JP5107577B2

JP5107577B2 - 生体触媒の固定化

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Publication number: JP5107577B2
Application number: JP2006537159A
Authority: JP
Inventors: バルテック、ヨハネス; ロビンス、カレン; ズィゴバ、ジャナ
Original assignee: ロンザアーゲー
Priority date: 2003-10-27
Filing date: 2004-10-26
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2024-10-26
Also published as: MX281018B; CN1871345B; AU2004284226B2; JP2007508851A; EP1682659A1; CN1871345A; JP2012196213A; IL174453A; US20070259415A1; EA200600704A1; KR20060100396A; IL174453A0; US20050089987A1; BRPI0415884A; EA015321B1; AU2004284226A1; MXPA06004672A; WO2005040373A1; CA2540251A1

Description

本発明は、被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズ、その製造方法、および生体触媒としてのその使用に関するものである。

被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズは、細胞内に含まれる酵素に依存する様々な生体内変化のための生体触媒として使用することができる。例えば、二トリルヒドラターゼを含むロドコッカス属の菌株の被包性細菌細胞を含むポリアクリルアミドビーズは二トリル類からアミド類へのトランスフォーメーションに使用することができる。

酵素を含むポリアクリルアミドビーズについてはニルソン等により執筆されている（非特許文献１を参照）。過硫酸アンモニウム（0.25g, 1.1 mmol）のトリエタノールアミン−ＨＣｌバッファー（0.05 M, pH 7.0, 0.5 mL）溶液およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（0.5 mL, 0.385 mg, 3.3 mmol)が、トリプリシン（60 mg）、アクリルアミド（8.55 g, 120 mmol）およびＮ，Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミド（0.45 g, 2.9 mmol）のトリエタノールアミン−ＨＣｌバッファー（0.05 M, pH 7.0）溶液（60mL）に加えられた。該溶液がソルビタンセスキオリエート（sorbitan sesquioleate）（1 mL）を含有する攪拌有機相（トルエン／クロロホルム 290:110, 400 mL）に注入された。４℃において３０分間、重合が実施された。ニルソン等は、ポリアクリルアミドビーズ中の細胞の包込みについては記載していなかった（非特許文献１を参照）。

モスバック（Mosbach）等は、被包性細胞を含む種々のビーズポリマーの調製について記載しており（特許文献１を参照）、動物油、植物油、リン酸トリブチル、液体シリコーン、パラフィン油、またはフタル酸ジブチルエステルが水不溶性相として使用されている。酵母細胞または酵素を含むポリアクリルアミドビーズは、アクリルアミド（17.6 g, 248 mmol）およびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（1.2 g, 8mmol）をトリス緩衝液（100 mL, 0.05 M, pH 7）に溶解し、この溶液８ｍＬを酵母細胞または酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、10 mg/mL, 2 Ml）および過硫酸アンモニウム（0.4 g/mL, 20 mL (8 mg, 0.03 mmol)）と混合し、該混合物を大豆油（40 mL）中で分散することにより調製した。好適なビーズサイズに達したとき、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（100 mL, 77.0 mg, 0.66 mmol）が加えられた。
ＵＳ４，６４７，５３６Ａ Biochim. Biophys. Acta 1972, 268, 253-256

［発明が解決しようとする課題］
本発明は、細胞を含むポリアクリルアミドビーズ、およびその製造方法を提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］
上記目的は、請求項１２のポリアクリルアミドおよびクレーム１の方法により達成された。

被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズを製造するための本発明の方法は、
(i) アクリルモノマー混合物の水溶液を提供する工程、
(ii) 過硫酸水溶液中の細胞懸濁液を提供する工程、
(iii) 任意に界面活性剤を含有し得る水非混和性液体中の、第三級アミン水溶液のエマルジョンを提供する工程、
(iv) 工程(i)で提供される溶液と工程(ii)で提供される懸濁液とを混合する工程、
(v) 工程(iv)で得られた混合物を工程(iii)で提供される攪拌エマルジョンに加える工程、
(vi) アクリルモノマーの混合物を重合すると同時に細胞を包込むことにより被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズを形成する工程、
を含む方法である。

本発明の方法は、アクリルモノマー、細胞および過硫酸塩の添加前に水非混和性液体に第三級アミンが既に添加されている限りにおいては有利である。

本発明の方法により製造されるポリアクリルアミドビーズは球状またはほぼ球状形をしている。

ポリアクリルアミドビーズは、０．０１乃至５ｍｍのサイズを有し得、破壊力は少なくとも１０ｍＮである。好ましくは、ポリアクリルアミドビーズは、０．０５乃至３ｍｍのサイズを有し、破壊力は少なくとも２００ｍＮである。より好ましくは、ポリアクリルアミドビーズは０．１乃至１．５ｍｍのサイズを有し、破壊力は少なくとも３００ｍＮである。

該破壊力は、二つの平面の間に置かれたビーズに、該ビーズが破壊するまで圧力を加えることにより測定される。

該細胞は、細菌性細胞、真菌類細胞、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞であり得る。好ましくは、該細胞は細菌性細胞であり、より好ましくはノカルジア状の放線菌類の細菌細胞、または腸内細菌科の細菌細胞である。更に好ましくは、該細胞はロドコッカス属またはエシェリキア属の細菌性細胞であり、特に好ましくは、ロドコッカス属の細菌性細胞である。

細菌の具体例としては、バチルス属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、アクチノミセス属、アルトロバクター属、コリネバクテリウム属、Ｇｏｒｄｏｎａ属、ノカルジア属、ロドコッカス属、またはＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属の細菌等のグラム陽性細菌、および、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、アルカリゲネス属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、シュードモナス属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、シトロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、またはクレブシエラ属の細菌等のグラム陰性細菌が挙げられる。

ノカルジア状の放線菌類の細菌の具体例としては、Ｇｏｒｄｏｎａ属、ノカルジア属、ロドコッカス属、およびＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属の細菌が挙げられる。腸内細菌科の細菌の具体例としては、シトロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、およびクレブシエラ属の細菌が挙げられる。

これら細胞は、当該分野で公知の方法により培養することができる。

該細菌性細胞は、染色体に関与する酵素をコードする遺伝子を含み得、あるいは関与する酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドで形質転換し得る。

細菌性細胞が染色体に関与する酵素をコードする遺伝子を含み、且つこの酵素が異化酵素である場合には、該細菌性細胞は好適な酵素誘発因子の存在下において培養され得る。例えば、ロドコッカス属菌株の細胞は、ニトリルヒドラターゼの発現を誘発するためにニトリルヒドラターゼ誘発因子の存在下において培養され得る。ロドコッカス属菌株のニトリルヒドラターゼに好適な誘発因子の例としては、メタクリルアミド、クロトンアミド、およびプロピオンアミドが挙げられる。

細菌性細胞が関与する酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドで形質転換し、且つこの遺伝子が誘導性プロモータの制御下にある場合には、関与する酵素をコードする遺伝子の転写は、培養の間の好適な時点で誘発され得る。誘導性プロモータの例としては、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ、アラビノース、およびラムノースプロモータが挙げられる。誘発は、用いられるプロモータに依存する。例えば、ラムノースプロモータはＬ−ラムノースの添加により誘発され得る。

培養後、関与する酵素を含む細胞は、発酵倍溶液から分離され得る。好ましくは、細胞は、５℃以下で適切なバッファー中で保存する。

アクリルモノマーの混合物は少なくとも一つの単官能アクリルモノマーおよび少なくとも一つの二官能アクリルモノマーからなり得る。

単官能アクリルモノマーは、式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１はＨまたはメチルであり、
Ｒ^２はＮＨ_２、ＮＨＲ^３、Ｎ（Ｒ^３）_２、ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｎ（Ｒ^３）_２およびＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｎ（Ｒ^３）_２からなる群から選択され、
Ｒ^３各々はＣ_１−４アルキルであり、
ｎは１乃至４の整数である。）
で表されるモノマーであり得る。

単官能アクリルモノマーの具体例としては、アクリルアミド（Ｒ^１＝Ｈ、Ｒ^２＝ＮＨ_２）；メタクリルアミド（Ｒ^１＝メチル、Ｒ^２＝ＮＨ_２）；Ｎ−アルキルアクリルアミド（Ｒ^１＝Ｈ、Ｒ^２＝ＮＨＲ^３、Ｒ^３＝Ｃ_１−４アルキル）、例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド（Ｒ^３＝エチル）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｒ^３＝イソプロピル）、又はＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（Ｒ^３＝ｔｅｒｔ−ブチル）等；Ｎ−アルキルメタクリルアミド（Ｒ^１＝メチル、Ｒ^２＝ＮＨＲ^３、Ｒ^３＝Ｃ_１−４アルキル）、例えば、Ｎ−エチルメタクリルアミド（Ｒ^３＝エチル）、又はＮ−イソプロピルメタクリルアミド（Ｒ^３＝イソプロピル）等；Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド（Ｒ^１＝Ｈ、Ｒ^２＝Ｎ（Ｒ^３）_２、Ｒ^３＝Ｃ_１−４アルキル）、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（Ｒ^３＝メチル）、及びＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（Ｒ^３＝エチル）等；Ｎ−［（ジアルキルアミノ）アルキル］アクリルアミド（Ｒ^１＝Ｈ、Ｒ^２＝ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ（Ｒ^３）_２、Ｒ^３＝Ｃ_１−４アルキル）、例えば、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド（ｎ＝３、Ｒ^３＝メチル）、又はＮ−［３−（ジエチルアミノ）プロピル］アクリルアミド（ｎ＝３、Ｒ^３＝エチル）等；Ｎ−［（ジアルキルアミノ）アルキル］メタクリルアミド（Ｒ^１＝メチル、Ｒ^２＝ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ（Ｒ^３）_２、Ｒ^３＝Ｃ_１−４アルキル）、例えば、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド（Ｒ^３＝メチル）、又はＮ−［３−（ジエチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド（Ｒ^３＝エチル）等；（ジアルキルアミノ）アルキルアクリレート（Ｒ^１＝Ｈ、Ｒ^２＝Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ（Ｒ^３）_２、Ｒ^３＝Ｃ_１−４アルキル）、例えば、２−（ジメチルアミノ）エチルアクリレート（ｎ＝２、Ｒ^３＝メチル）、２−（ジメチルアミノ）プロピルアクリレート（ｎ＝３、Ｒ^３＝メチル）、又は２−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート（ｎ＝２、Ｒ^３＝エチル）；（ジアルキルアミノ）アルキルメタクリレート（Ｒ^１＝メチル、Ｒ^２＝Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ（Ｒ^３）_２、Ｒ^３＝Ｃ_１−４アルキル）、例えば、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ｎ＝２、Ｒ^３＝メチル）等が挙げられる。

Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメタクリルアミド、Ｎ−［(ジアルキルアミノ）アルキル］アクリルアミド、Ｎ−［(ジアルキルアミノ）アルキル］メタクリルアミド、（ジアルキルアミノ）アルキルアクリレートおよび（ジアルキルアミノ）アルキルアクリレートは、当該分野で公知の方法により調製することができ、例えば、アクリロイルクロリド、メチルアクリレート、メタクリロイルクロリド又はメチルメタクリレートを各々アルキルアミン、ジアルキルアミンまたは（ジアルキルアミノ）アルキルアミンまたは（ジアルキルアミノ)アルコールと反応させることにより調製することができる。

二官能アクリルモノマーは、式（ＩＩ）：

（式中、
Ｒ^１はＨまたはメチルであり、
−Ｘ−は−（ＣＨ_２）_ｎ−、または−（ＣＨ−ＯＨ）_ｎ−であり、
ｎは１乃至４の整数である。）
で表されるモノマーであり得る。

二官能アクリルモノマーの具体例としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（Ｒ^１＝Ｈ、−Ｘ−＝−（ＣＨ_２）_ｎ−、ｎ＝１）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミド（Ｒ^１＝メチル、−Ｘ−＝−（ＣＨ_２）_ｎ−、ｎ＝１）、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド（Ｒ^１＝Ｈ、−Ｘ−＝−（ＣＨ_２）_ｎ−、ｎ＝２）、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスメタクリルアミド（Ｒ^１＝メチル、−Ｘ−＝−（ＣＨ_２）_ｎ−、ｎ＝２）、Ｎ，Ｎ’−プロピレンビスアクリルアミド（Ｒ^１＝Ｈ、−Ｘ−＝−（ＣＨ_２）_ｎ−、ｎ＝３）、およびＮ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド（Ｒ^１＝Ｈ、−Ｘ−＝−（ＣＨ−ＯＨ）_ｎ−、ｎ＝２）等が挙げられる。

二官能アクリルモノマーは当該分野で公知の方法により調製することができ、例えば、−Ｘ−が−（ＣＨ_２）_ｎ−である二官能アクリルモノマーは、アクリロイルクロリド、メチルアクリレート、メタクリロイルクロリド、またはメチルメタクリレートを各々ジアミンと反応させることにより調製することができる。

好ましくは、二官能アクリルモノマーは、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミド、およびＮ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミドからなる群から選択され、単官能モノマーは、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、Ｎ−［（ジアルキルアミノ）アルキル］メタクリルアミド、（ジアルキルアミノ）アルキルアクリレートおよび（ジアルキルアミノ）アルキルメタクリレートからなる群から選択される。

より好ましくは、二官能アクリルモノマーは、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドであり、単官能モノマーは、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミドおよび２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレートからなる群から選択される。

過硫酸塩は、いかなる水溶性過硫酸塩であってもよい。水溶性過硫酸塩の具体例としては、過硫酸アンモニウムおよびアルカリ金属の過硫酸塩が挙げられる。アルカリ金属の具体例としては、リチウム、ナトリウムおよびカリウムが挙げられる。好ましくは、過硫酸塩は、過硫酸アンモニウム、または過硫酸カリウムであり、より好ましくは、過硫酸アンモニウムである。

第三級アミンは、いかなる水溶性第三級アミンであってもよい。好ましくは、第三級アミンは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンまたは３−（ジメチルアミノ）プロピオニトリルであり、より好ましくは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンである。

水非混和性液体は、重合温度において液体であればいかなる水非混和性の液体であってもよい。水非混和性液体の具体例としては、鉱物油、植物油、合成油が挙げられる。鉱物油の具体例としては、トルエン、キシレン、脱芳香化された炭化水素混合物（例えば、ＥｘｘｏｌＤ１００）、およびイソパラフィン混合物（例えば、ＩｓｏｐｅｒＭ）が挙げられる。植物油の具体例としては、ヒマワリ油、オリーブ油、ピーナッツ油、アーモンド油、サフラワ油、ダイズ油、およびコーン油が挙げられる。合成油の具体例としては、シリコーン油が挙げられる。

好ましくは、水非混和性液体は鉱物油である。より好ましくは、飽和炭化水素又はその混合物である。特に好ましくは、脱芳香化された炭化水素混合物又はイソパラフィン混合物である。

水非混和性液体は任意に界面活性剤を含有し得る。界面活性剤は好適なものであればいずれでもよく、好適な界面活性剤の具体例としては、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、エチレングリコール脂肪酸エステル、およびグリセロール脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤；少なくとも一つのアルキルが８個以上の炭素原子を有するテトラアルキルアンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤が挙げられる。脂肪酸の具体例としては、オレイン酸またはステアリン酸が挙げられ、アルキルの具体例としては、エチル、プロピル、およびブチルが挙げられ、８個以上の炭素原子を有するアルキルの具体例としては、オクチル、ノニルおよびデシルが挙げられる。

界面活性剤／油比は、０．１０：１（ｗ/ｗ）以下であればよいが、界面活性剤は使用しないことが好ましい。

アクリルモノマー混合物の水溶液は、アクリルモノマーを水又はバッファー中に溶解することにより提供することができる。過硫酸塩水溶液中の細胞懸濁液は、過硫酸塩の水溶液又はバッファー溶液と水又はバッファー中の細胞懸濁液と混合することにより提供することができる。アクリルモノマーがバッファー中に溶解し、細胞がバッファー中に懸濁され、関与する酵素により有利とされる５乃至１０の範囲内にｐＨが調整されることが好ましい。例えば、６乃至８の範囲のｐＨは、ロドコッカス属菌株からのニトリルヒドラターゼにより有利とされる。

水非混和性液体中の第三級アミン水溶液のエマルジョンは、水非混和性液体に第三級アミンの水溶液又はバッファー溶液を乳化することにより提供することができる。

アクリルモノマー混合物の水溶液、過硫酸塩水溶液中の細胞懸濁液、および任意に界面活性剤を含有し得る水非混和性液体中の第三級アミン水溶液のエマルジョンは、例えば窒素をかける等により脱酸素されることが好ましい。

アクリルモノマー混合物の水溶液および過硫酸塩水溶液中の細胞懸濁液を混合し、直ちに水非混和性液体中の第三級アミン水溶液の攪拌エマルジョンに滴下する。好適なスターラーの例としては、３又は４ピッチ葉片タービンスターラー（three or four pitch bladed turbine stirrer）、スクリュースターラー又はビスコ−ジェット（visco-jet（登録商標））スターラーが挙げられ、ビスコ−ジェットが好適に使用される。好ましくは、重合は５〜３５℃で実施され、より好ましくは１５〜２５℃で実施され、特に好ましくは１８〜２２℃で実施される。

以下の比率が重合工程で好ましく用いられる。
アクリルモノマー混合物／水の好ましい比率は、０．０５：１〜０．５：１（ｗ／ｗ）である。より好ましくは、０．１：１〜０．３：１（ｗ／ｗ）であり、特に好ましくは、０．２：１〜０．２８：１（ｗ／ｗ）である。

二官能アクリルモノマー／単官能アクリルモノマーの好ましい比率は、０．００１：１〜０．８：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。より好ましくは、０．０１：１〜０．０８：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であり、特に好ましくは、０．０３：１〜０．０６：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。

乾燥細胞／アクリルモノマー混合物の好ましい比率は、０．００１：１〜１：１（ｗ／ｗ）である。より好ましくは、０．２：１〜０．９：１（ｗ／ｗ）であり、更に好ましくは、０．４〜０．８：１（ｗ／ｗ）であり、特に好ましくは、０．５：１〜０．７：１（ｗ／ｗ）である。

過硫酸塩／アクリルモノマー混合物の好ましい比率は、０．０００１：１〜０．１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。より好ましくは、０．００１：１〜０．０５：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であり、特に好ましくは、０．００２：１〜０．０３：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。

第三級アミン／過硫酸塩の好ましい比率は、０．２：１〜５０：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。より好ましくは、０．８：１〜１０：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であり、特に好ましくは、１：１〜５：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。

油／水の好ましい比率は、１．２：１〜１０：１（ｗ／ｗ）である。より好ましくは、１．３：１〜７：１（ｗ／ｗ）であり、更に好ましくは、１．４：１〜５：１（ｗ／ｗ）であり、特に好ましくは、１．５：１〜４：１（ｗ／ｗ）である。

重合後に得られるポリアクリルアミドビーズは、例えば、デカンテーション、または濾過により分離されることが好ましい。分離されたビーズは、水非混和性液体の痕跡を除去するために水又は水溶液を用いて洗浄され得、適切なバッファー中に保存され得る。

本発明の他の態様は、本発明の方法により得られる被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズである。好ましくは、該被包性細胞は、ニトリルヒドラターゼを含有するロドコッカス属菌株の細胞である。

本発明の更なる態様は、基質から産物へのトランスフォーメーションのための、上述した被包性細胞を含有するポリアクリルアミドビーズの生体触媒としての使用である。好ましくは、該基質はニトリルであり、産物は対応するアミドである。より好ましくは、該基質は３−シアノピリジンであり、産物はニコチンアミドである。

ニトリルの具体例としては、シアンアミド、シアノ酢酸、マロノジニトリル、シアノ酢酸メチルエステル、アクリロニトリル、ブチロニトリル、バレロニトリル、クロトノニトリル、メタクリロニトリル、２−シアノピリジン、３−シアノピリジン、４−シアノピリジン、ベンゾニトリル、２−クロロベンゾニトリル、４−クロロベンゾニトリル、ピラジンカルボニトリル、ピラジン−２，３−ジカルボニトリル、２−フロニトリル、チオフェン−２−カルボニトリル、ピバロニトリルおよびシクロプロパンカルボニトリルが挙げられる。

トランスフォーメーションは、バッチ反応または連続反応において実施することができる。好ましくは、該反応は、１０〜３５℃の温度において好適なバッファー中で実施される。

［実施例］
例１
ロドコッカス属菌株の培養
１．１培養物前駆体（preculture）の調製
酵母抽出物：１．２５％（ｗ／ｗ）、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．０５％（ｗ／ｗ）、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ：０．０３％（ｗ／ｗ）、クエン酸ナトリウム：０．５％（ｗ／ｗ）、メタクリルアミド：０．７５％（ｗ／ｗ）、およびＫＨ_２ＰＯ：０．２％（ｗ／ｗ）を含有する無菌培地（２００ｍＬ、ｐＨ７．０）に、ロドコッカス属菌株の寒天プレート培養物を摂取した。培養物前駆体を三角フラスコ（５００ｍＬ）中で４８時間、２８℃で１２０ｒｐｍにおいて培養した。

１．２培養物の調製
酵母抽出物：１．２５％（ｗ／ｗ）、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．０５％（ｗ／ｗ）、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ：０．０３％（ｗ／ｗ）、クエン酸ナトリウム：０．５％（ｗ／ｗ）、メタクリルアミド：０．７５％（ｗ／ｗ）、およびＫＨ_２ＰＯ：０．２％（ｗ／ｗ）を含有する無菌培地（１２Ｌ、ｐＨ７．０）に、例１．１の記載に従い得られたロドコッカス属菌株の培養物前駆体（２００ｍＬ）を接種した。該培養物を発酵槽（１２Ｌ）中で２８℃、ｐＨ７．０、溶解酸素濃度＞４０％（１体積空気／（体積発酵培養液ｘ分）における溶解酸素濃度に関して、２８℃）、３００−４００ｒｐｍにおいて48時間培養した。細胞を遠心分離により摘出し、ホスフェートバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で洗浄し、乾燥細胞濃度１５〜２０％（ｗ／ｗ）に濃縮し、−４０℃にて保存した。

例２
ロドコッカス属菌株のニトリルヒドラターゼ活性アッセイ
ロドコッカス属菌株の被包性細胞を含有するポリアクリルアミドビーズ（湿潤質量０．２ｇ）を、２５℃において３−シアノピリジン（１．５９ｇ）のホスフェートバッファー溶液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．０、３０ｍＬ）に加えた。５分後および１５分後のサンプル（１０００μｌ）を採取した。これらサンプルを直ちにＨ_２ＳＯ_４（４８％（ｗ／ｗ））２０μｌと混合し、メタノール／水＝４０：６０（ｖ／ｖ）混合物で１００倍（体積）に希釈し、濾過し（孔サイズ０．２μｍ）、ＨＰＬＣ（カラム：Ｃ８逆相、流速：１ｍＬ／分、移動相：メタノール／水＝４０：６０（ｖ／ｖ）、波長：２１０ｎｍ、２５℃）により分析した。湿潤生体触媒を５５℃、２０ミリバールにおいて４時間乾燥することにより、乾燥ポリアクリルアミドビーズを得た。

例３
ポリアクリルアミドビーズ中のロドコッカス属菌株の細胞の被包
アクリルアミド（４２．２５ｇ、５９４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ´−メチレンビスアクリルアミド（３．７５ｇ、２４ｍｍｏｌ）および２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（１．５ｇ、９ｍｍｏｌ）をホスフェートバッファー（３７．５ｇ、５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中に溶解し、溶液のｐＨを７．０に調整した。過硫酸アンモニウム（０．４６５ｇ、２ｍｍｏｌ）の蒸留水（５ｇ）溶液を、前記例１で得られたロドコッカス属菌株の細胞の懸濁液（２０％（ｗ／ｗ）乾燥細胞、１６５ｇ）に加えた。Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン（０．２３２ｇ、２ｍｍｏｌ）の蒸留水（５ｇ）溶液を、３５０ｒｐｍにおいて反応器（１Ｌ）中の鉱油（ＥｘｘｓｏｌＤ１００、３５０ｇ）中に分散した。モノマー溶液、細胞懸濁液および油を別々に１５分間窒素にかけた。モノマー溶液（流速：２．５ｇ／分）および細胞懸濁液（流速：５ｇ／分）を別々に２．５ｍＬミキシングフラスコにポンピングした。得られた混合物を直ちに２０℃において攪拌油（３５０ｒｐｍ、ビスコ−ジェット（登録商標）スターラー）中に滴下した。全部を添加した後、反応混合物を２０℃において更に３．５時間攪拌した。得られたロドコッカス属菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズを濾過により分離し、蒸留水で洗浄し、水中で膨潤させた。ポリアクリルアミドビーズを体積で２倍量の貯蔵バッファー（硫酸ナトリウム３．５５ｇ／Ｌ、デヒドロ酢酸０．２５％（ｗ／ｗ）、ナトリウム塩、ニコチンアミド０．０５％（ｗ／ｗ）、ｐＨ７．０）中に４℃において貯蔵した。湿潤ビーズは、サイズ２００μｍ〜１２００μｍの規則的な球状をしており、破壊力は＞３００ｍＮであった。乾燥ポリアクリルアミドビーズ／湿潤ポリアクリルアミドビーズの比は、０．１１：１（ｗ／ｗ）であった。比活性は、９．５μmolニコチンアミド／（分×ｍｇ乾燥ポリアクリルアミドビーズ）であった。

例４
３−シアノピリジンからニコチンアミドへの転化、バッチ反応
上記例３で得られたロドコッカス属菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズ（１００ｇ湿潤質量）を、２５℃において、ゆるやかに攪拌された３−シアノピリジン（４０ｇ、３．８ｍｏｌ）のホスフェートバッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ７．０、４００ｍＬ）溶液に加えた。１５分後、９９％の３−シアノピリジンがニコチンアミドに転化し、３０分後、９９％の３−シアノピリジンがニコチンアミドに転化していた。

例５
３−シアノピリジンからニコチンアミドへの転化、連続反応
上記例３で得られたロドコッカス属菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズ（１００ｇ湿潤質量）を、２５℃において、３−シアノピリジン（４０ｇ、３．８ｍｏｌ）のホスフェートバッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ７．０、４００ｍＬ）溶液に加えた。３−シアノピリジンのホスフェートバッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ７．０）溶液（１９％（ｗ／ｗ））を、ゆるやかに攪拌された反応混合物に連続的に加え、反応混合物（ポリアクリルアミドビーズなし）を連続的に除去した。連続転化を、２５℃において５週間、保持時間３．１時間において行った。５週間後、ビーズの磨砕は観察されなかった。３−シアノピリジンおよびニコチンアミド濃度を決定し（図１および２を参照）、転化率を計算した（図３を参照）。

例６
ポリアクリルアミドビーズにおけるロドコッカス属菌株の細胞の被包
アクリルアミド（４２２．５ｇ、５９４０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（３７．５ｇ、２４０ｍｍｏｌ）および２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（１５ｇ、９０ｍｍｏｌ）をホスフェートバッファー（３７５ｇ、５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解し、溶液のｐＨを７．０に調整した。過硫酸アンモニウム（４．６５ｇ、２０ｍｍｏｌ）の蒸留水（２５ｇ）溶液を、上記例１に従い得られたロドコッカス属菌株の細胞の懸濁液（１６％（ｗ／ｗ）乾燥細胞、１６５０ｇ）に加えた。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（２．３２ｇ、２０ｍｍｏｌ）の蒸留水（２５ｇ）溶液を反応器（１０Ｌ）中で鉱物油（ＥｘｘｓｏｌＤ１００）に分散させた。モノマー溶液、細胞懸濁液および油を別々に窒素に１５分間かけた。モノマー溶液（流速：１３．５ｇ／分）および細胞懸濁液（流速２７ｇ／分）を別々に一般的なパイプにポンピングした。得られた混合物を２０℃において攪拌油（２１５ｒｐｍ、ビスコ−ジェット（登録商標）スターラー）中にポンピングした。全部を添加した後、反応混合物を２０℃において更に３．５時間攪拌した。得られた、ロドコッカス属菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズを分離し、洗浄し、上記例３に従い貯蔵した。湿潤ビーズはサイズ２００μｍ〜１２００μｍの規則的な球形をしており、破壊力は＞４００ｍＮであった。乾燥ポリアクリルアミドビーズ／湿潤ポリアクリルアミドビーズの比は、０．０９：１（ｗ／ｗ）であった。比活性は７．３μモルニコチンアミド／（分×ｍｇ乾燥ポリアクリルアミドビーズ）であった。

例７
ロドコッカス属菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズの貯蔵安定性
例５に従い得られたロドコッカス属菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズを、貯蔵水溶液（硫酸ナトリウム３．５５ｇ／Ｌ、デヒドロ酢酸０．２５％（ｗ／ｗ）、ナトリウム塩、ニコチンアミド０．０５％（ｗ／ｗ）、ｐＨ７．０）中に４℃において５０週間貯蔵した。サンプルを５週間毎に取り出した。ポリアクリルアミドビーズを分離し、蒸留水で洗浄し、新鮮な貯蔵液（硫酸ナトリウム３．５５ｇ／Ｌ、デヒドロ酢酸０．２５％（ｗ／ｗ）、ナトリウム塩、ニコチンアミド０．０５％（ｗ／ｗ）、ｐＨ７．０）中で２５℃において１時間分散させた。ニトリルヒドラターゼ活性を例２に従い決定した。乾燥ポリアクリルアミドビーズ／湿潤ポリアクリルアミドビーズの比を決定した。乾燥ポリアクリルアミドビーズは湿潤ポリアクリルアミドビーズを５５℃、２０ミリバールで４時間乾燥した後に得た。

例８
ポリアクリルアミドビーズ中のロドコッカス属菌株細胞の被包
被包は、過硫酸アンモニウム（１．８６ｇ、８ｍｍｏｌ）の蒸留水（７．０ｇ）溶液およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（０．９２８ｇ、８ｍｍｏｌ）の蒸留水（５ｇ）溶液を使用したことを除き、例３に記載の被包と類似の態様で実施した。得られた、ロドコッカス属菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズを分離し、洗浄し、例３に従い貯蔵した。膨潤ビーズは、サイズ２５０μｍ〜１３００μｍの規則的な球形をしており、破壊力は＞４００ｍＮであった。乾燥ポリアクリルアミドビーズ／湿潤ポリアクリルアミドビーズの膨潤比は、０．１２：１（ｗ／ｗ）であった。比活性は、７．８μmol ニコチンアミド／（分×ｍｇポリアクリルアミドビーズ）であった。

例９
ポリアクリルアミドビーズ中のロドコッカス属菌株細胞の被包
被包は、ロドコッカス属菌株の細胞懸濁液（１６％（ｗ／ｗ）、乾燥細胞）を使用し、重合を１０℃で９時間行ったことを除き、例３に記載の被包と類似の態様で実施した。得られた、ロドコッカス属菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズを分離し、洗浄し、例３に従い貯蔵した。膨潤ビーズは、直径２５０μｍ〜１３００μｍの規則的な球形をしており、破壊力は＞４００ｍＮであった。乾燥ポリアクリルアミドビーズ／湿潤ポリアクリルアミドビーズの比は、０．０９：１．００（ｗ／ｗ）であった。比活性は、７．３μmol ニコチンアミド／（分×ｍｇ乾燥ポリアクリルアミドビーズ）であった。

例１０
ポリアクリルアミドビーズ中のロドコッカス属菌株細胞の被包
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（４２．２５ｇ、４２６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（３．７５ｇ、２４ｍｍｏｌ）および２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（１．５ｇ、９ｍｍｏｌ）をホスフェートバッファー（３７．５ｇ、５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解し、該溶液のｐＨを７．０に調整した。過硫酸アンモニウム（１．８６ｇ、８ｍｍｏｌ）の蒸留水（７ｇ）溶液を、例１に従い調製したロドコッカス属菌株の細胞懸濁液（１８％（ｗ／ｗ）乾燥細胞、１．６５ｇ）に加えた。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（０．９２８ｇ、８ｍｍｏｌ）の蒸留水（７ｇ）溶液を反応器（１Ｌ）中で鉱物油（ＥｘｘｓｏｌＤ１００、３５０ｇ）に分散させた。モノマー溶液、細胞懸濁液および油を別々に窒素に１５分間かけた。モノマー溶液（流速：２．５ｇ／分）および細胞懸濁液（流速：５ｇ／分）を別々にミキシングフラスコ２．５ｍＬにポンピングした。得られた混合物を直ちに攪拌油（３５０ｒｐｍ、ビスコ−ジェット（登録商標）スターラー）中に２０℃において滴下した。全部を添加した後、反応混合物を２０℃において更に３．５時間攪拌した。得られた、ロドコッカス属菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズを濾過により分離し、洗浄し、例３に従い貯蔵した。膨潤ビーズは、サイズ２００μｍ〜７００μｍの規則的な球形をしており、破壊力は＞４００ｍＮであった。乾燥ポリアクリルアミドビーズ／湿潤ポリアクリルアミドビーズの比は、０．２１：１（ｗ／ｗ）であった。比活性は、５．４μmol ニコチンアミド／（分×ｍｇ乾燥ポリアクリルアミドビーズ）であった。

例１１
ポリアクリルアミドビーズ中のロドコッカス属菌株細胞の被包
被包は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（４２．２５ｇ、４２６ｍｍｏｌ）に替えてアクリルアミド（４２．２５ｇ、５９４ｍｍｏｌ）を、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（１．５ｇ、９ｍｍｏｌ）に替えてＮ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド（１．５ｇ、９ｍｍｏｌ）を使用したことを除き、例１０に記載の被包と類似の態様で実施した。得られた、ロドコッカス属菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズを分離し、洗浄し、例３に従い貯蔵した。膨潤ビーズは、サイズ１５０μｍ〜１２００μｍの規則的な球形をしており、破壊力は＞４００ｍＮであった。乾燥ポリアクリルアミドビーズ／湿潤ポリアクリルアミドビーズの比は、０．１３：１（ｗ／ｗ）であった。比活性は、５．９μmol ニコチンアミド／（分×ｍｇ乾燥ポリアクリルアミドビーズ）であった。

例１２
ラムノースプロモータの転写調節下にアミダーゼをコードする遺伝子を有するプラスミドを含む大腸菌種菌株の培養
１２．１培養物前駆体の前駆物質（pre-preculture）の調製
トリプトン：１．６％（ｗ／ｗ）、酵母抽出物：１．０％（ｗ／ｗ）、ＮａＣｌ：０．５％（ｗ／ｗ）、アンピシリン：０．０１％（ｗ／ｗ）を含有する無菌培地（５ｍＬ、ｐＨ７．０）に、ラムノースプロモータの転写調節下にアミダーゼをコードする遺伝子を有するプラスミドを含む大腸菌種菌株の寒天プレート培養物を摂取した。培養物前駆体の前駆物質を３７℃において震盪器上で１２時間培養した。

１２．２培養物前駆体の調製
例１２．１に記載の無菌培地（１００ｍＬ）に、例１２．１に従い得られた大腸菌種菌株の培養物前駆体の前駆物質５ｍＬを接種した。培養物前駆体を震盪器上で３７℃において培養した。ＯＤ_６０００．２５において、Ｌ−ラムノース０．２％（ｗ／ｗ）を培養物に加えた。ＯＤ_６００５において、細胞を遠心分離により摘出し、バッファー（エチレンジアミンテトラ酢酸１．８０ｇ／Ｌ、二ナトリウム塩／酢酸ナトリウムバッファー２．６５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）で２回洗浄し、乾燥細胞濃度１５〜２０％（ｗ／ｗ）において同じバッファー中で再分散させた。該細胞懸濁液を−４０℃で貯蔵した。

例１３
アミダーゼアッセイ
アミダーゼを含有するエシェリキア属菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズ（０．４ｇ湿潤質量）を、３７℃において２−ヒドロキシ−２−メチル−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド（１．０ｇ）のホスフェートバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ８．０、０．９ｍＬ）攪拌溶液に加えた。０分、３０分後、および６０分後にサンプル（２００μｌ）を取った。形成されるアンモニアのモル量を測定した。形成されるアンモニアのモル量は、形成される２−ヒドロキシ−２−メチル−３，３，３−トリフルオロプロピオン酸のモル量に等しい。

例１４
ポリアクリルアミドビーズ中のラムノースプロモータの転写調節下にアミダーゼをコードする遺伝子を有するプラスミドを含む大腸菌種菌株の被包
被包は、例１２に従い得られた大腸菌種菌株の細胞懸濁液（１９％（ｗ／ｗ）、過硫酸アンモニウム（１．８６ｇ、８ｍｍｏｌ）の蒸留水（７．０ｇ）溶液およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（０．９２８ｇ、８ｍｍｏｌ）の蒸留水（５ｇ）溶液を使用し、重合を４００ｒｐｍ（ビスコ−ジェット（登録商標）スターラー）において行ったことを除き、例３に記載の被包と類似の態様で実施した。得られた大腸菌種菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズを分離し、例３に従い洗浄し、４℃においてホスフェートバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）中で貯蔵した。湿潤ビーズは、サイズ２００μｍ〜２０００μｍの不規則な球形をしており、破壊力は＞２００ｍＮであった。乾燥ポリアクリルアミドビーズ／湿潤ポリアクリルアミドビーズ比は０．２１：１（ｗ／ｗ）であった。比活性は、０．０２９μｍ２−ヒドロキシ−２−メチル−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド／（分×ｍｇ乾燥ポリアクリルアミドビーズ）であった。

例１５
２−ヒドロキシ−２−メチル−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミドから２−ヒドロキシ−２−メチル−３，３，３−トリフルオロプロピオン酸への転化、バッチ反応
例１４に従い得られたアミダーゼをコードする遺伝子を有するプラスミドを含有する大腸菌種菌株の細胞を含むポリアクリルアミドビーズ（０．４ｇ湿潤質量）を、２−ヒドロキシ−２−メチル−３，３，３−トリフルオロプロピオンアミド（１．０ｇ、６．３６６ｍｍｏｌ）のホスフェートバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ８．０、１０ｍＬ）溶液に３７℃において１時間加えた。２−ヒドロキシ−２−メチル−３，３，３−トリフルオロプロピオン酸（２％）が形成された。

例１６
ポリアクリルアミドビーズ中のラムノースプロモータの転写調節下にアミダーゼをコードする遺伝子を有するプラスミドを含有する大腸菌種菌株の被包
アクリルアミド（２１．１３ｇ、２９７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（１．８８ｇ、１２ｍｍｏｌ）および２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（０．７５ｇ、４．８ｍｍｏｌ）をホスフェートバッファー（１８．７５ｇ、５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中に溶解し、溶液のｐＨを７．０に調整した。過硫酸アンモニウム（０．９３ｇ、４ｍｍｏｌ）の蒸留水（２．５ｇ）溶液を、例１２に従い得られた大腸菌種菌株の細胞懸濁液（１９％（ｗ／ｗ）感想細胞、８２．５ｇ）中に加えた。Ｎ、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−エチレンジアミン（０．９２８ｇ、８ｍｍｏｌ）の蒸留水（５ｇ）を４５０ｒｐｍにおいて反応器（１Ｌ）中で鉱物油（ＩｓｏｐａｒＭ、３５０ｇ）中に分散させた。モノマー溶液、細胞懸濁液、および油相を別々に窒素に１５分間かけた。モノマー溶液（流速：２．５ｇ／分）および細胞懸濁液（流速：５ｇ／分）を別々にミキシングフラスコ２．５ｍＬにポンピングした。得られた混合物は直ちに攪拌油（４５０ｒｐｍ、ビスコ−ジェット（登録商標）スターラー）中に２０℃において滴下した。全部添加した後、反応混合物を２０℃において更に３．７５時間攪拌した。得られた大腸菌種菌株の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズを分離し、例３に従い洗浄し、４℃においてホスフェートバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）中で貯蔵した。膨潤ビーズは、サイズ１０００μｍ〜２０００μｍの不規則な球形をしており、破壊力は＞２００ｍＮであった。乾燥ポリアクリルアミドビーズ／湿潤ポリアクリルアミドビーズ比は、０．２５：１．００（ｗ／ｗ）であった。比活性は、０．０１６μmol ニコチンアミド／（分×ｍｇ乾燥ポリアクリルアミドビーズ）であった。

例１７
ニトリルヒドラターゼ含有ロドコッカス属の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズの、ニトリルからアミドへの転化のための生体触媒としての使用
例７に従い得られたロドコッカス属の被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズ（２５ｇ湿潤質量）を、ニトリルのホスフェートバッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ７、１００ｍＬ）攪拌溶液、またはホスフェートバッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ７、１００ｍＬ）およびメタノール攪拌混合物中に２５℃において徐々に加えた。５分後、１５分後、６０分後にサンプル（３ｍＬ）を取り、直ちにＨ_２ＳＯ_４（４８％（ｗ／ｗ）、０．０３ｍＬ）と混合した。反応混合物をＨＰＬＣ又はＧＣにより分析した。比活性を決定した。結果を表２に示す。

３−シアノピリジンのニコチンアミドへの連続反応時における反応混合物中のニコチンアミド濃度の時間依存性を示す図。３−シアノピリジンのニコチンアミドへの連続反応中における反応混合物中の３−シアノピリジン濃度の時間依存性を示す図。３−シアノピリジンのニコチンアミドへの連続反応中における３−シアノピリジンのニコチンアミドへの転化の時間依存性を示す図。

Claims

下記工程：
(i) アクリルモノマー混合物の水溶液を提供すること；
(ii) 過硫酸塩水溶液中の細胞懸濁液を提供すること；
(iii) 水非混和性液体中の、第三級アミン水溶液のエマルジョンを提供すること；
(iv) 工程(i)で提供される前記溶液と工程(ii)で提供される前記懸濁液を混合すること；
(v) 工程(iv)で得られる前記混合物を工程(iii)で提供される攪拌エマルジョンに加えること；
(vi) アクリルモノマー混合物を重合すると同時に細胞を被包し被包性細胞を含むポリアクリルアミドビーズを形成すること；
を含む被包性細胞含有ポリアクリルアミドビーズの製造方法であって、該ポリアクリルアミドビーズの破壊力が２００ｍＮ以上である製造方法。
ポリアクリルアミドビーズのサイズが０．０５〜３ｍｍである請求項１に記載の方法。
ポリアクリルアミドビーズのサイズが０．１〜１．５ｍｍであり、破壊力が３００ｍＮ以上である請求項２に記載の方法。
乾燥細胞／アクリルモノマー混合物比が０．００１：１〜１：１（ｗ／ｗ）である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
乾燥細胞／アクリルモノマー混合物比が０．２：１〜０．９：１（ｗ／ｗ）である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
細胞が細菌性細胞である請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
細胞がノカルジア状放線菌類属または腸内細菌科の細菌性細胞である請求項６に記載の方法。
第三級アミンがＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン又は３−（ジメチルアミノ）プロピオニトリルである請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
水非混和性液体が鉱物油である請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
界面活性剤が使用されていない請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
工程(vi)で形成されるポリアクリルアミドビーズが分離される請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。