CN108660131B - 固定化腈基水合酶和(s)-n-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法 - Google Patents

固定化腈基水合酶和(s)-n-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化腈基水合酶的制备方法及其催化制备(S)‑N‑乙基吡咯烷‑2‑甲酰胺的方法。首先采用碳纳米管经过羧基化、酰氯化后与多糖进行反应，制备多糖修饰的碳纳米管复合材料，再通过吸附作用固定化腈基水合酶，制备出高活力可回收利用的固定化腈基水合酶。本发明利用固定化腈基水合酶为催化剂，对底物2‑氰基‑N‑乙基吡咯烷进行酰胺化，获得高收率及高光学活性的产物(S)‑N‑乙基吡咯烷‑2‑甲酰胺。本发明工艺简洁，适用范围广泛，环境污染小，原子利用率高，是一条绿色化工艺。

Description

固定化腈基水合酶和(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备 方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及固定化腈基水合酶和(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法。
背景技术
舒必利(Sulpiride)是一种新型抗精神病药，1967年由法国Delagrange首先合成，与传统抗精神病药物不同，舒必利只选择性地阻断D2受体(多巴胺受体)。椎体系副反应轻微是其突出的优点，该药副作用小，治疗范围广，有“关系调节药物”、“情感赋活剂”和“抗孤独剂”等名称。左旋舒必利为舒必利的左旋体，与舒必利用途相同，但其剂量仅为一半或更少，毒副作用亦小。左旋舒必利可通过舒必利拆分获得，但因其收率低，分离纯化困难，目前工业上通常以(S)-N-乙基-2-氨甲基吡咯烷与2-甲氧基-5-氨磺酰苯甲酸甲酯为原料制备得到。此外，抗精神病新药舒托必利通常也使用(S)-N-乙基-2-氨甲基吡咯烷与2-甲氧基-5-乙磺酰基苯甲酸甲酯反应制备。
(S)-N-乙基-2-氨甲基吡咯烷作为左旋舒必利与舒托必利的关键中间体，可采用(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺为原料，在还原剂NaBH4或LiAlH4催化下，氢化还原得到，如Scheme 1(即方案1)所示。
Figure BDA0001644029440000011
根据文献报道，(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺一般采用L-脯氨酸为手性原料，先经过酰胺化，再进行N-乙基化(J.Med.Chem.,1990,33(9):2430-2437.)或者先经过N-乙基化，再经过酰胺化(化学试剂,2010,32(10):928-929.；化学与生物工程,2012,29(12):54-55.)合成，如Scheme 2(即方案2)所示。
Figure BDA0001644029440000021
传统的化学合成方法中，手性中心的引进的主要有三种方式：(1)以手性化合物为原料；(2)化学拆分法；(3)手性催化剂不对称合成；该三种方法均存在经济性差的缺点，手性原料和手性催化剂价格昂贵，化学拆分法原子利用率低。同时，化学合成或多或少运用到有毒有害物质，如氯化亚砜、吡啶等，路线长，综合收率低，三废量大。
发明内容
本发明的目的是提供一种固定化腈基水合酶的制备方法和固定化腈基水合酶催化制备(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的方法，该方法工艺简洁，适用范围广泛，环境污染小，原子利用率高。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种固定化腈基水合酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)多糖-碳纳米管复合材料的制备：
首先将碳纳米管与混酸超声处理0.5～2小时后，加热回流10～14小时反应，得到羧基化碳纳米管；再将羧基化碳纳米管分散于氯化亚砜中，在有机碱的催化下超声处理0.5～2小时后，加热回流20～28小时进行氯代反应，得到酰氯化碳纳米管；最后酰氯化碳纳米管与多糖在有机胺的存在下，于有机溶剂A中超声处理0.5～2小时后，再在80-100℃下进行酯化反应24-96小时，将多糖修饰于碳纳米管上，离心分离得到多糖-碳纳米管复合材料；
步骤(2)固定化腈基水合酶的制备：
采用多糖-碳纳米管复合材料与腈基水合酶在pH为6.0-7.0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中，10℃～35℃超声处理0.5～2小时后，再搅拌36～60小时进行固定化，制备固定化腈基水合酶。
步骤(1)中，所述的混酸为由体积比2～4：1(进一步优选3：1)的浓硫酸和浓硝酸组成，浓硫酸的质量百分数为93％～98.5％(进一步优选98％)，浓硝酸的质量百分数为63％～73％(进一步优选68％)，混酸体积用量以碳纳米管的质量计为1-3mL/g；
所述的有机碱为N,N-二取代的酰胺，优选为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、N,N-二乙基乙酰胺中的一种或两种以上(包括两种)，有机碱的质量用量为羧基化碳纳米管的质量的5％-10％g/g；
所述的氯化亚砜的质量用量为羧基化碳纳米管质量的5-10倍g/g；
所述的多糖为环糊精、壳聚糖、甲基纤维素、乙基纤维素、海藻酸或葡聚糖，多糖的质量用量为羧基化碳纳米管质量的3-8倍g/g；
所述的有机胺为三乙胺、二甲氨基吡啶、N,N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或者DBU(1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯)，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的2-4倍g/g；
所述的有机溶剂A为质子性溶剂，优选为N,N-二甲基甲酰胺、DMSO(二甲基亚砜)、2-甲基四氢呋喃、二恶烷中的一种或两种以上(包括两种)，其体积用量以羧基化碳纳米管质量计为30-35mL/g；
所述的离心分离的速率为7000r/min～9000r/min，进一步优选为8000r/min。
步骤(2)中，所述的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液的体积用量以多糖-碳纳米管复合材料质量计为20-25mL/g；所述的多糖-碳纳米管复合材料与腈基水合酶重量比为35-55：1。
本发明还将所述的固定化腈基水合酶应用于制备(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺中，即一种(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法，本发明所述的固定化腈基水合酶的应用中，具体包括：
(a)制备固定化腈基水合酶；
(b)以固定化腈基水合酶为催化剂，以2-氰基-N-乙基吡咯烷为底物，以pH为6.0-7.0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液为反应介质，加入有机溶剂B，在20-40℃下，搅拌反应12-24小时，反应完全后，得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺和(R)-N-乙基吡咯烷-2-羧酸混合液，将混合液分离纯化得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺。
步骤(b)中，本发明所述的固定化腈基水合酶的应用中，所述的固定化氰基水合酶的加入量为2-氰基-N-乙基吡咯烷质量的1％-10％g/g较佳，酶活19000-31000U/g；所述的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液体积用量以2-氰基-N-乙基吡咯烷质量计为100-150mL/g；所述的有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺、DMSO(二甲基亚砜)、乙醇或异丙醇，其体积用量是磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液体积用量的5％-10％mL/mL。
进一步，本发明所述的固定化腈基水合酶的应用中，所述混合液分离纯化包括：加入有机溶剂C进行萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺。
所述的混合液分离纯化中，所述的有机溶剂C为乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷或者二氯乙烷。
本发明所述的固定化腈基水合酶的方法，按照如下具体步骤进行：
步骤(1)多糖-碳纳米管复合材料的制备：将碳纳米管加入到混酸中，超声处理1小时后，再加热回流12小时反应，过滤，用蒸馏水洗涤至pH为7.0，50℃下减压真空干燥得羧基化碳纳米管；再将羧基化碳纳米管分散于氯化亚砜中，加入有机碱，超声处理1小时后，加热回流24小时进行氯代反应，减压蒸馏除去氯化亚砜，得到酰氯化碳纳米管；最后酰氯化碳纳米管溶于有机溶剂A中，多糖和有机胺，超声处理1小时，再在80-100℃下反应24-96小时，反应完全后冷却至室温，8000r/min下离心分离，固体产物用去离子水洗涤，80℃下减压真空干燥得多糖-碳纳米管复合材料。
步骤(2)固定化腈基水合酶的制备：将多糖-碳纳米管复合材料溶于pH为6.0-7.0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中，加入腈基水合酶，室温25℃下混合，超声1小时后，磁力搅拌48小时进行固定化腈基水合酶，充分固定完成后，8000r/min下离心分离，固体产物用去离子水洗涤，再离心，反复3次，得固定化腈基水合酶，冷藏备用。
酶活的定义：每分钟催化1μmol底物转化为产物所需要的酶量。
酶活的测定：在50mmol的底物2-氰基-N-乙基吡咯烷中，加入1L的pH为6.0-7.0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液和底物质量1％的固定化腈基水合酶，加入N,N-二甲基甲酰胺50mL，30℃下搅拌反应20min，加入等体积的乙酸乙酯进行萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，得原料和产物的混合物溶液。
用气相色谱对混合液进行检测，检测条件为：FID检测器；色谱柱：Agilent DB-1，0.25mm×30m，0.25μm；进样口温度：320℃；检测器温度：250℃；柱温：起始温度150℃(保留5min)，升温速率10℃/min，终温300℃(保留5min)；运行时间：25min，载气：氮气；面积归一法计算混合液中产物(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的含量。
酶活计算：
Figure BDA0001644029440000051
单位U/g；
其中，mp为生成产物(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的质量，g；Mp为产物(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺摩尔质量，142.2g/mol；t为反应时间，20min；me为固定化腈基水合酶的投入量，g；
本发明所述的腈基水合酶采用市售产品，如酶编号：EC 4.2.1.84；厂家：CreativeEnzymes；货号：NATE-1852；来源：大肠杆菌，可从官网https://www.creative-enzymes.com/订购，或者通过代理商购买。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明所述的固定化腈基水合酶采用多糖-碳纳米管复合材料为载体，载酶量高，易于制备；所述的固定化腈基水合酶在制备(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺中的应用中，酶活高，且可回收重复利用3-5次，所得产物ee值均在95％以上。
本发明所用的原料价格低廉、简单易得，产物制备工艺简单、生产成本低，采用生物酶技术环境污染小，是一条绿色化合成工艺。
附图说明
图1为实施例1制备的羧基化碳纳米管的SEM扫描图；
图2为实施例2制备的固定化腈基水合酶E1的SEM扫描图；
图3为实施例3制备的固定化腈基水合酶E2的SEM扫描图；
图4为实施例4制备的固定化腈基水合酶E3的SEM扫描图；
图5为实施例5制备的固定化腈基水合酶E4的SEM扫描图；
图6为实施例6制备的固定化腈基水合酶E5的SEM扫描图；
图7为实施例7制备的固定化腈基水合酶E6的SEM扫描图。
具体实施方式
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
腈基水合酶(酶编号：EC 4.2.1.84；厂家：Creative Enzymes；货号：NATE-1852；来源：大肠杆菌)。
实施例1
羧基化碳纳米管制备：
在干燥洁净的反应器中，加入30g碳纳米管(纯度95％，中国科学院成都有机化学有限公司)和60mL混酸(质量分数98％浓硫酸：质量分数68％浓硝酸体积比为3：1，其体积用量以碳纳米管的质量计为2mL/g)超声处理1小时后，再加热回流12小时反应，过滤，用蒸馏水洗涤至pH为7.0，50℃下减压真空干燥得羧基化碳纳米管。
实施例2
环糊精-碳纳米管-固定化腈基水合酶(简称E1)的制备：
(1)投料量：羧基化碳纳米管5g；N,N-二甲基甲酰胺为有机碱，投料量0.25g，其质量用量为羧基化碳纳米管的质量的5％g/g；氯化亚砜25g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的5倍g/g；环糊精(98％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，粘度200-400mPa.s)为多糖，投料量15g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的3倍g/g；三乙胺为有机胺，投料量10g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的2倍g/g；N,N-二甲基甲酰胺为有机溶剂A，投料量150mL，其体积用量以羧基化碳纳米管质量计为30mL/g；
在干燥洁净的反应器中，加入氯化亚砜、羧基化碳纳米管和N,N-二甲基甲酰胺，超声处理1小时后，加热回流24小时进行氯代反应，减压蒸馏除去氯化亚砜；再加入溶剂N,N-二甲基甲酰胺，环糊精和三乙胺，超声处理1小时，再在100℃下反应24小时，反应完全后冷却至室温25℃，8000r/min下离心分离，固体产物用去离子水洗涤，80℃下减压真空干燥得环糊精-碳纳米管复合材料。
(2)按照投料质量比多糖-碳纳米管复合材料：腈基水合酶为50：1投料，其中，多糖-碳纳米管复合材料为环糊精-碳纳米管复合材料，投料量15g；腈基水合酶0.30g；缓冲溶液300mL，体积用量以多糖-碳纳米管复合材料质量计为20mL/g。
在干燥洁净的反应器中，加入环糊精-碳纳米管复合材料、pH为6.0-7.0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液和腈基水合酶，室温25℃下混合，超声1小时后，磁力搅拌48小时进行固定化腈基水合酶，充分固定完成后，8000r/min下离心分离，固体产物用去离子水洗涤，再离心，反复3次，得环糊精-碳纳米管-固定化腈基水合酶(简称E1)，冷藏备用。
实施例3
壳聚糖-碳纳米管-固定化腈基水合酶(简称E2)的制备：
(1)投料量：羧基化碳纳米管5g；N,N-二甲基乙酰胺为有机碱，投料量0.5g，其质量用量为羧基化碳纳米管的质量的10％g/g；氯化亚砜40g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的8倍g/g；壳聚糖(粘度200-400mPa.s，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)为多糖，投料量25g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的5倍g/g；二甲氨基吡啶为有机胺，投料量15g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的3倍g/g；DMSO为有机溶剂A，投料量150mL，其体积用量以羧基化碳纳米管质量计为30mL/g；
反应温度为100℃，反应时间为48小时，其他操作同实施例2，得壳聚糖-碳纳米管复合材料。
(2)按照投料质量比多糖-碳纳米管复合材料：腈基水合酶为45：1投料，其中，多糖-碳纳米管复合材料为壳聚糖-碳纳米管复合材料，投料量15g；腈基水合酶0.33g；缓冲溶液300mL，体积用量以多糖-碳纳米管复合材料质量计为20mL/g。
其他操作同实施例2，得壳聚糖-碳纳米管-固定化腈基水合酶(简称E2)，冷藏备用。
实施例4
甲基纤维素-碳纳米管-固定化腈基水合酶(简称E3)的制备：
(1)投料量：羧基化碳纳米管5g；N,N-二乙基甲酰胺为有机碱，投料量0.3g，其质量用量为羧基化碳纳米管的质量的6％g/g；氯化亚砜50g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的10倍g/g；甲基纤维素(粘度400mPa.s，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)为多糖，投料量40g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的8倍g/g；N,N-二异丙基乙胺为有机胺，投料量20g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的4倍g/g；2-甲基四氢呋喃为有机溶剂A，投料量175mL，其体积用量以羧基化碳纳米管质量计为35mL/g；
反应温度为80℃，反应时间为96小时，其他操作同实施例2，得甲基纤维素-碳纳米管复合材料。
(2)按照投料质量比多糖-碳纳米管复合材料：腈基水合酶为35：1投料，其中，多糖-碳纳米管复合材料为甲基纤维素-碳纳米管复合材料，投料量15g；腈基水合酶0.43g；缓冲溶液375mL，体积用量以多糖-碳纳米管复合材料质量计为25mL/g。
其他操作同实施例2，得甲基纤维素-碳纳米管-固定化腈基水合酶(简称E3)，冷藏备用。
实施例5
乙基纤维素-碳纳米管-固定化腈基水合酶(简称E4)的制备：
(1)投料量：羧基化碳纳米管5g；N,N-二乙基乙酰胺为有机碱，投料量0.4g，其质量用量为羧基化碳纳米管的质量的8％g/g；氯化亚砜30g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的6倍g/g；乙基纤维素(CP，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)为多糖，投料量25g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的5倍g/g；N-甲基吗啉为有机胺，投料量20g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的4倍g/g；二恶烷为有机溶剂A，投料量175mL，其体积用量以羧基化碳纳米管质量计为35mL/g；
反应温度为100℃，反应时间为64小时，其他操作同实施例2，得乙基纤维素-碳纳米管复合材料。
(2)按照投料质量比多糖-碳纳米管复合材料：腈基水合酶为40：1投料，其中，多糖-碳纳米管复合材料为乙基纤维素-碳纳米管复合材料，投料量15g；腈基水合酶0.38g；缓冲溶液375mL，体积用量以多糖-碳纳米管复合材料质量计为25mL/g。
其他操作同实施例2，得乙基纤维素-碳纳米管-固定化腈基水合酶(简称E4)，冷藏备用。
实施例6
海藻酸-碳纳米管-固定化腈基水合酶(简称E5)的制备：
(1)投料量：羧基化碳纳米管5g；N,N-二甲基甲酰胺为有机碱，投料量0.3g，其质量用量为羧基化碳纳米管的质量的6％g/g；氯化亚砜40g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的8倍g/g；海藻酸(CP，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)为多糖，投料量25g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的5倍g/g；DBU(1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯)为有机胺，投料量10g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的2倍g/g；N,N-二甲基甲酰胺为有机溶剂A，投料量150mL，其体积用量以羧基化碳纳米管质量计为30mL/g；
反应温度为100℃，反应时间为24小时，其他操作同实施例2，得海藻酸-碳纳米管复合材料。
(2)按照投料质量比多糖-碳纳米管复合材料：腈基水合酶为55：1投料，其中，多糖-碳纳米管复合材料为海藻酸-碳纳米管复合材料，投料量15g；腈基水合酶0.27g；缓冲溶液300mL，体积用量以多糖-碳纳米管复合材料质量计为20mL/g。
其他操作同实施例2，得海藻酸-碳纳米管-固定化腈基水合酶，冷藏备用。
实施例7
葡聚糖-碳纳米管-固定化腈基水合酶(简称E6)的制备：
(1)投料量：羧基化碳纳米管5g；N,N-二甲基甲酰胺为有机碱，投料量0.4g，其质量用量为羧基化碳纳米管的质量的8％g/g；氯化亚砜50g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的10倍g/g；葡聚糖(分子量10000，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)为多糖，投料量25g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的5倍g/g；三乙胺为有机胺，投料量15g，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的3倍g/g；N,N-二甲基甲酰胺为有机溶剂A，投料量150mL，其体积用量以羧基化碳纳米管质量计为30mL/g；
反应温度为100℃，反应时间为24小时，其他操作同实施例2，得海藻酸-碳纳米管复合材料。
(2)按照投料质量比腈基水合酶：多糖-碳纳米管复合材料为42：1投料，其中，多糖-碳纳米管复合材料为葡聚糖-碳纳米管复合材料，投料量15g；腈基水合酶0.36g；缓冲溶液300mL，体积用量以多糖-碳纳米管复合材料质量计为20mL/g。
其他操作同实施例2，得葡聚糖-碳纳米管-固定化腈基水合酶，冷藏备用。
实施例8
固定化腈基水合酶的酶活检测：
酶活的定义：每分钟催化1μmol底物转化为产物所需要的酶量。
酶活的测定：在50mmol的底物2-氰基-N-乙基吡咯烷中，加入1L的pH为6.0-7.0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液和底物质量1％的固定化腈基水合酶，加入N,N-二甲基甲酰胺50mL，30℃下搅拌反应20min，加入等体积的乙酸乙酯进行萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，得原料和产物的混合物溶液。
用气相色谱对混合液进行检测，检测条件为：FID检测器；色谱柱：Agilent DB-1，0.25mm×30m，0.25μm；进样口温度：320℃；检测器温度：250℃；柱温：起始温度150℃(保留5min)，升温速率10℃/min，终温300℃(保留5min)；运行时间：25min，载气：氮气；面积归一法计算混合液中产物(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的含量。
酶活计算：
Figure BDA0001644029440000101
单位U/g；
其中，mp为生成产物(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的质量，g；Mp为产物(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺摩尔质量，142.2g/mol；t为反应时间，20min；me为固定化腈基水合酶的投入量，g；
实施例2～实施例7所制备的固定化腈基水合酶的酶活结果如表1所示。
表1
固定化腈基水合酶 E1 E2 E3 E4 E5 E6
酶活U/g 28000 25000 19000 22000 31000 23000
实施例9
(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备：
投料量：原料2-氰基-N-乙基吡咯烷6.2g，50mmol；固定化腈基水合酶为E5，投料量0.062g，加入量为2-氰基-N-乙基吡咯烷质量的1.0％g/g；缓冲溶液600mL，其体积用量以2-氰基-N-乙基吡咯烷质量计为100mL/g；有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺，投料量30mL，其体积用量是缓冲溶液体积用量的5％mL/mL；有机溶剂C为乙酸乙酯；
在干燥洁净的反应器中，加入2-氰基-N-乙基吡咯烷、固定化腈基水合酶E5、pH为6.0-7.0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液和有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺，在30℃下，搅拌反应24小时，反应完全后，得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺和(R)-N-乙基吡咯烷-2-羧酸混合液，加入等体积的有机溶剂乙酸乙酯进行萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺2.9g，收率81.6％，ee值99.0％。
实施例10
投料量：原料2-氰基-N-乙基吡咯烷6.2g，50mmol；固定化腈基水合酶为E3，投料量0.62g，加入量为2-氰基-N-乙基吡咯烷质量的10.0％g/g；缓冲溶液800mL，其体积用量以2-氰基-N-乙基吡咯烷质量计为130mL/g；有机溶剂B为DMSO，投料量80mL，其体积用量是缓冲溶液体积用量的10％mL/mL；有机溶剂C为乙酸丁酯；
反应温度20℃，反应时间12小时，其他操作同实施例9，得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺3.2g，收率90.0％，ee值99.3％。
实施例11
投料量：原料2-氰基-N-乙基吡咯烷6.2g，50mmol；固定化腈基水合酶为E1，投料量0.31g，加入量为2-氰基-N-乙基吡咯烷质量的5.0％g/g；缓冲溶液1000mL，其体积用量以2-氰基-N-乙基吡咯烷质量计为150mL/g；有机溶剂B为乙醇，投料量80mL，其体积用量是缓冲溶液体积用量的8％mL/mL；有机溶剂C为二氯甲烷；
反应温度40℃，反应时间20小时，其他操作同实施例9，得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺3.5g，收率98.5％，ee值99.1％。
实施例12
投料量：原料2-氰基-N-乙基吡咯烷6.2g，50mmol；固定化腈基水合酶为E2，投料量0.31g，加入量为2-氰基-N-乙基吡咯烷质量的5.0％g/g；缓冲溶液750mL，其体积用量以2-氰基-N-乙基吡咯烷质量计为120mL/g；有机溶剂B为异丙醇，投料量45mL，其体积用量是缓冲溶液体积用量的6％mL/mL；有机溶剂C为二氯乙烷；
反应温度30℃，反应时间16小时，其他操作同实施例9，得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺3.1g，收率87.2％，ee值99.2％。

Claims (10)

1.一种固定化腈基水合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)多糖-碳纳米管复合材料的制备：
首先将碳纳米管与混酸超声处理0.5～2小时后，加热回流10～14小时反应，得到羧基化碳纳米管；再将羧基化碳纳米管分散于氯化亚砜中，在有机碱的催化下超声处理0.5～2小时后，加热回流20～28小时进行氯代反应，得到酰氯化碳纳米管；最后酰氯化碳纳米管与多糖在有机胺的存在下，于有机溶剂A中超声处理0.5～2小时后，再在80-100℃下进行酯化反应24-96小时，将多糖修饰于碳纳米管上，离心分离得到多糖-碳纳米管复合材料；
步骤(2)固定化腈基水合酶的制备：
采用多糖-碳纳米管复合材料与腈基水合酶在pH为6.0-7.0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中，10℃～35℃超声处理0.5～2小时后，再搅拌36～60小时进行固定化，制备固定化腈基水合酶。
2.根据权利要求1所述的固定化腈基水合酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的混酸为由体积比2～4：1的浓硫酸和浓硝酸组成，浓硫酸的质量百分数为93％～98.5％，浓硝酸的质量百分数为63％～73％，混酸体积用量以碳纳米管的质量计为1-3mL/g。
3.根据权利要求1所述的固定化腈基水合酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的有机碱为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、N,N-二乙基乙酰胺中的一种或两种以上，有机碱的质量用量为羧基化碳纳米管的质量的5％-10％g/g；
所述的氯化亚砜的质量用量为羧基化碳纳米管质量的5-10倍g/g。
4.根据权利要求1所述的固定化腈基水合酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的多糖为环糊精、壳聚糖、甲基纤维素、乙基纤维素、海藻酸或葡聚糖，多糖的质量用量为羧基化碳纳米管质量的3-8倍g/g；
所述的有机胺为三乙胺、二甲氨基吡啶、N,N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或者DBU，其质量用量为羧基化碳纳米管质量的2-4倍g/g。
5.根据权利要求1所述的固定化腈基水合酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的有机溶剂A为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、2-甲基四氢呋喃、二恶烷中的一种或两种以上，其体积用量以羧基化碳纳米管质量计为30-35mL/g；
所述的离心分离的速率为7000r/min～9000r/min。
6.根据权利要求1所述的固定化腈基水合酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液的体积用量以多糖-碳纳米管复合材料质量计为20-25mL/g；
所述的多糖-碳纳米管复合材料与腈基水合酶重量比为35-55：1。
7.一种(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法，包括以下步骤：
(a)采用权利要求1～6任一项所述的制备方法制备的固定化腈基水合酶；
(b)以固定化腈基水合酶为催化剂，以2-氰基-N-乙基吡咯烷为底物，以pH为6.0-7.0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液为反应介质，加入有机溶剂B，在20-40℃下，搅拌反应12-24小时，反应完全后，得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺和(R)-N-乙基吡咯烷-2-羧酸混合液，将混合液分离纯化得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺。
8.根据权利要求7所述的(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述的固定化氰基水合酶的加入量为2-氰基-N-乙基吡咯烷质量的1％-10％g/g，所述的固定化氰基水合酶的酶活19000-31000U/g；
所述的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液体积用量以2-氰基-N-乙基吡咯烷质量计为100-150mL/g；
所述的有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醇或异丙醇，其体积用量是磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液体积用量的5％-10％mL/mL。
9.根据权利要求7所述的(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述的混合液分离纯化包括：加入有机溶剂C进行萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺。
10.根据权利要求9所述的(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂C为乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷或者二氯乙烷。
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