定的引物的例子是本领域内已知的(见，例如Winer，R.L.，S.K.Lee，J.P.Hughes，D.E.Adam，N.B.Kiviat，and L.A.Koutsky.2003.Genital human papillomavirus infection：incidence and risk factors in a cohort offemale university students.Am J Epidemiol 157(3)：218-26；Levi，J.E.，B.Kleter，W.G.Quint，M.C.Fink，C.L.Canto，R.Matsubara，I.Linhares，A.Segurado，B.Vanderborght，J.E.Neto，and L.J.Van Doorn.2002.Highprevalence of human papillomavirus(HPV)infections and high frequency ofmultiple HPV genotypes in human immunodeficiency virus-infected women inBrazil.J Clin Microbiol 40(9)：3341-5；Skerlev，M.，M.Grce，M.Sirotkoviae-Slcerlev，K.Husnjak，and J.Lipozencic.2002.Human papillomavirus malegenital infections；clinical variations and the significance of DNA typing.ClinDermatol 20(2)：173-8)。

在另一种实施方式中，核酸类似物被设计为：具有用于对Neisseriagonorrhoeae进行基于PCR的检测的引物的序列。用于通过基于PCR的分析对Neisseria gonorrhoeae进行鉴定的引物的例子是本领域内已知的(见，例如Mgone，C.S.，T.Lupiwa，and W.Yeka.2002.High prevalence ofNeisseria gonorrhoeae and multiple sexually transmitted diseases among ruralwomen in the Eastern Highlands Province of Papua New Guinea，detected bypolymerase chain reaction.Sex Transm Dis 29(12)：775-9；Gomes，J.P.，L.Tavira，F.Exposto，E.Prieto，and M.A.Catry.2001.Neisseria gonorrhoeae andChlamydia trachomatis infections in patients attending STD and family planningclinics in Bissau，Guinea-Bissau.Acta Trop 80(3)：261-4；Diemert，D.J.，M.D.Libman，and P.Lebel.2002.Confirmation by 16S rRNA PCR of the COBASAMPLICOR CT/NG test for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae infection in alow-prevalence population.J Clin Microbiol 40(11)：4056-9)。

在另一种实施方式中，核酸类似物被设计为：具有用于对生殖器疱疹进行基于PCR的检测的引物的序列。用于通过基于PCR的分析对生殖器疱疹进行鉴定的引物的例子是本领域内已知的(见，例如Wolff，M.H.，J.Schmitt，M.Rahaus，H.Dudda，and W.Hatzmann.2002.Clinical andsubclinical reactivation of genital herpes virus.Intervirology 45(1)：20-3；Wald，A.2002.Testing for genital herpes：how，who，and why.Curr Clin Top InfectDis 22：166-80；Scoular，A.2002.Using the evidence base on genital herpes：optimising the use of diagnostic tests and information provision.Sex TransmInfect 78(3)：160-5)。

核酸类似物也可以被设计为：具有用于对Trichomonas vanginalis进行基于PCR的检测的引物的序列。用于通过基于PCR的分析对Trichomonasvanginalis进行鉴定的引物的例子是本领域内已知的(见，例如Wendel，K.A.，E.J.Erbelding，C.A.Gaydos，and A.M.Rompalo.2002.Trichomonasvaginalis polymerase chain reaction compared with standard diagnostic andtherapeutic protocols for detection and treatment of vaginal trichomoniasis.ClinInfect Dis 35(5)：576-80；Wendel，K.A.，E.J.Erbelding，C.A.Gaydos，and A.M.Rompalo.2003.Use of urine polymerase chain reaction to define theprevalence and clinical presentation of Trichomonas vaginalis in men attendingan STD clinic.Sex Transm Infect 79(2)：151-153)。

最后，核酸类似物可被设计为用于检测普通的STD。用于通过基于PCR的分析对STD进行鉴定的引物的例子是本领域内已知的(见，例如Mitrani-Rosenbaum，S.，R.Tsvieli，O.Lavie，R.Boldes，E.Anteby，S.Shimonovitch，T.Lazarovitch，and A.Friedmann.1994.Simultaneous detectionof three common sexually transmitted agents by polymerase chain reaction.AmJ Obstet Gynecol 171(3)：784-90)。

H.抗生素抗性

本发明的方法、组合物和分析系统可用于检测赋予抗生素抗性的基因表达是否存在或是否有所改变。目标多核苷酸可与对病原体赋予抗生素抗性的基因相对应。或者，目标多核苷酸可以对应于：其代谢发生了可能影响到抗生素疗效的改变的宿主的基因。

表达抗生素抗性的基因的例子可在下述文献中找到。提供例子并非是用提供的例子进行限制。编码例如beta内酰胺酶的基因赋予对如下抗生素的抗性，所述抗生素包括但不限于：青霉素、红霉素、头孢噻肟(cefotaxime)、氨苄青霉素、哌拉西林(piperacillin)、先锋必素(cefoperazone)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢吡肟(cefepime)、拉氧头孢(moxalactam)、伊米配能(imipenem)(见，例如Livermore，D.M.1995.β-Lactamases in Laboratory and Clinical Resistance.Clin.Microbiol.Reviews.8：557-584.，Hsueh，P.，Teng，L.，Lee，L.，Yang，P.，Ho，S.，and Luh，K，1999.Dissemination of High-Level Penicillin-，Extended-SpectrumCephalosporin-，and Erythromycin-Resistant Streptococcus pneumoniae Clonesin Taiwan.J.Clin.Microbiol.37：221-224.，Setchanova，L.，and Tomasz，A.1999.Molecular Characterization of Penicillin-Resistant Streptococcuspneumoniae Isolates from Bulgaria.J.Clin.Microbiol.37：638-648.，Wichelhaus，T.A.，Kern，S.，Schfer，V.，Brade，V.1999.Rapid Detection ofEpidemic Strains of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.J.Clin.Microbiol.37：690-693.和Jacoby G.A.1994.Genetics of Extended-SpectrumBeta-Lactamases.Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.13：suppl.1：2-11)。

抗生素抗性赋予基因的其它非限制性例子包括喹诺酮类(quinolones)抗性基因，其赋予对下述抗生素的抗性，例如：ceprofloxacin、氧氟沙星(ofloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、司氟沙星(sparfloxacin)(见，例如Margerrison，E.E.C.，Hopewell，R.，and Fisher，L.M.1992.Nucleotide Sequence of the Staphylococcus aureus gyrB-gyrALocus Encoding the DNA Gyrase A and B Proteins.J.Bacteriol.174：1596-1603.，McWhinney，P.H.M.，Patel，S.，Whiley，R.A.，Hardie，J.M.，Gillespie，S.H.，and Kibbler，C.C.1993.Activities of Potential Therapeutic andProphylactic Antibiotics against Blood Culture Isolates of Viridans GroupStreptococci from Neutropenic Patients Receiving Ciprofloxacin.Antimicrob.Agents.Chemother.37：2493-2495.，and Yoshida，H.，Bogaki，M.，Nakamura，S.，Ubukata，K.，and Konno，M.1990.Nucleotide Sequence and Characterization ofthe Staphylococcus aureus norA Gene，Which Confers Resistance to Quinolones.J.Bacteriol.172：6942-6949)。

抗生素抗性赋予基因的其它例子包括糖肽抗性基因，其赋予对下述抗生素的抗性，例如：万古霉素和壁霉素(teicoplanin)(见，例如Tremlett，C.H.，Brown，D.F.J，and Woodford，N.1999.Variation in Structure andLocation of VanA Glycopeptide Resistance Elements among Enterococci from aSingle Patient.J.Clin.Microbiol.37：818-820.，and Arthur，M.，Depardieu，F.，Molinas，C.，Reynolds，P.，and Courvalin，P.1995.The vanZ gene of Tnl546from Enterococcus faecium BM4147 confers resistance to teicoplanin.Gene，154(1995)87-92.)aminoglycoside resistance genes which convey resistance toantibiotics such as托普霉素(tobramycin)，庆大霉素(gentamicin)，链霉素(strepomycin)，卡那霉素(kanamycin)，氨基丁卡霉素(amikacin)(Galimand M.，Lambert，T.，Gerbaud，G.，and Courvalin，P.1993.Characterization of the aac(6′)-Ib gene Encoding an Aminoglycoside 6′-N-Acetyltransferase inPseudomonas aeruginosa BM2656.Antimicrob.Agents.Chemother.37：1456-1462.，Lambert，T.，Gerbaud，G.，and Courvalin，P.1994.Characterization ofTransposon Tnl528，Which Confers Amikacin Resistance by Synthesis ofAminoglycoside  3′-O-Phosphotransferase Type VI.Antimicrob.Agents.Chemother.38：702-706，and Shaw，K.J.，Munayyer，H.，Rather，P.N.，Hare，R.S.，and Miller，G.H.1993.Nucleotide Sequence Analysis and DNAHybridization Studies of the ant(4′)-IIa Gene from Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob.Agents.Chemother.37：708-714)。

某些情况下，存在引起高度关注的某些特定种类的抗性。它们包括具有甲氧西林(methicillin)抗性的Staphylococcus aureus(见，例如Ito，T.，K.Okuma，X.X.Ma，H.Yuzawa，and K.Hiramatsu.2003.Insights on antibioticresistance of Staphylococcus aureus from its whole genome：genomic islandSCC.Drug Resist Update 6(1)：41-52，Kuroda，M.，T.Ohta，I.Uchiyama，T.Baba，H.Yuzawa，I.Kobayashi，L.Cui，A.Oguchi，K.Aoki，Y.Nagai，J.Lian，T.Ito，M.Kanamori，H.Matsumaru，A.Maruyama，H.Murakami，A.Hosoyama，Y.Mizutani-Ui，N.K.Takahashi，T.Sawano，R.Inoue，C.Kaito，K.Sekimizu，H.Hirakawa，S.Kuhara，S.Goto，J.Yabuzaki，M.Kanehisa，A.Yamashita，K.Oshima，K.Furuya，C.Yoshino，T.Shiba，M.Hattori，N.Ogasawara，H.Hayashi，and K.Hiramatsu.2001.Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus.Lancet 357(9264)：1225-40，and Skurray，R.A.，and N.Firth.1997.Molecular evolution of multiply-antibiotic-resistantstaphylococci.Ciba Found Symp 207：167-83′)。

其它可被检测到的抗生素抗性赋予基因包括：结核病抗生素抗性基因(见，例如Mokrousov，I.，T.Otten，M.Filipenko，A.Vyazovaya，E.Chrapov，E.Limeschenko，L.Steldova，B.Vyshnevskiy，and O.Narvskaya.2002.Detection of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by amultiplex allele-specific PCR assay targeting katG codon 315 variation.J ClinMicrobiol 40(7)：2509-12；Gong，G.，H.Lee，G.H.Kang，Y.H.Shim，J.Huh，and S.K.Khang.2002.Nested PCR for diagnosis of tuberculous lymphadenitisand PCR-SSCP for identification of rifampicin resistance in fine-needleaspirates.Diagn Cytopathol 26(4)：228-31；Garcia de Viedma，D.，M.del SolDiaz Infantes，F.Lasala，F.Chaves，L.Alcala，and E.Bouza.2002.New real-time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutationsand high-level isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis.JClin Microbiol 40(3)：988-95)。

I.对药物应答(Drug Response)易感体质的遗传筛选

本发明的方法、组合物和分析方法可被用于检测：造成对药物应答的易感体质的基因。目标多核苷酸可对应于：造成对药物应答的易感体质的任何多核苷酸序列。目标多核苷酸可对应于：影响心血管系统的药物的易感体质所涉及的序列(见，例如Dudley，C.，B.Keavney，B.Casadei，J.Conway，R.Bird，and P.Ratcliffe.1996.Prediction of patient responses toantihypertensive drugs using genetic polymorphisms：investigation of renin-angiotensin system genes.J Hypertens 14(2)：259-62；Lima，P.R.，J.A.Gontijo，J.B.Lopes de Faria，F.F.Costa，and S.T.Saad.1997.Band 3 Campinas：anovel splicing mutation in the band 3 gene(AE1)associated with hereditaryspherocytosis，hyperactivity of Na+/Li+ countertransport and an abnormal renalbicarbonate handling.Blood 90(7)：2810-8；Sakaeda，T.，T.Nalcamura，M.Horinouchi，M.Kakumoto，N.Ohmoto，T.Sakai，Y.Morita，T.Tamura，N.Aoyama，M.Hirai，M.Kasuga，and K.Olcumura.2001.MDR1 genotype-relatedpharmacokinetics of digoxin after single oral administration in healthy Japanesesubiects.Pharm Res 18(10)：1400-4.)。目标多核苷酸还可对应于：对精神病药物的易感体质所涉及的基因和其它多核苷酸(见，例如Nikoloff，D.，J.C.Shim，M.Fairchild，N.Patten，B.A.Fijal，W.H.Koch，A.MacPherson，D.Flockhart，Y.R.Yoon，J.S.Yoon，Y.H.Kim，and J.G.Shin.2002.Associationbetween CYP2D6 genotype and tardive dyskinesia in Korean schizophrenics.Pharmacogenomics J 2(6)：400-7；Bertilsson，L.，M.L.Dahl，and G.Tybring.1997.Pharmacogenetics of antidepressants：clinical aspects.Acta PsychiatrScand Suppl 391：14-21.；Chen，S.，W.H.Chou，R.A.Blouin，Z.Mao，L.L.Humphries，Q.C.Meek，J.R.Neill，W.L.Martin，L.R.Hays，and P.J.Wedlund.1996.The cytochrome P450 2D6(CYP2D6)enzyme polymorphism：screening costs and influence on clinical outcomes in psychiatry.ClinPharmacol Ther 60(5)：522-34)。目标多核苷酸还可对应于：与应答止痛药的易感体质相对应的基因序列或其它多核苷酸序列(见，例如Torres-Galvan，M.J.，N.Ortega，F.Sanchez-Garcia，C.Blanco，T.Carrillo，and J.Quiralte.2001.LTC4-synthase A-444C polymorphism：lack of association withNSAID-induced isolated periorbital angioedema in a Spanish population.AnnAllergy Asthma Immunol 87(6)：506-10.)。

J.有效药物应答中涉及的基因

本发明的方法、组合物和分析系统可用于遗传检验，用于对药物反应的可能的指示。本发明的方法、组合物和分析系统可用于确定目前的治疗是否有效，或是否抗性(或耐受性)正在发展。基因表达检验可被用于检测肿瘤是否形成，或将要形成，对治疗的抗性。基于基因的诊断试验还可包括：对在未来发展成疾病或紊乱的可能性进行初筛，对某些类型的癌症的遗传易感体质进行初筛，以及确定遗传多态性。

核酸类似物可被设计为用于检测特定基因是否存在以及是否表达。在一个方面，本发明的方法可用于检测能代谢相关药物的酶的表达水平。多态性酶会改变药物的效果，并因此改变它们用于治疗的能力。可对影响到相关药物应答(并因此影响到药物用于治疗的能力)的基因中的遗传多态性进行检测。

在一种实施方式中，核酸类似物可被设计为用于检测编码细胞色素CYP2D6的序列或序列片段。细胞色素CYP2D6可代谢用于治疗抗高血压的Debrisoquin。CYP2D6表达的提高暗示了对Debrisoquin的抗性(见，例如Mahgoub，A.，J.R.Idle，L.G.Dring，R.Lancaster，and R.L.Smith.1977.Polymorphic hydroxylation of Debrisoquine in man.Lancet 2(8038)：584-6；and Wennerholm，A.，I.Johansson，A.Y.Massele，M.Lande，C.Alm，Y.Aden-Abdi，M.L.Dahl，M.Ingelman-Sundberg，L.Bertilsson，and L.L.Gustafsson.1999.Decreased capacity for debrisoquine metabolism among black Tanzanians：analyses of the CYP2D6 genotype and phenotype.Pharmacogenetics 9(6)：707-14)。

细胞色素CYP2D6的存在或表达可被用于测定对司巴丁(sparteine)(用于治疗手术后疼痛)的抗性(见，例如Eichelbaum，M.，N.Spannbrucker，B.Steincke，and H.J.Dengler.1979.Defective N-oxidation ofsparteine in man：a new pharmacogenetic defect.Eur J Clin Pharmacol 16(3)：183-7；Broly，F.，D.Marez，N.Sabbagh，M.Legrand，S.Millecamps，J.M.LoGuidice，P.Boone，and U.A.Meyer.1995.An efficient strategy for detection ofknown and new mutations of the CYP2D6 gene using single strandconformation polymorphism analysis.Pharmacogenetics 5(6)：373-84)。

细胞色素CYP2D6的存在或表达可被用于测定对去甲替林(用于治疗抑郁或心血管疾病)的抗性(见，例如Dalen，P.，M.L.Dahl，M.L.Ruiz，J.Nordin，and L.Bertilsson.1998.10-Hydroxylation of nortriptyline in whitepersons with 0，1，2，3，and 13 functional CYP2D6 genes.Clin Pharmacol Ther63(4)：444-52；Yue，Q.Y.，Z.H.Zhong，G.Tybring，P.Dalen，M.L.Dahl，L.Bertilsson，and F.sjoqvist.1998.Pharmacokinetics of nortriptyline and its 10-hydroxy metabolite in Chinese subjects of different CYP2D6 genotypes.ClinPharmacol Ther 64(4)：384-90)。

细胞色素P459的存在或表达可被用于测定改变的可待因(codeine)代谢(见，例如Sindrup，S.H.，and K.Brosen.1995.The pharmacogenetics ofcodeine hypoalgesia.Pharmacogenetics 5(6)：335-46；Mortimer，O.，K.Persson，M.G.Ladona，D.Spalding，U.M.Zanger，U.A.Meyer，and A.Rane.1990.Polymorphic formation of morphine from codeine in poor and extensivemetabolizers of dextromethorphan：relationship to the presence ofimmunoidentified cytochrome P-450IID1.Clin Pharmacol Ther 47(1)：27-35)。

在另一种实施方式中，核酸类似物被设计为用于检测编码细胞色素CYP2C9的序列或序列片段。细胞色素CYP2C9可代谢华法林(Warfarin)(其被用作为抗凝血剂)(见，例如Aithal，G.P.，C.P.Day，P.J.Kesteven，and A.K.Daly.1999.Association of polymorphisms in thecytochrome P450 CYP2C9 with warfarin dose requirement and risk of bleedingcomplications.Lancet 353(9154)：717-9；Loebstein，R.，H.Yonath，D.Peleg，S.Almog，M.Rotenberg，A.Lubetsky，J.Roitelman，D.Harats，H.Halkin，and D.Ezra.2001.Interindividual variability in sensitivity to warfarin--Nature ornurture？Clin Pharmacol Ther 70(2)：159-64)。

细胞色素CYP2C9还可代谢用于治疗脑部损伤的苯妥英(Phenytoin)(见，例如van der Weide，J.，L.S.Steijns，M.J.van Weelden，and K.de Haan.2001.The effect of genetic polymorphism of cytochrome P450 CYP2C9 onphenytoin dose requirement.Pharmacogenetics 11(4)：287-91；Brandolese，R.，M.G.Scordo，E.Spina，M.Gusella，and R.Padrini.2001.Severe phenytoinintoxication in a subject homozygous for CYP2C9*3.Clin Pharmacol Ther 70(4)：391-4)。

此外，细胞色素CYP2C19可代谢用于治疗胃酸返流疾病的奥美拉唑(Omeprazole)(见，例如Balian，J.D.，N.Sukhova，J.W.Harris，J.Hewett，L.Pickle，J.A.Goldstein，R.L.Woosley，and D.A.Flockhart.1995.Thehydroxylation of omeprazole correlates with S-mephenytoin metabolism：apopulation study.Clin Pharmacol Ther 57(6)：662-9；Tybring，G.，Y.Bottiger，J.Widen，and L.Bertilsson.1997.Enantioselective hydroxylation of omeprazolecatalyzed by CYP2C19 in Swedish white subjects.Clin Pharmacol Ther 62(2)：129-37)。

在又一种实施方式中，核酸类似物可被设计为用于检测编码二氢嘧啶脱氢酶的序列或序列片段。二氢嘧啶脱氢酶可代谢氟尿嘧啶(其被用于治疗抗肿瘤类疾病(对多种癌症的治疗))(见，例如Tuchman，M.，J.S.Stoeckeler，D.T.Kiang，R.F.O′Dea，M.L.Ramnaraine，and B.L.Mirkin.1985.Familial pyrimidinemia and pyrimidinuria associated with severe fluorouraciltoxicity.N Engl J Med 313(4)：245-9；Diasio，R.B.，T.L.Beavers，and J.T.Carpenter.1988.Familial deficiency of dihydropyrimidine dehydrogenase.Biochemical basis for familial pyrimidinemia and severe 5-fluorouracil-inducedtoxicity.J Clin Invest 81(1)：47-51)。

核酸类似物可被设计为用于检测编码丁酰胆碱酯酶的序列或序列片段，丁酰胆碱酯酶可代谢作为肌肉弛缓剂的琥珀胆碱(见，例如Lockridge，O.1990.Genetic variants of human serum cholinesterase infuence metabolismof the muscle relaxant succinylcholine.Pharmacol Ther 47(1)：35-60；andCeppa，F.，S.Gidenne，A.Benois，E.Fontan，and P.Burnat.2002.Rapididentification of atypical variant of plasma butyrylcholinesterase by PCR.ClinChem Lab Med 40(8)：799-801)。

核酸类似物可被设计为用于检测编码N-乙酰转移酶2的序列或序列片段，N-乙酰转移酶2可代谢用于治疗结核病的异烟肼(Isoniazid)(见，例如Furet，Y.，Y.Bechtel，C.Le Guellec，P.R.Bechtel，E.Autret-Leca，and G.Paintaud.2002.Clinical relevance of N-acetyltransferase type 2(NAT2)geneticpo1ymorphism，Therapie 57(5)：427-31；Kita，T.，Y.Tanigawara，S.Chikazawa，H.Hatanaka，T.Sakaeda，F.Komada，S.Iwakawa，and K.Okumura.2001.N-Acetyltransferase2 genotype correlated with isoniazid acetylation in Japanesetuberculous patients.Biol Pharm Bull 24(5)：544-9；and Hiratsuka，M.2002.Development of simplified and rapid detection assay for genetic polymorphismsinfluencing drug response and its clinical applications.Yakugaku Zasshi 122(7)：451-63)。

N-乙酰转移酶2还可代谢用于治疗抗高血压的肼苯哒嗪(Hydralazine)(见，例如Timbrell，J.A.，S.J.Harland，and V.Facchini.1980.Polymorphic acetylation of hydralazine.Clin Pharmacol Ther 28(3)：350-5；和Zschieschang，P.，F.Hiepe，E.Gromnica-Ihle，I.Roots，and I.Cascorbi.2002.Lack of association between arylamine N-acetyltransferase 2(NAT2)polymorphism and systemic lupus erythematosus.Pharmacogenetics 12(7)：559-63)。

N-乙酰转移酶2可代谢用于治疗抗心律不齐的普鲁卡因胺(Procainamide)(见，例如Reidenberg，M.M.，D.E.Drayer，M.Levy，andH.Warner.1975.Polymorphic acetylation procainamide in man.ClinPharmacol Ther 17(6)：722-30；and Hickman，D.，J.R.Palamanda，J.D.Unadlcat，and E.Sim.1995.Enzyme kinetic properties of human recombinantarylamine N-acetyltransferase 2 allotypic variants expressed in Escherichia coli.Biochem Pharmacol 50(5)：697-703)。

在另一个方面，核酸类似物可被设计为用于检测编码尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(ruidine disphosphate-glucuronosyltransferase)1A1的序列或序列片段。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1可代谢用于治疗直肠癌的伊立替康(Irinotecan)(见，例如Iyer，L.，D.Hall，S.Das，M.A.Mortell，J.Ramirez，S.Kim，A.Di Rienzo，and M.J.Ratain.1999.Phenotype-genotypecorrelation of in vitro SN-38(active metabolite of irinotecan)and bilirubinglucuronidation in human liver tissue with UGT1A1 promoter polymorphism.Clin Pharmacol Ther 65(5)：576-82；Ando，Y.，H.Saka，G.Asai，S.Sugiura，K.Shimokata，and T.Kamataki.1998.UGTlAl genotypes and glucuronidation ofSN-38，the active metabolite ofirinotecan.Ann Oncol 9(8)：845-7)。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1还可代谢用于治疗Gilbert’s综合征(温和的肝脏紊乱)的胆红素(见，例如Bosma，P.J.，J.R.Chowdhury，C.Bakker，S.Gantla，A.de Boer，B.A.Oostra，D.Lindhout，G.N.Tytgat，P.L.Jansen，R.P.Oude Elferink，and et al.1995.The genetic basis of the reducedexpression of bilirubin UDP-glucuronosyltransferase 1 in Gilbert′s syndrome.NEngl J Med 333(18)：1171-5；Kim，Y.H.，J.E.Yeon，G.M.Jung，H.J.Kim，J.S.Kim，K.S.Byun，Y.T.Bak，and C.H.Lee.2002.A study of polymorphismin UDP-glucuronosyltransferase 1(UGT-1A1)promoter gene in Korean patientswith Gilbert′s syndrome.Taehan Kan Hakhoe Chi 8(2)：132-8)。

核酸类似物还可被设计为用于检测编码硫嘌呤S-甲基转移酶的序列或序列片段，硫嘌呤S-甲基转移酶可代谢用于治疗Crohn′s症的巯基嘌呤(Mercaptopurine)(见，例如Weinshilboum，R.M.1992.Methylationpharmacogenetics：thiopurine methyltransferase as a model system.Xenobiotica 22(9-10)：1055-71；and Wennerholm，A.，I.Johansson，A.Y.Massele，M.Lande，C.Alm，Y.Aden-Abdi，M.L.Dahl，M.Ingelman-Sundberg，L.Bertilsson，and L.L.Gustafsson.1999.Decreased capacity for debrisoquinemetabolism among black Tanzanians：analyses of the CYP2D6 genotype andphenotype.Pharmacogenetics 9(6)：707-14)。

硫嘌呤S-甲基转移酶还可代谢也是用于治疗Crohn′s症的咪唑硫嘌呤(Azathioprine)(见，例如Kaskas，B.A.，E.Louis，U.Hindorf，E.Schaeffeler，J.Deflandre，F.Graepler，K.Schmiegelow，M.Gregor，U.M.Zanger，M.Eichelbaum，and M.Schwab.2003.Safe treatment of thiopurine S-methyltransferase deficient Crohn′s disease patients with azathioprine.Gut 52(1)：140-2；and Marra，C.A.，J.M.Esdaile，and A.H.Anis.2002.PracticalPharmacogeneties：The Cost Effectiveness of Screening for Thiopurine s-Methyltransferase Polymorphisms in Patients with Rheumatological ConditionsTreated with Azathioprine.J Rheumatol 29(12)：2507-12)。

核酸类似物还可被设计为用于检测编码儿茶酚O-甲基转移酶的序列或序列片段，儿茶酚O-甲基转移酶可代谢用于治疗Parkinson′s症的左旋多巴(Levodopa)(见，例如Reilly，D.K.，L.Rivera-Calimlim，and D.Van Dyke.1980.Catechol-O-methyltransferase activity：a determinant of levodoparesponse.Clin Pharmacol Ther 28(2)：278-86；and Wennerholm，A.，I.Johansson，A.Y.Massele，M.Lande，C.Alm，Y.Aden-Abdi，M.L.Dahl，M.Ingelman-Sundberg，L.Bertilsson，and L.L.Gustafsson.1999.Decreasedcapacity for debrisoquine metabolism among black Tanzanians：analyses of theCYP2D6 genotype and phenotype.Pharmacogenetics 9(6)：707-14)。

核酸类似物还可被设计为用于检测与药物抗性相关的遗传多态性。在一种实施方式中，核酸类似物可被设计为用于检测ACE多态性，其会影响到ACE抑制剂抗高血压药(用于治疗心力衰竭)的应答(见，例如Jacobsen，P.，K.Rossing，P.Rossing，L.Tarnow，C.Mallet，O.Poirier，F.Cambien，and H.H.Parving.1998.Angiotensin converting enzyme genepolymorphism and ACE inhibition in diabetic nephropathy.Kidney Int 53(4)：1002-6；Kohno，M.，K.Yokokawa，M.Minami，H.Kano，K.Yasunari，T.Hanehira，and J.Yoshikawa.1999.Association between angiotensin-convertingenzyme gene polymorphisms and regression of left ventricular hypertrophy inpatients treated with angiotensin-converting enzyme inhibitors.Am J Med 106(5)：544-9)。

ACE多态性还会影响对氟伐他汀(Fluvastatin，用于治疗冠状动脉粥样硬化)的应答(见，例如Marian，A.J.，F.Safavi，L.Ferlic，J.K.Dunn，A.M.Gotto，and C.M.Ballantyne.2000.Interactions between angiotensin-Iconverting enzyme insertion/deletion polymorphism and response of plasmalipids and coronary atherosclerosis to treatment with fluvastatin：the lipoproteinand coronary atherosclerosis study.J Am Coll Cardiol 35(1)：89-95；Bosse，Y.，M.C.Vohl，M.Dumont，M.Brochu，J.Bergeron，J.P.Despres，and D.Prud′homme.2002.Influence of the angiotensin-converting enzyme geneinsertion/deletion polymorphism on lipoprotein/lipid response to gemfibrozil.Clin Genet 62(1)：45-52)。

在另一种实施方式中，核酸类似物可被设计为用于检测花生四烯酸5-酯加氧酶多态性，其会影响到用作为抗炎药的白细胞三烯抑制剂的应答(见，例如Fowler，S.J.，I.P.Hall，A.M.Wilson，A.P.Wheatley，and B.J.Lipworth.2002.5-Lipoxygenase polymorphism and in-vivo response toleukotriene receptor antagonists.Eur J Clin Pharmacol 58(3)：187-90；andKoshino，T.，S.Takano，S.Kitani，N.Ohshima，Y.Sano，T.Takaishi，K.Hirai，K.Yamamoto，and Y.Morita.1999.Novel polymorphism of the 5-lipoxygenaseactivating protein(FLAP)promoter gene associated with asthma.Mol Cell BiolRes Commun 2(1)：32-5)。

核酸类似物可被设计为用于检测β2-肾上腺素受体多态性，其会影响到用于治疗哮喘和肺部疾病的β2激动药的应答(见，例如Liggett，S.B.2000.beta(2)-adrenergic receptor pharmacogenetics.Am J Respir Crit CareMed 161(3 Pt 2)：S197-201；Dishy，V.，G.G.Sofowora，H.G.Xie，R.B.Kim，D.W.Byrne，C.M.Stein，and A.J.Wood.2001.The effect of commonpolymorphisms of the beta2-adrenergic receptor on agonist-mediated vasculardesensitization.N EnglJ Med 345(14)：1030-5)。

核酸类似物可被设计为用于检测缓激肽B2受体多态性，其会影响到用于治疗心力衰竭的ACE抑制剂的应答(见，例如Mukae，S.，S.Aoki，S.Itoh，T.Iwata，H.Ueda，and T.Katagiri.2000.Bradykinin B(2)receptor genepolymorphism is associated with angiotensin-converting enzyme inhibitor-related cough.Hypertension 36(1)：127-31；Mukae，S.，S.Itoh，S.Aoki，T.Iwata，K.Nishio，R.Sato，and T.Katagiri.2002.Association of polymorphismsof the renin-angiotensin system and bradykinin B2 receptor with ACE-inhibitor-related cough.J Hum Hypertens 16(12)：857-63)。

核酸类似物可被设计为用于检测多巴胺受体(D2、D3、D4)多态性，其会影响到抗精神病药的应答(见，例如Arranz，M.J.，J.Munro，J.Birkett，A.Bolonna，D.Mancama，M.Sodhi，K.P.Lesch，J.F.Meyer，P.Sham，D.A.Collier，R.M.Murray，and R.W.Kerwin.2000.Pharmacogeneticprediction of clozapine response.Lancet 355(9215)：1615-6；I Basile，V.S.，M.Masellis，F.Badri，A.D.Paterson，H.Y.Meltzer，J.A.Lieberman，S.G.Potkin，F.Macciardi，and J.L.Kennedy.1999.Association of the MscI polymorphismof the dopamine D3 receptor gene with tardive dyskinesia in schizophrenia.Neuropsychopharmacology 21(1)：17-27)。

核酸类似物还可被设计为用于检测雌激素(Estrogen)受体-α多态性，其会影响到共轭雌激素的应答，并可用于对绝经、骨质疏松症进行的激素替代疗法(见，例如Herrington，D.M.，T.D.Howard，G.A.Hawkins，D.M.Reboussin，J.Xu，S.L.Zheng，K.B.Brosnihan，D.A.Meyers，and E.R.Bleecker.2002.Estrogen-receptor polymorphisms and effects of estrogenreplacement on high-density lipoprotein cholesterol in women with coronarydisease.N Engl J Med 346(13)：967-74；Ongphiphadhanakul，B.，S.Chanprasertyothin，P.Payatikul，S.S.Tung，N.Piaseu，L.Chailurkit，S.Chansirikarn，G.Puavilai，and R.Rajatanavin.2000.Oestrogen-receptor-alphagene polymorphism affects response in bone mineral density to oestrogen inpost-menopausal women.Clin Endocrinol(Oxf)52(5)：581-5)。

核酸类似物可被设计为用于检测糖蛋白IIb/IIIa的糖蛋白IIIa亚基多态性，其会影响到阿司匹林或糖蛋白IIb/IIIa抑制剂(用于治疗心肌梗塞)的应答(见，例如Michelson，A.D.，M.I.Furman，P.Goldschmidt-Clermont，M.A.Mascelli，C.Hendrix，L.Coleman，J.Hamlington，M.R.Barnard，T.Kickler，D.J.Christie，S.Kundu，and P.F.Bray.2000.Platelet GP IIIa P1(A)polymorphisms display different sensitivities to agonists.Circulation 101(9)：1013-8；Andrioli，G.，P.Minuz，P.Solero，S.Pincelli，R.Ortolani，S.Lussignoli，and P.Bellavite.2000.Defective platelet response to arachidonic acid andthromboxane A(2)in subjects with P1(A2)polymorphism of beta(3)subunit(glycoprotein IIIa).Br J Haematol 110(4)：911-8)。

在又一种实施方式中，核酸类似物可被设计为用于检测复合胺(5-羟色胺)转运蛋白的多态性，其会影响到用于治疗Alzheimer′s症和抑郁症的抗抑郁药的应答(见，例如Kim，D.K.，S.W.Lim，S.Lee，S.E.Sohn，S.Kim，C.G.Hahn，and B.J.Carroll.2000.Serotonin transporter genepolymorphism and antidepressant response.Neuroreport 11(1)：215-9和Smeraldi，E.，R.Zanardi，F.Benedetti，D.Di Bella，J.Perez，and M.Catalano.1998.Polymorphism within the promoter of the serotonin transporter gene andantidepressant efficacy of fluvoxamine.Mol Psychiatry 3(6)：508-11)。

核酸类似物可被设计为用于检测内收蛋白(adducin)多态性，其会影响到用于治疗心肌梗塞、高血压的利尿剂的应答(见，例如Sciarrone，M.T.，P.Stella，C.Barlassina，P.Manunta，C.Lanzani，G.Bianchi，and D.Cusi.2003.ACE and alpha-adducin polymorphism as markers of individual responseto diuretic therapy.Hypertension 41(3)：398-403；Psaty，B.M.，N.L.Smith，S.R.Heckbert，H.L.Vos，R.N.Lemaitre，A.P.Reiner，D.S.Siscovick，J.Bis，T.Lumley，W.T.Longstreth，Jr.，and F.R.Rosendaal.2002.Diuretic therapy，thealpha-adducin gene variant，and the risk of myocardial infarction or stroke inpersons with treated hypertension.Jama 287(13)：1680-9)。

核酸类似物还可被设计为用于检测载脂蛋白E(APOE)多态性，其会影响到用于治疗冠状动脉疾病、胆固醇和动脉粥样硬化的斯达汀(statin)的应答(见，例如Ordovas，J.M.，J.Lopez-Miranda，F.Perez-Jimenez，C.Rodriguez，J.S.Park，T.Cole，and E.J.Schaefer.1995.Effect of apolipoproteinE and A-IV phenotypes on the low density lipoprotein response to HMG CoAreductase inhibitor therapy.Atherosclerosis 113(2)：157-66；Gerdes，L.U.，C.Gerdes，K.Kervinen，M.Savolainen，I.C.Klausen，P.S.Hansen，Y.A.Kesaniemi，and O.Faergeman.2000.The apolipoprotein epsilon4 alleledetermines prognosis and the effect on prognosis of simvastatin in survivors ofmyocardial infarction：a substudy of the Scandinavian simvastatin survivalstudy.Circulation 101(12)：1366-71)。

APOE多态性还能影响到用于治疗Alzheimer’s症的他克林(Tacrine)的应答(见，例如Poirier，J.，M.C.Delisle，R.Quirion，I.Aubert，M.Farlow，D.Lahiri，S.Hui，P.Bertrand，J.Nalbantoglu，B.M.Gilfix，and et al.1995.Apolipoprotein E4 allele as a predictor of cholinergic deficits and treatmentoutcome in Alzheimer disease.Proc Natl Acad Sci USA 92(26)：12260-4.Poirier，J.1999.Apolipoprotein E：a pharmacogenetic target for the treatment ofAlzheimer′s disease.Mol Diagn 4(4)：335-41；Soininen，H.，O.Kosunen，S.Helisalmi，A.Mannermaa，L.Paljarvi，S.Talasniemi，M.Ryynanen，and P.Riekkinen，Sr.1995.A severe loss of choline acetyltransferase in the frontalcortex of Alzheimer patients carrying apolipoprotein epsilon 4 allele.NeurosciLett 187(2)：79-82)。

在另一种实施方式中，核酸类似物还可被设计为用于检测HLA多态性，其会影响到用作为抗病毒药及用于治疗HIV的阿巴卡韦(Abacavir)的应答(见，例如Mallal，S.，D.Nolan，C.Witt，G.Masel，A.M.Martin，C.Moore，D.Sayer，A.Castley，C.Mamotte，D.Maxwell，I.James，and F.T.Christiansen.2002.Association between presence of HLA-B*5701，HLA-DR7，and HLA-DQ3 and hypersensitivity to HIV-1 reverse-transcriptase inhibitorabacavir.Lancet 359(9308)：727-32和Hetherington，S.，A.R.Hughes，M.Mosteller，D.Shortino，K.L.Baker，W.Spreen，E.Lai，K.Davies，A.Handley，D.J.Dow，M.E.Fling，M.Stocum，C.Bowman，L.M.Thurmond，and A.D.Roses.2002.Genetic variations in HLA-B region and hyPersensitivity reactionsto abacavir.Lancet 359(9312)：1121-2)。

核酸类似物还可被设计为用于检测胆固醇酯转运蛋白(CETP)多态性，其会影响到用于治疗冠状动脉疾病、胆固醇和动脉粥样硬化的斯达汀的应答(见，例如Kuivenhoven，J.A.，J.W.Jukema，A.H.Zwinderman，P.de Knjiff.R.McPherson，A.V.Bruschke，K.I.Lie，and J.J.Kastelein.1998.The role of a common variant of the cholesteryl ester transfer protein gene in theprogression of coronary atherosclerosis.The Regression Growth EvaluationStatin Study Group.N Engl J Med 338(2)：86-93；Rump，P.，R.P.Mensink，andG.Hornstra.2002.Interaction between a common variant of the cholesterylester transfer protein gene and the apolipoprotein E polymorphism：effects onplasma lipids and lipoproteins in a cohort of 7-year-old children.Nutr MetabCardiovasc Dis 12(6)：317-24和van Venrooij，F.V.，R.P.Stolk，J.D.Banga，T.P.Sijmonsma，A.van Tol，D.W.Erkelens，and G.M.Dallinga-Thie.2003.Common cholesteryl ester transfer protein gene polymorphisms and the effect ofatorvastatin therapy in type2 diabetes.Diabetes Care 26(4)：1216-23)。

在另一种实施方式中，核酸类似物可被设计为用于检测离子通道相关的多态性，其会影响到用于治疗细菌感染的红霉素(一种抗生素)的应答(见，例如Sesti，F.，G.W.Abbott，J.Wei，K.T.Murray，S.Saksena，P.J.Schwartz，S.G.Priori，D.M.Roden，A.L.George，Jr.，and S.A.Goldstein.2000.A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiacarrhythmia.Proc Natl Acad Sci USA 97(19)：10613-8；Abbott，G.W.，F.Sesti，I.Splawslci，M.E.Buck，M.H.Lehmann，K.W.Timothy，M.T.Keating，and S.A.Goldstein.1999.MiRPl forms IKr potassium channels with HERG and isassociated with cardiac arrhythmia.Cell 97(2)：175-87)。

核酸类似物还可被设计为用于检测甲基鸟嘌呤甲基转移酶多态性，其会影响到用于治疗胶质瘤的卡氯芥(Carmustine)的应答(见，例如Esteller，M.，J.Garcia-Foncillas，E.Andion，S.N.Goodman，O.F.Hidalgo，V.Vanaclocha，S.B.Baylin，and J.G.Herman.2000.Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents.NEngl J Med 343(19)：1350-4；Gerson，S.L.2002.Clinical relevance of MGMTin the treatment of cancer.J Clin Oncol 20(9)：2388-99)。

核酸类似物可被设计为用于检测Parkin多态性，其会影响到用于治疗parkinson′s症的左旋多巴的应答(见，例如Lucking，C.B.，A.Durr，V.Bonifati，J.Vaughan，G.De Michele，T.Gasser，B.S.Harhangi，G.Meco，P.Denefle，N.W.Wood，Y.Agid，and A.Brice.2000.Association between early-onset Parkinson′s disease and mutations in the parkin gene.French Parkinson′sDisease Genetics Study Group.N Engl J Med 342(21)：1560-7；Bonifati，V.，G.De Michele，C.B.Lucking，A.Durr，E.Fabrizio，G.Ambrosio，N.Vanacore，M.De Mari，R.Marconi，L.Capus，M.M.Breteler，T.Gasser，B.Oostra，N.Wood，Y.Agid，A.Filla，G.Meco，and A.Brice.2001.The parkin gene and itsphenotype.Italian PD Genetics Study Group，French PD Genetics Study Groupand the European Consortium on Genetic Susceptibility in Parkinson′s Disease.Neurol Sci 22(1)：51-2)。

核酸类似物可被设计为用于检测凝血素和因子V多态性，其会影响到口服避孕药的应答，并能指示出血栓形成发展的潜在风险(见，例如Tassin，J.，A.Durr，A.M.Bonnet，R.Gil，M.Vidailhet，C.B.Lucking，J.Y.Goas，F.Durif，M.Abada，B.Echenne，J.Motte，A.Lagueny，L.Lacomblez，P.Jedynak，B.Bartholome，Y.Agid，and A.Brice.2000.Levodopa-responsivedystonia.GTP cyclohydrolase I or parkin mutations？Brain 123(Pt 6)：1112-21；Martinelli，I.，E.Sacchi，G.Landi，E.Taioli，F.Duca，and P.M.Mannucci.1998.High risk of cerebral-vein thrombosis in carriers of a prothrombin-gene mutationand in users of oral contraceptives.N Engl J Med 338(25)：1793-7；andMartinelli，I.，E.Taioli，P.Bucciarelli，S.Akhavan，and P.M.Mannucci.1999.Interaction between the G20210A mutation of the prothrombin gene and oralcontraceptive use in deep vein thrombosis.Arterioscler Thromb Vase Biol 19(3)：700-3)。

核酸类似物还可被设计为用于检测基质溶解酶-1(Stromelysin-1)多态性，其会影响到用于治疗动脉粥样硬化的斯达汀的应答(见，例如Legnani，C.，G.Palareti，G.Guazzaloca，B.Cosmi，B.Lunghi，F.Bernard，and S.Coccheri.2002.Venous thromboembolism in young women；role ofthrombophilic mutations and oral contraceptive use.Eur Heart J 23(12)：984-90；Liggett，S.B.2000.beta(2)-adrenergic receptor pharmacogenetics.Am J RespirCrit Care Med 161(3 Pt 2)：S197-201；Humphries，S.E.，L.A.Luong，P.J.Talmud，M.H.Frick，Y.A.Kesaniemi，A.Pasternack，M.R.Taskinen，and M.Syvanne.1998.The 5A/6A polymorphism in the promoter of the stromelysin-1(MMP-3)gene predicts progression of angiographically determined coronaryartery disease in men in the LOCAT gemfibrozil study.Lopid CoronaryAngiography Trial.Atherosclerosis 139(1)：49-56).Humphries，S.，C.Bauters，A.Meirhaeghe，L.Luong，M.Bertrand，and P.Amouyel.2002.The 5A6Apolymorphism in the promoter of the stromelysin-1(MMP3)gene as a riskfactor for restenosis.Eur Heart J 23(9)：721-5；and de Maat，M.P.，J.W.Jukema，S.Ye，A.H.Zwinderman，P.H.Moghaddam，M.Beekman，J.J.Kastelein，A.J.van Boven，A.V.Bruschke，S.E.Humphries，C.Kluft，and A.M.Henney.1999.Effect of the stromelysin-1 promoter on efficacy ofpravastatin in coronary atherosclerosis and restenosis.Am J Cardiol 83(6)：852-6)。

K.经遗传修饰的生物

本文公开的方法还提供了对是否存在经遗传修饰的生物(GMO)进行快速且灵敏的诊断试验的方法。GMO的例子包括但不限于：其中一种或多种基因已经经过修饰、添加或缺失的生物。GMO可具有如下特征：存在一种或多种特定基因、不存在一种或多种特定基因、特定变化、或一种或多种特定基因的表达有所改变。核酸类似物可被设计为用于与GMO所特有的目标多核苷酸互补。用本反应的方法可对GMO是否存在和存在的量进行测量。

L.非本地植物和动物

本文公开的方法还提供了对非本地植物和动物是否存在以及存在的数量进行快速且灵敏的诊断试验的方法。对特定区域来说是非本地的生物会对本地植物和动物造成环境和生物危害。核酸类似物可被设计为：与非本地植物和动物所特有的目标多核苷酸互补。用本发明的方法，可对是否存在非本地植物和动物以及存在的量进行测量。

M.农业应用

本文公开的方法还提供了对特定植物和植物变异体是否存在以及存在的数量进行快速且灵敏的诊断试验的方法。核酸类似物可被设计为：与特定植物和植物变异体所特有的目标多核苷酸互补。用本发明的方法，可对是否存在特定植物和植物变异体以及存在的量进行测量。

N.兽医应用

本文公开的方法、组合物和分析系统还提供了用于兽医应用中的快速且灵敏的诊断试验方法。核酸类似物可被设计为与目标多核苷酸互补，所述目标多核苷酸对应于基于动物的感染，或对应于遗传疾病或紊乱。

在一种实施方式中，本发明的方法、组合物和分析系统可被用于检测是否存在狂犬病病毒或是否被其感染。核酸类似物可被设计为：具有用于对狂犬病进行基于PCR的检测的引物的序列。用于通过基于PCR的分析来鉴定狂犬病的引物的例子是本领域内已知的(见，例如Ito M，Itou T，Shoji Y，Sakai T，Ito FH，Arai YT，Takasaki T，Kurane I.Discriminationbetween dog-related and vampire bat-related rabies viruses in Brazil by strain-specific reverse transcriptase-polymerase chain reaction and restriction fragmentlength polymorphism analysis.J Clin Virol.2003 Apr；26(3)：317-30；BlackEM，Lowings JP，Smith J，Heaton PR，McElhinney LM.A rapid RT-PCRmethod to differentiate six established genotypes of rabies and rabies-relatedviruses using TaqMan technology.J Virol Methods.2002 Aug；105(1)：25-35；David D，Yakobson B，Rotenberg D，Dveres N，Davidson I，Stram Y.Rabiesvirus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains.VetMicrobiol.2002 Jun 20；87(2)：111-8；Ito M，Itou T，Sakai T，Santos MF，AraiYT，Takasaki T，Kurane I，Ito FH.Detection of rabies virus RNA isolated fromseveral species of animals in Brazil by RT-PCR，J Vet Med Sci.2001 Dec；63(12)：1309-13)。

在另一种实施方式中，本发明的方法、组合物和分析系统可用于检测猪应激综合征。猪应激综合征是兰尼定(ryanodine)受体(RYR-1)基因(同源的或异源的)突变所导致的。核酸类似物可被设计为：具有用于对猪应激综合征进行基于PCR的检测的引物的序列。用于通过基于PCR的分析来鉴定猪应激综合征的引物的例子是本领域内已知的(见，例如LeeSH，Cho KK，Kang SK，Kim CW，Park HC，Choy YH，Choi YJ.Detection ofpigs resistant to post-weaning diarrheaea，oedema disease and porcine stresssyndrome by allele-specific polymerase chain reaction.Anim Genet.2002 Jun；33(3)：237-9，Bu H，Liu J，Li SF.The RYR1 genotype of Chinese inbred pigs.Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi.2000 Sep；14(5)：311-4)。

本发明的方法、组合物和分析系统可用于检测高钾性周期性麻痹疾病(HyPP)。HyPP是美国夸特(Quarter)马或杂交种的遗传疾病。数据暗示，HyPP作为共显性遗传缺陷被遗传，因为纯合体较之杂合体显示出更为严重的临床征候。核酸类似物可被设计为：具有用于对HyPP进行基于PCR的检测的引物的序列。

在另一种实施方式中，本发明的方法、组合物和分析系统可用于检测FeCV(猫科冠状病毒)。核酸类似物可被设计为：具有用于对猫科冠状病毒进行基于PCR的检测的引物的序列。用于通过基于PCR的分析来鉴定猫科冠状病毒的引物的例子是本领域内已知的(见，例如Kennedy M，Citino S，McNabb AH，Moffatt AS，Gertz K，Kania S.Detection of felinecoronavirus in captive Felidae in the USA.J Vet Diagn Invest.2002 Nov；14(6)：520-2；Addie DD，Jarrett O.Use of a reverse-transcriptase polymerase chainreaction for monitoring the shedding of feline coronavirus by healthy cats.VetRec.2001 May 26；148(21)：649-53；Herrewegh AA，Mahler M，Hedrich HJ，Haagmans BL，Egberink HF，Horzinek MC，Rottier PJ，de Groot RJ.Persistenceand evolution of feline coronavirus in a closed cat-breeding colony.Virology.1997 Aug 4；234(2)：349-63)。

在另一种实施方式中，本发明的方法、组合物和分析系统可用于检测FIP病毒(普遍存在于猫科肠道的冠状病毒(FECV)的突变体)是否存在或是否被其感染。核酸类似物可被设计为：具有用于对FIP病毒进行基于PCR的检测的引物的序列。用于通过基于PCR的分析来鉴定FIP的引物的例子是本领域内已知的(见，例如Gunn-Moore DA，Gruffydd-Jones TJ，Harbour DA.Detection of feline coronaviruses by culture and reversetranscriptase-polymerase chain reaction of blood samples from healthy cats andcats with clinical feline infectious peritonitis.Vet Microbiol.1998 Jul；62(3)：193-205；Kennedy M，Boedeker N，Gibbs P，Kania S.Deletions in the 7a ORFof feline coronavirus associated with an epidemic of feline infectious peritonitis.Vet Microbiol.2001 Aug 8；81(3)：227-34)。

本发明的方法、组合物和分析系统还可用于检测马传染性贫血症病毒(EIAV)是否存在或是否被其感染。核酸类似物可被设计为：具有用于对EIAV病毒进行基于PCR的检测的引物的序列。用于通过基于PCR的分析来鉴定EIAV的引物的例子是本领域内已知的(见，例如Cook RF，CookSJ，Li FL，Montelaro RC，Issel CJ.Development of a multiplex real-time reversetranscriptase-polymerase chain reaction for equine infectious anemia virus(EIAV).J Virol Methods.2002 Aug；105(1)：171-9；Langemeier JL，Cook SJ，Cook RF，Rushlow KE，Montelaro RC，Issel CJ.Detection of equine infectiousanemia viral RNA in plasma samples from recently infected and long-terminapparent carrier animals by PCR.J Clin Microbiol.1996 Jun；34(6)：1481-7；Nagarajan MM，Simard C.Detection of horses infected naturally with equineinfectious anemia virus by nested polymerase chain reaction.J Virol Methods.2001 May；94(1-2)：97-109)。

本发明的方法、组合物和分析系统还可用于检测Brucella ovis是否存在或是否被其感染。核酸类似物可被设计为：具有用于对Brucella ovis病毒进行基于PCR的检测的引物的序列。用于通过基于PCR的分析来鉴定Brucella ovis的引物的例子是本领域内已知的(见，例如Manterola L，Tejero-Garces A，Ficapal A，Shopayeva G，Blasco JM，Marin CM，Lopez-Goni I.Evaluation of a PCR test for the diagnosis of Brucella ovis infection in semensamples from rams.，Vet Microbiol.2003 Mar 20；92(1-2)：65-72；Hamdy ME，Amin AS.Detection of Brucella species in the milk of infected cattle，sheep，goats and camels by PCR.Vet J.2002 May；163(3)：299-305；Bricker BJ，Halling SM.Differentiation of Brucella abortus bv.1，2，and 4，Brucellamelitensis，Brucella ovis，and Brucella suis bv.1 by PCR.J Clin Microbiol.1994 Nov；32(11)：2660-6)。

前述例子仅仅是示例性的。目标多核苷酸可以包括：与本领域已知的、能赋予抗生素抗性的其它基因相对应的多核苷酸。

VIII.试剂盒

在一个方面，本发明提供了用于检测目标多核苷酸的试剂盒。试剂盒可以包括：一种或多种可用于本发明中的试剂，例如，染料、核酸类似物、光刺激的来源、缓冲液、用于对照的标准、显示对照样品阳性或阴性以用于判断反应结果的参考(key)。可选地，提供一种或多种缓冲液。试剂盒还可以包括：对下文公开的组合物、说明书和/或其它可选的组分的合适的包装。

A.染料

本文提供的试剂盒包括一种或多种染料。

染料可以以预先包装的量来提供，或者可以以单独的小管来提供，从所述小管中可分出一定份量。

还可以将染料进一步包装于任何合适的包装中，以使其与试剂盒的其它组分分离，以及促进组合物的调剂。

B.核酸类似物

试剂盒还可以包括一种或多种核酸类似物。

核酸类似物可以是本文所述的任何形式的核酸类似物。在一种实施方式中，核酸类似物是LNA。在另一种实施方式中，核酸类似物是PNA。

核酸类似物可以具有任何与目标核酸序列互补或完全互补的序列。所述序列可以是本领域内已知的任何序列。在一种实施方式中，核酸类似物具有本文中公开的序列。

核酸类似物可被提供于任何合适的容器中，并可以预先分装为适于使用的份量，或者被提供于将进行分装的单独的小管中。还可以将容器进一步包装于任何合适的包装中，以使其与试剂盒的其它组分分离，以及促进净制组合物的调剂。在另一种实施方式中，同一包装中可含有两种或多种核酸类似物序列。

试剂盒还可以包括媒介物，用于促进核酸类似物与目标多核苷酸有效杂交，例如鲑鱼精DNA。

C.光刺激的来源

可选地，试剂盒还可以包括光刺激的来源。光源的非限制性的例子包括：Sylvania Cool White T8-CW、General Electric T8-C50和Fritz Aurora50/50、Sylvania dulux S9W CF9DS/蓝和Osram F9TT/50K。

D.多核苷酸操作组分

试剂盒还可包括用于对多核苷酸进行操作的组分，例如缓冲液、酶、柱和其它物质。

缓冲液、酶、柱和其它物质可以包括用于对细胞进行裂解或从细胞中提取DNA或RNA的那些。缓冲液、酶、柱和其它物质还可包括用于对多核苷酸(包括DNA和RNA)进行操作的组分。此类组分包括，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，third edition(Sambrook et a1.，2000)Cold Spring Harbor Press或本文公开的任何其它参考文献中所公开的那些。

E.说明书

试剂盒还可包括用于开展本文所述的方法的说明书。说明书可作为单独的部分和/或作为包装或容器的一部分(例如，作为贴到容器上的标签，或者，被写上去或用其它手段整合为容器一部分)被包括进来。说明书可以告诉使用者：应用和/或移除试剂盒中内含物的方法、关于对物质进行操作的预警和方法、期待结果、关于不正确使用的警告等。

F.试剂盒的其它可选组分

试剂盒还可含有可用于进行本文公开的方法的组分。

示例性的其它组分包括：对化学物质具有抗性的一次性包、试管、稀释剂、手套、剪刀、记号笔和眼保护罩。

                         实施例

下述非限制性的实施例用于更为完整地描述使用上文所述的本发明的手段。应当理解，这些实施例并非以任何方式来限制本发明的范围，其仅仅只作阐述示例目的之用。

除非另有指明，下文中所有核酸类似物和DNA贮藏溶液都被配制于pH7.5的5mM磷酸缓冲液中。贮藏染料被配制于甲醇或DMSO中。

 实施例1  用于检测PNA/多核苷酸结合的基于液体的分析系统

PNA/多核苷酸复合物的形成导致指示剂染料的颜色变化。花菜花叶病毒35S启动子DNA被用作为特定的目标多核苷酸。染料是3’，3’-二乙基硫杂羰花青。

在试管中，将15μM与花菜花叶病毒35S启动子互补的PNA分子(35SPNA)加入到5μM35S启动子DNA(35SDNA)中。PNA序列是CCCACCCACGAGG-LYS(SEQ ID NO：11)。加入处于5mM磷酸缓冲液(pH7.5)中的150μM染料。35SPNA和染料在系统中是过量的。

颜色变化显示多核苷酸的存在。

用1μl 2.5mM染料(稀释于总体积为50μl的5mM PO4反应缓冲液中)来进行基于液体的分析。系统和方法都经过检验，其在pH4-10的范围内是成功的，但是，在pH大于5时，系统能更好地运作。在时间为零时，pH4-10范围内的反应看上去互相都近乎一致，但较之缺少PNA/目标多核苷酸杂交体的对照具有更少的变动。暴露给光刺激后，反应物开始变澄清。进一步暴露给光刺激后，有PNA/多核苷酸杂交体的反应物变得完全澄清，pH6-10之间的反应物变化速率都相同。具有PNA/多核苷酸杂交体的、pH4-5之间的反应物具有残余染料，以不同深浅的粉红存在。

已经使用了大量10mM浓度的缓冲液。在不同的pH对一些缓冲液进行了检测。在高达0.5M的浓度下对NaPO₄缓冲液进行了检测。最理想地，使用的缓冲液和盐包括：NaPO₄、NaHSO₄、K₂HPO₄、K₂SO₄和CaSO₄。不能使本发明的方法成功进行的缓冲液和盐包括：柠檬酸钠、NaCl、CaH₂PO₄、FeSO₄和MgSO₄。本发明的方法还可使用：纯净水、0.1％ SDS、0.1％ Triton X、0.1％ Tween-20、3％丁醇、10％甲醇、10％异丙醇或10％ DMSO、1X血液裂解缓冲液(0.15M NH₄Cl、10mMNaHCO₃、1mM EDTA)(pH7.4)或蔗糖裂解缓冲液(0.32M蔗糖、10mM Tris、1％ Trition X-100、5mM MgCl₂)。

在pH4、5、5.5、6、7、8、9、10处对磷酸钠缓冲液进行了检验。在pH7.5时对其它所有缓冲液都进行了检验。pH7时，磷酸钠缓冲液能提供最快的反应。

对每微升反应物中300个目标多核苷酸进行检测。还检测了浓度为1.5×10¹⁴目标多核苷酸/反应(3×10¹²目标多核苷酸/μl反应物)；10⁸扩增出的目标多核苷酸/反应(2×10⁶扩增目标多核苷酸/μl反应物)。

    实施例2  测定PNA分子对PCR反应的影响

本实施例展示了不同PNA分子对PCR反应的影响。PCR组分如下：

组分                      体积      终浓度

水                        38μl     N/A

上游引物，50μM           0.5μl    25μM

下游引物，50μM           0.5μl    25μM

MgCl₂，25mM              3μl      1.5mM

10X反应缓冲液(Promega)    5μl      1X

PCR核苷酸混合物(Promega)，1μl      800μM

10mM每种dNTP

Taq DNA聚合酶，           0.5μl    0.05u/μl

Storage Buffer B(Promega)中，5u/μl

10X反应缓冲液的组成：

Tris-HCl                   100mM

KCl                        500mM

Triton X-100               1％

引物序列如下：

引物	引物序列
		OI 17	5′GCTCCTACAAATGCCATCA(SEQ ID NO：12)
OI 18	5′GATAGTGGGATTGTGCGTCA(SEQ ID NO：13)
		PNA	5′CCCACCCACGAGGAACATC(SEQ ID NO：14)

热循环仪程序(MJ Research PTC-200)

          95℃，1分钟

42个循环：94℃，10秒

          53℃，10秒

          72℃，20秒

保存于4℃。

通过PCR对下述样品进行分析，以确定PNA分子是否会抑制PCR反应；

1.1μl Bt/RR玉米DNA(Bt/RR玉米已经经过了遗传修饰)

2.1μl Bt/RR玉米DNA，1μl PNA(100mM)

3.1μl Bt/RR玉米DNA，5μl PNA(100mM)

4.1μl水

用2％ TBEE琼脂糖凝胶电泳来观察PCR结果。

对下述样品进行分析，以确定PNA的存在是否会抑制PCR。此外，测定PNA和甲醇对PCR效果的影响。

1.1μl Bt/RR玉米DNA

2.1μl Bt/RR玉米DNA，1μl PNA(100mM)

3.1μl Bt/RR玉米DNA，5μl PNA(100mM)

4.1μl Bt/RR玉米DNA，1μl甲醇

5.1μl Bt/RR玉米DNA，5μl甲醇

6.1μl Water

用2％ TBEE琼脂糖凝胶电泳来观察PCR结果。

结果显示，当向反应物中加入1μl PNA时，PNA不抑制PCR(管2)。当向向反应物中加入5μl PNA时，PNA抑制PCR(管3)。当向反应物中加入1μl甲醇时，甲醇不抑制PCR(管4)。当向反应物中加入5μl甲醇时，甲醇抑制PCR(管5)。

                     实施例3

针对特定的目标多核苷酸序列和PNA序列，对不同浓度的DNA分子，测定碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青光学性能受光刺激产生的变化的时间段。

目标多核苷酸是5′CTACGGGAGGCAGCAGTG 3′(SEQ ID NO：2)，互补的PNA分子是N′CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys.(SEQ ID NO：1)。目标多核苷酸浓度是列于图5的图例说明中的那些。PNA浓度为14.4pmol/反应。染料浓度为6nmol/反应。

图5示出了：对不同浓度的DNA而言，暴露给光刺激后碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青染料发射率随时间的变化。用混合波长的光源来刺激变化时，不同待测DNA浓度下的分析敏感度。图例中描述了多核苷酸(本例中，DNA)的不同浓度。图例浓度代表每项反应中的DNA终浓度。(□)代表仅含有探针和染料的样品；(△)代表仅含有染料的样品；(×)代表仅含有缓冲液的样品。

图6示出了不同DNA浓度下发射率的百分比变化。在较高的DNA浓度下，染料具有较高的发射率变化速率。通过对较高PNA浓度下染料光学性能变化速率与较低PNA浓度下(或不存在PNA时)染料光学性能变化速率进行比较，对目标多核苷酸的存在情况进行检测，并可对其进行定量，如图10所示。多核苷酸浓度与图5的图例中所示一致。

                     实施例4

本实施例表明：不同波长的光刺激下，染料光学性能的变化速率也不同。

将具有序列5′CTACGGGAGGCAGCAGTG 3′(SEQ ID NO：2)的目标多核苷酸(20pmol/反应)和具有序列N′CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys(SEQ ID NO：1)的PNA分子(14.4pmol/反应)与碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青染料组合起来，形成混合物。然后将该混合物暴露给不同光谱产生的光刺激(超过10分钟)，测量染料发射率随时间的百分比变化。

图7描述了本实验的结果。用Fritz Aurora 50/50可见光谱来产生白光刺激，产生400nm至700nm之间的波长。用蓝色滤光器来产生蓝光刺激。得到的蓝光在450nm至480nm之间。用绿色滤光器来产生绿光刺激。得到的绿光在450nm至480nm之间。用红色滤光器来产生红光刺激，得到的红光在630nm至720nm之间。

白光刺激得到了最大的发射率百分比变化。蓝光和绿光波长导致发射率的百分比变化初始时更慢。红光波长显示了非常慢的发射率百分比变化。

                     实施例5

本实施例表明：本发明的方法可用于检测核酸序列的区别。

准备两种样品。第一种样品含有：与DMO大豆多核苷酸中发现的GMO序列互补的PNA、GMO大豆多核苷酸以及碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青的混合物。第二种样品含有：与DMO大豆多核苷酸中发现的GMO序列互补的PNA、非GMO大豆多核苷酸以及碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青的混合物。暴露给光刺激后，对两种样品都观察其发射率随时间的百分比变化。对两种混合物而言，大豆多核苷酸都是从大豆植株叶片中获得的。在两种混合物中，使用1μl经过分离的DNA，反应体积为100μl，DNA浓度为25ng/μl。

图8中示出了得到的发射率随时间的变化速率。对样品测量碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青发射率随时间的百分比变化，样品中含有碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青、与经遗传修饰的生物(GMO)大豆的35S多核苷酸区域互补的PNA分子和经遗传修饰的生物(GMO)大豆多核苷酸或非GMO多核苷酸。染料的发射率变化来自PNA与GMO大豆的杂交，而杂交不会由非GMO大豆所导致。本方法能检测到GMO大豆，而检测不到的是非GMO大豆。本方法提供了检测DNA中存在的多核苷酸序列的区别的方法。

                     实施例6

本实施例显示：可以通过下述方法来测定样品中多核苷酸的含量：测量具有未知浓度的多核苷酸的样品中染料光学性能的变化速率，将光学性能的变化速率与已知的光学性能变化速率的曲线进行比较。时间可以是固定的，可在特定的反应时间对变化进行测量。对速率的测定还可包括：测定单个时间点处光学性能的变化，将光学性能的变化关联于具有已知浓度的一种或多种样品的浓度。

计算出对一系列多核苷酸浓度而言，发射率发生20％变化所需要的时间。目标多核苷酸序列是5′CTACGGGAGGCAGCAGTG 3′(SEQ ID NO：2)PNA分子序列是N′CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys(SEQ ID NO：1)。图10中示出了作为目标多核苷酸浓度的函数的降低20％所需要的时间。数据对应于图6中的百分比变化数据。对分析的一种方式而言，对具有未知浓度的样品，测量其发射率发生20％改变时的时间点。可通过外推标准曲线来测定给定样品中多核苷酸的含量。

                     实施例7

本实施例表明：目标多核苷酸可以是RNA。

组合PNA、RNA和碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青染料。目标RNA序列是5′CUACGGGAGGCAGCAGUG 3′(SEQ ID NO：15)，PNA序列是通用的细菌PNA探针，其具有与RNA序列互补的序列。将混合物暴露给光刺激，测量染料的发射率随时间的百分比变化，将其与包括DNA多核苷酸(用于代替RNA多核苷酸序列)的样品进行比较。

图11中示出了得到的光学性能随时间的百分比变化。对20pmol目标DNA/反应(■)和目标RNA(●)(RNA浓度为20pmol/反应、10pmol/反应和2pmol/反应)进行了比较。Y轴代表：较之仅有探针和染料的情况，荧光随时间的百分比变化。RNA多核苷酸导致了染料的发射率随时间变化。基于染料光学性能变化的速率，检测到了RNA的存在。

                     实施例8

本实施例显示，本方法可进行于污染背景存在的情况下。

在熟食肉汁的污染背景下，测量样品中碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青发射率随时间的百分比变化。制备碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青染料和PNA分子。目标多核苷酸是5′CTACGGGAGGCAGCAGTG 3′(SEQ ID NO：2)，PNA序列是CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys(SEQ ID NO：1)。

图12中示出了结果。其中示出了以(■)表示的未受污染的、清洁的系统的百分比变化，和浓度为1 □l、2 □l和4 □l的熟食肉汁背景中受污染的样品(以空心图例表示)中的百分比变化。本例说明可以在受污染背景中检测到多核苷酸的存在

                     实施例9

图13描述了向系统中加入PNA“楔子”。将生物素化的PNA((5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt)(SEQ ID NO：16)结合到链亲合素孔上，然后与多核苷酸反应。杂交后，加入染料，系统被暴露于光刺激中，然后测量随时间的百分比变化。多核苷酸可以是合成的多核苷酸或是扩增子(amplicon)目标多核苷酸。“试验/a”代表35S PNA 5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQ ID NO：16)和195bp的扩增子目标多核苷酸。“试验/a+1”包括35S PNA 5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQ ID NO：16)以及195bp的扩增子目标多核苷酸和PNA 5′tcttctttttccacg-LYS(SEQ ID NO：17)。“试验/a+2”包括35S PNA 5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQ ID NO：16)以及195bp的扩增子目标多核苷酸和PNA 5′tcttctttttccacg-LYS(SEQ ID NO：17)。“试验/a+b”包括35S PNA 5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQ ID NO：16)以及195bp的扩增子目标多核苷酸、5′tcttctttttccacg-LYS(SEQ ID NO：17)和5′tcacatcaatccact-LYS(SEQ ID NO：18)。“试验/a+b pre”包括35SPNA 5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQ ID NO：16)以及195bp的扩增子目标多核苷酸、5′tcttctttttccacg-LYS(SEQ ID NO：17)和5′tcacatcaatccact-LYS(SEQ ID NO：18)，其中，在与结合的PNA杂交之前，5′tcttctttttccacg-LYS(SEQ ID NO：17)和5′tcacatcaatccact-LYS(SEQ ID NO：18)与扩增子目标多核苷酸共同温育。“试验/o”代表35S PNA 5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQ ID NO：16)以及互补的多核苷酸.接头(linker)-oo-是8-氨基-3，6-二氧辛酸。在本实施方式和其它实施方式中，接头可以是本领域内已知得任何化学连接基团。将核酸类似物加入到目标多核苷酸的不同位点会改变变化速率。

                     实施例10

本实施例描述了不同波长下染料光学性能的变化速率。

图14示出了对一系列样品暴露给不同波长的光刺激的情况的比较。制备目标多核苷酸、PNA和碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青染料的混合物，观察染料光学性能的变化。目标多核苷酸是5′CTACGGGAGGCAGCAGTG 3′(SEQ ID NO：2)，PNA分子是CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys(SEQ IDNO：1)。

图14a)-d)示出了：在一系列波长下，染料发射率随时间的变化图，波长如下所示：a)混合光；b)蓝光源，450nm；c)绿光源，510nm；d)红光源，645nm。对a)-d)中的每种而言，(■)示出了阳性对照或试验样品；(□)示出了仅有PNA探针的情况；(▲)示出了仅有碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青染料的情况；(×)示出了缓冲液背景。发射率对应于图7中所示的百分比变化。

                      实施例11

本实施例显示，通过在与固体支持物结合之前或之后制备PNA/多核苷酸杂交体，本发明的方法可被用于基于固体的形式。

将通用的细菌PNA探针及其互补的多核苷酸用于下述实验。目标多核苷酸是5′CTACGGGAGGCAGCAGTG 3′(SEQ ID NO：2)，PNA分子是5′bio-CACTGCTGCCTCCCCGTAG3′(SEQ ID NO：1)。在第一种样品中，通过链亲合素-生物素结合，将经生物素化的PNA探针固定到孔上。然后加入多核苷酸和碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青染料。将样品暴露给光刺激，对染料荧光发射率的百分比变化进行测量。

在第二种样品中，使生物素化的探针和目标多核苷酸得以相互杂交，以形成PNA/多核苷酸杂交体。然后将PNA/多核苷酸杂交体加入到涂有链亲合素的孔中，使杂交体得以与孔的表面结合。

图15示出了在第一种和第二种样品中观察到的发射率随时间的百分比变化。在试验1(■)中，在与目标DNA和染料反应之前，通过链亲合素-生物素的结合，对探针进行生物固定，固定到孔上。试验2(●)中，PNA分子和目标得以在加入到孔中之前在溶液中互相杂交。Y-轴表示：较之仅有探针的情况，荧光随时间的百分比变化。

                      实施例12

本实施例表明：本发明的方法可被用于对从血液样品中获得的目标多核苷酸进行鉴定和/或定量。

通过静脉穿刺将人类血液收集到EDTA管中。将10μl男性血液和10μl女性血液加入到含有180μl裂解缓冲液的微离心管中，所述缓冲液为6M硫氰酸胍、20mM EDTA、10mM TRIS.HCl(pH6.5)、40g/LTritonX、10g/L二硫代苏糖醇。加入血液之前，在60℃对缓冲液进行加热至其溶解。将10μl女性血液加入到含有190μl同样的裂解缓冲液的微离心管中。反应在室温温育10分钟。

在4000rpm对反应物进行5分钟的离心。弃去上清液，用500μl裂解缓冲液对沉淀进行洗涤。在最高速度下再对沉淀离心2分钟。弃去上清液，用500μl洗涤缓冲液(25％乙醇、25％异丙醇、100mM NaCl、10mMTris.HCl(pH8.0))对沉淀进行洗涤。再在最高速度下对反应物进行2分钟的离心，弃去上清液。用用于PNA杂交反应的5mM磷酸缓冲液对反应物进行两次洗涤。最后一次漂洗后，将反应物重新悬浮于200μl 5mM的磷酸冲液中。

下表显示了用于在微孔中的试验条件。2.5μl全血液被用于50μl的反应体积中。这相当于300目标/μl反应物和1ng的DNA。PNA序列5′Bio-OO-TGAGTGTGTGGCTTTCG 3′(SEQ ID NO：19)。

	试验	阴性对照	无PNA的对照
				样品	48μl试验	48μl阴性	48μl阴性
PNA	1μl	1μl	0
				染料	1μl	1μl	1μl

用Genios分光光度计在激发波长为535nm和发射波长为590nm处来收集发射率数据。最初的零分钟读数后，样品被暴露给Aurora 50/50的光刺激，暴露30秒。在10分钟内，每30秒测一次荧光。

图16显示，本分析检测到了目标男性血液的样品，以(■)表示，而以(□)表示的女性血液作为阴性对照则没有被检测到。

                     实施例14

大量的核酸序列已被用于或可被用于检测目标多核苷酸。下面列出了这些序列。

PNA名称	序列
			PPI2101bio	5′bio-oo-tgagtgtgtggctttcg(SEQ ID NO：19)	huSRY
PPI2024	5′cactgctgcctcccgtag-LYS(SEQ ID NO：1)	16S
			PPI2024bio	5′bio-OO-actgctgcctcccgtag(SEQ ID NO：20)
PPI2025bio4	5′bio-OOOO-tgcctcccgtag(SEQ ID NO：21)
			PPI2025bio6	5′bio-OOOOOO-tgcctcccgta(SEQ ID NO：22)
PPI2025bio8	5′bio-OOOOOOOO-tgcctcccgta(SEQ ID NO：22)
			PPI2025bio10	5′bio-OOOOOOOOOO-tgcctcccgtag(SEQ ID NO：21)
PPI2025 UL	5′tgcctcccgtag(SEQ ID NO：21)
			PPI18bio	5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQ ID NO：16)	35S
PPI359	5′cccacccacgagg-LYS(SEQ ID NO：11)
			PPI485	5′tcttctttttccacg-LYS(SEQ ID NO：17)
PPI486	5′tcacatcaatccact-LYS(SEQ ID NO：18)
			PPI2202	bio-(O)10-ctcattgatggt(SEQ ID NO：23)	HIV
PPI911	bio-(O)10-cgcagaccacta(SEQ ID NO：24)	HCV

                     实施例15

图19示出了暴露给不同波长的光刺激的影响。

将包括16S PNA(5′cactgctgcctcccgtag-LYS)(SEQ ID NO：1)、多核苷酸(5′ctacgggaggcagcagtg)(SEQ ID NO：2)和碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青染料的混合物暴露给具有所有可见波长的白光刺激、蓝光源(450nm)、绿光源(510nm)和红光源(645nm)，以及无光刺激暴露。用于混合光的光源是来自FITZ的Aurora 50/50。为获得蓝、绿和红光，将滤光器置于Aurora 50/50上。在Safire多孔板读数器(Tecan制造)上进行读数。

暴露给光刺激的混合物导致染料光学性能较之参照值具有了不同的变化速率。没暴露给光刺激的混合物在测量中没有表现出可被测量到的随着时间的变化。不同的波长导致了光学性能变化的不同速率。本实施例显示，发光可被用于产生染料光学性能的不同变化速率。

                     实施例16

将PNA固定于固体支持物上，基于染料荧光变化速率对DNA的量进行检测。

下述反应物被用于本实施例中：a)10μM探针-BIO(来自实施例14)；b)2mM碘化二乙基硫杂羰花青染料(DMSO中100mM的贮液；5mM缓冲液中，2mM工作浓度)；c)5mM缓冲液(pH5.5)(1ml100mM Na₂HPO₄·7H₂O+24ml 100mM Na₂H₂PO₄·H₂O+475ml H₂O，pH至5.5)；d)1 X PBS+0.05％ Tween20(PBST)(1 X PBS＝0.137MNaCl+2.68mM KCl+4.3mM NaH₂PO₄+1.47mM KH₂PO₄)；e)链亲合素微滴定板(NUNC)和f)含有或缺乏目标多核苷酸的试验样品。

对孔的数量进行计算，每个孔都通过用200μl 1 X PBST对孔进行3次预洗涤来准备。将1μl PNA探针用于50μl总反应体积。将3μl探针加入到147μl的PBST中。

将PNA探针结合到微滴定孔的固体表面上。在轻微振荡下，于室温对混合物进行1小时的温育。

+对照	试验样品	仅有探针	仅有缓冲液
				50μl	50μl	50μl	50μl缓冲液

然后用100μl的PBST对孔进行3X洗涤。移去液体。然后用5mM磷酸缓冲液再对孔进行3X洗涤。对阳性对照而言，将1μl反应物加入到49μl 5mM磷酸缓冲液中，然后加入到阳性对照孔中。将1μl样品稀释于49μl磷酸缓冲液中，然后加入到试验样品孔中。对于仅有探针和缓冲液的孔，加入50μl磷酸缓冲液。在轻微振荡下，于室温对所有的孔进行30分钟的温育。用100μl上述磷酸缓冲液对孔进行5X洗涤。

通过用1μl 2mM的染料与49μl磷酸缓冲液/孔来制备染料溶液。将染料溶液加入到所有的孔中，除了仅有阴性对照缓冲液的孔。将50μl磷酸缓冲液加入到仅有缓冲液的孔中。

观察染料的荧光情况。在提供来自Aurora 50/50光源的光刺激以前，对最初的荧光读数进行检测。激发位于535nm处，用Genios多孔板读数器，对590nm处的发射率，每2分钟进行一次观察。

                     实施例17

A.用液体PNA样品来进行下述方案。

准备对于试验样品的数目来说足够多的孔，再加3个供对照使用。分离DNA或RNA。

每份试验反应物含有：1μL PNA探针、47μL缓冲液[(5mM)、2ml 100mM Na₂HPO₄·7H₂O+48ml Na₂H₂PO₄·H₂O/L(pH5.5)]以及1μL试验样品。将样品上样至Greiner 96孔条状平板(strip plate)(#705070)。

探针、染料和缓冲液组合起来形成混合物，对每个孔的安排如下：

+对照	试验样品	仅有探针	仅有缓冲液
				1μL+对照	1μL样品	1μL缓冲液	50μL缓冲液

将49μL混合物加入到所有孔中，只除了仅有缓冲液的孔。轻轻混合溶液。

在下述波长下，对没有暴露给光刺激的荧光吸光度进行测量：吸收：562nm；荧光发射：535nm以及荧光激发：590nm。

用Aurora 50/50，将样品暴露给光刺激，暴露给光刺激每30秒后，测定吸光度或荧光。

B.用固定到固体表面的PNA分子来进行下述方案。

下述体系被用于本方案：a)10μM PNA(ABI)；b)2mM碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青(Sigma-Aldrich，目录#173738)染料；c)5mM 1XPBS(0.137M NaCl、2.68mM KCl、4.3mM NaH₂PO₄、1.47mMKH₂PO₄)+0.05％ Tween-20；d)1 X PBS(0.137M NaCl、2.68mMKCl、4.3mM NaH₂PO₄、1.47mM KH₂PO₄)+0.05％ Tween-20；e)包括目标多核苷酸的试验样品和f)涂布有链亲合素的平板(NuncbrandImmobilizer^TM(目录号436014))。

在一种变化方式中，在引入多核苷酸样品之前对PNA进行固定。通过用300μl 1 X PBST洗三次，来准备对于待试验样品来说足够多的孔(n)，再加3个额外的孔用于对照。分离出待试验的DNA或RNA。通过将1μl 10μM PNA贮液加入到49μl PBST中，将经生物素化的PNA固定到涂布有链亲合素的孔上。

制备PNA的总体预混合物(master mix)，其中包括(n+2)X 1μl10μM PNA贮液以及(n+2)X 49μl PBST。向所有孔中加入50μl PNA混合物，只除了仅有缓冲液的孔。

将混合物盖住，在轻柔的摇床上，于室温对其进行1小时的温育。

用200μl PBST对每个孔进行3X洗涤，然后用5mM磷酸缓冲液进行3X洗涤，将核酸样品加入到被固定的探针上。将1μl样品加入到49μl 5mM磷酸缓冲液中。

按照下表来制备对照孔：

	试验	+对照	仅有PNA	仅有缓冲液
					试验样品	1μl	1μl	0	0
5mM磷酸缓冲液	49μl	49μl	50μl	50μl

将孔盖住，在轻微振荡下，于室温对其进行30分钟的温育。然后用100μl 5mM磷酸缓冲液对每个孔进行6X洗涤。通过将1μl 2mM染料溶液加入到49μl 5mM磷酸缓冲液中(对每份样品而言)来制备染料溶液。向仅有缓冲液的孔中加入50μl 5mM磷酸缓冲液。

在下述波长下，对暴露给光刺激之前的最初的荧光或吸光度进行测量：吸收：562nm；荧光发射：535nm以及荧光激发：590nm。

用Aurora 50/50，将样品暴露给光刺激。Aurora 50/50还可与不同颜色的滤光器(蓝、绿、红)一起使用，以在暴露给光刺激每20分钟时提供人们感兴趣的波长。

在另一种变化中，PNA被固定，同时用目标多核苷酸进行杂交。通过用300μl 1 X PBST洗三次，来准备对于待试验样品来说足够多的孔(n)，再加3个额外的孔用于对照。对DNA或RNA进行分离。

按照下表来制备PNA探针和样品的混合物：

	试验	+对照	仅有PNA	仅有缓冲液
					PNA	1μl	1μl	1μl	0
试验样品	1μl	1μl	0	0
					5mM磷酸缓冲液	48μl	48μl	49μl	50μl

在轻微振荡下，于室温对混合物进行10-120分钟(取决于应用)的加盖温育。用100μl 5mM磷酸缓冲液对混合物进行6X洗涤。按照上文所述来制备染料溶液。向每个孔中加入50μl溶液，只除了仅有缓冲液的孔。

                     实施例18

用植物DNA来进行下述方案。

品系为RR 2701大豆。其中使用的DNA来自经过纯化的DNA提取物，其中含有62ng/μl。对样品进行一系列稀释，从62ng/μl至0.062ng/μl。将稀释液中的1μl用于50μl反应物。

用400μl磷酸缓冲过的盐缓冲液(PBS)(+0.5％ tween(PBST))在室温对链亲合素平板进行3X洗涤。用移液枪来进行所有的洗涤、上样、移开步骤。将400μl用于洗涤的溶液直接加入到孔中。然后用同样的移液枪和枪头吸走溶液。

将PNA bio-18(35S)在水中进行1/10的稀释。(1μl PNA贮液到9μl水)。(BIO-OO-GATAGTGGGATTGTGCGT(SEQ ID NO：16)，其中OO是两个接头)。将1μl经稀释的PNA加入到49μl PBST中。制备总体预混合物，其中包括所有要用于结合的孔，再加上一个过量的孔。因此，如果我们要结合10个孔，那么要准备足够用于11个孔的混合物。(11μl经稀释的PNA+539μl PBST)。向每个孔中加入50μl该混合物。在轨道摇床(orbital shaker)上，轻微振荡下，于室温对平板进行1小时的温育。同时，通过在微PCR管中，对每种DNA样品制备一系列的稀释水溶液(1/10、1/100、1/1000)，来制备DNA。将管置于热循环仪中，开始进行变性程序(95℃，5分钟)。完成后将管放置于冰上，直至对其进行使用。温育之后，用上述PBST对平板进行3X洗涤。然后用如上文所述的5mM PO4缓冲液(pH5.7)对平板进行3X洗涤。将1μl DNA或经稀释的DNA样品加入到每个孔中，(GM或非GM DNA，每个孔一种样品)。加入49μl的PO4缓冲液。轻轻混合平板，在轨道摇床上，轻微振荡下，于室温对其进行30分钟的温育。温育之后，用上述的PO4缓冲液对平板进行5X洗涤。向49μl PO4缓冲液中加入1μl碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青(3mM)(总体预混合物被制备为包括足够用于所有的孔再加一个多余的孔的量)。用移液枪向每个孔中加入50μl染料/缓冲液。然后将平板置于Tecan扫描仪上，以监测535nm激发和590nm发射处的光谱发射率。在时间为零处记录最初的读数。然后将平板暴露给光刺激，以1分钟为间隔进行读数。在Excel中进行数据分析，用公式100-(样品/仅有PNA染料)X 100来绘制基于百分比变化对时间的图。

图20显示，检测到了不同浓度的大豆DNA。这些被表示为+。不含GMO序列的大豆DNA与背景水平接近。这些被表示为-。本发明可以检测到0.0625ng的GMO大豆DNA，其相应于大约21个基因组。图21示出了光学性能百分比变化对GMO阳性大豆和不含PNA目标序列的野生型大豆基因组数量的图。

                     实施例19

下述反应显示了对仅有磷酸缓冲液以及具有多种tween 20浓度中的目标多核苷酸的检测。用其它非离子去垢剂(包括NP-40和triton X-100)进行了类似的实验。

下述体系被用于本方案：a)10μM PNA(ABI)；b)2mM碘化3，3’-二乙基硫杂羰花青(Sigma-Aldrich，目录#173738)染料；c)5mM缓冲液(pH5.5)(2ml 100mM Na₂HPO₄·7H₂O+48ml NaH₂PO₄·H₂O/L)；

d)试验样品。

根据待试验样品数目加上用于对照的3个，来准备足够的孔。对DNA或RNA进行分离。每份试验反应物含有：1μL探针、47μL缓冲液和1μL样品，以组成混合物。

+对照	试验样品	仅有PNA	仅有缓冲液
				1μL+对照	1μL样品	1μL缓冲液	50μL缓冲液

向除了仅有缓冲液的孔之外的所有孔中，加入49μL混合物，对溶液进行轻柔的混合。

在没有暴露给光刺激的情况下，发射设置为535nm，激发设置为590nm，对最初的荧光进行测量。用Aurora 50/50，将样品暴露给光刺激，每暴露给光刺激60秒后，对吸光度和/或荧光进行测量。使用标准的5mM磷酸缓冲液(pH5.5)，将其与含有0.05％、0.1％、0.5％、1.0％、1.5％和2％ tween20的磷酸缓冲液中的反应物进行比较。

图22示出了使用不同浓度的tween时的发射率。(■)代表与目标DNA进行的反应，(□)代表仅有探针的情况，(△)代表缓冲液中有染料的情况，(^*)代表仅有缓冲液的情况。

图23示出了对于不同浓度的tween而言发射率的％变化。

                     实施例20

本实施例显示，反应可用不是PNA的核酸类似物来进行。本反应使用锁核酸(LNA)。还对磷酸缓冲液中多种浓度的tween20进行了检测。

使用下述LNA序列：

LNA-A    Tg^mc^mCt^mc^mc^mCGTAG(SEQ ID NO：25)

LNA-B    TGc^mCt^mCc^mCGTAG(SEQ ID NO：26)

LNA-C    TGCCTCc^mCGTAG(SEQ ID NO：27)

带有^m的小写字母代表经过修饰的序列。

根据上文实施例19中公开的方法，以液体形式进行反应。

图24比较了在液体反应中使用PNA探针和LNA探针的原始数据。将磷酸缓冲液中的标准反应与加入到磷酸缓冲液中的多种浓度的tween20的情况进行比较。实心符号代表试验反应，空心符号代表仅存在各自的探针的情况。(■，□)PNA；(◆，◇)LNA-A；(▲，△)LNA-B；(●，○)LNA-C。

图25示出了用PNA和LNA时发射率的百分比变化比较。(■)代表：与单独使用PNA探针相比时，反应中的百分比变化。(◆)代表：与单独使用LNA-A探针和染料相比时，LNA-A试验反应中的百分比变化。(▲)代表：与单独使用LNA-B探针相比时，LNA-B试验反应中的百分比变化。(●)代表：与单独使用LNA-C探针相比时，LNA-C试验反应中的百分比变化。

                     实施例21

本发明的分析方法还可用于检测丙型肝炎病毒。使用标准方法，从存在已知量的丙型肝炎病毒的血浆中分离出丙型肝炎病毒的RNA。按照上文实施例19中公开的方法，使用该分离出的RNA，以液体形式来开展反应。

图26示出了用不同量的血浆对丙型肝炎病毒探针进行的检测。对病毒而言，甚至在非常低的拷贝数的情况下，光学性能的变化速率也是不同的。

还可对丙型肝炎病毒的拷贝数进行定量。图27示出了将不同数量丙型肝炎病毒RNA引入到分析中时获得的染料发射率。系统中病毒RNA的数量较低，通常会使得一分钟后的荧光发射率也较低。

                     实施例22

本实施例表明，本发明的方法可用于对细菌中的目标多核苷酸进行鉴定和/或定量。

通过将500μl细菌(E.coli或Bacillus cereus)培养物(在TSB(典型大豆培养基)中培养过夜的)在6000rpm下离心5分钟，获得沉淀，然后将沉淀重新悬浮于500μl磷酸缓冲液中，静置于室温下，5分钟。此后将PNA(用于16S序列的5′bio-oo-gatagtgggattgtgcgt(SEQ ID NO：16)或用于非特异性HCV阴性对照序列的5′Bio-OO-TGAGTGTGTGGCTTTCG 3′(SEQ ID NO：19))以及染料加入到系统中，暴露给光刺激，并读取读数。

下表显示了用于50μl反应体积的微孔的试验条件。

	P/O试验	仅有探针	仅有染料	细菌试验	细菌染料
						PNA	5μl	5μl		5μl
寡核苷酸	5μl
						细菌培养物				43μl	43μl
染料	2μl	2μl	2μl	2μl	2μl
						磷酸缓冲液	38μl	43μl	48μl		5μl

用Genios分光光度计在激发波长为535nm和发射波长为590nm处来收集发射率数据。读取零分钟时的最初读数后，将样品暴露给来自Aurora50/50的光刺激，暴露60秒。十分钟内，每60秒对荧光进行一次测量。

图28描述了：较之不存在核酸类似物/多核苷酸杂交体的情况下，每份样品中的荧光变化率。在分析中使用16S PNA探针，检测到了目标E.coli或B.cereus的样品(分别由x和+表示)，而在分析中使用病毒性HCV PNA探针，则无法检测到目标E.coli或B.cereus的样品(分别由◇和▲表示)。黑色的方形显示了：用寡核苷酸对作为目标多核苷酸的16S序列做出的阳性对照。

                     实施例23

将寡核苷酸(5′tgtgaacgca 3′and 5′tgcgttcaca 3′)混合于退火缓冲液(10mM Tris，pH 7.5-8.0，50mM NaCl，1mM EDTA)中，至10mM，在热循环仪中于95℃加热10分钟。加热后，将寡核苷酸混合物在室温冷却l小时。每份反应中使用1微升的该混合物。

将PNA N′Bio-OO-gatagtgggattgtgcgt，C(1)′和N′tcacatcaatccact-lys，C′，(2)混合使用，在反应缓冲液(5mM PO4+0.05％ Tween)中每种都为10mM。每份反应中使用1微升的该混合物。

将10mM 3’，3’-二乙基硫杂羰花青染料贮液在反应缓冲液中稀释为4mM。每份反应中使用1微升的该混合物。

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出于一切目的，在此通过引用的方式将本文中引用的所有公开文本、专利和专利申请的全部内容都包括进来，其范围与通过引用的方式指明及单独指定将单份公开文本、专利和专利申请包括进本文的范围是相同的。虽然为了使对本发明的理解更为清楚的目的，已通过阐述和实施例的方式对前文所述的本发明进行了详细的描述，但是根据本发明的教导，在不偏离本文公开的原则和范围的情况下，还可以进行某些变化和改良，这对本领域普通技术人员来说是显而易见的。

序列表

<110>因维斯蒂恩有限公司

     希瑟·克施恩斯克

     迈克尔·S·兹维克

     永·K·乔依

<120>检测多核苷酸的系统

<130>429572000740

<150>60/471,827

<151>2003-05-20

<160>27

<170>FastSEQ for windows Version 4.0

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>细菌

<220>

<221>misc_feature

<222>19

<223>赖氨酸连到g上

<400>1

cactgctgcc tccccgtag                                             19

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<212>DNA

<213>细菌

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ctacgggagg cagcagtg                                              18

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<212>DNA

<213>细菌

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gaassmycya acacytagca ct                                         22

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<212>DNA

<213>细菌

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<212>DNA

<213>革兰氏阳性细菌

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gcagywaacg cattaagcac t                                          21

<210>6

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<212>DNA

<213>革兰氏阳性细菌

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acgacacgag ctgacgacaa                                            20

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<212>DNA

<213>革兰氏阴性细菌

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tctagctggt ctgagaggat gac                                        23

<210>8

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<212>DNA

<213>革兰氏阴性细菌

<400>8

gagttagccg gtgcttcttc t                                          21

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<212>DNA

<213>真菌

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cctgcggctt aatttgactc a                                          21

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<212>DNA

<213>真菌

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tagcgacggg cggtgtgta                                             19

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<212>DNA

<213>菜花花叶病毒

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<222>13

<223>赖氨酸连接到g上

<400>11

cccacccacg agg                                                   13

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<212>DNA

<213>菜花花叶病毒

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gctcctacaa atgccatca                                             19

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<212>DNA

<213>菜花花叶病毒

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gatagtggga ttgtgcgtca                                            20

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<212>DNA

<213>菜花花叶病毒

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cccacccacg aggaacatc                                             19

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<212>RNA

<213>真菌

<400>15

cuacgggagg cagcagug                                              18

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<212>DNA

<213>菜花花叶病毒

<400>16

gatagtggga ttgtgcgt                                              18

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<212>DNA

<213>菜花花叶病毒

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<221>misc_feature

<222>15

<223>赖氨酸连到g上

<400>17

tcttcttttt ccacg                                                 15

<210>18

<211>15

<212>DNA

<213>菜花花叶病毒

<220>

<221>misc_feature

<222>15

<223>赖氨酸连到g上

<400>18

tcacatcaat ccact                                                 15

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<212>DNA

<213>人类

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tgagtgtgtg gctttcg                                               17

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<212>DNA

<213>细菌

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actgctgcct cccgtag                                               17

<210>21

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<212>DNA

<213>细菌

<400>21

tgcctcccgt ag                                                    12

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<211>11

<212>DNA

<213>细菌

<400>22

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<211>12

<212>DNA

<213>人类免疫缺陷病毒

<400>23

ctcattgatg gt                                                    12

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<211>12

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>24

cgcagaccac ta                                                    12

<210>25

<211>12

<212>DNA

<213>细菌

<220>

<221>misc_feature

<222>2，3，5，6，7

<223>经修饰的

<400>25

tgcctcccgt ag                                                    12

<210>26

<211>12

<212>DNA

<213>细菌

<220>

<221>misc_feature

<222>3，5，7

<223>经修饰的

<400>26

tgcctcccgt ag                                                    12

<210>27

<211>12

<212>DNA

<213>细菌

<220>

<221>misc_feature

<222>7

<223>经修饰的

<400>27

tgcctcccgt ag                                                    12

Claims (54)

1.一种用于检测样品中目标多核苷酸是否存在或存在含量的方法，所述方法包括：

a)将样品、与所述目标多核苷酸的目标核酸序列互补的核酸类似物以及染料组合起来，得到混合物，其中，当存在及不存在目标多核苷酸/核酸类似物杂交体时，所述染料光学性能变化速率会有所不同；

b)将所述混合物中染料光学性能的变化速率与类似混合物中染料光学性能的变化速率所特有的参照值相比较，以测定光学性能的相对变化速率，其中，所述类似混合物含有已知量的多核苷酸/核酸类似物杂交体；以及

c)将所述混合物中染料光学性能的相对变化速率与样品中是否存在特定的目标多核苷酸或存在的量关联起来。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸类似物是肽核酸(PNA)。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸类似物是锁核酸(LNA)。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸类似物是苏糖核酸(TNA)。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸类似物是连接有金属的核酸。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包括：组织、细胞收集物、细胞裂解物、经纯化的多核苷酸或经分离的多核苷酸、病毒、环境样品、工业样品、医学样品、食物样品、农业样品、兽医样品、农业牲畜样品、水样品、土壤样品、空气样品、与生物武器试剂相关的样品或与农业战争试剂相关的样品。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述混合物被暴露给光刺激。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述目标多核苷酸是DNA。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述目标多核苷酸是全细胞DNA、核DNA、线粒体DNA、核糖体DNA、叶绿体DNA、病毒DNA、质粒DNA、人工DNA、表观基因组DNA、表观遗传化DNA、体外扩增出的DNA或嵌合DNA。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述目标多核苷酸是RNA。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述RNA是核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、带盔甲RNA、病毒RNA、小分子RNA、siRNA、人工RNA或嵌合RNA。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述目标多核苷酸从生物中获得。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述生物是人类。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述样品是环境样品。

15.如权利要求12所述的方法，其中所述生物是病原体。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述病原体是病毒。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述病原体是细菌。

18.如权利要求12所述的方法，其中所述生物是真菌。

19.如权利要求15所述的方法，其中所述病原体选自由Bacillusanthracis、Clostridium botulinum、Brucellae、Vibrio cholera、Clostridiumperfringes、Ebola病毒、Yersinia pesits、Coxiella burnetii、天花病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒所构成的组。

20.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸类似物与目标多核苷酸序列互补。

21.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸序列与目标多核苷酸精确互补。

22.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸类似物的互补区域长度大于大约4个核酸碱基，并且长度小于大约24个核酸碱基。

23.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸类似物长度为大约12个核酸碱基。

24.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸类似物被固定于固体基底上。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述核酸类似物通过非共价相互作用被固定于固体基底上。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述非共价相互作用是生物素和抗生物素蛋白或链亲合素之间的相互作用。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述非共价相互作用是抗原/抗体反应。

28.如权利要求1所述的方法，其中所述目标多核苷酸被固定于固体基底上。

29.如权利要求24所述的方法，其中所述核酸类似物与固体基底共价结合。

30.如权利要求1所述的方法，其中，较之不存在核酸类似物/目标多核苷酸杂交体的情况，在存在有核酸类似物/目标多核苷酸杂交体的时候，所述染料可以具有更高的光学性能变化速率。

31.如权利要求1所述的方法，其中，较之不存在核酸类似物/目标多核苷酸杂交体的情况，在存在有核酸类似物/目标多核苷酸杂交体的时候，所述染料可以具有更低的光学性能变化速率。

32.如权利要求1所述的方法，其中所述染料是青色素染料。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述染料选自由碘化3’，3’-二乙基硫杂羰花青、碘化3’，3’-二乙基硫杂二羰花青和碘化3’，3’-二乙基硫杂三羰花青所构成的组。

34.如权利要求1所述的方法，其中所述光学性能选自由吸光度、荧光、反射率或化学发光所构成的组。

35.如权利要求1所述的方法，还进一步包括：在多个时间点对所述光学性能进行测量。

36.如权利要求1所述的方法，还进一步包括：在单一时间点对所述光学性能进行测量。

37.一种用于对样品中生物进行检测的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法对样品中是否存在目标多核苷酸或存在的量进行检测，其中，所述目标核酸序列是特异于所述生物的序列，并且，其中，所述目标多核苷酸是否存在或存在的量能够表明所述生物是否存在或存在的量。

38.一种用于对样品中一类生物进行检测的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法对样品中是否存在目标多核苷酸或存在的量进行检测，其中，所述目标核酸序列是特异于所述的类的生物的序列，并且，其中，所述目标多核苷酸是否存在或存在的量能够表明所述的类的生物是否存在或存在的量。

39.一种用于对样品中生物的株系进行检测的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法对样品中是否存在目标多核苷酸或存在的量进行检测，其中，所述目标核酸序列是特异于所述生物的所述株系的序列，并且，其中，所述目标多核苷酸是否存在或存在的量能够表明所述生物的所述株系是否存在或存在的量。

40.一种用于对样品中经遗传修饰的生物(GMO)进行检测的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法对样品中是否存在目标多核苷酸或存在的量进行检测，其中，所述目标核酸序列是特异于所述经遗传修饰的生物的序列，并且，其中，所述目标多核苷酸是否存在或存在的量能够表明所述经遗传修饰的生物是否存在或存在的量。

41.一种用于对受试对象中是否存在疾病状态进行检测的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法对是否存在目标多核苷酸或存在的量进行检测，其中，所述目标核酸序列是特异于所述疾病状态的序列，并且，其中，所述目标多核苷酸是否存在或存在的量能够表明所述疾病状态。

42.一种用于对受试对象中是否存在遗传变异进行检测的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法对是否存在目标多核苷酸或存在的量进行检测，其中，所述目标核酸序列是特异于所述遗传变异的序列，并且，其中，所述目标多核苷酸是否存在或存在的量能够表明所述遗传变异。

43.一种用于对单核苷酸多态性(SNP)进行检测的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法对是否存在目标多核苷酸或存在的量进行检测，其中，所述目标核酸序列是特异于SNP的序列，并且，其中，所述目标多核苷酸是否存在或存在的量能够表明所述SNP。

44.一种用于对样品中的遗传序列进行检测的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法对样品中是否存在目标多核苷酸或存在的量进行检测，其中，所述目标核酸序列是特异于所述生物的序列，并且，其中，所述目标多核苷酸是否存在或存在的量能够表明所述生物是否存在或存在的量。

45.一种用于对样品中的体外扩增序列进行检测的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法对样品中是否存在目标多核苷酸或存在的量进行检测，其中，所述目标核酸序列是特异于所述生物的序列，并且，其中，所述目标多核苷酸是否存在或存在的量能够表明所述生物是否存在或存在的量。

46.一种用于检测碱基对变化的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法对样品中是否存在目标多核苷酸或存在的量进行检测，其中，所述目标核酸序列是特异于SNP的序列，并且，其中，所述目标多核苷酸是否存在或存在的量能够表明所述SNP是否存在或存在的量。

47.一种用于检测宿主是否被病原体感染的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法对样品中是否存在目标多核苷酸或存在的量进行检测，其中，所述目标核酸是特异于所述病原体的核糖核酸(RNA)，并且，其中，所述目标多核苷酸是否存在或存在的量能够表明所述宿主是否被所述病原体感染。

48.一种用于对两份或多份样品中目标多核苷酸进行检测的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法，用第一种核酸类似物分子，在多位点设备的第一个位点对第一份所述样品中的所述目标多核苷酸进行检测；以及

按照权利要求1所述的方法，用第二种核酸类似物分子，在多位点设备的第二个位点对第二份所述样品中的所述目标多核苷酸进行检测。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述核酸类似物分子被固定于固体基底上。

50.一种对样品中两种或多种目标多核苷酸是否存在或存在的量进行检测的方法，所述方法包括：

按照权利要求1所述的方法，对样品中第一种目标多核苷酸进行检测；

按照权利要求1所述的方法，对样品中第二种目标多核苷酸序列进行检测。

51.如权利要求50所述的方法，其中，两种或多种序列被固定于固体基底上。

52.用于检测目标多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含：

a)与所述目标多核苷酸的目标核酸序列至少部分互补的一种或多种核酸类似物，以及

b)一种或多种染料

53.如权利要求52所述的试剂盒，还包括刺激源。

54.如权利要求52所述的试剂盒，其中，所述染料选自由碘化3’，3’-二乙基硫杂羰花青、碘化3’，3’-二乙基硫杂二羰花青和碘化3’，3’-二乙基硫杂三羰花青所构成的组。

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