CN1871345B - 生物催化剂的固定 - Google Patents

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Abstract

用包括以下步骤的方法制备了含有包裹的细胞的聚丙烯酰胺珠：(i)提供丙烯酸单体混合物的水溶液，(ii)提供在过硫酸盐水溶液中的细胞的悬浮液，(iii)提供在不与水混溶的液体中的叔胺水溶液的乳液，上述液体可任选含有表面活性剂，(iv)混合步骤(i)提供的溶液和步骤(ii)提供的悬浮液，(v)将步骤(iv)中获得的混合物加入步骤(iii)中提供搅拌的乳液，(vi)聚合丙烯酸单体的混合物，同时包裹细胞以形成含有包裹的细胞的聚丙烯酰胺珠。

Description

生物催化剂的固定
本发明涉及含有包裹的细胞的聚丙烯酰胺珠，涉及它们的制造方法并涉及它们作为生物催化剂的应用。
含有包裹的细胞的聚丙烯酰胺珠可用作各种依赖于细胞内所含的酶的生物转化的生物催化剂。例如，包含含有腈水合酶的红球菌属菌株的包裹的细菌细胞的聚丙烯酰胺珠可用来将腈转化成酰胺。
含有酶的聚丙烯酰胺珠已经描述于Nilsson等(Biochim.Biophys.Acta 1972，268，253-256)。将三乙醇胺-HCl缓冲液(0.05M，pH 7.0，0.5mL)中的过硫酸铵(0.25g，1.1mmol)溶液和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(0.5mL，0.385mg，3.3mmol)加入三乙醇胺-HCl缓冲液(0.05M，pH 7.0)中的(60mL)胰蛋白酶(60mg)、丙烯酰胺(8.55g，120mmol)和N，N′-亚甲基-双丙烯酰胺(0.45g，2.9mmol)的溶液。将该溶液边搅拌边加入含有失水山梨糖醇倍半油酸酯(1mL)的有机相(甲苯/氯仿290∶110，400mL)。在4℃聚合30分钟。Nilsson等(Biochim.Biophys.Acta 1972，268，253-256)未描述将细胞包裹入聚丙烯酰胺珠。
Mosbach等(US 4,647,536A)描述了制造各种含有包裹的细胞的珠聚合物，其中动物油、植物油、磷酸三丁酯、液体硅酮、石蜡油或苯二甲酸二丁酯被用作水不溶相。通过将丙烯酰胺(17.6g，248mmol)和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(1.2g，8mmol)溶于tris(三羟基甲基氨基甲烷)缓冲液(100mL，0.05M，pH 7)，将8mL该溶液与酵母细胞或酶(例如过氧化物酶体，10mg/mL，2mL)以及过硫酸铵(0.4g/mL，20μL(8mg，0.03mmol))混合并将该混合物分散在豆油(40mL)中制造了含有酵母细胞或酶的聚丙烯酰胺珠。当已经达到合适的珠大小时加入N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(100μL，77.0mg，0.66mmol)。
本发明的一个目的是提供含有细胞的聚丙烯酰胺珠以及它们的制备方法。
该目的是通过权利要求12所述的聚丙烯酰胺珠和权利要求1所述的方法实现的。
本发明的制造含有包裹的细胞的聚丙烯酰胺珠的方法包括以下步骤：
(i)提供丙烯酸单体混合物的水溶液，
(ii)提供在过硫酸盐水溶液中的细胞的悬浮液，
(iii)提供在不与水混溶的液体中的叔胺水溶液的乳液，上述液体可任选含有表面活性剂，
(iv)混合步骤(i)提供的溶液和步骤(ii)提供的悬浮液，
(v)将步骤(iv)中获得的混合物加入步骤(iii)中提供的搅拌的乳液，和
(vi)聚合丙烯酸单体的混合物同时包裹细胞以形成含有包裹的细胞的聚丙烯酰胺珠。
本发明方法的优点在于，在加入丙烯酸单体、细胞和过硫酸盐之前已将叔胺加入不与水混溶的液体。
用本发明方法形成的聚丙烯酰胺珠是球形或近乎球形的。
所述聚丙烯酰胺珠的大小可为0.01-5mm，机械强度至少为10mN。优选地，所述聚丙烯酰胺珠的大小为0.05-3mm，机械强度至少为200mN。更优选地，所述聚丙烯酰胺珠的大小为0.1-1.5mm，机械强度至少为300mN。
所述机械强度是通过对置于两个平板之间的珠施压直到珠破裂来测量的。
所述细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。优选地，所述细胞是细菌细胞，更优选地，它是诺卡氏菌形放线菌(nocardioformActinomycete)属细菌或肠杆菌科细菌的细胞。再优选地，所述细胞是红球菌属或埃希氏菌属细菌的细胞，且最优选地，它是红球菌属细菌的细胞。
革兰氏阳性菌的例子有诸如芽孢杆菌属(Bacillus)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、戈登氏菌属(Gordona)、诺卡氏菌属(Nocardia)、红球菌属(Rhodococcus)或拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)的细菌，革兰氏阴性菌的例子有诸如醋杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱菌属(Alcaligenes)、从毛单胞菌属(Comamonas)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)或克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌。
诺卡氏菌形放线菌属细菌的例子有戈登氏菌属、诺卡氏菌属、红球菌属和拟无枝酸菌属的细菌。肠杆菌科细菌的例子有柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属和克雷伯氏菌属的细菌。
所述细胞可用本领域已知的方法培养。
所述细菌细胞的染色体上可含有编码感兴趣酶的基因，或者可用含有编码感兴趣酶的基因的质粒转化。
如果细菌细胞的染色体上可含有编码感兴趣酶的基因，并且该酶是分解代谢酶，则可在存在合适的酶诱导物时培养该细菌细胞。例如，可在存在腈水合酶诱导物时培养红球菌属菌株的细胞以诱导腈水合酶表达。合适的红球菌属菌株腈水合酶诱导物的例子有甲基丙烯酰胺、巴豆酰胺和丙酰胺。
如果细菌细胞用含有编码感兴趣酶的基因的质粒转化，且该基因出于诱导型启动子控制之下，则可在培养期间的合适点上诱导编码感兴趣酶的基因转录。诱导型启动子的例子有trp、lac、tac、阿拉伯糖和鼠李糖启动子。诱导取决于所采用的启动子，例如，鼠李糖启动子可通过加入L-鼠李糖来诱导。
培养之后可从发酵液中分离含有感兴趣的酶的细胞。优选细胞在5℃以下储存在合适的缓冲液中。
所述丙烯酸单体混合物可由至少一个单官能丙烯酸单体和至少一个双官能丙烯酸单体构成。
单官能丙烯酸单体可以是下式表示的单体
式中，
R1是H或甲基，
R2选自NH2、NHR3，N(R3)2、NH-(CH2)n-N(R3)2和O-(CH2)n-N(R3)2
R3在每次出现时为C1-4-烷基，和
n是1-4的整数。
单官能丙烯酸单体的例子有丙烯酰胺(R1＝H，R2＝NH2)，甲基丙烯酰胺(R1＝甲基，R2＝NH2)，N-烷基丙烯酰胺(R1＝H，R2＝NHR3，R3＝C1-4-烷基)如N-乙基丙烯酰胺(R3＝乙基)、N-异丙基丙烯酰胺(R3＝异丙基)或N-叔丁基丙烯酰胺(R3＝叔丁基)，N-烷基甲基丙烯酰胺(R1＝甲基，R2＝NHR3，R3＝C1-4-烷基)如N-乙基甲基丙烯酰胺(R3＝乙基)或N-异丙基甲基丙烯酰胺(R3＝异丙基)，N，N-二烷基丙烯酰胺(R1＝H，R2＝N(R3)2，R3＝C1-4-烷基)如N，N-二甲基丙烯酰胺(R3＝甲基)和N，N-二乙基-丙烯酰胺(R3＝乙基)，N-[(二烷基氨基)烷基]丙酰胺(R1＝H，R2＝NH-(CH2)n-NH(R3)2，R3＝C1-4-烷基)如N-[3-(二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺(n＝3，R3＝甲基)或N-[3-(二乙基氨基)丙基]丙烯酰胺(n＝3，R3＝乙基)，N-[(二烷基氨基)烷基]甲基丙烯酰胺(R1＝甲基，R2＝NH-(CH2)n-NH(R3)2，R3＝C1-4-烷基)如N-[3-(二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(R3＝甲基)或N-[3-(二乙基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(R3＝乙基)，丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯(R1＝H，R2＝O-(CH2)n-NH(R3)2，R3＝C1-4-烷基)如丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(n＝2，R3＝甲基)、丙烯酸2-(二甲基氨基)丙酯(n＝3，R3＝甲基)或丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯(n＝2，R3＝乙基)，以及甲基丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯(R1＝甲基，R2＝O-(CH2)n-NH(R3)2，R3＝C1-4-烷基)如甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(n＝2，R3＝甲基)。
N-烷基丙烯酰胺、N-烷基甲基丙烯酰胺、N，N-二烷基丙烯酰胺、N，N-二烷基-甲基丙烯酰胺、N-[(二烷基氨基)烷基]丙烯酰胺、N-[(二烷基氨基)-烷基]甲基丙烯酰胺、丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯和丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯可用本领域已知的方法制备，例如通过使烯丙酰氯、丙烯酸甲酯、甲基烯丙酰氯或甲基丙烯酸甲酯与各自的烷基胺、二烷基氨或(二烷基氨基)烷基胺或(二烷基氨基)醇反应。
双官能丙烯酸单体可以是下式表示的单体。
式中，
R1是H或甲基
-X-是-(CH2)n-或-(CH-OH)n-
n是1-4的整数
双官能丙烯酸单体的例子有N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(R1＝H，-X-＝-(CH2)n-，n＝1)，N，N′-亚甲基双甲基丙烯酰胺(R1＝甲基，-X-＝(CH2)n，N＝1)，N，N′-亚乙基双丙烯酰胺(R1＝H，-X-＝-(CH2)n-，n＝2)，N，N′-亚乙基双-甲基丙烯酰胺(R1＝甲基，-X-＝-(CH2)n-，n＝2)，N，N′-亚丙基双丙烯酰胺(R1＝H，-X-＝-(CH2)n-，n＝3)和N，N′-(1，2-二羟基亚乙基)双丙烯酰胺(R1＝H，-X-＝-(CH-OH)n-，n＝2)
双官能丙烯酸单体可用本领域已知的方法制备，例如，其中-X-是-(CH2)的双官能丙烯酸单体可通过使烯丙酰氯、丙烯酸甲酯、甲基烯丙酰氯或甲基丙烯酸甲酯与各自的二胺反应来制备。
优选地，所述双官能丙烯酸单体选自N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、N，N′-亚甲基双甲基丙烯酰胺和N，N′-(1，2-二-羟基亚乙基)双丙烯酰胺，所述单官能单体选自丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N，N-二烷基丙烯酰胺、N-[(二烷基-氨基)烷基]甲基丙烯酰胺、(二烷基氨基)烷基丙烯酸酯和(二烷基氨基)烷基甲基丙烯酸酯。
更优选地，所述双官能丙烯酸单体是N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，所述单官能单体选自丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-[3-(二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯。
所述过硫酸盐可以是任何水溶性过硫酸盐。水溶性过硫酸盐的例子有过硫酸铵和碱金属的过硫酸盐。碱金属的例子有锂、钠和钾。优选地，所述过硫酸盐是过硫酸铵或过硫酸钾，更优选地，它是过硫酸铵。
所述叔胺可以是任何水溶性叔胺。优选地，所述叔胺是N，N，N′，N′-四甲基乙二胺或3-(二甲基氨基)丙腈，更优选地，它是N，N，N’，N’-四甲基乙二胺。
所述不与水混溶的液体可以是任何在聚合温度下是液态的不与水混溶物质。不与水混溶的液体的例子有矿物油、植物油和合成的油类。矿物油的例子有甲苯、二甲苯、脱芳构的混合烃如Exxsol D100和混合异链烷烃如Isopar M。植物油的例子有葵花籽油、橄榄油、花生油、杏仁油、红花油、豆油和玉米油。合成油的例子有硅酮油。
优选不与水混溶的液体是矿物油。更优选地，它是饱和烃或其混合物。最优选地，它是脱芳构的混合烃或混合异链烷烃。
所述不与水混溶的液体可任选含有表面活性剂。所述表面活性剂可以是任何合适的表面活性剂。合适的表面活性剂的例子有非离子表面活性剂如失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、乙二醇脂肪酸酯或甘油脂肪酸酯，以及阳离子表面活性剂如四烷基铵盐，其中至少一个烷基含有至少8个碳原子。脂肪酸的例子有油酸或硬脂酸。烷基的例子有乙基、丙基和丁基。含有至少8个碳原子的烷基的例子有辛基、壬基和癸基。
表面活性剂/油的比例可以高达0.10∶1(w/w)。优选不使用表面活性剂。
可将丙烯酸单体溶于水或缓冲液来提供丙烯酸单体混合物的水溶液。可将过硫酸盐在水或缓冲液中的溶液与细胞在水或缓冲液中的悬液混合来提供在过硫酸盐水溶液中的细胞悬浮液。优选将丙烯酸单体溶于缓冲液并将细胞悬浮在该缓冲液中，将pH调至5-10，该范围适合感兴趣的酶。例如，6-8的pH范围适合来自红球菌属菌株的腈水合酶。
可在不与水混溶的液体中将叔胺在水或缓冲液中的溶液乳化来提供在不与水混溶的液体中的叔胺水溶液的乳液。
优选地，丙烯酸单体混合物的水溶液、过硫酸盐水溶液中的细胞悬液以及不与水混溶的液体中的叔胺水溶液的乳液(其中所述液体任选含有表面活性剂)进行脱氧，例如通过用氮气净化。
将丙烯酸单体混合物的水溶液以及过硫酸盐水溶液中的细胞悬液混合并立即边搅拌边滴入在不与水混溶的液体中的叔胺水溶液的乳液中。合适的搅拌器的例子有三叶或四叶涡轮搅拌器、螺旋桨搅拌器或
Figure S04831541520060510D000061
搅拌器。优选使用
Figure S04831541520060510D000062
搅拌器。优选地，聚合在5-35℃下进行。更优选地，聚合在15-25℃下进行，且最优选在18-22℃下进行。
下面是聚合步骤的优选比例：
丙烯酸单体混合物/水的比例优选为0.05∶1-0.5∶1(w/w)。更优选为0.1∶1-0.3∶1(w/w)。最优选为0.2∶1-0.28∶1(重量/重量(w/w))。
双官能丙烯酸单体/单官能丙烯酸单体的比例优选为0.001∶1-0.8∶1(mol/mol)。更优选为0.01∶1-0.08∶1(mol/mol)。最优选为0.03∶1-0.06∶1(mol/mol)。
干细胞/丙烯酸单体混合物的比例优选为0.001∶1-1∶1(w/w)。更优选为0.2∶1-0.9∶1。再优选为0.4-0.8∶1(w/w)。最优选为0.5∶1-0.7∶1(w/w)。
过硫酸盐/丙烯酸单体混合物的比例优选为0.0001∶1-0.1∶1(mol/mol)。更优选为0.001∶1-0.05∶1(mol/mol)。最优选为0.002∶1-0.03∶1(mol/mol)。
叔胺/过硫酸盐的比例优选为0.2∶1-50∶1(mol/mol)。优选为0.8∶1-10∶1(mol/mol)。最优选为1∶1-5∶1(mol/mol)。
油/水的比例优选为1.2∶1-10∶1(w/w)。更优选为1.3∶1-7∶1(w/w)。再优选为1.4∶1-5∶1(w/w)。最优选为1.5∶1-4∶1(w/w)。
优选地，聚合反应之后获得的聚丙烯酰胺珠被分离，例如通过倾析或过滤。分离的珠可用水或水溶液洗涤以除去痕量的不与水混溶的液体，并且可储存在合适的缓冲液中。
用本发明方法获得的含有包裹的细胞的聚丙烯酰胺珠也是本发明的一个部分。优选地，所述包裹的细胞是含有腈水合酶的红球菌属菌株的细胞。
本发明的另一部分是将上述含有包裹的细胞的聚丙烯酰胺珠用作生物催化剂以将底物转化成产物。优选地，所述底物是腈而所述产物是相应的酰胺。更优选地，所述底物是3-氰基吡啶而所述产物是烟酰胺。
腈的例子有氨腈、氰基乙酸、丙二腈(malonodinitrile)、氰基乙酸甲酯、丙烯腈、丁腈、戊腈、丁烯腈、甲基丙烯腈、2-氰基吡啶、3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、苯腈、2-氯苯腈、4-氯苯腈、吡嗪基腈(pyrazinecarbonitrile)、吡嗪-2，3-二腈、2-氟代腈、噻吩-2-腈、新戊腈(pivalonitrile)和环丙腈(cyclopropanecarbonitrile)。
转化可以分批反应或连续反应进行。优选地，反应是在合适的缓冲液中在10-35℃下进行的。
图1显示了在3-氰基吡啶连续反应生成烟酰胺的过程中反应混合物中烟酰胺的浓度与时间的关系。
图2显示了在3-氰基吡啶连续反应生成烟酰胺的过程中反应混合物中3-氰基吡啶的浓度与时间的关系。
图3显示了在3-氰基吡啶连续反应生成烟酰胺的过程中3-氰基吡啶到烟酰胺的转化率与时间的关系。
实施例1
培养红球菌属菌株
1.1.制备预培养物(preculture)
在含有1.25％(w/w)酵母提取物、0.05％(w/w)MgSO4·7H2O、0.003％(w/w)CoCl2·6H2O、0.5％(w/w)柠檬酸钠、0.75％(w/w)甲基丙烯酰胺和0.2％(w/w)KH2PO4的无菌培养基(200mL，pH 7.0)内接种红球菌属菌株的琼脂平板培养物。将预培养物在锥形瓶(500mL)中于28℃以120rpm培养48小时。
1.2.制备培养物
在含有1.25％(w/w)酵母提取物、0.05％(w/w)MgSO4·7H2O、0.003％(w/w)CoCl2·6H2O、0.5％(w/w)柠檬酸钠、0.75％(w/w)甲基丙烯酰胺和0.2％(w/w)KHPO4的无菌培养基(12L，pH 7.0)内接种按实施例1.1的描述获得的红球菌属菌株的预培养物(200mL)。将此培养物在发酵罐(12L)中于28℃，pH 7.0，溶解氧浓度＞40％(28℃下，1体积空气/(发酵液的体积×分钟)时溶解的氧气的浓度，)和300-400rpm培养48小时。细胞通过离心收获，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)洗涤，浓缩至干细胞浓度为15-20％(w/w)并储存在-40℃。
实施例2
红球菌属菌株的腈水合酶活性测定
在25℃下将含有包裹的红球菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠(湿重0.2g)加到磷酸盐缓冲液(0.05M，pH 7.0，30mL)中的3-氰基吡啶(1.59g)溶液中。在5和15分钟后取出样品(1000μl)。将这些样品立即与20μl H2SO4(48％(w/w))混合，用甲醇/水＝40∶60(v/v)的混合物稀释100倍体积，过滤(孔径0.2μm)并用HPLC分析(柱：C8反相，流速：1mL/min，流动相：甲醇/水＝40∶60(v/v))，波长：210nm，25℃)。将湿的生物催化剂在55℃、20毫巴下干燥4小时后获得干的聚丙烯酰胺珠。
实施例3
将红球菌属菌株的细胞包裹在聚丙烯酰胺珠中
将丙烯酰胺(42.25g，594mmol)、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(3.75g，24mmol)和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(1.5g，9mmol)溶于磷酸盐缓冲液(37.5g，50mM，pH7.0)并将溶液的pH调至7.0。在按实施例1的描述获得的红球菌属菌株细胞的悬浮液(20％(w/w)干细胞，165g)中加入用蒸馏水(5g)配制的过硫酸铵(0.465g，2mmol)溶液。在反应器(1L)中于350rpm下将用蒸馏水(5g)配制的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(0.232g，2mmol)溶液分散于矿物油(Exxsol D100，350g)。单体溶液、细胞悬浮液和油各自用氮气净化15分钟。单体溶液(流速：2.5g/min)和细胞悬浮液(流速：5g/min)被分别泵入一2.5mL的混合烧瓶。在20℃将所得混合物立即边搅拌(350rpm，
Figure S04831541520060510D000081
搅拌器)边滴入油中。完全加入反应混合物后再在20℃搅拌3.5小时。所得含有包裹的红球菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠通过过滤分离，用蒸馏水洗涤并使其在水中溶胀。将该聚丙烯酰胺珠于4℃储存在两倍体积的储存缓冲液(3.55g/L硫酸钠，0.25％(w/w)脱氢乙酸，钠盐，0.05％(w/w)烟酰胺，pH7.0)中。溶胀的珠为规则的球形，其大小为200-1200μm，机械强度＞300mN。干聚丙烯酰胺珠/湿聚丙烯酰胺珠的比例是0.11∶1(w/w)。比活为9.5μmol烟酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
实施例4
将3-氰基吡啶转化成烟酰胺，分批反应
25℃下，将在实施例3中获得的含有包裹的红球菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠(100g湿重)温和搅拌加入磷酸盐缓冲液(0.05M，pH7.0，400mL)中的3-氰基吡啶(40g，3.8mol)溶液。15分钟后，99％的3-氰基吡啶被转化成烟酰胺，30分钟后99％的3-氰基毗啶被转化成烟酰胺。
实施例5
将3-氰基吡啶转化成烟酰胺，连续反应
25℃下，将在实施例3中获得的含有红球菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠(100g湿重)加入磷酸盐缓冲液(0.05M，pH 7.0，400mL)中的3-氰基吡啶(40g，3.8mol)溶液。温和搅拌反应混合物，在其中连续加入用磷酸盐缓冲液(0.05M，pH 7.0)配制的3-氰基吡啶(10％(w/w))溶液，并连续取出反应混合物(不含聚丙烯酰胺珠)。在25℃下连续转化3.1小时，为期5周。5周后未观察到珠的磨损。确定3-氰基吡啶和烟酰胺的浓度(见图1和2)并计算转化率(见图3)。
实施例6
将红球菌属菌株的细胞包裹入聚丙烯酰胺珠
将丙烯酰胺(422.5g，5940mmol)、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(37.5g，240mmol)和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(15g，90mmol)溶于磷酸盐缓冲液(375g，50mM，pH 7.0)并将溶液的pH调至7.0。在按实施例1的描述获得的红球菌属菌株细胞的悬浮液(16％(w/w)干细胞，1650g)中加入用蒸馏水(25g)配制的过硫酸铵(4.65g，20mmol)溶液。在反应器(10L)中将用蒸馏水(25g)配制的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(2.32g，20mmol)溶液分散于矿物油(Exxsol D100，3500g)。单体溶液、细胞悬浮液和油各自用氮气净化15分钟。单体溶液(流速：13.5g/min)和细胞悬浮液(流速：27g/min)被分别泵入一常规的管子。在20℃将所得混合物边搅拌(215rpm，搅拌器)边泵入油中。完全加入反应混合物后再在20℃搅拌3.5小时。按实施例3的描述将所得含有包裹的红球菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠分离、洗涤和储存。溶胀的珠为规则的球形，其大小为200-1200μm，机械强度＞400mN。干聚丙烯酰胺珠/湿聚丙烯酰胺珠的比例是0.09∶1(w/w)。比活为7.3μmol烟酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
实施例7
含有包裹的红球菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠的储存稳定性
将实施例5中获得的含有包裹的红球菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠于4℃在水性储存溶液(3.55g/L硫酸钠，0.25％(w/w)脱氢乙酸钠，钠盐，0.05％(w/w)烟酰胺，pH 7.0)中储存50周。每五周取出样品。将聚丙烯酰胺珠分离，用蒸馏水洗涤并在25℃下在新鲜的储存溶液(3.55g/L硫酸钠，0.25％(w/w)脱氢乙酸，钠盐，0.05％(w/w)烟酰胺，pH 7.0)中悬浮1小时。按实施例2的描述确定腈水合酶的活性。确定干聚丙烯酰胺珠/湿聚丙烯酰胺珠的比例。在55℃和20毫巴下将湿聚丙烯酰胺珠干燥4小时后获得干聚丙烯酰胺珠。
表1：含有红球菌属细胞的聚丙烯酰胺珠的储存稳定性
周   干聚丙烯酰胺珠/湿聚丙烯酰胺珠(w/w)   比活[μmol烟酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)]
  0   0.09   7.3
  5   0.09   7.3
  10   0.09   7.0
  13   0.09   6.5
  50   0.08   6.0
实施例8
将红球菌属菌株的细胞包裹入聚丙烯酰胺珠
用类似于实施例3所述的包裹方法进行包裹，但使用用蒸馏水(7.0g)配制的过硫酸铵(1.86g，8mmol)溶液和用蒸馏水(5g)配制的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(0.928g，8mmol)溶液。按实施例3的描述将所得含有包裹的红球菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠分离、洗涤和储存。溶胀的珠为规则的球形，其大小为250-1300μm，机械强度＞400mN。干聚丙烯酰胺珠/湿聚丙烯酰胺珠的溶胀率为0.12∶1(w/w)。比活为7.8μmol烟酰胺/(min×mg聚丙烯酰胺珠)。
实施例9
将红球菌属菌株的细胞包裹入聚丙烯酰胺珠
用类似于实施例3所述的包裹方法进行包裹，但使用红球菌属菌株细胞的悬浮液(16％(w/w)干细胞)且聚合反应在10℃进行9小时。按实施例3的描述将所得含有包裹的红球菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠分离、洗涤和储存。溶胀的珠为规则的球形，其大小为250-1300μm，机械强度＞400mN。干聚丙烯酰胺珠/湿聚丙烯酰胺珠的比例为0.09∶1(w/w)。比活为7.3μmol烟酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
实施例10
将红球菌属菌株的细胞包裹入聚丙烯酰胺珠
将丙烯酰胺(42.25g，426mmol)、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(3.75g，24mmol)和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(1.5g，9mmol)溶于磷酸盐缓冲液(37.5g，50mM，pH7.0)并将溶液的pH调至7.0。在按实施例1的描述获得的红球菌属菌株细胞的悬浮液(18％(w/w)干细胞，165g)中加入用蒸馏水(7g)配制的过硫酸铵(1.86g，8mmol)溶液。在反应器(1L)中将用蒸馏水(7g)配制的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(0.928g，8mmol)溶液分散于矿物油(Exxsol D100，350g)。单体溶液、细胞悬浮液和油分别用氮气净化15分钟。单体溶液(流速：2.5g/min)和细胞悬浮液(流速：5g/min)被分别泵入一2.5mL的混合烧瓶。在20℃将所得混合物立即边搅拌(350rpm，
Figure S04831541520060510D000111
搅拌器)边滴入油中。完全加入反应混合物后再在20℃搅拌3.5小时。按实施例3的描述将所得含有包裹的红球菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠通过过滤分离，洗涤并储存。溶胀的珠为规则的球形，其大小为200-700μm，机械强度＞400mN。干聚丙烯酰胺珠/湿聚丙烯酰胺珠的比例是0.21∶1(w/w)。比活为5.4μmol烟酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
实施例11
将红球菌属菌株的细胞包裹入聚丙烯酰胺珠
用类似于实施例10所述的包裹方法进行包裹，但用丙烯酰胺(42.25g，594mmol)代替N，N-二甲基丙烯酰胺(42.25g，426mmol)并用N-[3-(二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(1.5g，9mmol)代替甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(1.5g，9mmol)。按实施例3的描述将所得含有包裹的红球菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠分离、洗涤和储存。溶胀的珠为规则的球形，其大小为150-1200μm，机械强度＞400mN。干聚丙烯酰胺珠/湿聚丙烯酰胺珠的比例为0.13∶1(w/w)。比活为5.9μmol烟酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
实施例12
培养包含具有在鼠李糖启动子转录控制之下编码酰胺酶的基因的质粒的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)种的菌株
12.1.制备预-预培养物(pre-preculture)
在含有1.6％(w/w)胰胨、1.0％(w/w)酵母提取物、0.5％(w/w)NaCl和0.01％(w/w)氨苄青霉素的无菌培养基(5mL，pH 7.0)内接种包含具有在鼠李糖启动子转录控制之下编码酰胺酶的基因的质粒的大肠埃希氏菌种的菌株的琼脂平板培养物。将预-预培养物在振荡器上于37℃培养12小时。
12.2.制备预培养物
在实施例12.1所述的无菌培养基(100mL)内接种5mL按实施例12.1的描述获得的大肠埃希氏菌种的菌株的预-预培养物。将此预培养物在振荡器上于37℃培养。在OD6000.25时在培养物中加入0.2％(w/w)L-鼠李糖。在OD6005时通过离心收获细胞，用缓冲液(1.80g/L乙二胺四乙酸，2.65g/L二钠盐/乙酸钠缓冲液，pH 7.0)洗涤两次并重悬于相同的缓冲液中，使干细胞浓度为15-20％(w/w)。细胞悬浮液储存在-40℃。
实施例13
酰胺酶测定
37℃下，将含有包裹的含酰胺酶的埃希氏菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠(0.4g湿重)边搅拌边加入用磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 8.0，9mL)配制的2-羟基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺(1.0g)溶液。在0、30和60分钟后取出样品(200μl)。测量形成的氨的摩尔量。形成的氨的摩尔量等于形成的2-羟基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酸的摩尔量。
实施例14
将包含具有在鼠李糖启动子转录控制之下编码酰胺酶的基因的质粒的大肠埃希氏菌种的菌株包裹入聚丙烯酰胺珠
用类似于实施例3所述的包裹方法进行包裹，但使用按实施例12的描述获得的大肠埃希氏菌种菌株细胞的悬浮液(19％(w/w)干细胞)、用蒸馏水(7.0g)配制的过硫酸铵(1.86g，8mmol)溶液以及用蒸馏水(5g)配制的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(0.928g，8mmol)溶液，并在400rpm(
Figure S04831541520060510D000121
搅拌器)下进行聚合。按实施例3的描述将所得含有包裹的大肠埃希氏菌种菌株细胞的聚丙烯酰胺珠通过过滤分离并于4℃储存在磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.0)中。溶胀的珠为不规则的球形，其大小为200-2000μm，机械强度＞200mN。干聚丙烯酰胺珠/湿聚丙烯酰胺珠的比例是0.21∶1(w/w)。比活为0.029μm 2-羟基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
实施例15
将2-羟基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺转化成2-羟基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酸，分批反应
在37℃，将实施例14中获得的含有包含具有编码酰胺酶的基因的质粒的大肠埃希氏菌种菌株的细胞的聚丙烯酰胺珠(0.4g湿重)加入用磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0，10mL)配制的2-羟基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酰胺(1.0g，6.366mmol)溶液中，保持1小时。形成2-羟基-2-甲基-3，3，3-三氟丙酸(2％)。
实施例16
将包含具有在鼠李糖启动子转录控制之下编码酰胺酶的基因的质粒的大肠埃希氏菌种的菌株包裹入聚丙烯酰胺珠
将丙烯酰胺(21.13g，297mmol)、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(1.88g，12mmol)和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(0.75g，4.8mmol)溶于磷酸盐缓冲液(18.75g，50mM，pH 7.0)并将溶液的pH调至7.0。在按实施例12的描述获得的大肠埃希氏菌种菌株细胞的悬浮液(19％(w/w)干细胞，82.5g)中加入用蒸馏水(2.5g)配制的过硫酸铵(0.93g，4mmol)溶液。在反应器(1L)中于450rpm下将用蒸馏水(5g)配制的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(0.928g，8mmol)溶液分散于矿物油(Exxsol D100，350g)。单体溶液、细胞悬浮液和油分别用氮气净化15分钟。单体溶液(流速：2.5g/min)和细胞悬浮液(流速：5g/min)被分别泵入一2.5mL的混合烧瓶。在20℃将所得混合物立即边搅拌(450rpm，
Figure S04831541520060510D000131
搅拌器)边滴入油中。完全加入反应混合物后再在20℃搅拌3.75小时。按实施例3的描述将所得含有包裹的大肠埃希氏菌种菌株细胞的聚丙烯酰胺珠分离并洗涤，在4℃储存在磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.0)中。溶胀的珠为不规则的球形，其大小为1000-2000μm，机械强度＞200mN。干聚丙烯酰胺珠/湿聚丙烯酰胺珠的比例是0.25∶1.00(w/w)。比活为0.016μmol烟酰胺/(min×mg干聚丙烯酰胺珠)。
实施例17
使用含有包裹的含腈水合酶的红球菌属细胞的聚丙烯酰胺珠作为将腈转化成酰胺的生物催化剂
在25℃下，将在实施例7中获得的含有包裹的红球菌属菌株细胞的聚丙烯酰胺珠(25g湿重)温和搅拌加入磷酸盐缓冲液(0.05M，pH 7.0，400mL)中或磷酸盐缓冲液(0.05M，pH 7，100mL)和甲醇的混合物中的腈溶液。在5、15和60分钟后取出样品并立即与H2SO4(48％(w/w)，0.03mL)混合。反应混合物通过HPLC或GC分析。测定比活。结果示于表2。
表2：用含有含腈水合酶的红球菌属细胞的聚丙烯酰胺珠作为生物催化剂时各种腈到相应的酰胺的生物转化。
底物 产物   底物浓度[mM]   MeOH/缓冲液比例[v/v]   比活[μmol/(min×mg)]
  氨腈   尿素   200   0∶1   857
  氰基乙酸   丙酰胺酸   100   0∶1   107
丙二腈   2-氰基乙酰胺/丙二酰胺 200 0∶1 946
  氰基乙酸甲酯   丙二酸甲酯   100   0∶1   340
  丙烯腈   丙烯酰胺   200   0∶1   76
  丁腈   丁酰胺   200   0∶1   1025
  戊腈   戊酰胺   200   1∶9   1708
  丁烯腈   巴豆酰胺   200   0∶1   1585
  甲基丙烯腈   甲基丙烯酰胺   200   0∶1   591
  2-氰基吡啶   吡啶酰胺   9.6   0∶1   24.6
  3-氰基吡啶   烟酰胺   250   0∶1   2320
  4-氰基吡啶   异烟酰胺   125   0∶1   613
  苯腈   苯甲酰胺   50   1∶4   276
  2-氯苯腈   2-氯苯甲酰胺   7.3   1∶4   6.4
  4-氯苯腈   4-氯苯甲酰胺   7.2   1∶4   42.6
吡嗪基腈   吡嗪-2-羧酰胺(carboxamide) 100 1∶4 246
  吡嗪-2，3-二腈   吡嗪-2，3-二羧酰胺   7.7   1∶4   0.53
  2-氟腈   呋喃-2-羧酰胺   100   1∶4   235
  噻吩-2-腈   噻吩-2-羧酰胺   9.2   1∶4   73
  新戊腈   2，2-二甲基丙酰胺   100   1∶4   321
  环丙烷腈   环丙烷羧酰胺   100   1∶4   562

Claims (14)

1.一种制备含有包裹的细胞的聚丙烯酰胺珠的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供丙烯酸单体混合物的水溶液，所述丙烯酸单体混合物由至少一个单官能丙烯酸单体和至少一个双官能丙烯酸单体构成，所述单官能丙烯酸单体选自丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N-[3-(二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯，所述双官能丙烯酸单体是N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；
(ii)提供在过硫酸盐水溶液中的细胞的悬浮液，
(iii)提供在矿物油中的叔胺水溶液的乳液，
(iv)混合步骤(i)提供的溶液和步骤(ii)提供的悬浮液，
(V)将步骤(iv)中获得的混合物边搅拌边加入步骤(iii)中提供乳液，
(Vi)聚合丙烯酸单体的混合物，同时包裹细胞以形成含有包裹的细胞的聚丙烯酰胺珠；
其中，所述聚丙烯酰胺珠的大小为0.05-3mm，机械强度至少为200mN，并且是球形或近乎球形的。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺珠的大小为0.1-1.5mm，机械强度至少为300mN。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，干细胞／丙烯酸单体混合物的比例为0.001：1-1：1(w／w)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，干细胞／丙烯酸单体混合物的比例为0.2：1-0.9：1(w／w)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是细菌细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞是诺卡氏菌形放线菌属细菌或肠杆菌科细菌的细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述叔胺是N，N，N’，N’-四甲基乙二胺或3-(二甲基氨基)丙腈。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，未使用表面活性剂。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(vi)中形成的聚丙烯酰胺珠被分离。
10.用权利要求1-9中任一项所述方法获得的含有包裹的细胞的聚丙烯酰胺珠，其中，所述聚丙烯酰胺珠的机械强度至少为200mN。
11.如权利要求10所述的聚丙烯酰胺珠，其特征在于，所述包裹的细胞是含有腈水合酶的红球菌属菌株的细胞。
12.如权利要求10或11所述的聚丙烯酰胺珠作为将底物转化成产物的生物催化剂的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述底物是腈，所述产物是相应的酰胺。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述腈是3-氰基吡啶，所述产物是烟酰胺。
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