EA015321B1 - Способ получения полиакриламидных гранул, полиакриламидные гранулы и их применение - Google Patents

Способ получения полиакриламидных гранул, полиакриламидные гранулы и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA015321B1
EA015321B1 EA200600704A EA200600704A EA015321B1 EA 015321 B1 EA015321 B1 EA 015321B1 EA 200600704 A EA200600704 A EA 200600704A EA 200600704 A EA200600704 A EA 200600704A EA 015321 B1 EA015321 B1 EA 015321B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
polyacrylamide granules
polyacrylamide
mixture
granules
Prior art date
Application number
EA200600704A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600704A1 (ru
Inventor
Иоганнес Бартек
Карен Робинс
Яна Зигова
Original Assignee
Лонца Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Лонца Аг filed Critical Лонца Аг
Publication of EA200600704A1 publication Critical patent/EA200600704A1/ru
Publication of EA015321B1 publication Critical patent/EA015321B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/098—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer formed in the presence of the enzymes or microbial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Abstract

Полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки, получают способом, включающим следующие стадии: (1) получение водного раствора смеси акриловых мономеров, (2) получение суспензии клеток в водном растворе персульфата, (3) получение эмульсии водного раствора третичного амина в несмешивающейся с водой жидкости, которая необязательно содержит поверхностно-активное вещество (ПАВ), (4) смешивание раствора, полученного на стадии (1), и суспензии, полученной на стадии (2), (5) добавление смеси, полученной на стадии (4), в перемешиваемую эмульсию, полученную на стадии (3), и (6) полимеризация смеси акриловых мономеров и одновременное инкапсулирование клеток с образованием полиакриламидных гранул, содержащих инкапсулированные клетки.

Description

Настоящее изобретение относится к полиакриламидным гранулам, содержащим инкапсулированные клетки, к способу их получения и применения в качестве биокатализатора.
Полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки, можно использовать в качестве биокатализатора для различных биопревращений в зависимости от ферментов, содержащихся в клетках. Например, полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные бактериальные клетки штамма КЬобососсик, включающие нитрилгидратазу, можно использовать для превращения нитрилов в амиды.
В статье Νίΐδδοη и др. (ВюсЫт. Вюрйук. Лс1а. 268, 253-256 (1972)) описаны полиакриламидные гранулы, содержащие ферменты. Раствор персульфата аммония (0,25 г, 1,1 ммоль) в буферном растворе триэтаноламин-НС1 (0,05 М, рН 7,0, 0,5 мл) и Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилэтилендиамин (0,5 мл, 0,385 мг, 3,3 ммоль) добавляли в раствор (60 мл) трипсина (60 мг), акриламида (8,55 г, 120 ммоль) и Ν,Ν'-метилен-бис-акриламида (0,45 г, 2,9 ммоль) в буферном растворе триэтаноламин-НС1 (0,05 М, рН 7,0). Раствор выливали в перемешиваемую смесь органических растворителей (толуол/хлороформ, 290:110, 400 мл), содержащую сесквиолеат сорбита (1 мл). Полимеризацию проводили при 4°С в течение 30 мин. В статье Νίΐδδοη и др. (ВюсЫт. Вюрйук. Ас1а, 268, 253-256 (1972)) не описано инкапсулирование клеток в полиакриламидные гранулы.
В патенте МокЬасй и др. (ϋδ 4647536 А) описан способ получения различных полимерных гранул, содержащих инкапсулированные клетки, причем в качестве водно-нерастворимой фазы использовали животные масла, растительные масла, трибутилфосфат, силиконовое масло, парафиновое масло или дибутиловый эфир фталевой кислоты. Полиакриламидные гранулы, содержащие дрожжевые клетки или ферменты, получали при растворении акриламида (17,6 г, 248 ммоль) и Ν,Ν'-метилен-бис-акриламида (1,2 г, 8 ммоль) в трис-буферном растворе (100 мл, 0,05 М, рН 7), затем перемешивали полученный раствор (8 мл) в смеси с дрожжевыми клетками или ферментами (например, перокисдазой, 10 мг/мл, 2 мл) и персульфатом аммония (0,4 г/мл, 20 мкл, 8 мг, 0,03 ммоль) и диспергировали смесь в соевом масле (40 мл). Затем добавляли Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилэтилендиамин (100 мкл, 77,0 мг, 0,66 ммоль) и получали гранулы пригодного размера.
Объектом настоящего изобретения является получение полиакриламидных гранул, содержащих клетки, и способ их получения.
Указанная цель достигается при получении полиакриламидных гранул по п.12 с использованием способа по п.1.
Способ по настоящему изобретению для получения полиакриламидных гранул, содержащих инкапсулированные клетки, включает следующие стадии:
(1) получение водного раствора смеси акриловых мономеров, (2) получение суспензии клеток в водном растворе персульфата, (3) получение эмульсии водного раствора третичного амина в несмешивающейся с водой жидкости, которая необязательно содержит поверхностно-активное вещество (ПАВ), (4) смешивание раствора, полученного на стадии (1), и суспензии, полученной на стадии (2), (5) добавление смеси, полученной на стадии (4), в перемешиваемую эмульсию, полученную на стадии (3), и (6) полимеризация смеси акриловых мономеров и одновременное инкапсулирование клеток с образованием полиакриламидных гранул, содержащих инкапсулированные клетки.
Преимущество способа по настоящему изобретению заключается в том, что перед добавлением акриловых мономеров, клеток и персульфата в несмешивающуюся с водой жидкость уже добавлен третичный амин.
Полиакриламидные гранулы, полученные способом по настоящему изобретению, имеют сферическую или практически сферическую форму.
Размер полиакриламидных гранул составляет от 0,01 до 5 мм, а механическая прочность по крайней мере 10 мН. Размер полиакриламидных гранул предпочтительно составляет от 0,05 до 3 мм, а механическая прочность по крайней мере 200 мН, более предпочтительно размер составляет от 0,1 до 1.5 мм, а механическая прочность по крайней мере 300 мН.
Механическую прочность измеряют, оказывая давление на гранулу, расположенную между пластинами, до разрыва гранулы.
В качестве клеток можно использовать бактериальные клетки, грибковые клетки, дрожжевые клетки, растительные клетки или клетки млекопитающих. Клетками предпочтительно являются бактериальные клетки, более предпочтительно бактериальные клетки актиномицетов группы нокардиоформа или бактерии семейства ЕЫегоЬаЫепасеае. Еще более предпочтительными клетками являются бактерии рода КЬобососсик или ЕксйепсЫа и наиболее предпочтительными клетками являются бактерии рода КЬобососсик.
Примеры бактерий включают грамположительные бактерии, такие как род ВасШик, Асе1оЬас1егшт, Асбпотусек, АбЫоЬас1ег, СогупеЬас1егшт, Согбопа, №сагб1а, КЬобососсик или Атусо1а1орк1к, и грамотрицательные бактерии рода Асе1оЬас1ег, АдгоЬас1егшт, А1са11депек, Сотатопак, 61исопоЬас1ег, Ркеиботопак, КЫ/оЫит, СйгоЬас1ег, Еп1егоЬас1ег, ЕксйепсЫа или К1еЬк1е11а.
- 1 015321
Примеры бактерий группы актиномицетов группы нокардиоформа включают Согбопа. Иосагб1а. Вйобососсик и Лтуео1аЮр515. Примеры бактерий семейства Еп1сгоЬас1спассас включают бактерии рода СйгоЬас1сг. Еп1сгоЬас1сг. ЕхсЕспсЫа и К1сЬз1с11а.
Клетки культивируют известными методами.
Бактериальные клетки могут содержать ген. кодирующий исследуемый фермент в хромосоме. или их можно встраивать в плазмиду. содержащую ген. кодирующий исследуемый фермент.
Если бактериальные клетки содержат ген. кодирующий исследуемый фермент в хромосоме. и этот фермент является катаболическим ферментом. то бактериальные клетки культивируют в присутствии пригодного индуктора фермента. Например. клетки штамма рода Вйобососсик культивируют в присутствии индуктора нитрилгидратазы. который индуцирует экспрессию нитрилгидратазы. Примеры пригодных индукторов нитрилгидратазы штамма рода Вйобососсик включат метакриламид. кротонамид и пропионамид.
Если бактериальные клетки трансформированы плазмидой. содержащей ген. кодирующий исследуемый фермент. и этот ген регулируется индуцибельным промотером. то транскрипцию гена. кодирующего исследуемый фермент. можно индуцировать в определенный момент времени в процессе культивирования. Примеры индуцибельных промотеров включают 1гр. 1ас. 1ас. чувствительные к арабинозе и рамнозе промотеры. Индукция зависит от используемого промотера. Например. чувствительный к рамнозе промотер индуцируют при добавлении Ь-рамнозы.
После культивирования клетки. содержащие исследуемый фермент. можно отделить от ферментационной среды. Предпочтительно клетки хранят в соответствующем буферном растворе при температуре ниже 5°С.
Смесь акриловых мономеров содержит по крайней мере один монофункциональный и по крайней мере один бифункциональный акриловый мономер.
Монофункциональным акриловым мономером является мономер формулы к’
О где В1 означает Н или метил.
В2 выбирают из группы. включающей ΝΗ2. ΝΗΒ3. Ν(Β3)2. ИН-(СН2)п-Ы(Вз)2 и О-(СН2)п-Ы(В3)2.
В1 в каждом случае означает С1-С4алкил. а п равно целому числу от 1 до 4.
Примеры монофункциональных акриловых мономеров включают акриламид (В1 означает Н. В2 означает ΝΗ2). метакриламид (В1 означает метил. В2 означает ΝΗ2). Ν-алкилакриламиды (В1 означает Н. В2 означает НИВ3. В3 означает С1-С4-алкил). такой как Ν-этилакриламид (В3 означает этил). Ν-изопропилакриламид (В3 означает изопропил) или Ν-трет-бутилакриламид (В3 означает трет-бутил). Ν-алкилметакриламиды (В1 означает метил. В2 означает NΗΒ3. В3 означает С1-С4-алкил). такие как Ν-этилметакриламид (В3 означает этил) или Ν-изопропилметакриламид (В3 означает изопропил). Ν.Ν-диалкилакриламиды (В1 означает Н. В2 означает МВ3)2. В3 означает С1-С4-алкил). такие как Ν.Ν-диметилакриламид (В3 означает метил) и Ν.Ν-диэтилакриламид (В3 означает этил). И-[(диалкиламино)алкил]акриламиды (В1 означает Н. В2 означает ΝΗ^ΟΗ^-ΝΗ^3)^ В3 означает С1-С4-алкил). такие как N-[3-(диметиламино)пропил]акриламид (п равно 3. В3 означает метил) или И-[3-(диэтиламино)пропил] акриламид (п равно 3. В3 означает этил). N-[(диалкиламино)алкил]метакриламиды (В1 означает метил. В2 означает ΝΗ^Η^-ΝΗ^Ε. В3 означает С1-С4алкил). такие как И-[3-(диметиламино)пропил] метакриламид (В3 означает метил) или И-[3-(диэтиламино)пропил]метакриламид (В3 означает этил). (диалкиламино)алкилакрилаты (В1 означает Н. В2 означает Ο^Η^-ΝΗ^Ν В3 означает С1-С4-алкил). такие как 2-(диметиламино)этилакрилат (п равно 2. В3 означает метил). 2-(диметиламино)пропилакрилат (п равно 3. В3 означает метил) или 2-(диэтиламино)этилакрилаты (п равно 2. В3 означает этил) и (диалкиламино)алкилметакрилаты (В1 означает метил. В2 означает Ο-(СΗ2)η-NΗ(Β3)2. В3 означает С1-С4алкил). такие как 2-(диметиламино)этилметакрилат (п равно 2. В3 означает метил).
Ν-Алкилакриламиды. Ν-алкилметакриламиды. Ν.Ν-диалкилакриламиды. Ν.Ν-диалкилметакриламиды. М-[(диалкиламино)алкил]акриламиды. М-[(диалкиламино)алкил]метакриламиды. (диалкиламино)аклилакрилаты и (диалкиламино)алкилакрилаты можно получить известными методами. например при взаимодействии акрилоилхлорида. метилакрилата. метакрилоилхлорида или метилметакрилата с соответствующим алкиламином. диалкиламином или (диалкиламино)алкиламином или (диалкиламино)спиртом.
- 2 015321
Бифункциональными акриловыми мономерами являются мономеры формулы
-Х- означает -(СН2)П- или -(СН-ОН)П-;
η равно целому числу от 1 до 4.
Примеры бифункциональных акриловых мономеров включают Ν,Ν'-метилен-бис-акриламид (В1 означает Н, -Х- означает -(СН2)П-, η равно 1), Ν,Ν'-метилен-бис-метакриламид (В1 означает метил, -Х- означает (СН2)П, η равно 1), Ν,Ν'-этилен-бис-акриламид (В1 означает Н, -Х- означает -(СН2)П-, η равно 2), Ν,Ν'этилен-бис-метакриламид (В1 означает метил, -Х- означает -(СН2)п-, η равно 2), Ν,Ν'-пропиленбисакриламид (В1 означает Н, -Х- означает -(СН2)п-, η равно 3) и ^№-(1,2-дигидроксиэтилен)-бисакриламид (В1 означает Н, -Х- означает -(СН-ОН)п-, η равно 2).
Бифункциональные акриловые мономеры можно получить известными методами, например бифункциональные акриловые мономеры, в которых -Х-означает -(СН2)п-, получают при взаимодействии акрилоилхлорида, метилакрилата, метакрилоилхлорида или метилметакрилата с соответствующим диамином.
Предпочтительный бифункциональный акриловый мономер выбирают из группы, включающей Ν,Ν'-метилен-бис-акриламид, Ν,Ν'-метилен-бис-метакриламид и ^№-(1,2-дигидроксиэтилен)-бисакриламид, а монофункциональный мономер выбирают из группы, включающей акриламид, метакриламид, Ν,Ν-диалкилакриламиды, №[(диалкиламино)алкил]метакриламиды, (диалкиламино)алкилакрилаты и (диалкиламино)алкилметакрилаты.
Более предпочтительно в качестве бифункционального мономера используют Ν,Ν'-метиленбисакриламид, а монофункциональный мономер выбирают из группы, включающей акриламид, Ν,Ν-диметилакриламид, №[3-(диметиламино)пропил]метакриламид и 2-(диметиламино)этилметакрилат.
Персульфатом является любой водорастворимый персульфат. Примеры водорастворимых персульфатов включают персульфат аммония и персульфаты щелочных металлов. Примеры щелочных металлов включают литий, натрий и калий. Предпочтительно используют персульфат аммония или персульфат калия, более предпочтительно персульфат аммония.
Третичным амином является любой водорастворимый третичный амин. Предпочтительным третичным амином является Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилэтилендиамин или 3-(диметиламино)пропионитрил, более предпочтительно Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилэтилендиамин.
Несмешивающейся с водой жидкостью является любой несмешивающийся с водой материал, который является жидкостью при температуре полимеризации. Примеры несмешивающихся с водой жидкостей включают минеральные масла, растительные масла и синтетические масла. Примеры минеральных масел включают толуол, ксилол, деароматизированные смеси углеводородов, такие как продукт Εχχκοί Ό100, и изопарафиновые смеси, такие как продукт Норат М. Примеры растительных масел включают подсолнечное масло, оливковое масло, арахисовое масло, миндальное масло, сафлоровое масло, соевое масло и кукурузное масло. Пример синтетического масла включает силиконовое масло.
Предпочтительной несмешивающейся с водой жидкостью является минеральное масло, более предпочтительно насыщенный углеводород или их смесь, наиболее предпочтительно смесь деароматизированных углеводородов или изопарафиновая смесь.
Несмешивающаяся с водой жидкость необязательно содержит ПАВ, которым является любое пригодное ПАВ. Примеры пригодных ПАВ включают неионные ПАВ, такие как сложные эфиры жирных кислот и сорбита, эфиры жирных кислот и полиэтиленгликоля, эфиры жирных кислот и этиленгликоля или эфиры жирных кислот и глицерина, а также катионные ПАВ, такие как соли тетраалкиламмония, в которых по крайней мере одна алкильная группа содержит по крайней мере 8 атомов углерода. Примеры жирных кислот включают олеиновую кислоту и стеариновую кислоту. Примеры алкильных групп включают этил, пропил и бутил. Примеры алкильных групп, содержащих по крайней мере 8 атомов углерода, включают октил, нонил и децил.
Соотношение ПАВ/масло составляет вплоть до 0,10:1 (мас./мас.). В предпочтительных вариантах ПАВ не используется.
Водный раствор смеси акриловых мономеров можно получить при растворении акриловых мономеров в воде или буферном растворе. Суспензию клеток в водном растворе персульфата получают при смешивании раствора персульфата в воде или буферном растворе с суспензией клеток в воде или буферном растворе. Предпочтительно сначала растворяют акриловые мономеры в буферном растворе и клетки суспендируют, затем рН суспензии доводят до величины в диапазоне от 5 до 10, то есть до рН, оптимального для исследуемого фермента. Например, оптимальная величина рН для нитрилгидратазы из штамма Вйобососсик составляет диапазон от 6 до 8.
Эмульсию водного раствора третичного амина в несмешивающейся в воде жидкости получают при
- 3 015321 эмульгировании раствора третичного амина в воде или буферном растворе в несмешивающейся с водой жидкости.
В предпочтительном варианте водный раствор акриловых мономеров, суспензию клеток в водном растворе персульфата и эмульсию водного раствора третичного амина в несмешивающейся с водой жидкости, которая необязательно содержит ПАВ, дегазируют (удаляют кислород), например продувают азотом.
Водный раствор смеси акриловых мономеров смешивают с суспензией клеток в водном растворе персульфата, затем немедленно добавляют по каплям в перемешиваемую эмульсию водного раствора третичного амина в несмешивающейся с водой жидкости. Примеры пригодных смесителей включают трех- или четырехшаговые лопастные турбинные мешалки, пропеллерные мешалки или струйные смесители У15со-)с1. причем предпочтительным является смеситель У15со-)с1. Полимеризацию предпочтительно проводят при температуре от 5 до 35°, более предпочтительно от 15 до 25° и наиболее предпочтительно от 18 до 22°С.
При полимеризации используют следующие предпочтительные соотношения.
Предпочтительное соотношение смеси акриловые мономеры/вода составляет от 0,05:1 до 0,5:1 (мас./мас.), более предпочтительно от 0,1:1 до 0,3:1 (мас./мас.), наиболее предпочтительно от 0,2:1 до 0,28:1 (мас./мас.).
Предпочтительное соотношение смеси бифункциональные акриловые мономеры/монофункциональные акриловые мономеры составляет от 0,001:1 до 0,8:1 (мол./мол.), более предпочтительно от 0,01:1 до 0,08:1 (мол./мол.), наиболее предпочтительно от 0,03:1 до 0,06:1 (мол./мол.).
Предпочтительное соотношение сухие клетки/смесь акриловых мономеров составляет от 0,001:1 до 1:1 (мас./мас.), более предпочтительно от 0,2:1 до 0,9:1 (мас./мас.), еще более предпочтительно от 0,4 до 0,8:1 (мас./мас.), наиболее предпочтительно от 0,5:1 до 0,7:1 (мас./мас.).
Предпочтительное соотношение персульфат/смесь акриловых мономеров составляет от 0,0001:1 до 0,1:1 (мол./мол.), более предпочтительно от 0,001:1 до 0,05:1 (мол./мол.), наиболее предпочтительно от 0,002:1 до 0,03:1 (мол./мол.).
Предпочтительное соотношение третичный амин/персульфат составляет от 0,2:1 до 50:1 (мол./мол.), более предпочтительно от 0,8:1 до 10:1 (мол./мол.), наиболее предпочтительно от 1:1 до 5:1 (мол./мол.).
Предпочтительное соотношение масло/вода составляет от 1,2:1 до 10:1 (мас./мас.), более предпочтительно от 1,3:1 до 7:1 (мас./мас.), еще более предпочтительно от 1,4:1 до 5:1 (мас./мас.), наиболее предпочтительно от 1,5:1 до 4:1 (мас./мас.).
Полиакриламидные гранулы, полученные после полимеризации, предпочтительно отделяют, например, декантацией или фильтрованием. Отделенные гранулы можно промыть водой или водным раствором для удаления следов несмешивающейся с водой жидкости, и их можно хранить в соответствующем буферном растворе.
Другим объектом осуществления настоящего изобретения являются полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки, полученные способом по настоящему изобретению. Инкапсулированными клетками предпочтительно являются клетки штамма Яйобососсик, содержащие нитрилгидратазу.
Еще одним объектом настоящего изобретения является применение описанных выше полиакриламидных гранул, содержащих инкапсулированные клетки, в качестве биокатализатора для превращения субстрата в продукт. Предпочтительным субстратом является нитрил, а продуктом - соответствующий амид. Более предпочтительным субстратом является 3-цианопиридин, а продуктом никотинамид.
Примеры нитрилов включают цианамид, цианоуксусную кислоту, малонодинитрил, метиловый эфир цианоуксусной кислоты, акрилонитрил, бутиронитрил, валеронитрил, кротононитрил, метакрилонитрил, 2-цианопиридин, 3-цианопиридин, 4-цианопиридин, бензонитрил, 2-хлорбензонитрил, 4хлорбензонитрил, пиразинкарбонитрил, пиразин-2,3-дикарбонитрил, 2-фуронитрил, тиофен-2карбонитрил, пивалонитрил и циклопропанкарбонитрил.
Превращение проводят в статистическом режиме или в непрерывном режиме. Реакцию предпочтительно проводят в пригодном буферном растворе при температуре от 10 до 35°С.
На фиг. 1 показана зависимость концентрации никотинамида в реакционной смеси от времени в процессе превращения 3-цианопиридина в никотинамид в непрерывном режиме;
на фиг. 2 показана зависимость концентрации 3-цианопиридина в реакционной смеси от времени в процессе превращения 3-цианопиридина в никотинамид в непрерывном режиме;
на фиг. 3 показана зависимость конверсии 3-цианопиридина в никотинамид от времени в процессе превращения 3-цианопиридина в никотинамид в непрерывном режиме.
Пример 1. Культивирование штамма ККобососсик.
1.1. Получение прекультуры.
В стерильную среду (200 мл, рН 7,0), содержащую 1,25 мас.% дрожжевого экстракта, 0,05 мас.% Мд§О4 -7 Н2О, 0,003 мас.% СоС12-6Н2О, 0,5 мас.% цитрата натрия, 0,75 мас.% метакриламида и 0,2 мас.% КН2РО4, высеивали культуру штамма И1юбососси5 из слоя агара с культурой. Прекультуру культивиро
- 4 015321 вали в колбе Эрленмейера (500 мл) при 28°С и 120 об/мин в течение 48 ч.
1.2. Получение культуры.
В стерильную среду (12 л, рН 7,0), содержащую 1,25 мас.% дрожжевого экстракта, 0,05 мас.% Мд§04-7 Н2О, 0,003 мас.% СоС12-6Н2О, 0,5 мас.% цитрата натрия, 0,75 мас.% метакриламида и 0,2 мас.% КН2РО4, высеивали прекультуру (200 мл) штамма Кйобососсик, полученную, как описано в примере 1.1. Клетки культивировали в ферментере (12 л) при 28°С, рН 7,0, при концентрации растворенного кислорода >40% (в расчете на концентрацию растворенного кислорода в 1 об. воздуха/(объем ферментационной среды х мин), 28°С) и при 300-400 об/мин в течение 48 ч. Клетки собирали центрифугированием, промывали фосфатным буферным раствором (50 мМ, рН 7,0), концентрировали до 15-20 мас.% сухих клеток и хранили при -40°С.
Пример 2. Определение активности нитрилгидратазы в культуре штамма Кйобососсик.
Полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма Кйобососсик (0,2 г влажного материала), добавляли в раствор 3-цианопиридина (1,59 г) в фосфатном буферном растворе (0,05 М, рН 7,0, 30 мл) при 25°С. Образцы на анализ (1000 мкл) отбирали через 5 и 15 мин. Указанные образцы немедленно смешивали с 20 мкл Н2§04 (48 мас.%), разбавляли в 100 раз по объему смесью метанол/вода, 40:60 (об./об.), фильтровали (диаметр пор 0,2 мкм) и анализировали методом ЖХВР (колонка С8 для обращенно-фазовой хроматографии, скорость потока 1 мл/мин, элюент: метанол/вода, 40:60 (об./об.), детектирование при 210 нм, 25°С). После высушивания влажного биокатализатора при 55°С и 20 мбар в течение 4 ч получали сухие полиакриламидные гранулы.
Пример 3. Инкапсулирование клеток штамма КЕобососсик в полиакриламидные гранулы.
Акриламид (42,25 г, 594 ммоль), Ν,Ν'-метилен-бис-акриламид (3,75 г, 24 ммоль) и 2-(диметиламино)этилметакрилат (1,5 г, 9 ммоль) растворяли в фосфатном буферном растворе (37,5 г, 50 мМ, рН 7,0) и рН раствора доводили до 7,0. Раствор персульфата аммония (0,465 г, 2 ммоль) в дистиллированной воде (5 г) добавляли в суспензию клеток штамма КЕобососсик (20 мас.% сухих клеток, 165 г), полученную, как описано в примере 1. Раствор Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилэтилендиамина (0,232 г, 2 ммоль) в дистиллированной воде (5 г) диспергировали в минеральном масле (Еххко1 Ό100, 350 г) в реакторе объемом 1 л при 350 об/мин. Раствор мономеров, суспензию клеток и масло (каждый компонент в отдельности) продували азотом в течение 15 мин. Раствор мономеров (скорость потока 2,5 г/мин) и суспензию клеток (скорость потока 5 г/мин), каждый в отдельности, загружали с помощью насоса в колбу для смешивания объемом 2,5 л. Полученную смесь немедленно по каплям при 20°С добавляли в перемешиваемое масло (350 об/мин, струйный смеситель У15со-)с1). После завершения добавления реагентов реакционную смесь перемешивали в течение еще 3,5 ч при 20°С. Полученные полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма Кйобососсик, отделяли фильтрованием, промывали дистиллированной водой и оставляли набухать в воде. Полиакриламидные гранулы хранили в двух объемах буферного раствора для хранения (3,55 г/л сульфата натрия, 0,25 мас.% натриевой соли дегидрацетовой кислоты, 0,05 мас.% никотинамида, рН 7,0) при 4°С. Набухшие гранулы характеризуются правильной сферической формой размером от 200 до 1200 мкм и механической прочностью >300 мН. Соотношение сухие полиакриламидные гранулы/влажные полиакриламидные гранулы составляет 0,11:1 (мас./мас.). Удельная активность составляет 9,5 мкмоль никотинамида/(мин х мг сухих полиакриламидных гранул).
Пример 4. Конверсия 3-цианопиридина в никотинамид в статистическом режиме.
Полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма КЕобососсик (100 г влажных гранул), полученные, как описано в примере 3, добавляли в медленно перемешиваемый раствор 3-цианопиридина (40 г, 3,8 моль) в фосфатном буферном растворе (0,05 М, рН 7,0, 400 мл) при 25°С. Через 15 мин конверсия 3-цианопиридина в никотинамид составляла 99%, через 30 мин - 99%.
Пример 5. Конверсия 3-цианопиридина в никотинамид в непрерывном режиме.
Полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма КЕобососсик (100 г влажных гранул), полученные, как описано в примере 3, добавляли в раствор 3-цианопиридина (40 г, 3,8 моль) в фосфатном буферном растворе (0,05 М, рН 7,0, 400 мл) при 25°С. Раствор 3-цианопиридина (10 мас.%) в фосфатном буферном растворе (0,05 М, рН 7,0) непрерывно добавляли в медленно перемешиваемую реакционную смесь и реакционную смесь (не содержащую полиакриламидные гранулы) непрерывно удаляли. Непрерывную конверсию проводили в течение 5 недель при 25°С, время выдерживания составляло 3,1 ч. При этом в течение 5 недель разрушения гранул не наблюдалось. В ходе реакции определяли концентрацию 3-цианопиридина и никотинамида (см. фиг. 1 и 2) и рассчитывали конверсию (см. фиг. 3).
Пример 6. Инкапсулирование клеток штамма Кйобососсик в полиакриламидные гранулы.
Акриламид (422,5 г, 5940 ммоль), Ν,Ν'-метилен-бис-акриламид (37,5 г, 240 ммоль) и 2-(диметиламино)этилметакрилат (15 г, 90 ммоль) растворяли в фосфатном буферном растворе (375 г, 50 мМ, рН 7,0) и рН раствора доводили до 7,0. Раствор персульфата аммония (4,65 г, 20 ммоль) в дистиллированной воде (25 г) добавляли в суспензию клеток штамма Кйобососсик (16 мас.% сухих клеток, 1650 г), полученную, как описано в примере 1. Раствор Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилэтилендиамина (2,32 г, 20 ммоль) в дистиллированной воде (25 г) диспергировали в минеральном масле (Еххко1 Ό100, 3500 г) в реакторе
- 5 015321 объемом 10 л. Раствор мономеров, суспензию клеток и масло (каждый компонент в отдельности) продували азотом в течение 15 мин. Раствор мономеров (скорость потока 13,5 г/мин) и суспензию клеток (скорость потока 27 г/мин), каждый в отдельности, загружали с помощью насоса в общий шланг для подачи растворов. Полученную смесь добавляли с помощью наноса при 20°С в перемешиваемое масло (215 об/мин, струйный смеситель У15со-]с1). После завершения добавления реагентов реакционную смесь перемешивали в течение еще 3,5 ч при 20°С. Полученные полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма Кйобососсик, отделяли фильтрованием, промывали и хранили, как описано в примере 3. Набухшие гранулы характеризуются правильной сферической формой размером от 200 до 1200 мкм и механической прочностью >400 мН. Соотношение сухие полиакриламидные гранулы/влажные полиакриламидные гранулы составляет 0,09:1 (мас./мас.). Удельная активность составляет 7,3 мкмоль никотинамида/(мин х мг сухих полиакриламидных гранул).
Пример 7. Стабильность при хранении полиакриламидных гранул, содержащих инкапсулированные клетки штамма Кйобососсик.
Полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма Кйобососсик, полученные, как описано в примере 5, хранили в водном растворе для хранения (3,55 г/л сульфата натрия, 0,25 мас.% натриевой соли дегидрацетовой кислоты, 0,05 мас.% никотинамида, рН 7,0). Через каждые 5 недель отбирали образцы. Полиакриламидные гранулы отделяли, промывали дистиллированной водой и суспендировали в свежем буферном растворе для хранения (3,55 г/л сульфата натрия, 0,25 мас.% натриевой соли дегидрацетовой кислоты, 0,05 мас.% никотинамида, рН 7,0) при 25°С в течение 1 ч. Активность нитрилгидратазы определяли, как описано в примере 2. Определяли соотношение сухие полиакриламидные гранулы/влажные полиакриламидные гранулы. Сухие полиакриламидные гранулы получали при высушивании влажных полиакриламидных гранул при 55°С и 20 мбар в течение 4 ч.
Таблица 1
Стабильность при хранении полиакриламидных гранул, содержащих клетки штамма Кйобососсик
Недели Сухие полиакриламидные гранулы/ влажные полиакриламидные гранулы (мас./мас.) Удельная активность [мкмоль никотинамида/(минхмг сухих полиакриламидных гранул)]
0 0,09 7,3
5 0,09 7,3
10 0,09 7,0
13 0,09 6,5
50 0,08 6,0
Пример 8. Инкапсулирование клеток штамма Кйобососсик в полиакриламидные гранулы.
Инкапсулирование проводили аналогично тому, как описано в примере 3, но при этом использовали раствор персульфата аммония (1,86 г, 8 ммоль) в дистиллированной воде (7,0 г) и раствор Ν,Ν,Ν',Ν'тетраметилэтилендиамина (0,928 г, 8 ммоль) в дистиллированной воде (5 г). Полученные полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма Кйобососсик, отделяли, промывали и хранили, как описано в примере 3. Набухшие гранулы характеризуются правильной сферической формой размером от 250 до 1300 мкм и механической прочностью >400 мН. Соотношение сухие полиакриламидные гранулы/влажные полиакриламидные гранулы составляет 0,12:1 (мас./мас.). Удельная активность составляет 7,8 мкмоль никотинамида/(мин х мг сухих полиакриламидных гранул).
Пример 9. Инкапсулирование клеток штамма Кйобососсик в полиакриламидные гранулы.
Инкапсулирование проводили аналогично тому, как описано в примере 3, но при этом использовали суспензию клеток штамма Кйобососсик (16 мас.% сухих клеток), а полимеризацию проводили при 10°С в течение 9 ч. Полученные полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма Кйобососсик, отделяли, промывали и хранили, как описано в примере 3. Набухшие гранулы характеризуются правильной сферической формой размером от 250 до 1300 мкм и механической прочностью >400 мН. Соотношение сухие полиакриламидные гранулы/влажные полиакриламидные гранулы составляет 0,09:1,00 (мас./мас.). Удельная активность составляет 7,3 мкмоль никотинамида/(мин х мг сухих полиакриламидных гранул).
Пример 10. Инкапсулирование клеток штамма Вйобососсик в полиакриламидные гранулы.
Ν,Ν-Диметилакриламид (42,25 г, 426 ммоль), Ν,Ν'-метилен-бис-акриламид (3,75 г, 24 ммоль) и 2-(диметиламино)этилметакрилат (1,5 г, 9 ммоль) растворяли в фосфатном буферном растворе (37,5 г, 50 мМ, рН 7,0) и рН раствора доводили до 7,0. Раствор персульфата аммония (1,86 г, 8 ммоль) в дистиллированной воде (7 г) добавляли в суспензию клеток штамма Кйобососсик (18 мас.% сухих клеток, 166 г), полученную, как описано в примере 1. Раствор Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилэтилендиамина (0,928 г, 8 ммоль) в дистиллированной воде (7 г) диспергировали в минеральном масле (Ехх§о1 Ό100, 350 г) в реакторе объемом 1 л. Раствор мономеров, суспензию клеток и масло (каждый компонент в отдельности) продували азотом в течение 15 мин. Раствор мономеров (скорость потока 2,5 г/мин) и суспензию клеток (скорость потока 5 г/мин) (каждый компонент в отдельности) загружали с помощью насоса в колбу для
- 6 015321 смешивания объемом 2,5 л. Полученную смесь немедленно добавляли по каплям при 20°С в перемешиваемое масло (350 об/мин, струйный смеситель Уйсо-)е1). После завершения добавления реагентов реакционную смесь перемешивали в течение еще 3,5 ч при 20°С. Полученные полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма Кйойососсик, отделяли фильтрованием, промывали и хранили, как описано в примере 3. Набухшие гранулы характеризуются правильной сферической формой размером от 200 до 700 мкм и механической прочностью >400 мН. Соотношение сухие полиакриламидные гранулы/влажные полиакриламидные гранулы составляет 0,21:1 (мас./мас.). Удельная активность составляет 5,4 мкмоль никотинамида/(мин х мг сухих полиакриламидных гранул).
Пример 11. Инкапсулирование клеток штамма Кйойососсик в полиакриламидные гранулы.
Инкапсулирование проводили аналогично тому, как описано в примере 10, но вместо Ν,Ν-диметилакриламида (42,25 г, 426 ммоль) использовали акриламид (42,25 г, 594 ммоль), а вместо 2-(диметиламино)этилметакрилата (1,5 г, 9 ммоль) использовали №[3-(диметиламино)пропил]метакриламид (1,5 г, 9 ммоль). Полученные полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма Кйойососсик, отделяли, промывали и хранили, как описано в примере 3. Набухшие гранулы характеризуются правильной сферической формой размером от 150 до 1200 мкм и механической прочностью >400 мН. Соотношение сухие полиакриламидные гранулы/влажные полиакриламидные гранулы составляет 0,13:1 (мас./мас.). Удельная активность составляет 5,9 мкмоль никотинамида/(мин х мг сухих полиакриламидных гранул).
Пример 12. Культивирование штамма ЕксйепсЫа сой, содержащего плазмиду, включающую кодирующий амидазу ген, транскрипция которого регулируется промотером-рамнозой.
12.1. Получение пре-прекультуры.
В стерильную среду (5 мл, рН 7,0), содержащую 1,6 мас.% триптона, 1,0 мас.% дрожжевого экстракта, 0,5 мас.% №1С1 и 0,01 мас.% ампицилина, высеивали культуру штамма ЕксйепсШа сой из слоя агара с культурой, причем культура содержит плазмиду, включающую кодирующий амидазу ген, транскрипция которого регулируется промотером-рамнозой. Пре-прекультуру культивировали при 37°С в течение 12 ч на качалке.
12.2. Получение прекультуры.
В стерильную среду, описанную в примере 12.1 (100 мл), высеивали 5 мл пре-прекультуры штамма ЕксйепсШа сой, полученной в примере 12.1. Прекультуру культивировали при 37°С на качалке. При поглощении 0,25 при длине волны 600 нм в культуру добавляли 0,2 мас.% Ь-рамнозу. При поглощении 5 при 600 нм клетки собирали центрифугированием, дважды промывали буферным раствором (1,80 г/л этилендиаминтетрауксусной кислоты, 2,65 г/л динатриевой соли/натрий ацетатного буферного раствора, рН 7,0) и ресуспендировали в указанном буферном растворе до концентрации сухих клеток 15-20 мас.%. Суспензию клеток хранили при -40°С.
Пример 13. Определение амидазной активности.
Полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма ЕксйепсШа сой, содержащие амидазу (0,4 г влажных клеток), добавляли в перемешиваемый раствор 2-гидрокси-2-метил3,3,3-трифторпропионамида (1,0 г) в фосфатном буферном растворе (0,1 М, рН 8,0, 9 мл) при 37°С. Образцы (200 мкл) отбирали через 0, 30 и 60 мин. Затем измеряли молярное количество образующегося аммиака, которое равно молярному количеству образующейся 2-гидрокси-2-метил-3,3,3-трифторпропионовой кислоты.
Пример 14. Инкапсулирование в полиакриламидные гранулы штамма ЕксйепсШа сой, содержащего плазмиду, включающую кодирующий амидазу ген, транскрипция которого регулируется промотеромрамнозой.
Инкапсулирование проводили аналогично тому, как описано в примере 3, но при этом использовали суспензию клеток штамма ЕксйепсЫа сой (19 мас.% сухих клеток), полученную, как описано в примере 12, раствор персульфата аммония (1,86 г, 8 ммоль) в дистиллированной воде (7,0 г) и раствор Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилэтилендиамина (0,928 г, 8 ммоль) в дистиллированной воде (5 г), а полимеризацию проводили при 400 об/мин (струйный смеситель Уйсо-)е1). Полученные полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма ЕксйепсЫа сой, отделяли и промывали, как описано в примере 3, хранили в фосфатном буферном растворе (0,1 М, рН 7,0). Набухшие гранулы характеризуются неправильной сферической формой размером от 200 до 2000 мкм и механической прочностью >200 мН. Соотношение сухие полиакриламидные гранулы/влажные полиакриламидные гранулы составляет 0,21:1 (мас./мас.). Удельная активность составляет 0,029 мкмоль 2-гидрокси-2-метил-3,3,3-трифторпропионамида/(мин х мг сухих полиакриламидных гранул).
Пример 15. Конверсия 2-гидрокси-2-метил-3,3,3-трифторпропионамида в 2-гидрокси-2-метил-3,3,3трифторпропионовую кислоту в статическом режиме.
Полиакриламидные гранулы, содержащие клетки штамма ЕксйепсЫа сой, содержащие плазмиду, включающую кодирующий амидазу ген, и полученные, как описано в примере 14 (0,4 г влажных гранул), добавляли в раствор 2-гидрокси-2-метил-3,3,3-трифторпропионамида (1,0 г, 6,366 ммоль) в фосфатном буферном растворе (0,1 М, рН 8,0, 10 мл) при 37°С в течение 1 ч. При этом образуется 2-гидрокси-2
- 7 015321 метил-3,3,3-трифторпропионовая кислота (2%).
Пример 16. Инкапсулирование в полиакриламидные гранулы штамма ЕксйепсЫа сой, содержащего плазмиду, включающую кодирующий амидазу ген, транскрипция которого регулируется промотеромрамнозой.
Акриламид (21,13 г, 297 ммоль), Ν,Ν'-метилен-бис-акриламид (1,88 г, 12 ммоль) и 2-(диметиламино)этилметакрилат (0,75 г, 4,8 ммоль) растворяли в фосфатном буферном растворе (18,75 г, 50 мМ, рН 7,0) и рН раствора доводили до 7,0. Раствор персульфата аммония (0,93 г, 4 ммоль) в дистиллированной воде (2,5 г) добавляли в суспензию клеток штамма ЕксйепсЫа сой (19 мас.% сухих клеток, 82,5 г), полученную, как описано в примере 12. Раствор Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилэтилендиамина (0,928 г, 8 ммоль) в дистиллированной воде (5 г) диспергировали в минеральном масле (1кораг М, 350 г) в реакторе объемом 1 л при 450 об/мин. Раствор мономеров, суспензию клеток и масло (каждый компонент в отдельности) продували азотом в течение 15 мин. Раствор мономеров (скорость потока 2,5 г/мин) и суспензию клеток (скорость потока 5 г/мин) (каждый компонент в отдельности) загружали с помощью насоса в колбу для смешивания объемом 2,5 л. Полученную смесь немедленно добавляли по каплям при 20°С в перемешиваемое масло (450 об/мин, струйный смеситель У|ксо-)е1). После завершения добавления реагентов реакционную смесь перемешивали в течение еще 3,75 ч при 20°С. Полученные полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма ЕксйепсЫа сой, отделяли и промывали, как описано в примере 3, хранили в фосфатном буферном растворе (0,1 М, рН 7,0) при 4°С. Набухшие гранулы характеризуются неправильной сферической формой размером от 1000 до 1200 мкм и механической прочностью >200 мН. Соотношение сухие полиакриламидные гранулы/влажные полиакриламидные гранулы составляет 0,25:1,00 (мас./мас.). Удельная активность составляет 0,016 мкмоль никотинамида/(мин х мг сухих полиакриламидных гранул).
Пример 17. Применение полиакриламидных гранул, содержащих инкапсулированные клетки штамма КЕобососсик, содержащие нитрилгидратазу, в качестве биокатализатора для превращения нитрилов в амиды.
Полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки штамма Кбюбососсик и полученные, как описано в примере 7 (25 г влажных гранул), добавляли в медленно перемешиваемый раствор нитрила в фосфатном буферном растворе (0,05 М, рН 7, 100 мл) или в смеси фосфатного буферного раствора (0,05 М, рН 7, 100 мл) и метанола при 25°С. Через 5, 15 и 60 мин отбирали образцы (3 мл) и их немедленно смешивали с Н2§04 (48 мас.%, 0,03 мл). Реакционную смесь анализировали методом ЖХВР или ГХ и определяли удельную активность. Полученные результаты приведены в табл. 2.
- 8 015321
Таблица 2 Биопревращение различных нитрилов в соответствующие амиды с использованием полиакриламидных гранул, содержащих клетки штамма Шюбососсик, включающих нитрилгидратазу, в качестве биокатализатора
Субстрат Цианамид Продукт Мочевина Концентрация субстрата [мМ] 200 Соотношение МеОН/ буферный раствор [об. /об.] 0:1 Удельная активность [мкмоль/ (мин х мг)] 857
Цианоуксусная кислота Моноамид малоновой кислоты 100 0:1 107
Малонодинитрил 2-цианоацетамид/ малонамид 200 0:1 946
Метиловый эфир цианоуксусной кислоты Метиловый эфир малоновой кислоты 100 0:1 340
Акрилонитрил Акриламид 200 0:1 76
Бутиронитрил Бутирамид 200 0:1 1025
Валеронитрил Валерамид 200 1:9 1708
Кротононитрил Кротонамид 200 0:1 1585
Метакрилонитрил Метакриламид 200 0:1 591
2-Цианоп иридии Пиколинамид 9,6 0:1 24,6
3 -Цианопиридин Никотинамид 250 0:1 2320
4-Цианопиридин Изоникотинамид 125 0:1 613
Бензонитрил Бензамид 50 1:4 276
2-Хлорбензонитрил 2-Хлорбензамид 7,3 1:4 6,4
4-Хлорбензонитрил 4-Хлорбензамид 7,2 1:4 42,6
Пиразинкарбонитрил Пиразин-2карбоксамид 100 1:4 246
Пиразин-2,3 дикарбонитрил Пиразин-2,3дикарбоксамид 7,7 1:4 0,53
2-Фуронитрил Фуран-2-карбоксамид 100 1:4 235
Тиофен-2карбонитрил Тиофен-2-карбоксамид 9,2 1:4 73
Пивалонитрил 2,2- Диметилпропионамид 100 1:4 321
Циклопропанкарбонитрил Циклопропанкарбоксамид 100 1:4 562
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (13)

1. Способ получения полиакриламидных гранул, содержащих инкапсулированные клетки и характеризующихся прочностью по меньшей мере 200 мН, включающий следующие стадии:
(1) получение водного раствора смеси акриловых мономеров, (2) получение суспензии клеток в водном растворе персульфата, (3) получение эмульсии водного раствора третичного амина в несмешивающейся с водой жидкости, (4) смешивание раствора, полученного на стадии (1), и суспензии, полученной на стадии (2), (5) добавление смеси, полученной на стадии (4), в перемешиваемую эмульсию, полученную на стадии (3), (6) полимеризация смеси акриловых мономеров и одновременное инкапсулирование клеток с образованием полиакриламидных гранул, содержащих инкапсулированные клетки, (7) выделение полученных полиакриламидных гранул.
2. Способ по п.1, в котором размер полиакриламидных гранул составляет от 0,05 до 3 мм.
3. Способ по п.2, в котором размер полиакриламидных гранул составляет от 0,1 до 1,5 мм, а механическая прочность по крайней мере 300 мН.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором массовое соотношение сухие клетки/смесь акриловых мономеров составляет от 0,001:1 до 1:1.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором массовое соотношение сухие клетки/смесь акриловых мономеров составляет от 0,2:1 до 0,9:1.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором клеткой является бактериальная клетка.
7. Способ по п.6, в котором клеткой является бактериальная клетка группы нокардиоформы актиномицетов или семейства Еи1егоЬас1епасеа.
- 9 015321
8. Способ по любому из пп.1-7, в котором третичным амином является Ν,Ν,Ν',Ν'тетраметилэтилендиамин или 3-(диметиламино)пропионитрил.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором несмешивающейся с водой жидкостью является минеральное масло.
10. Способ по любому из пп.1-9, в котором используется поверхностно-активное вещество.
11. Полиакриламидные гранулы, содержащие инкапсулированные клетки, полученные способом по любому из пп.1-10, причем механическая прочность полиакриламидных гранул составляет по крайней мере 200 мН.
12. Полиакриламидные гранулы по п.11, в которых инкапсулированными клетками являются клетки штамма рода Кйобососсик, включающие нитрилгидратазу.
13. Применение полиакриламидных гранул по п.11 или 12 в качестве биокатализатора для превращения нитрильного субстрата в соответствующий амид.
EA200600704A 2003-10-27 2004-10-26 Способ получения полиакриламидных гранул, полиакриламидные гранулы и их применение EA015321B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03024648 2003-10-27
PCT/EP2004/012065 WO2005040373A1 (en) 2003-10-27 2004-10-26 Immobilization of biocatalyst

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600704A1 EA200600704A1 (ru) 2006-10-27
EA015321B1 true EA015321B1 (ru) 2011-06-30

Family

ID=34486107

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600704A EA015321B1 (ru) 2003-10-27 2004-10-26 Способ получения полиакриламидных гранул, полиакриламидные гранулы и их применение

Country Status (12)

Country Link
US (2) US20050089987A1 (ru)
EP (1) EP1682659A1 (ru)
JP (2) JP5107577B2 (ru)
KR (1) KR20060100396A (ru)
CN (1) CN1871345B (ru)
AU (1) AU2004284226B2 (ru)
BR (1) BRPI0415884A (ru)
CA (1) CA2540251A1 (ru)
EA (1) EA015321B1 (ru)
IL (1) IL174453A (ru)
MX (1) MXPA06004672A (ru)
WO (1) WO2005040373A1 (ru)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050266027A1 (en) * 2004-05-25 2005-12-01 Watson James B Live organism product
US20150177115A1 (en) 2012-04-06 2015-06-25 Slingshot Biosciences Hydrogel particles with tunable optical properties
KR102656644B1 (ko) 2015-02-09 2024-04-09 슬링샷 바이오사이언시즈 인코포레이티드 튜닝가능한 광 특성을 갖는 하이드로겔 입자 및 이를 사용하기 위한 방법
CN104894092A (zh) * 2015-05-13 2015-09-09 安徽国星生物化学有限公司 一种仿生固定化3-氰基吡啶腈水合酶的制备方法
WO2017055518A1 (en) * 2015-09-30 2017-04-06 Basf Se Means and methods for producing an amide compound
CN108660131B (zh) * 2018-04-27 2020-07-21 浙江工业大学 固定化腈基水合酶和(s)-n-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法
JP2023511132A (ja) 2020-01-24 2023-03-16 スリングショット バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 細胞様較正粒子のための組成物および方法
WO2021226036A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Slingshot Biosciences, Inc. Compositions and methods for passive optical barcoding for multiplexed assays
CN113025671B (zh) * 2020-06-23 2023-01-31 浙江恒康药业股份有限公司 苜蓿中华根瘤菌来源的腈水合酶在制备酰胺吡嗪类化合物中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4647536A (en) * 1982-03-08 1987-03-03 Klaus Mosbach Method of encapsulating biomaterial in bead polymers
US4774178A (en) * 1984-05-02 1988-09-27 Bayer Aktiengesellschaft Immobilization of biological material within a polymer matrix
WO1997006248A1 (en) * 1995-08-09 1997-02-20 Allied Colloids Limited Processes for the production of amidase

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA968485B (en) * 1995-11-01 1997-05-20 Lonza Ag Process for preparing nicotinamide
GB9525372D0 (en) * 1995-12-12 1996-02-14 Allied Colloids Ltd Enzymes, their preparation and their use in the production of ammonium acrylate
BR9707375A (pt) * 1996-02-09 1999-07-20 Reilly Ind Inc Processos contínuos para a hidrólise de cianopiridinas sob condições substancialmente adiabáticas
US5863750A (en) * 1996-12-18 1999-01-26 Cytec Tech Corp Methods for the detoxification of nitrile and/or amide compounds

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4647536A (en) * 1982-03-08 1987-03-03 Klaus Mosbach Method of encapsulating biomaterial in bead polymers
US4774178A (en) * 1984-05-02 1988-09-27 Bayer Aktiengesellschaft Immobilization of biological material within a polymer matrix
WO1997006248A1 (en) * 1995-08-09 1997-02-20 Allied Colloids Limited Processes for the production of amidase

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NILSSON H. ET AL.: "THE USE OF BEAD POLYMERIZATION OF ACRYLIC MONOMERS FOR IMMOBILIZATION OF ENZYMES", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 268, no. 1, 1972, pages 253-256, XP008043513, ISSN: 0006-3002, cited in the application, the whole document *
SADA E. ET AL.: "PERFORMANCE OF AN ENZYME REACTOR UTILIZING A MAGNETIC FIELD", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 22, no. 1, 1980, pages 243-246, XP002318986, ISSN: 0006-3592, page 243 *

Also Published As

Publication number Publication date
MX281018B (ru) 2010-11-16
KR20060100396A (ko) 2006-09-20
JP2012196213A (ja) 2012-10-18
AU2004284226A1 (en) 2005-05-06
MXPA06004672A (es) 2006-11-20
IL174453A0 (en) 2006-08-01
CA2540251A1 (en) 2005-05-06
JP5107577B2 (ja) 2012-12-26
US20050089987A1 (en) 2005-04-28
WO2005040373A1 (en) 2005-05-06
AU2004284226B2 (en) 2009-04-09
CN1871345A (zh) 2006-11-29
IL174453A (en) 2010-11-30
BRPI0415884A (pt) 2007-01-09
EA200600704A1 (ru) 2006-10-27
JP2007508851A (ja) 2007-04-12
EP1682659A1 (en) 2006-07-26
CN1871345B (zh) 2014-05-07
US20070259415A1 (en) 2007-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2012196213A (ja) 生体触媒の固定化
EP0307926B1 (en) Process for biological production of amides
RU2288270C2 (ru) Способ производства амидного соединения с применением микробного катализатора
RU98113063A (ru) Ферменты, их получение и их использование для получения аммонийакрилата
Nagasawa et al. ε-Caprolactam, a new powerful inducer for the formation of Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase
CA2238443A1 (en) Enzymes, their preparation and their use in the production of ammonium acrylate
RU2007105993A (ru) Способ получения мономеров и их полимеров
CN107746841A (zh) 一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体及制备方法
IE58209B1 (en) Crosslinked polymers, a process for their preparation and their use
Hwang et al. Biotransformation of acrylonitrile to acrylamide using immobilized whole cells of Brevibacterium CH1 in a recycle fed‐batch reactor
CN112980826A (zh) 一种脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料及其制备方法和应用
CN1628175A (zh) 用组合的酶催化剂生产甲基丙烯酸和丙烯酸的方法
Xudong et al. Bioconversion of acrylnitrile to acrylamide using hollow-fiber membrane bioreactor system
Kim et al. Production of acrylamide using immobilized cells of Rhodococcus rhodochrous M33
CN103975071A (zh) 丙烯酰胺水溶液的制造方法
Ramakrishna et al. Superiority of cobalt induced acrylonitril hydratase of Arthrobacter sp. IPCB-3 for conversion of acrylonitrile to acrylamide
Kanwar et al. Enhancement of ethyl propionate synthesis by poly (AAc-co-HPMA-cl-MBAm)-immobilized pseudomonas aeruginosa MTCC-4713, exposed to Hg 2+ and NH 4+ ions
EP0528669A2 (en) Method of producing alpha-hydroxyisobutylamide
Fukatsu et al. Optimum culture conditions for the production of N-substituted formamide deformylase by Arthrobacter pascens F164
CN103687844B (zh) 丙烯酰胺水溶液的制造方法
JP2010022314A (ja) カルボン酸の製造方法
CN116716285A (zh) 一种脂肪酶/单宁酸丙烯酰胺磁性水凝胶微球催化材料及其制备方法和应用
RU2001104716A (ru) Биотехнологический способ получения водных растворов акриламида
JP2007295933A (ja) 微生物触媒を用いたアミド化合物の製造方法
JP2007236396A (ja) 微生物触媒を用いたアミド化合物の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU