CN1840679A - 葡聚糖的生产方法和制备方法 - Google Patents

Abstract

第一种生产葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖－1－磷酸、蔗糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶的反应溶液起反应以生产葡聚糖的步骤。从反应开始到结束，反应溶液中蔗糖－磷酸盐比例最大值不超过约17。第二种生产葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖－1－磷酸、蔗糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶的反应溶液起反应以生产葡聚糖的步骤。反应在约40℃到约70℃的温度下进行。

Description

葡聚糖的生产方法和制备方法

本申请是PCT申请号为PCT/JP02/05125(其进入国家阶段的申请号为02814919.X)、申请日为2002年5月27日、发明名称为“葡聚糖的生产方法和制备方法”的发明专利申请的分案申请。

                      技术领域

本发明涉及生产葡聚糖及其衍生物的方法。更具体地说，本发明涉及延长α-1，4-葡聚糖链的方法。

                      背景技术

葡聚糖是对仅由D-葡萄糖组成其糖类组分的多糖的通称。代表性葡聚糖的实例包括淀粉、纤维素等。淀粉是通过α-糖苷键连接其糖类组分的α-葡聚糖。淀粉中存在直链淀粉，即直链α-1，4-葡聚糖，和具有分枝结构的支链淀粉。直链淀粉与支链淀粉丰度比例的变化取决于储存淀粉的植物。因此，很难获得含有任意组成比例的直链淀粉和支链淀粉的淀粉。如果可以稳定生产直链淀粉，这种直链淀粉便可与商业可应用淀粉混合，以生产具有任意直链淀粉含量的淀粉。

通常，可利用水解酶、转移酶等酶的作用生产直链淀粉和具有任意结构的支链淀粉。然而，对通过延伸其α-1，4-葡聚糖链而结构性改造淀粉的报导是有限的。开发一种有效延伸α-1，4-葡聚糖链的方法是有用的，因为不仅可生产直链淀粉，也可任意修饰淀粉的结构。

已知在含淀粉食物中，淀粉中直链淀粉的含量和结构对食物的物理属性有很大影响。然而，淀粉中直链淀粉的含量和结构是由被作为原料利用的淀粉决定的。如果直链淀粉的含量和结构可以被任意改变，便可期待开发出具有新口感的食物。

人们希望不溶性直链淀粉具有与膳食纤维相同的功能，并也可被利用在健康食品中。此外，直链淀粉具有一个特征，即直链淀粉可含有，例如碘、脂肪酸、或分子相似物。因此，人们希望直链淀粉可应用在药物、化妆品和卫生产品领域中。直链淀粉也可作为原料用于生产具有与其相同包含能力的环糊精和环直链淀粉。此外，含直链淀粉的薄膜具有不低于多用途塑料的抗拉强度，并且对生物可降解塑料而言，直链淀粉是非常有希望的材料。因而人们希望直链淀粉有多种用途。然而，获得基本上纯的直链淀粉是困难的，并且这种直链淀粉非常昂贵。因此，这种直链淀粉仅被划分为试剂级，并且几乎不作为工业材料应用。所以需要一种以稳定且便宜的方式生产直链淀粉的方法。

已知有一些生产直链淀粉的方法。淀粉中存在的直链淀粉所占比例约为0～70％。采用沉淀剂，如丁醇，通过T.J.Schoch et al.，J.AmericanChemical Society，64，2957(1942)中描述的方法可从天然原料淀粉中提取直链淀粉。然而该提取操作复杂且产率低。此外，通过提取操作难以获得不含α-1，6-糖苷键的直链葡聚糖。而且难以提取具有窄分子量分布的直链葡聚糖。

就酶促延伸α-1，4-葡聚糖链的方法而言，有一种合成方法，该方法中，以糖核苷酸为底物，通过糖原合成酶、淀粉合成酶等途径，将糖部分转移到作为引物的麦芽四糖或相似物上。然而该方法的不利之处是作为底物的糖核苷酸非常昂贵，因而不能被工业利用。

有一种合成α-1，4-葡聚糖链的方法是通过来源自马铃薯的葡聚糖磷酸化酶(GP)途径，将α-葡糖-1-磷酸的糖基基团转移到引物，如麦芽七糖等。

此外，有一种公开的方法(US Patent No.5,405,449和EP 0590736)是以葡萄糖-1-氟化物为底物，并使蔗糖磷酸化酶(SP)和葡聚糖磷酸化酶同时作用在引物上。

这些合成方法的有利之处是反应开始时，反应溶液中底物与引物的比例是任意设定的，因此可控制获所得直链葡聚糖的分子量。然而底物，α-葡糖-1-磷酸和葡萄糖-1-氟化物是昂贵的，因而对便宜地生产可利用在广泛工业领域中的直链α-1，4-葡聚糖而言是不适用的。

就以更便宜的方式生产直链葡聚糖的方法而言，有一种公开的方法(Waldmann，H.et al.，Carbohydrate Research，157(1986)c4-c7)是使蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶同时作用于引物和蔗糖(下文见SP-GP方法)。Waldmann等人采用来源自明串珠菌属(肠系膜状明串珠菌)的蔗糖磷酸化酶和来源自马铃薯块茎的葡聚糖磷酸化酶高产率地从蔗糖合成直链葡聚糖。Waldmann等人的SP-GP方法保证了可利用便宜的底物生产直链葡聚糖，但是还有一些难题需要改进，如下。

首先，由于采用大量的酶，因此生产成本高，不可能廉价生产。为解决这一难题，需要减少所采用的酶量，或需要研究反应条件以改进单位酶的直链淀粉产率。

SP-GP方法中，决定所采用的酶量或单位酶的直链淀粉产率的诸多因素之一是，例如反应开始时溶液中无机磷酸盐与蔗糖的浓度比例，其中蔗糖是SP的底物。Waldmann等人的现有技术中，反应开始时采用的无机磷酸盐浓度与溶液中蔗糖浓度相比是相当低的，所以才能高产率地生产葡聚糖。SP-GP方法中，蔗糖首先被转化为葡糖-1-磷酸，继而葡糖-1-磷酸被转化为葡聚糖，如果采用高浓度的无机磷酸盐，中间产物葡糖-1-磷酸便会积累至高浓度。因此终产物葡聚糖的产率被认为是降低了。所以认为在常规SP-GP方法中应采用低的无机磷酸盐浓度。在本发明之前，尚无公开内容是关于反应开始时的溶液中，蔗糖与无机磷酸盐的浓度比例的改变对所采用的酶量或单位酶直链淀粉产率的影响，并且更少有对这种改变效果的预测。

有报导一种将两种类型磷酸化酶相似地组合到SP-GP方法中，并且通过无机磷酸盐合成碳水化合物的方法。例如Chaen等人(Journal ofBioscience and Bioengineering，92(2001)177-182)公开的一种利用麦芽糖磷酸化酶和曲二糖磷酸化酶的组合，从麦芽糖合成清酒曲低聚糖的方法。Chaen等人描述反应开始时，溶液中的无机磷酸盐浓度越低，反应产物，即清酒曲低聚糖的产率越高。因此，通常认为在一种有两种磷酸化酶组合的反应体系中，为增加终产物产率，反应开始时溶液中优选地无机磷酸盐浓度应较低。

SP-GP方法中，决定所采用的酶量或单位酶的直链淀粉产率的第二个因素是反应温度。通常，在酶反应中，反应温度越高，反应速率越快。因此，在高温度条件下进行反应是理想的。然而，由于酶蛋白是热不稳定的，因此实际的酶反应是在酶蛋白不会热失活的温度范围内进行的。Waldmann等人的现有技术中，采用了来源自明串珠菌属的蔗糖磷酸化酶，并且考虑该酶的热稳定性，在37℃进行葡聚糖合成反应。本发明之前，尚无公开内容是关于反应溶液中蔗糖浓度的改变对蔗糖磷酸化酶稳定性的影响，并且也没有对其效果进行预测。此外，对来源自明串珠菌属的蔗糖磷酸化酶的热稳定性也没有公开的内容。因此，不可能对在葡聚糖合成中利用该蔗糖磷酸化酶的任何效果作出预测。

第二个难题是操作性难题。葡聚糖，尤其是直链淀粉会老化为不可溶的，导致沉淀或形成凝胶体。众所周知，老化速率取决于温度。反应温度低时，操作性难题出现在生产后的后续阶段，如直链淀粉溶液的凝胶化。因此，优选地反应温度应尽可能高。然而Waldmann等人的现有技术中，生产直链淀粉的反应温度有问题地低至37℃。

当从葡聚糖特定生产无支链结构的直链淀粉时，不得不以直链麦芽低聚糖做为引物。Waldmann等人的现有技术中，将纯化的麦芽七糖作为直链麦芽-低聚糖利用。然而，纯化的麦芽七糖仅被划分为试剂级，且非常昂贵。便宜引物的选择物包括通过对淀粉适当水解所得麦芽低聚糖的混合物。然而已知，对诸多葡聚糖磷酸化酶而言，只有聚合度大于或等于麦芽四糖的麦芽低聚糖可被用作引物，而聚合度小于或等于麦芽三糖的麦芽低聚糖则不能被用作引物。除了含有可作为引物起作用，且聚合度大于或等于麦芽六糖的麦芽低聚糖外，麦芽低聚糖混合物还含有不起引物作用的麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖。此外，已知麦芽低聚糖混合物中所含的葡萄糖是蔗糖磷酸化酶的抑制物。因此，含麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的麦芽低聚糖混合物是否具有引物功能，以及蔗糖磷酸化酶的抑制物葡萄糖在SP-GP方法中是否可以有效发挥作用，在本发明以前均未被公开过，并且也不能容易地推测其效果。

本发明方法的情况中，酶反应结束后，反应溶液中有大量副产物果糖伴随葡聚糖产生。因此，采用本发明方法工业化生产葡聚糖的情况中，葡聚糖合成反应步骤结束后，有效纯化葡聚糖的过程是必要的。Waldmann等人的现有技术中，纯化直链淀粉时利用的是一种采用丁醇选择性沉淀直链淀粉的方法。然而工业化大量生产直链淀粉时，利用有机溶剂的方法在成本、对人体安全性、环境问题方面均不是一种好的方法。还没有任何采用非有机溶剂的方法被公开过。

                      发明内容

本发明要解决上述难题。本发明的一个目标是提供一种在比常规方法更实用的条件下，以稳定且便宜的方式生产葡聚糖，尤其是直链淀粉的方法。更为特定地，本发明的目标是提供一种在从蔗糖生产直链淀粉的过程中尽可能多地减少所需要的酶量，并且在较高温度下实现反应的方法。

本发明的另一个目标是不采用有机溶剂从生产的直链淀粉溶液中有效纯化直链淀粉。

为解决上述难题，本发明的发明人进行了严谨的研究，终于发现从反应开始到结束的一段时间内，通过在一定范围内，设定蔗糖摩尔浓度与无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸的总摩尔浓度的比例最大值，可获得高于常规方法的产率水平。基于该发现，发明人完善了本发明。

发明人也发现在至少某一浓度蔗糖存在情况下，蔗糖磷酸化酶的耐热性是增加的，因此反应温度可以升高；结果可减少所需要的酶量，或提高单位酶的葡聚糖产率；并且进一步地可以在高温下进行反应，使得直链淀粉可不老化地被生产。基于该发现，发明人完善了本发明。

发明人也发现利用来源自链球菌属的蔗糖磷酸化酶可提高反应温度；结果是可减少所需要的酶量，或提高单位酶的葡聚糖产率；并且进一步地可在高温下进行反应，使得直链淀粉可不老化(aging)地被生产。基于该发现，发明人完善了本发明。

发明人也发现在SP-GP方法中，即使以麦芽低聚糖混合物(尤其是一种含有不可作为许多葡聚糖磷酸化酶的引物起作用的麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物，并且葡萄糖是蔗糖磷酸化酶的抑制物)，而不是以纯化的麦芽低聚糖做为引物，也可以进行目标葡聚糖，特别是直链淀粉的合成，并且没有特殊难题。基于该发现，发明人完善了本发明。

本发明人发现可通过任一下列过程从反应溶液中有效除去果糖，以便生产葡聚糖，基于该发现，完善了本发明：

(1)不利用有机溶剂纯化已生成的葡聚糖；

(2)反应结束后冷却反应溶液以沉淀葡聚糖，并通过固-液分离方法纯化沉淀的葡聚糖；

(3)于葡聚糖生产反应期间或之后冷却反应溶液以凝胶化葡聚糖，回收凝胶状葡聚糖，并通过选自水洗涤、冷冻-融化、过滤、压榨、抽吸(suction)和离心的操作从凝胶状葡聚糖中除去果糖；并

(4)于葡聚糖生成反应结束后采用超滤膜或层析法，通过膜分级分离除去果糖，无需使溶解于水中的葡聚糖沉淀。

本发明第一种生产葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的反应溶液起反应以生产葡聚糖的步骤。从反应开始到结束，反应溶液中蔗糖-磷酸盐比例的最大值不超过约17。

一种实施方案中，最大值可以至少约为0.5，且不超过约15，优选至少约为1，且不超过约10，更优选至少约为2，且不超过约7。

一种实施方案中，葡聚糖可为直链淀粉。

一种实施方案中，蔗糖磷酸化酶可来源自属于链球菌属的细菌。优选地，蔗糖磷酸化酶可来源自选自变异链球菌、嗜热链球菌、肺炎链球菌、和缓症链球菌的属于链球菌属的细菌：。

一种实施方案中，葡聚糖磷酸化酶可来源自植物。更优选地葡聚糖磷酸化酶可来源自藻类或马铃薯。

一种实施方案中，葡聚糖磷酸化酶可来源自水生栖热杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。

一种实施方案中，蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一个可通过重组微生物生成。

一种实施方案中，蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一个可以被固定在载体上。

一种实施方案中，蔗糖可为未纯化的糖类。

一种实施方案中，引物可选自麦芽低聚糖、直链淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、出芽短梗霉聚糖、偶联糖、淀粉及它们的衍生物。

一种实施方案中，麦芽低聚糖可为麦芽低聚糖混合物。

一种实施方案中，除了含有聚合度大于或等于麦芽四糖的麦芽低聚糖外，麦芽低聚糖混合物还可含有麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖中的至少一种。

一种实施方案中，淀粉可选自可溶性淀粉、蜡质淀粉、高直链淀粉、脱支酶降解淀粉、磷酸化酶降解淀粉、水解酶部分降解的淀粉、已加工淀粉及其衍生物。

一种实施方案中，方法可进一步包括不采用有机溶剂纯化已生成的葡聚糖的步骤。

一种实施方案中，方法可进一步包括在反应结束后冷却反应溶液以沉淀葡聚糖，并通过固-液分离方法纯化已沉淀葡聚糖的步骤。

一种实施方案中，方法可进一步包括在葡聚糖生产反应期间或之后冷却反应溶液以凝胶化葡聚糖，回收凝胶状葡聚糖，并通过选自水洗涤、冷冻-融化、过滤、压榨、抽吸和离心的操作从凝胶状葡聚糖中除去果糖的步骤。

一种实施方案中，方法可进一步包括在葡聚糖生成反应结束后，采用超滤膜或层析法，使溶解在水中的葡聚糖通过膜分级分离，无需沉淀除去果糖。超滤膜的截留分子量可以约为30,000。超滤膜可为中空纤维类型。层析法中可采用的载体可为用于凝胶过滤层析法的载体、用于离子交换层析法的载体，或用于疏水层析法的载体。

一种实施方案中，反应溶液可进一步含有选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶、糖原脱支酶的酶。

本发明第二种生产葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶、和葡聚糖磷酸化酶的反应溶液起反应以制得葡聚糖的步骤。反应在约40℃到约70℃的温度下进行。

一种实施方案中，反应温度可以为约45℃到约65℃。

一种实施方案中，反应开始时，反应溶液的蔗糖浓度可以为约5％到约100％，优选地约8％到约80％，更为优选地约15％到约50％。

一种实施方案中，葡聚糖可为直链淀粉。

一种实施方案中，蔗糖磷酸化酶可来源自属于链球菌属的细菌。优选地，蔗糖磷酸化酶可来源自选自变异链球菌、嗜热链球菌、肺炎链球菌和缓症链球菌的属于链球菌属的细菌。

一种实施方案中，葡聚糖磷酸化酶可来源自植物。更优选地，葡聚糖磷酸化酶可来源自藻类或马铃薯。

一种实施方案中，葡聚糖磷酸化酶可来源自水生栖热杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。

一种实施方案中，蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一个可通过重组微生物生成。

一种实施方案中，蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一个可以被固定在载体上。

一种实施方案中，蔗糖可为未纯化的糖类。

一种实施方案中，引物可选自麦芽低聚糖、直链淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、出芽短梗霉聚糖、偶联糖、淀粉及其衍生物。

一种实施方案中，麦芽低聚糖可为麦芽低聚糖混合物。

一种实施方案中，除了含有聚合度大于或等于麦芽四糖的麦芽低聚糖外，麦芽低聚糖混合物还可含有麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖中的至少一种。

一种实施方案中，淀粉可选自可溶性淀粉、蜡质淀粉、高直链淀粉、脱支酶降解淀粉、磷酸化酶降解淀粉、水解酶部分降解的淀粉、已加工淀粉及其衍生物。

一种实施方案中，方法可进一步包括不采用有机溶剂纯化已生成的葡聚糖的步骤。

一种实施方案中，方法可进一步包括在反应结束后冷却反应溶液以沉淀葡聚糖，并通过固-液分离方法纯化已沉淀葡聚糖的步骤。

一种实施方案中，方法可进一步包括在葡聚糖生产反应期间或之后冷却反应溶液以凝胶化葡聚糖，回收凝胶状葡聚糖，并通过选自水洗涤、冷冻-融化、过滤、压榨、抽吸和离心的操作从凝胶状葡聚糖中除去果糖的步骤。

一种实施方案中，方法可进一步包括在葡聚糖生成反应结束后，采用超滤膜或层析法，使溶解于水中的葡聚糖无需沉淀，通过膜分级分离以除去果糖。超滤膜的截留分子量可约为30,000。超滤膜可为中空纤维类型。层析法中可采用的载体可为用于凝胶过滤层析法的载体、用于离子交换层析法的载体，或用于疏水层析法的载体。

一种实施方案中，反应溶液可进一步含有选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶、糖原脱支酶的酶。

本发明的第三种生产葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的反应溶液起反应以制得葡聚糖的步骤。从反应开始到结束，反应溶液中蔗糖-磷酸盐比例最大值不超过约17，并且反应在约40℃到约70℃的温度下进行。

一种实施方案中，最大值可至少约为0.5，且不超过约15，优选地至少约为1，且不超过10，更为优选地至少约为2，且不超过约7。

一种实施方案中，反应温度可为约45℃到约65℃。

一种实施方案中，反应开始时反应溶液的蔗糖浓度可约为5％到约100％，优选地约8％到约80％，更为优选地约15％到约50％。

一种实施方案中，葡聚糖可为直链淀粉。

一种实施方案中，蔗糖磷酸化酶可来源自属于链球菌属的细菌。优选地蔗糖磷酸化酶可来源自选自变异链球菌、嗜热链球菌、肺炎链球菌和缓症链球菌，属于链球菌属的细菌。

一种实施方案中，葡聚糖磷酸化酶可来源自植物。更优选地，葡聚糖磷酸化酶可来源自藻类或马铃薯。

一种实施方案中，葡聚糖磷酸化酶可来源自水生栖热杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。

一种实施方案中，蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一个可由重组微生物生成。

一种实施方案中，蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一个可被固定在载体上。

一种实施方案中，蔗糖可为未纯化的糖类。

一种实施方案中，引物可选自麦芽低聚糖、直链淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、出芽短梗霉聚糖、偶联糖、淀粉及其衍生物。

一种实施方案中，麦芽低聚糖可为麦芽低聚糖混合物。

一种实施方案中，除了含有聚合度大于或等于麦芽四糖的麦芽低聚糖外，麦芽低聚糖混合物还可含有麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖中的至少一种。

一种实施方案中，淀粉可选自可溶性淀粉、蜡质淀粉、高直链淀粉、脱支酶降解淀粉、磷酸化酶降解淀粉、水解酶部分降解的淀粉、已加工淀粉及其衍生物。

一种实施方案中，方法可进一步包括不采用有机溶剂纯化已生成的葡聚糖的步骤。

一种实施方案中，方法可进一步包括在反应结束后冷却反应溶液以沉淀葡聚糖，并通过固-液分离方法纯化已沉淀葡聚糖的步骤。

一种实施方案中，方法可进一步包括在葡聚糖生产反应期间或之后冷却反应溶液以凝胶化葡聚糖，回收凝胶状葡聚糖，并通过选自水洗涤、冷冻-融化、过滤、压榨、抽吸和离心的操作从凝胶状葡聚糖中除去果糖的步骤。

一种实施方案中，方法可进一步包括在葡聚糖生成反应结束后，采用超滤膜或层析法，使溶解在水中的葡聚糖无需沉淀，通过膜分级分离除去果糖。超滤膜的截留分子量可约为30,000。超滤膜可为中空纤维类型。层析法中可采用的载体可为用于凝胶过滤层析法的载体、用于离子交换层析法的载体，或用于疏水层析法的载体。

一种实施方案中，反应溶液可进一步含有选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶、糖原脱支酶的酶。

本发明第四种生产葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶的反应溶液起反应以制得葡聚糖的步骤，其中反应开始时，反应溶液中蔗糖-磷酸盐比例不超过约17。

一种实施方案中，反应开始后既不进一步添加无机磷酸盐，也不进一步添加葡糖-1-磷酸。

一种实施方案中，反应可在约40℃到约70℃的温度下进行。

本发明第五种生产葡聚糖的方法包括使含有蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶的反应溶液开始反应；进一步将蔗糖、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸添加到反应溶液中；进一步继续反应以生产葡聚糖的步骤，其中添加步骤结束时，反应溶液中蔗糖-磷酸盐比例不超过约17。

一种实施方案中，反应可在约40℃到约70℃的温度下进行。

本发明的葡聚糖是通过上述方法中的任意一种生产而得的。

                     附图简述

图1是一张显示从蔗糖合成葡聚糖的生产流程示意图。

图2是一张显示采用4％初始蔗糖、肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶、马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶，于37℃和45℃的反应温度下进行反应时直链淀粉的产率图。

图3是一张显示在不同初始蔗糖浓度，45℃的反应温度下进行反应时直链淀粉的产率图。

图4是一张显示在不同初始蔗糖浓度，37℃和45℃的反应温度下进行反应时直链淀粉的产率图。

图5是一张显示在不同初始蔗糖浓度，45℃和50℃的反应温度下，采用变异链球菌(耐热细菌)来源的蔗糖磷酸化酶和马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图6是一张显示在不同初始蔗糖浓度，45℃和50℃的反应温度下，采用酶活总计相当于图5中采用的酶的一半活性的变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶和马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图7是一张显示在不同初始蔗糖浓度，45℃的反应温度下，采用肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶和水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图8是一张显示在不同初始蔗糖浓度，45℃的反应温度下，采用酶活总计相当于图7中采用的酶的一半活性的肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶和水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图9是一张显示在不同初始蔗糖浓度，50℃的反应温度下，采用变异链球菌(耐热细菌)来源的蔗糖磷酸化酶和水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图10是一张显示在不同初始蔗糖浓度，50℃的反应温度下，采用酶活总计相当于图9中采用的酶的一半活性的变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶和水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图11是一张显示在不同初始蔗糖浓度，45℃的反应温度下，采用肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶和嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图12是一张显示在不同初始蔗糖浓度，37℃和45℃的反应温度下，采用酶活总计相当于图11中采用的酶的一半活性的肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶和嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图13是一张显示在不同初始蔗糖浓度，50℃的反应温度下，采用变异链球菌(耐热细菌)来源的蔗糖磷酸化酶和嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图14是一张显示在不同初始蔗糖浓度，45℃和50℃的反应温度下，采用酶活总计相当于图13中采用的酶的一半活性的变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶和嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图15是一张显示在65℃的反应温度下，反应开始时初始蔗糖浓度为50％，采用变异链球菌(耐热细菌)来源的蔗糖磷酸化酶和马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶或水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图16是一张显示在不同初始无机磷酸盐浓度，37℃的反应温度下，采用肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶和马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图17是一张显示在不同初始无机磷酸盐浓度，45℃的反应温度下，采用变异链球菌(耐热细菌)来源的蔗糖磷酸化酶和马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶进行反应时直链淀粉的产率图。

图18是一张显示加热至55℃时，不同蔗糖浓度的蔗糖溶液中，重组变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶剩余活性的图。

图19是一张显示加热至55℃时，不同蔗糖浓度的蔗糖溶液中，肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶剩余活性的图。

图20是一张显示蔗糖或果糖对蔗糖磷酸化酶稳定性影响的图。

图21是一张显示无机磷酸盐对蔗糖磷酸化酶稳定性影响的图。

图22是一张显示在不同初始蔗糖浓度，50℃的反应温度下，以出芽短梗霉聚糖为引物进行反应时葡聚糖的产率图。

图23是一张显示在不同初始无机磷酸盐浓度，50℃的反应温度下，以出芽短梗霉聚糖为引物进行反应时葡聚糖的产率图。

图24是一张显示以葡糖-1-磷酸为底物时葡聚糖的产率图。

                    最佳实施方式

下文将详细描述本发明。

本发明方法中生产了葡聚糖。本说明书中，“葡聚糖”指组成单位是D-葡萄糖，且含有至少两个经由α-1，4-糖苷键连接的糖单位的糖。葡聚糖可为直链、分枝或环状分子。直链葡聚糖和α-1，4-葡聚糖同义。直链葡聚糖中，糖单位仅经由α-1，4-糖苷键连接。至少包含一个α-1，6-糖苷键的葡聚糖是分枝葡聚糖。优选地葡聚糖包括一定程度的直链部分。无分枝的直链葡聚糖是更为优选的。

一些情况中，具有少量分枝(即α-1，6-糖苷键)的葡聚糖是优选的。这些情况中，分枝数目代表性地是0～10,000，优选0～1000，更优选0～500，更优选0～100，更优选0～50，更优选0～25，更优选0。

本发明的葡聚糖中，α-1，6-糖苷键的数目为1的情况下，α-1，4-糖苷键与α-1，6-糖苷键的数目比例为优选1～10000，更优选10～5000，更优选50～1000，更优选100～500。

α-1，6-糖苷键可以是任意或均一地分布在葡聚糖中。优选地是在葡聚糖中存在至少有5个糖单位长的直链部分。

葡聚糖可以仅由D-葡萄糖组成，或者可以是经过某种程度修饰后未损害葡聚糖属性的衍生物。未修饰的葡聚糖是优选的。

葡聚糖具有的代表性分子量至少为约8×10³，优选至少约1×10⁴，更优选至少约5×10⁴，更优选至少约1×10⁵，更优选至少约6×10⁵。葡聚糖具有的代表性分子量不超过1×10⁸，优选不超过1×10⁷，更优选不超过5×10⁶，更优选不超过1×10⁶。

本领域的技术人员容易理解的是通过适当设定本发明生产方法所采用的底物量、酶量、反应时间等，可获得具有预期分子量的葡聚糖。

<生产葡聚糖的原料>

本发明的生产方法中，主要原料采用的是例如蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸、缓冲剂、蔗糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶和可溶解它们的溶剂。尽管通常是在反应开始时添加所有这些原料，这些原料中仍然有一些是可以在反应期间进一步添加的。本发明的生产方法中，如果必要，可采用选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶和糖原脱支酶的酶。根据预定的葡聚糖结构，可于本发明生产方法开始或期间将选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶和糖原脱支酶的酶添加至反应溶液中。

(1)蔗糖：

蔗糖被表示为C₁₂H₂₂O₁₁，是分子量约为342的二糖。蔗糖存在于任何可进行光合作用的植物中。蔗糖可分离自植物或化学合成。根据成本，蔗糖优选地是从植物中分离。含有大量蔗糖的植物实例包括：甘蔗、甜菜等。甘蔗的汁液中含有约20％的蔗糖。甜菜的汁液中含有约10～15％的蔗糖。蔗糖可作为从含蔗糖的植物汁液到纯化糖的纯化过程中任何一个阶段所获的任何原料被提供。

本发明方法采用的蔗糖优选地是纯的。不过蔗糖可含有任何其它杂质，只要这些杂质不抑制蔗糖在本发明中的效果即可。

溶液中所含的蔗糖浓度代表性地约5％到约100％，优选约8％到约80％，更优选约8％到约50％。应当指出本说明书中，蔗糖浓度是通过重量/体积计算的，即(蔗糖重量)×100/(溶液体积)。

如果蔗糖量过大，未反应的蔗糖可能在反应期间沉淀。如果采用的蔗糖量过小，在高温反应中可能降低产率。

应当指出在上述第一种方法的情况中，即从反应开始到结束，反应溶液中蔗糖-磷酸盐比例的最大值不超过约17，并无必要将蔗糖浓度限定于上述范围。同样，在上述第四种方法的情况中，即反应开始时，反应溶液中蔗糖-磷酸盐比例不超过约17，以及在上述第五种方法的情况中，即包括进一步将蔗糖、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸添加到反应溶液中的步骤，并无必要将蔗糖浓度限定于上述范围。本说明书中，以反应溶液中蔗糖的摩尔浓度除以反应溶液中无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸的总摩尔浓度，所获得比例称作蔗糖-磷酸盐比例。换言之：

蔗糖-磷酸盐比例＝(蔗糖的摩尔浓度)/(无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸的总摩尔浓度)

如果在反应开始时将待反应的所有原料混合，并且在反应期间不再添加任何原料，则反应开始时，蔗糖-磷酸盐比例最高。

(2)引物：

本发明采用的引物指作为启动物质对合成葡聚糖起作用的分子。如果引物含有至少一个可经由α-1，4-糖苷键连接糖单位的自由部分，则其它部分可由除糖以外的组成部分构成。本发明方法中，糖单位经由α-1，4-糖苷键被相继连接到引物上，从而合成了葡聚糖。引物包括任何可通过葡聚糖磷酸化酶添加糖单位的糖。

对本发明中的反应而言，引物可为任何启动物质。例如，可以本发明方法合成的葡聚糖为引物，再次通过本发明方法延伸α-1，4糖苷链。

引物可以是仅包含α-1，4-糖苷键的α-1，4葡聚糖，或者是部分包含α-1，6-糖苷键的α-1，4葡聚糖。本领域技术人员可根据目标葡聚糖容易地选择合适引物。合成直链淀粉的情况中，优选以仅包含α-1，4-糖苷键的α-1，4葡聚糖为引物，因为可以无需采用脱支酶等便合成直链淀粉。

引物实例包括麦芽-低聚糖、直链淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、出芽短梗霉聚糖、偶联糖、淀粉及其衍生物。

本说明书中，麦芽-低聚糖指通过2～10个葡萄糖的脱水-浓缩，并由α-1，4键连接而生成的物质。麦芽-低聚糖优选地含4～10个糖单位，更优选5～10个糖单位，更优选7～10个糖单位。麦芽-低聚糖实例包括麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、麦芽八糖、麦芽九糖、麦芽十糖等。优选地麦芽-低聚糖是麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、或麦芽七糖。麦芽-低聚糖可为单一成分产物或多种麦芽-低聚糖的混合物。优选麦芽-低聚糖混合物是因为其低廉的成本。一种实施方案中，麦芽-低聚糖混合物除了含有聚合度大于或等于麦芽四糖的麦芽-低聚糖以外，还含有麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖中的至少一种。此处“聚合度大于或等于麦芽四糖的麦芽-低聚糖”指聚合度至少为4的麦芽-低聚糖。低聚糖可为直链低聚糖或分枝低聚糖。低聚糖可以在其分子中具有环状部分。本发明中，优选的是直链低聚糖。

直链淀粉是由经α-1，4键连接的葡萄糖单位组成的直链分子。天然生成的淀粉包含直链淀粉。

支链淀粉是由α-1，4键连接的葡萄糖单位组成，并经由α-1，6键连有葡萄糖单位的分枝分子。天然生成的淀粉中包含支链淀粉。就支链淀粉而言，例如可采用100％由支链淀粉组成的蜡质种玉米淀粉。例如可以聚合度至少为约1×10⁵的支链淀粉作为原料。

糖原是葡聚糖的一种类型，由葡萄糖组成，并具有高频分枝。糖原作为耐储多聚糖，以小颗粒的形式广泛分布于动物和植物基本上所有的细胞中。例如糖原存在于玉米种子或植物的相似部位。糖原中代表性地，经由α-1，6键，以大约每三个葡萄糖单位对应一条链的比例，将平均聚合度为12～18的α-1，4键糖链连接到葡萄糖的α-1，4键糖链上。由α-1，6键连接的分枝经由α-1，6键被相似地连接到葡萄糖的α-1，4键糖链上。因此，糖原具有网状结构。

糖原的分子量代表性的约为1×10⁵到约1×10⁸，优选约1×10⁶到约1×10⁷。

出芽短梗霉聚糖是分子量约为100,000到约300,000(如约200,000)的葡聚糖，其中以阶梯方式经由α-1，6键规律地连有麦芽三糖。例如，以淀粉为原料，通过培养出芽短梗霉菌生成出芽短梗霉聚糖。例如出芽短梗霉聚糖可获得自Hayashibara Shoji，Inc.。

偶联糖是一种混合物，其主要成分为蔗糖、葡糖基蔗糖和麦芽糖基蔗糖。例如，通过使巨大芽孢杆菌等生成的环式糊精葡聚糖转移酶作用于蔗糖和淀粉的混合溶液，可制得偶联糖。偶联糖可获得自例如Hayashibara Shoji，Inc.。

淀粉是直链淀粉和支链淀粉的混合物。就淀粉而言，可采用任何通常商业上可提供的淀粉。淀粉所含直链淀粉与支链淀粉的比例变化取决于生成淀粉的植物类型。糯米、蜡质种玉米等植物所包含的淀粉中大部分为支链淀粉。但是，不能从普通植物中获得仅由直链淀粉组成，而不含支链淀粉的淀粉。

淀粉被划分为：天然生成的淀粉、淀粉降解产物和已加工淀粉。

根据其来自的原料，天然生成的淀粉可被划分为块茎淀粉和谷物淀粉。块茎淀粉的实例包括马铃薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉、葛藤淀粉、欧洲蕨淀粉等。谷物淀粉的实例包括玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉等。天然生成的淀粉的一个实例是高直链淀粉(如高直链淀粉玉米淀粉)，作为培育产淀粉植物的结果，其增加的直链淀粉含量可高达50％～70％。天然生成的淀粉的另一个实例是通过对产淀粉植物进行培育而获得的不含直链淀粉的蜡质淀粉。

可溶性淀粉指对天然生成的淀粉进行不同处理而获得的水溶性淀粉。

已加工淀粉是以如水解、酯化、胶凝等方式对天然生成的淀粉进行处理后获得，并被赋予了更易于利用的属性的淀粉。有广泛多种的已加工淀粉是可以利用的，它们具有多种不同组合的属性，如开始胶凝化的温度、淀粉糊的粘度、淀粉糊的透明度、老化稳定性等。有多种不同类型的已加工淀粉。这种淀粉的实例是通过下述步骤获得的淀粉，即在不超过淀粉胶凝化温度的温度下将淀粉颗粒浸入一种酸中，使淀粉分子裂解，但淀粉颗粒并不破碎。

淀粉降解产物是经过诸如酶处理、水解等方式对淀粉进行处理后获得的低聚糖或多聚糖，其分子量低于处理前的分子量。淀粉降解产物的实例包括脱支酶降解淀粉、磷酸化酶降解淀粉和水解作用部分降解淀粉。

脱支酶降解淀粉是通过使脱支酶作用于淀粉而获得的。通过不同程度地改变脱支酶的作用时间，可获得分枝部分(即α-1，6-糖苷键)被裂解为任意大小的脱支酶降解淀粉。脱支酶降解淀粉实例包括含有1～20个α-1，6-糖苷键、由4～10,000个糖单位组成的降解产物，无α-1，6-糖苷键、由3～500个糖单位组成的降解产物，麦芽-低聚糖和直链淀粉。在脱支酶降解淀粉的情况中，根据降解淀粉类型可改变所获降解产物的分子量分配。脱支酶降解淀粉可以是具有不同长度的糖链的混合物。

磷酸化酶降解淀粉是通过使葡聚糖磷酸化酶(也称作磷酸化酶)作用于淀粉而获得的。葡聚糖磷酸化酶将葡萄糖残基从淀粉的非还原终端转移至位于一个接一个的糖单位基础上的其它底物。葡聚糖磷酸化酶不能裂解α-1，6-糖苷键。因此，如果使葡聚糖磷酸化酶作用于淀粉足够长的时间，可获得在α-1，6-糖苷键终止裂解的降解产物。本发明中，磷酸化酶降解淀粉所包含的糖单位数目优选约为10到约100,000，更优选约为50到约50,000，更优选约为100到约10,000。在磷酸化酶降解淀粉的情况中，根据待降解淀粉的类型可改变降解产物的分子量分配。磷酸化酶降解淀粉可以是具有不同长度的糖链的混合物。

通过水解作用部分降解的糊精和淀粉指通过酸、碱、酶等物质作用部分地降解淀粉而获得的降解产物。本发明中，通过水解作用部分降解的糊精和淀粉所包含的糖单位数目优选约为10到约100,000，更优选约50到约50,000，更优选约为100到约10,000。在通过水解作用部分降解的糊精和淀粉的情况中，根据待降解淀粉的类型可改变所获降解产物的分子量分配。通过水解作用部分降解的糊精和淀粉可以是具有不同长度的糖链的混合物。

淀粉优选地选自可溶性淀粉、蜡质淀粉、高直链淀粉、脱支酶降解淀粉、磷酸化酶降解淀粉、水解作用部分降解淀粉、已加工淀粉及其衍生物。

本发明方法中，可以上述不同糖的衍生物为引物。例如可采用上述糖中至少有一个醇式羟基团被羟烷基化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硫酸化、磷酸化等而得的衍生物。进一步地，可采用至少包括两种上述衍生物的混合物作为原料。

(3)无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸：

本说明书中，无机磷酸盐指在SP反应中可提供磷酸盐底物的物质。此处，磷酸盐底物指作为提供葡糖-1-磷酸中磷酸盐部分的原料的物质。在蔗糖磷酸化酶催化的蔗糖磷酸解作用中，无机磷酸盐被认为是以磷酸盐离子的形式起底物的作用。本领域中，这种底物通常被称为无机磷酸盐，所以在本说明书中，该底物被称为无机磷酸盐。无机磷酸盐包括磷酸和磷酸的无机盐。典型地，在含阳离子，如碱金属离子的水中采用无机磷酸盐。该情况中，磷酸、磷酸盐和磷酸盐离子达到平衡，所以难以区分磷酸盐与磷酸。因此，为方便起见，将磷酸和磷酸盐统称为无机磷酸盐。本发明中，无机磷酸盐优选地是磷酸的任何金属盐，更为优选地是磷酸的任何碱金属盐。无机磷酸盐的优选特定实例包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钾、磷酸(H₃PO₄)、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵等。

反应开始时的SP-GP反应体系中，可以仅包含一种类型的无机磷酸盐，或包含大多数类型的无机磷酸盐。

无机磷酸盐可通过，例如将经由物理、化学或酶反应降解而得的浓缩磷酸的降解产物，如多磷酸(如焦磷酸、三磷酸和四磷酸)或其盐添加至反应溶液中而获得。

本说明书中，葡糖-1-磷酸指葡糖-1-磷酸(C₆H₁₃O₉P)和其盐。葡糖-1-磷酸优选地是狭义上的葡糖-1-磷酸(C₆H₁₃O₉P)的任何金属盐，更为优选地是葡糖-1-磷酸(C₆H₁₃O₉P)的任何碱金属盐。葡糖-1-磷酸的优选特定实例包括葡糖-1-磷酸二钠、葡糖-1-磷酸二钾、葡糖-1-磷酸(C₆H₁₃O₉P)等。本说明书中，没有括号化学式的葡糖-1-磷酸代表广义上的葡糖-1-磷酸，即狭义上的葡糖-1-磷酸和其盐。

反应开始时的SP-GP反应体系中，可以仅包含一种类型的葡糖-1-磷酸，或包含大多数类型的葡糖-1-磷酸。

本发明方法中，反应开始时，反应溶液中磷酸盐与葡糖-1-磷酸的比例可为任意比例。

反应溶液中所含的无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸的总摩尔浓度代表性地约为1mM到约1000mM，优选约10mM到约500mM，更优选约20mM到约250mM。调节无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸各自的摩尔浓度，以使从反应开始到结束，反应溶液中蔗糖-磷酸盐比例的最大值代表性地不超过约17，优选至少约0.5，且不超过约15，更优选至少约1，且不超过约10，更优选至少约2，且不超过约7。发明的上述第四种方法的情况中，调节无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸各自的摩尔浓度，以使反应开始时，反应溶液中的蔗糖-磷酸盐比例在上述范围内。发明的上述第五种方法的情况中，调节无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸各自的摩尔浓度，以使在将蔗糖、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸进一步添加至反应溶液的步骤结束时，反应溶液中的蔗糖-磷酸盐比例在上述范围内。如果无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸的量过多，可能降低葡聚糖产率。如果这个量过小，可能花费很长时间才能合成葡聚糖。

可通过下文1.4描述的方法定量SP-GP反应体系的无机磷酸盐含量。SP-GP反应体系的葡糖-1-磷酸可通过下文1.3描述的方法定量。在不采用反应不涉及的含磷光体物质的情况中，可通过原子吸收光谱学测定无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸的总含量。

应当指出在上述第二种方法的情况中，即在约40℃到约70℃的反应温度下进行反应时，上述最大值非必要地不超过约17。

(4)蔗糖磷酸化酶(EC.2.4.1.7)：

本说明书中，“蔗糖磷酸化酶”指任何通过将蔗糖的α-糖基基团转移到磷酸盐基团，从而实现磷酸解作用的酶。通过蔗糖磷酸化酶催化的反应可通过下列公式表示：

蔗糖+无机磷酸盐α-D-葡糖-1-磷酸+D-果糖

自然界的多种生物体中均含有蔗糖磷酸化酶。生成蔗糖磷酸化酶的生物体实例包括但不仅限于：链球菌属细菌(如嗜温链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌和缓症链球菌)、肠系膜状明串珠菌、假单胞菌种、梭菌种、发芽霉菌属、木醋杆菌、土壤杆菌种、Synecococcus sp.、大肠杆菌、李司特菌、青春双岐杆菌、黑曲霉、Monilia sitophila、Sclerotinea escerotiorum、衣藻。

蔗糖磷酸化酶可来源自任何生成蔗糖磷酸化酶的生物体。优选地蔗糖磷酸化酶具有某种程度上的耐热性。单独存在的蔗糖磷酸化酶的耐热性越高，该蔗糖磷酸化酶就更为优选。例如，优选地蔗糖磷酸化酶是指在4％蔗糖存在情况下加热至55℃并持续30分钟时，与加热前的蔗糖磷酸化酶活性相比，仍保留至少50％活性的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶优选地来源自属于链球菌属的细菌，更优选地是来源自变异链球菌、嗜温链球菌、肺炎链球菌或缓症链球菌。

本说明书中，一种酶“来源自”某种生物体不仅意味着直接从生物体分离，还指通过以某种方式利用生物体而获得酶。例如，当将编码了获得自某种生物体的某种酶的基因导入大肠杆菌，并从大肠杆菌中分离该酶时，该酶被称为“来源”自生物体。

本发明采用的蔗糖磷酸化酶可直接分离自上述存在于自然界并产生蔗糖磷酸化酶的生物体。本发明采用的蔗糖磷酸化酶可分离自微生物(如细菌、真菌等)，该微生物是通过利用编码了分离自上述生物体的蔗糖磷酸化酶的基因进行基因重组而获得。

如下可制备本发明方法中采用的蔗糖磷酸化酶。首先，培养产蔗糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌等)。该微生物可以是直接产生蔗糖磷酸化酶的微生物。可选的，克隆编码了蔗糖磷酸化酶的基因，并利用获得的基因，对利于表达蔗糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌等)进行基因重组，以获得重组微生物。从该重组微生物可获得蔗糖磷酸化酶。

通过考虑不同条件，如蔗糖磷酸化酶易表达性、易培养性、生长率、安全性等可容易地选择出可用于利用蔗糖磷酸化酶基因进行基因重组的微生物。优选地蔗糖磷酸化酶不含淀粉酶杂质。因此，优选地是在基因重组中，采用不生成或不表达，或者生成或表达低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)。对蔗糖磷酸化酶的基因重组而言，优选采用的是中温微生物，如大肠杆菌或枯草杆菌。由不生成或不表达、或者生成或表达低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)生成的蔗糖磷酸化酶基本上不含淀粉酶，因而被优选地采用在本发明方法中。

利用克隆基因进行微生物(如细菌、真菌等)的基因重组可通过本领域技术人员所熟知的方法进行。利用克隆基因时，基因被优选地可操作地连接到组成型启动子或诱导型启动子上。“可操作地连接”表明启动子和基因被连接到一起，所以基因的表达受启动子的控制。当采用诱导型启动子时，培养优选地在诱导条件下进行。不同诱导型启动子是本领域技术人员所熟知的。

就克隆基因而言，为了在细菌细胞外分泌已生成的蔗糖磷酸化酶，可将编码了信号肽的基础序列连接到该基因上。编码信号肽的基础序列是本领域技术人员所熟知的。

为生成蔗糖磷酸化酶，本领域技术人员可适当确定培养微生物(如细菌、真菌等)的条件。培养微生物的合适培养基、诱导每种诱导型启动子的合适条件等都是本领域技术人员所熟知的。

培养合适的时间后，从培养物中回收蔗糖磷酸化酶。当生成的蔗糖磷酸化酶是于细菌细胞外分泌时，可通过离心作用除去细菌细胞以获得上清液中的蔗糖磷酸化酶。当细菌细胞内生成的蔗糖磷酸化酶不是于细菌细胞外分泌时，可通过超声处理、机械破坏、化学破坏等方式破坏微生物以获得被破坏的细菌细胞的溶液。

本发明方法中，被破坏的细菌细胞的溶液可以无需纯化而被应用。其后，可通过对被破坏的细菌细胞的溶液进行离心以除去细菌细胞的碎片，从而获得上清液。可通过一种众所周知的方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性作用层析、亲合层析、羟磷灰石层析、和凝集素层析对所获得的上清液进行处理，以回收本发明的酶。如必要可对回收产物进行纯化。

一种优选实施方案中，在蔗糖存在(代表性地为约4％到约30％，优选为约8％到约30％，更优选为约8％到约25％)的情况下，在纯化过程中的任一阶段均可加热蔗糖磷酸化酶。该加热过程中，优选地溶液温度是在该温度下加热溶液30分钟后，与加热前溶液所含蔗糖磷酸化酶的活性相比，蔗糖磷酸化酶仍保留至少50％，更优选至少80％活性。这样的温度优选为约50℃到约80℃，更优选为约55℃到约70℃。例如，在来源自变异链球菌的蔗糖磷酸化酶的情况中，反应温度优选为约50℃到约60℃。进行加热时，通过考虑反应温度可任意确定加热时间，只要不明显减弱蔗糖磷酸化酶活性即可。加热时间代表性地为约10分钟到约90分钟，更优选为约30分钟到约60分钟。

相对于反应开始时溶液中的蔗糖而言，反应开始时，溶液所含蔗糖磷酸化酶量代表性地为约0.05～1,000U/g蔗糖，优选为约0.1～500U/g蔗糖，更优选为约0.5～100U/g蔗糖。蔗糖磷酸化酶量过多时，反应中变性的酶很可能凝集。采用的量过小时，可能降低葡聚糖产率。

蔗糖磷酸化酶可以被纯化，也可以不纯化。可以被固定，也可以不固定。蔗糖磷酸化酶优选地是固定的。就固定方法而言，可采用本领域技术人员所熟知的载体结合方法(如共价结合方法、离子结合方法或物理吸附方法)、交联法、包埋法(网格型或微囊型)等。蔗糖磷酸化酶优选地被固定在载体上。

(5)葡聚糖磷酸化酶(EC.2.4.1.1)：

葡聚糖磷酸化酶是对催化α-1，4-葡聚糖的磷酸解作用的酶的通称，也被称为磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、糖原磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶等。葡聚糖磷酸化酶也催化α-1，4-葡聚糖合成反应，该反应是相对于磷酸解作用的逆反应。其中反应进行的方向取决于底物的量。生物体中，无机磷酸盐的量是丰富的，所以葡聚糖磷酸化酶促使反应以磷酸解作用方向进行。本发明方法中，由于在蔗糖的磷酸解作用中采用的是无机磷酸盐，所以反应溶液中无机磷酸盐的量少，反应以合成α-1，4-葡聚糖的方向进行。

葡聚糖磷酸化酶被认为普遍存在于可储存淀粉或糖原的多种植物、动物和微生物中。

可生成葡聚糖磷酸化酶的植物实例包括：藻类、块茎蔬菜(如马铃薯、甘薯、山药、天南星科植物、木薯等)、蔬菜(如甘蓝、菠菜等)、谷类(如玉蜀黍、稻、小麦、大麦、黑麦、谷子等)、豆类(如豌豆、大豆、赤豆、uzura bean等)等。

可生成葡聚糖磷酸化酶的动物实例包括：哺乳动物(如人类、兔、鼠、猪等)等。

可生成葡聚糖磷酸化酶的微生物实例包括：水生栖热杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、抗辐射奇异球菌、海岸热球菌、蓝色链霉菌、pyrococcushorikoshi、结核分枝杆菌、thermotoga maritima、aquifex aeolicus、甲烷球菌、假单胞铜绿菌、肺炎衣原体、小球藻、根瘤土壤杆菌、巴斯德氏梭状芽孢杆菌、克雷白氏肺炎杆菌、synecococcus sp.、蓝细菌、大肠杆菌、粗糙脉孢菌、啤酒酵母、衣藻等。可生成葡聚糖磷酸化酶的生物体并不局限于这些实例。

本发明采用的葡聚糖磷酸化酶优选地来源自马铃薯、水生栖热杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌，更优选马铃薯。优选地，本发明采用的葡聚糖磷酸化酶具有高的最佳反应温度。例如，具有高的最佳反应温度的葡聚糖磷酸化酶可来源自极端嗜热细菌。

本发明采用的葡聚糖磷酸化酶可直接分离自存在于自然界中，并生成葡聚糖磷酸化酶的上述动物、植物和微生物。

本发明采用的葡聚糖磷酸化酶可分离自微生物(如细菌、真菌等)，该微生物是通过利用编码了分离自动物、植物或微生物的葡聚糖磷酸化酶的基因进行基因重组而获得的。

葡聚糖磷酸化酶可通过与上述蔗糖磷酸化酶相似的方式从重组微生物中获得。

与上述蔗糖磷酸化酶相似，通过考虑不同条件，如葡聚糖磷酸化酶易表达性、易培养性、生长速率、安全性等，可容易地选择出用于基因重组的微生物(如细菌、真菌等)。优选地葡聚糖磷酸化酶不含淀粉酶杂质。因此，优选地是在基因重组中，采用不生成或不表达，或者生成或表达低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)。对聚糖磷酸化酶的基因重组而言，优选采用的是中温微生物，如大肠杆菌或枯草杆菌。由不生成或不表达，或者生成或表达低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)生成的葡聚糖磷酸化酶基本上不含淀粉酶，因而被优选地采用在本发明方法中。

通过基因重组获得的葡聚糖磷酸化酶的生产和纯化可通过与上述蔗糖磷酸化酶相似的方式进行。

相对于反应开始时溶液所含蔗糖而言，反应开始时溶液中所含葡聚糖磷酸化酶量代表性的约为0.05～1,000U/g蔗糖，优选约0.1～500U/g蔗糖，更优选约0.5～100U/g蔗糖。如果葡聚糖磷酸化酶量过多，反应中变性的酶很可能凝集。采用的量过少时，则可能降低葡聚糖产率。

葡聚糖磷酸化酶可以被纯化，也可以不纯化。可以被固定，也可以不固定。葡聚糖磷酸化酶优选地是固定的。就固定方法而言，可采用本领域技术人员所熟知的载体结合方法(如共价结合方法、离子结合方法或物理吸附方法)、交联法、包埋法(网格型或微囊型)等。葡聚糖磷酸化酶优选地是被固定在载体上。葡聚糖磷酸化酶也可被固定在与固定蔗糖磷酸化酶的载体相同的载体上，或其它载体上，优选地是被固定在与固定蔗糖磷酸化酶的载体相同的载体上。

(6)脱支酶

本发明方法中，当产物中产生分枝时，如当采用含α-1，6-糖苷键的起始原料时，如有必要可利用脱支酶。

本发明可采用的脱支酶是可以裂解α-1，6-糖苷键的酶。脱支酶被分为两类，即良好地作用于支链淀粉和糖原的异淀粉酶(EC3.2.1.68)，和作用于支链淀粉、糖原和出芽短梗霉聚糖的α-糊精内-1，6-α-葡萄糖苷酶(也称作支链淀粉酶)(EC 3.2.1.41)。

脱支酶存在于微生物、细菌和植物中。可生成脱支酶的微生物实例包括酿酒酵母和衣藻。可生成脱支酶的细菌实例包括短杆菌、bacillus acidopullulyticus、浸麻类芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、水生栖热杆菌、克雷白氏肺炎杆菌、嗜温高温放线菌、thermoanaerobacter ethanolicus、pseudomonas amyloderamosa等。可生成脱支酶的植物实例包括马铃薯、甘薯、玉蜀黍、稻类、小麦、大麦、燕麦、甜菜等。可生成脱支酶的生物体并不局限于这些实例。

本发明可采用的脱支酶优选地来源自克雷白氏肺炎杆菌、短杆菌、bacillus acidopullulyticus、或pseudomonas amyloderamosa，更为优选地是克雷白氏肺炎杆菌或pseudomonas amyloderamosa。优选地，本发明采用的脱支酶具有高的最佳反应温度。例如，具有高的最佳反应温度的脱支酶可来源自极端嗜热细菌。

本发明可采用的脱支酶可直接分离自存在于自然界中，并生成脱支酶的上述微生物、细菌和植物。

本发明可采用的脱支酶可分离自微生物(如细菌、真菌等)，该微生物是通过利用编码了分离自微生物、细菌和植物的脱支酶的基因进行基因重组而获得的。

脱支酶可以与上述蔗糖磷酸化酶相似的方式从重组微生物中获得。

与上述蔗糖磷酸化酶相似，通过考虑不同条件，如脱支酶易表达性、易培养性、生长速率、安全性等，可轻易地选择出用于基因重组的微生物(如细菌、真菌等)。优选地脱支酶不含淀粉酶杂质。因此，优选地是在基因重组中，采用不生成或不表达，或者生成或表达低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)。对脱支酶的基因重组而言，优选采用的是中温微生物，如大肠杆菌或枯草杆菌。由不生成或不表达，或者生成或表达低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)生成的脱支酶基本上不含淀粉酶，因而被优选地采用在本发明方法中。

通过基因重组获得的脱支酶的生产和纯化可通过与上述蔗糖磷酸化酶相似的方式进行。

相对于反应开始时溶液所含蔗糖而言，反应开始时溶液中所含脱支酶量代表性的为约0.05～1,000U/g蔗糖，优选为约0.1～500U/g蔗糖，更优选为约0.5～100U/g蔗糖。如果脱支酶量过多，在反应中变性的酶很可能凝集。采用的量过少时，则可能降低葡聚糖产率。

脱支酶可以被纯化，也可以不纯化。可以被固定，也可以不固定。脱支酶优选地是固定的。就固定方法而言，可采用本领域技术人员所熟知的载体结合方法(如共价结合方法、离子结合方法或物理吸附方法)、交联法、包埋法(网格型或微囊型)等。脱支酶优选地是被固定在载体上。脱支酶也可被固定在与固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者中至少一个的载体相同的载体上，或另一个载体上，优选地是被固定在与固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的载体相同的载体上。

(7)分支酶(EC.2.4.1.18)：

本发明方法中，当希望在产物中产生分枝时，如必要可利用分支酶。

本发明可采用的分支酶是可将α-1，4-葡聚糖链的一部分转移到α-1，4-葡聚糖链中的葡萄糖残基的第6位，而生成分枝的酶。分支酶也被称为1，4-α-葡聚糖分支酶，分枝产生酶或Q酶。

分支酶存在于微生物、动物和植物中。生成分支酶的微生物实例包括嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草杆菌、热容芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、液化淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、bacillus caldovelox、bacillusthermocatenulatus、bacillus smithii、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、alkalophillic bacillus sp、蓝色链霉菌、aquifex aeolicus、synechosystissp.、大肠杆菌、根瘤土壤杆菌、水生栖热杆菌、rhodothermusobamensis、粗糙脉孢菌、酵母等。生成分支酶的动物实例包括哺乳动物，如人类、兔、鼠、猪等。生成分支酶的植物实例包括藻类、块茎蔬菜(如马铃薯、甘薯、山药、天南星科植物、木薯等)、蔬菜(如菠菜等)、谷类(如玉蜀黍、稻、小麦、大麦、黑麦、粟等)等。生成分支酶的生物体并不局限于这些实例。

本发明可采用的分支酶优选地来源自马铃薯、嗜热脂肪芽孢杆菌或aquifex aeolicus，更优选是嗜热脂肪芽孢杆菌或Aquifex aeolicus。优选地，本发明采用的分支酶具有高的最佳反应温度。例如，具有高的最佳反应温度的分支酶可来源自极端嗜热细菌。

本发明可采用的分支酶可直接分离自存在于自然界中，并生成分支酶的上述微生物、动物和植物。

本发明可采用的分支酶可分离自微生物(如细菌、真菌等)，该微生物是通过利用编码了分离自微生物、动物和植物的分支酶的基因进行基因重组而获得。

分支酶可以与上述蔗糖磷酸化酶相同的方式从重组微生物中获得。

与上述蔗糖磷酸化酶相似，通过考虑不同条件，如分支酶易表达性、易培养性、生长速率、安全性等，可容易地选择出用于基因重组的微生物(如细菌、真菌等)。优选地分支酶不含淀粉酶杂质。因此，优选地是在基因重组中采用不生成或不表达，或者生成或表达低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)。对分支酶的基因重组而言，优选采用的是中温微生物，如大肠杆菌或枯草杆菌。由不生成或不表达，或者生成或表达低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)生成的分支酶基本上不含淀粉酶，因而被优选地采用在本发明方法中。

通过基因重组获得的分支酶的生产和纯化可通过与上述蔗糖磷酸化酶相似的方式进行。

相对于反应开始时溶液中所含蔗糖而言，溶液中所含分支酶量代表性地为约10到约100,000U/g蔗糖，优选为约100到约50,000U/g蔗糖，更优选为约1,000到约10,000U/g蔗糖。如果分支酶量过多，反应中变性的酶很可能凝集。采用的量过少时，则可能降低葡聚糖产率。

分支酶可以被纯化，也可以不纯化。可以被固定，也可以不固定。分支酶优选地是固定的。就固定方法而言，可采用本领域技术人员所熟知的载体结合方法(如共价结合方法、离子结合方法或物理吸附方法)、交联法、包埋法(网格型或微囊型)等。分支酶优选地是被固定在载体上。分支酶也可以被固定在与固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者中至少一个的载体相同的载体上，或另一个载体上，优选地是被固定在与固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的载体相同的载体上。

(8)4-α-葡聚糖转移酶(EC.2.4.1.25)

本发明方法中，当希望在产物中产生环状结构时，如必要可利用4-α-葡聚糖转移酶。

本发明可采用的4-α-葡聚糖转移酶是可催化麦芽-低聚糖的糖转移反应(歧化反应)的酶，该酶也被称为歧化酶、D酶、麦芽糖转葡萄糖基酶、歧化作用酶等。4-α-葡聚糖转移酶是可将糖基基团，或麦芽糖基或麦芽寡基单位从供体分子的非还原末端转移到受体分子的非还原末端。因此，该酶反应导致最初提供的麦芽-低聚糖的聚合程度的歧化作用。当供体分子与受体分子相同时，便发生分子内转移，使得产物中具有环状结构。

4-α-葡聚糖转移酶存在于微生物和植物中。生成4-α-葡聚糖转移酶的微生物实例包括aquifex aeolicus、肺炎链球菌、丁酸梭菌、抗辐射奇异球菌、流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌、海岸热球菌、thermotogamaritima、thermotoga neapolitana、鹦鹉热衣原体、火球菌属、Dictyoglomus thermophilum、伯氏疏螺旋菌、Synechosystis sp.、大肠杆菌、水生栖热杆菌等。生成4-α-葡聚糖转移酶的植物实例包括块茎蔬菜(如马铃薯、甘薯、山药、木薯等)、谷类(如玉蜀黍、稻、小麦等)、豆类(如豌豆、大豆等)等。生成4-α-葡聚糖转移酶的生物体并不局限于这些实例。

本发明可采用的4-α-葡聚糖转移酶优选地来源自马铃薯、水生栖热杆菌或海岸热球菌，更优选马铃薯或水生栖热杆菌。优选地本发明采用的4-α-葡聚糖转移酶具有高的最佳反应温度。例如，具有高的最佳反应温度的4-α-葡聚糖转移酶可来源自极端嗜热细菌。

本发明可采用的4-α-葡聚糖转移酶可直接分离自存在于自然界中，并生成4-α-葡聚糖转移酶的上述微生物和植物。

本发明可采用的分支酶可分离自微生物(如细菌、真菌等)，该微生物是通过利用编码了分离自微生物和植物的4-α-葡聚糖转移酶的基因进行基因重组而获得的。

4-α-葡聚糖转移酶可以与上述蔗糖磷酸化酶相同的方式从重组微生物中获得。

与上述蔗糖磷酸化酶相似，通过考虑不同条件，如4-α-葡聚糖转移酶易表达性、易培养性、生长速率、安全性等，可容易地选择出用于基因重组的微生物(如细菌、真菌等)。优选地4-α-葡聚糖转移酶不含淀粉酶杂质。因此，优选地是在基因重组中采用不生成或不表达，或者生成或表达低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)。对4-α-葡聚糖转移酶的基因重组而言，优选采用的是中温微生物，如大肠杆菌或枯草杆菌。由不生成或不表达，或者生成或表达低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)生成的4-α-葡聚糖转移酶基本上不含淀粉酶，因而被优选地采用在本发明方法中。

通过基因重组获得的4-α-葡聚糖转移酶的生产和纯化可通过与上述蔗糖磷酸化酶相似的方式进行。

相对于反应开始时溶液中所含蔗糖而言，溶液中所含4-α-葡聚糖转移酶量代表性的为约0.05～1,000U/g蔗糖，优选为约0.1～500U/g蔗糖，更优选为约0.5～100U/g蔗糖。如果4-α-葡聚糖转移酶量过多，反应中变性的酶很可能凝集。采用的量过少时，则可能降低葡聚糖产率。

4-α-葡聚糖转移酶可以被纯化，也可以不纯化。可以被固定，也可以不固定。4-α-葡聚糖转移酶优选地是固定的。就固定方法而言，可采用本领域技术人员所熟知的载体结合方法(如共价结合方法、离子结合方法或物理吸附方法)、交联法、包埋法(网格型或微囊型)等。4-α-葡聚糖转移酶优选地是被固定在载体上。4-α-葡聚糖转移酶也可被固定在与固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者中至少一个的载体相同的载体上，或另一个载体上，优选地是被固定在与固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的载体相同的载体上。

(9)糖原脱支酶(EC.2.4.1.25/EC.3.2.1.33)

本发明方法中，当产物中产生环状结构时，如必要可利用糖原脱支酶。

本发明可采用的糖原脱支酶是具有两种类型活性的酶，即α-1，6-葡萄糖苷酶活性和4-α-葡聚糖转移酶活性。由于4-α-葡聚糖转移酶活性是糖原脱支酶所具有的，因此可获得具有环状结构的产物。

糖原脱支酶存在于微生物和动物中。生成糖原脱支酶的微生物实例包括酵母等。生成糖原脱支酶的动物实例包括哺乳动物，如人类、兔、鼠、猪等)。生成糖原脱支酶的生物体并不局限于这些实例。

本发明可采用的糖原脱支酶优选地来源自酵母。优选地本发明采用的糖原脱支酶具有高的最佳反应温度。例如，具有高的最佳反应温度的糖原脱支酶可通过利用蛋白质工程技术对在中温起作用的酶进行修饰而获得。

本发明可采用的糖原脱支酶可直接分离自存在于自然界中，并生成糖原脱支酶的上述微生物和动物。

本发明可采用的糖原脱支酶可分离自微生物(如细菌、真菌等)，该微生物是通过利用编码了分离自微生物和动物的糖原脱支酶的基因进行基因重组而获得的。

糖原脱支酶可以与上述蔗糖磷酸化酶相同的方式从重组微生物中获得。

与上述蔗糖磷酸化酶相似，通过考虑不同条件，如糖原脱支酶易表达性、易培养性、生长速率、安全性等，可容易地选择出用于基因重组的微生物(如细菌、真菌等)。优选地糖原脱支酶不含淀粉酶杂质。因此，优选地是在基因重组中采用不生成或不表达，或者生成或表达低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)。对糖原脱支酶的基因重组而言，优选采用的是中温微生物，如大肠杆菌或枯草杆菌。由不生成或不表达，或者生成或表达低水平淀粉酶的微生物(如细菌、真菌等)生成的糖原脱支酶基本上不含淀粉酶，因而被优选地采用在本发明方法中。

通过基因重组获得的糖原脱支酶的生产和纯化可通过与上述蔗糖磷酸化酶相似的方式进行。

相对于反应开始时溶液中所含蔗糖而言，溶液中所含糖原脱支酶量代表性的为约0.01～5,000U/g蔗糖，优选为约0.1～1,000U/g蔗糖，更优选为约1～500U/g蔗糖。如果糖原脱支酶量过多，反应中变性的酶很可能凝集。采用的量过少时，则可能降低葡聚糖产率。

糖原脱支酶可以被纯化，也可以不纯化。可以被固定，也可以不固定。糖原脱支酶优选地是固定的。就固定方法而言，可采用本领域技术人员所熟知的载体结合方法(如共价结合方法、离子结合方法或物理吸附方法)、交联法、包埋法(网格型或微囊型)等。糖原脱支酶优选地是被固定在载体上。糖原脱支酶也可以被固定在与固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者中至少一个的载体相同的载体上，或另一个载体上，优选地是被固定在与固定蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的载体相同的载体上。

(10)溶剂：

本发明方法中采用的溶剂可以是任何不削弱蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶活性的溶剂。

只要生成葡聚糖的反应可以进行，就没有必要使溶剂完全溶解本发明方法所采用的原料。例如，当由固体载体携带酶时，就没有必要使酶溶解在溶剂中。此外，没有必要溶解所有待反应的原料，一部分原料溶解至某一可使反应进行的程度即可。

代表性的溶剂是水。制备上述蔗糖磷酸化酶或葡聚糖磷酸化酶时，溶剂可为伴随蔗糖磷酸化酶或葡聚糖磷酸化酶而获得的被破坏细胞的溶液中的水。

水可为任何软水、中层水(intermediate water)和硬水。软水指硬度至少为20°的水。中层水指硬度至少为10°，并低于20°的水。硬水指硬度低于10°的水。优选地水是软水或中层水，更为优选地是软水。

(11)其它组分：

含有蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸的溶液可含有任何其它物质，只要这些物质不干扰蔗糖磷酸化酶和蔗糖之间的相互作用，和葡聚糖磷酸化酶和引物之间的相互作用即可。这种物质的实例包括缓冲剂、可生成蔗糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌等)组分、可生成葡聚糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌等)组分、盐类、培养基组分等。

<葡聚糖的生产>

本发明的葡聚糖是通过在含有蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的反应溶液中进行反应的步骤而生产的。

图1用示意图显示本发明所采用的，从蔗糖合成葡聚糖。利用蔗糖磷酸化酶从蔗糖和无机磷酸盐生成葡糖-1-磷酸。生成的葡糖-1-磷酸和添加至反应溶液中的葡糖-1-磷酸被葡聚糖磷酸化酶立即转移到合适的引物上，从而延伸了α-1，4-葡聚糖链。进一步地，该情况中生成的无机磷酸盐被再次循环在蔗糖磷酸化酶反应中。

首先制备反应溶液。例如，可通过将固体蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶添加至合适的溶剂中而制得反应溶液。可选的，通过将分别含有蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的诸多溶液混合而制得反应溶液。可选的，通过将含有蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶其中的一些组分的溶液与其它固体组分混合而制得反应溶液。任何缓冲剂均可随意地被添加至反应溶液中，只要其不因调节pH而抑制酶反应即可。选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶和糖原脱支酶的酶可被随意地添加至反应溶液中。

其后，通过本领域已知的方法任意加热使反应溶液开始反应。只要可获得本发明的效果，反应温度可为任意温度。反应开始时，反应溶液中蔗糖浓度约为5％到约100％时，反应温度可以代表性地约为40℃到约70℃。该反应步骤中溶液温度优选地是在预定反应时间结束后，溶液中所含蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶中的至少一者，更为优选地是二者仍保留反应前活性的至少约50％，更优选至少约80％的温度。该温度优选约为40℃到约70℃，更优选约为45℃到约70℃，还要优选约为45℃到约65℃。

应当指出在上述第一种方法的情况中，即从反应开始到结束，反应溶液中蔗糖-磷酸盐比例的最大值不超过约17时，反应温度应低于上述范围。在上述第四种方法的情况中，即反应开始时，反应溶液中蔗糖-磷酸盐比例不超过约17时，以及在上述第五种方法的情况中，即包括将蔗糖、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸进一步添加至反应溶液的步骤时，反应温度可以低于上述范围。例如，反应可在室温进行，无需加热。

通过考虑反应温度、通过反应生成的葡聚糖的分子量、酶的剩余活性，可任意确定反应时间。反应时间代表性地约为1小时到约100小时，更优选约为1小时到约72小时，更优选约为2小时到约36小时，最为优选约为2小时到约24小时。

加热可通过任何方式进行。优选地，边搅拌边进行加热，以使整个溶液均一传热。将溶液置于例如，包括热水夹套和搅拌设备的不锈钢反应罐中，并进行搅拌。

本发明方法中，当反应进行至某种程度时，可将蔗糖、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶中的至少一种添加至反应溶液。

如此，制得含葡聚糖的溶液。

反应结束后，例如可于100℃任意加热反应溶液10分钟，从而钝化反应溶液中的酶。可选地，可进行其后的步骤，无需使酶钝化的处理。反应溶液可以无需改动地储存，或经过处理以分离生成的葡聚糖。

<纯化方法>

如有必要可对制得的葡聚糖进行纯化。通过纯化除去的杂质的一个实例是果糖。就纯化葡聚糖方法的实例而言，有采用有机溶液的方法(T.J.Schoch et al.，J.American Chemical Society，64，2957(1942))和采用非有机溶液的方法。

采用有机溶剂纯化可采用的有机溶剂实例包括丙酮、正戊醇、五唑、正丙醇、正己醇、2-乙基-1-丁醇、2-乙基-1-己醇、十二醇、环己醇、正丁醇、3-戊醇、4-甲基-2-戊醇、d，1-茨醇、α-萜品醇、异丁醇、2-丁醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、3-戊醇、薄荷醇、甲醇、乙醇和乙醚。

下文将描述采用非有机溶剂的纯化方法实例。

(1)一种于葡聚糖生成反应后，通过冷却反应溶液以沉淀葡聚糖，并通过普通固-液分离方法，如膜分级分离、过滤、离心等方法对沉淀的葡聚糖进行处理，以纯化葡聚糖的方法；

(2)一种于葡聚糖生成反应期间或之后冷却反应溶液以凝胶化葡聚糖，回收凝胶状葡聚糖，并通过水洗涤、冷冻-融化、过滤等方法从凝胶状葡聚糖中除去果糖的方法；及

(3)一种于葡聚糖生成反应后，通过利用超滤膜或层析法进行膜分级分离以除去果糖，并且无需使溶解于水中的葡聚糖沉淀的方法。

可被用于纯化的超滤膜实例包括具有约1,000到约100,000，优选约5,000到约50,000，更优选约10,000到约30,000的分子量截留的超滤膜(由Daicel Chemical Industries Ltd.生产的UF膜单位)。

可被用于层析法的载体实例包括用于凝胶过滤层析法的载体、用于配位体交换层析法的载体、用于离子交换层析法的载体、和用于疏水层析法的载体。

(实施例)

通过下列实施例将更详细地描述本发明。本发明不仅限于下列实施例。

(1.用于测量和计算的方法)

本发明的每种物质均可通过下列测量方法测定。

(1.1葡萄糖的定量)

采用商业可提供的测量试剂盒定量葡萄糖。该测量中，采用了葡萄糖AR-II显色试剂(由Wako Pure Chemical Industires，Ltd.生产)。

(1.2果糖的定量)

采用商业可提供的测量试剂盒定量果糖。该测量中，采用了F-试剂盒D-葡萄糖/D-果糖(由Roche生产)。

(1.3葡糖-1-磷酸的定量)

采用下述方法定量葡糖-1-磷酸。将600μl含有被适当稀释的葡糖-1-磷酸的溶液添加至300μl的测量试剂中(200mM Tris-HCl(pH7.0)、3mM NADP、15mM氯化镁、3mM EDTA、15μM葡萄糖-1，6-二磷酸盐、6μg/ml葡糖磷酸变位酶、6μg/ml葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶)，继而进行搅拌以获得反应体系。将该反应体系于30℃下保持30分钟。其后，利用分光光度计在340nm测量吸光度。以相似方式测量已知浓度的葡糖-1-磷酸钠的吸光度，制得标准曲线。将获得自样品的吸光度对照于标准曲线，以测定出样品的葡糖-1-磷酸浓度。典型地，将每分钟生成1μmol葡糖-1-磷酸的活性定义为一个单位。该定量方法仅可定量葡糖-1-磷酸，而不适用于定量无机磷酸盐。

(1.4无机磷酸盐的定量)

无机磷酸盐是通过下述方法定量的，其中无机磷酸盐被认为是磷酸盐离子。使含有无机磷酸盐的溶液(200μl)与800μl钼试剂(15mM钼酸铵、100mM醋酸锌)混合，并添加200μl 568mM的抗坏血酸维生素C(pH5.0)，继而进行搅拌，获得反应体系。将该反应体系于30℃下保持20分钟。其后，利用分光光度计在850nm测量吸光度。以相似方式测量已知浓度的无机磷酸盐的吸光度，制得标准曲线。将获得自样品的吸光度对照于标准曲线，以测定出样品的无机磷酸盐浓度。该定量方法可定量无机磷酸盐，而不适用于葡糖-1-磷酸。

(1.5计算葡聚糖产量的方法)

以无机磷酸盐为起始物质生产的葡聚糖的产量是从反应结束后溶液中所含蔗糖、果糖和葡糖-1-磷酸的量，并利用下述公式计算而来的。

(葡聚糖(mM葡萄糖当量))＝(果糖(mM))-(葡糖-1-磷酸(mM))-(葡萄糖(mM))

该公式基于下述原理。

本发明方法中，最初可发生下述公式表示的反应(A)。

(A)蔗糖+无机磷酸盐→葡糖-1-磷酸+果糖

该反应由蔗糖磷酸化酶催化。该反应中，蔗糖与无机磷酸盐反应而产生等摩尔量的葡糖-1-磷酸和果糖。产生的果糖不再与其它物质反应。因此，通过测定果糖的摩尔量，可以测定产生的葡糖-1-磷酸的摩尔量。

除上述反应(A)以外，蔗糖磷酸化酶可在作为副反应的下述反应(B)中催化蔗糖的水解。

(B)蔗糖→葡萄糖+果糖

被带入葡聚糖的葡萄糖的量可通过下述公式计算：

(被带入葡聚糖的葡萄糖的量)＝(由反应A生成的葡糖-1-磷酸的量)-(未反应的葡糖-1-磷酸的量)＝(由反应A生成的果糖的量)-(未反应的葡糖-1-磷酸的量)。

考虑反应(B)中产生的果糖，由反应A生成的果糖的量可通过下述公式计算：

(由反应A生成的果糖的量)＝(反应结束后果糖的量)-(反应结束后葡萄糖的量)。

因此，通过下述公式可获得葡聚糖产量。

(葡聚糖(mM葡萄糖当量))＝(果糖(mM))-(葡糖-1-磷酸(mM))-(葡萄糖(mM))

以葡糖-1-磷酸为起始物质生产的葡聚糖的产量是从葡糖-1-磷酸的初始量，及反应结束后溶液中所含葡萄糖、果糖和葡糖-1-磷酸的量，并利用下述公式计算而来的。

(葡聚糖(mM葡萄糖当量))＝(初始葡糖-1-磷酸(mM))+(果糖(mM))-(葡萄糖(mM))-(反应后的葡糖-1-磷酸(mM))

该公式基于下述原理。

反应溶液中，除了初始葡糖-1-磷酸以外，反应A也产生葡糖-1-磷酸。因此，初始葡糖-1-磷酸和生成的葡糖-1-磷酸可用于合成葡聚糖。通过从可合成葡聚糖的葡糖-1-磷酸的量减去反应结束后反应溶液中仍保留的葡糖-1-磷酸的量，可计算出反应中被利用的葡糖-1-磷酸的量，即带入葡聚糖的葡萄糖的量。因此，通过上述公式可获得带入葡聚糖的葡萄糖的量。应当指出，该公式可适用于在SP-GP反应体系中，无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸均被用作起始物质的情况。

(1.6葡聚糖产率)

以无机磷酸盐为起始物质生产的葡聚糖的产率可通过下述公式获得。

(葡聚糖产率(％))＝(葡聚糖(mM葡萄糖当量))/(初始蔗糖(mM))×100

以葡糖-1-磷酸为起始物质生产的葡聚糖的产率可通过下述公式获得。

(葡聚糖产率(％))＝{(初始葡糖-1-磷酸(mM))+(果糖(mM))-(葡萄糖(mM))-(反应后的葡糖-1-磷酸(mM))}/{(初始蔗糖(mM))+(初始葡糖-1-磷酸(mM))}×100

应当指出该公式可适用于在SP-GP反应体系中，无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸均被用作起始物质的情况中。

(1.7葡聚糖磷酸化酶活性的测量)

葡聚糖磷酸化酶的活性单位可通过下述方法测定。

将50μl 4％的成团糊精水溶液与50μl 50mM的葡糖-1-磷酸钠的水溶液混合，并进一步添加100μl经适当稀释的酶液，以开始反应。使混合物于37℃反应15分钟。其后，添加10μl 20％的SDS以终止反应。其后，通过上文1.4所描述的方法检定反应溶液中无机磷酸盐的量。该方法中，每分钟生成1μmol无机磷酸盐的活性被定义为一个单位。在来源自水生栖热杆菌的葡聚糖磷酸化酶的情况中，葡聚糖磷酸化酶的活性是通过在50℃反应而测量的，而不是在37℃。

(1.8蔗糖磷酸化酶活性的测量)

蔗糖磷酸化酶活性可通过下述方法获得。

将25μl 10％的蔗糖溶液与20μl 500mM的磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)混合。将5μl经适当稀释，并已除去不溶性蛋白质的酶液添加至该混合物中，继而进行搅拌以获得反应体系。使该反应体系在37℃反应20分钟。其后，在100℃加热该反应体系5分钟，以终止反应。其后，对反应后溶液中的葡糖-1-磷酸进行定量。典型地，每分钟生成1μmol葡糖-1-磷酸的活性被定义为一个单位。

(2.酶的制备)

本发明实施例中所采用的各种酶是通过下述相应的方法制备而得。

(2.1制备来源自马铃薯块茎的葡聚糖磷酸化酶的方法)

将1.4公斤的商业可应用马铃薯块茎削皮。利用榨汁机磨碎去皮的块茎，以获得汁液。其后，用纱布过滤汁液以获得滤清。在该滤清中添加Tris缓冲溶液(pH7.0)至终浓度为100mM，以获得酶液。将该酶液置于55℃水浴中，液体温度达到50℃后加热10分钟。加热后，利用离心机(AVANTI J-25I；由Beckman生产)在8,500rpm离心该酶液20分钟，以除去不溶性蛋白质等，从而获得上清液。

向所获的上清液中添加硫酸铵至100g/L。将混合物于4℃静置2小时，沉淀蛋白质。其后，利用离心机(AVANTI J-25I；由Beckman生产)在8,500rpm离心该混合物20分钟，以除去不溶性蛋白质等，从而获得上清液。进一步地，向所获得的上清液中添加硫酸铵至终浓度为250g/L。将混合物于4℃静置2小时，沉淀蛋白质。其后，利用离心机(AVANTI J-25I；由Beckman生产)在8,500rpm离心该混合物20分钟，以回收不溶性蛋白质。

将回收的不溶性蛋白质悬浮于150ml 25mM Tris缓冲溶液中(pH7.0)。在相同缓冲溶液中对悬浮酶液透析过夜。透析后，使预平衡过的Q-琼脂糖凝胶阴离子交换树脂(由Pharmacia生产)吸附样品，继而采用含200mM氯化钠的缓冲溶液进行洗涤。其后，采用含400mM氯化钠的缓冲溶液洗脱蛋白质，并回收洗脱液。洗脱液被称为含有马铃薯块茎来源的、被部分纯化的葡聚糖磷酸化酶的溶液。

在一些购买的马铃薯中，本发明可采用的含葡聚糖磷酸化酶的溶液可于该阶段获得，但在大多数情况中，需要进一步地纯化。如有必要，将采用Sephacryl S-200HR(由Pharmacia生产)等的凝胶过滤层析法进行分级分离的方法，和采用Phenyl-TOYOPEARL 650M(由Tosoh Corporation生产)等的疏水层析法进行分级分离的方法结合起来，从而有可能获得纯化的含马铃薯葡聚糖磷酸化酶的溶液。

(2.2制备重组马铃薯葡聚糖磷酸化酶的方法)

将马铃薯葡聚糖磷酸化酶基因(Nakano et al.，Journal ofBiochemistry(Tokyo)106(1989)691)和可选择的标记基因Ampr整合进表达载体pET34(由STRATAGENE生产)，以获得质粒pET-PGP113。该质粒中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导启动子的控制下，可操作地连接葡聚糖磷酸化酶基因。通过适当的细胞方法将该质粒导入大肠杆菌TG-1(由STRATAGENE生产)。将该大肠杆菌覆盖于含有抗生素氨苄青霉素的LB培养基平板(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物(均由Difco生产)，1％氯化钠，1.5％琼脂)上，继而在37℃培养过夜。通过对该平板上生长的大肠杆菌进行选择，可获得具有导入的马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶基因的大肠杆菌。对该导入基因的序列进行的分析证实所获得的大肠杆菌具有葡聚糖磷酸化酶基因。进一步地，测量葡聚糖磷酸化酶的活性，证实所获得的大肠杆菌表达葡聚糖磷酸化酶。

将该大肠杆菌接种至含抗生素氨苄青霉素的一升LB培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物(均由Difco生产)，1％氯化钠)中，继而于37℃，120rpm震荡培养3小时。其后，将IPTG和吡哆醇添加至培养基中，所得浓度分别为0.1mM和1mM，继而进一步于22℃震荡培养20小时。其后，于5,000rpm离心培养物5分钟，以收集大肠杆菌细胞。将所获细胞悬浮在含0.05％ Triton X-100的50ml 20mMTris-HCl缓冲溶液(pH7.0)中。继而通过超声处理破坏，以获得50ml被破坏的细菌细胞的溶液。该被破坏的细菌细胞的溶液含4.7U/mg葡聚糖磷酸化酶。

将该被破坏的细菌细胞的溶液于55℃加热30分钟。加热后，于8,500rpm离心该液体20分钟以除去不可溶蛋白质等，从而获得上清液。将所获上清液通过预平衡过的Q-琼脂糖阴离子交换树脂，使得葡聚糖磷酸化酶可被吸附在树脂上。采用含200mM氯化钠的缓冲溶液洗涤树脂，以除去杂质。其后，采用含300mM氯化钠的缓冲溶液洗脱蛋白质。所获洗脱物被称为重组葡聚糖磷酸化酶溶液。

(2.3制备水生栖热杆菌葡聚糖磷酸化酶的方法)

通过Takaha等人的方法(J.Appl.Glycosci.，48(1)(2001)71)制备的酶被称为水生栖热杆菌葡聚糖磷酸化酶。

(2.4制备重组水生栖热杆菌葡聚糖磷酸化酶的方法)

将水生栖热杆菌葡聚糖磷酸化酶基因(J.Appl.Glycosci.，48(1)(2001)71)和可选择的标记基因Ampr和Tetr整合进pKK388-1(由CLONTECH生产)，以获得质粒pKK388-GP。该质粒中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导启动子的控制下，可操作地连接葡聚糖磷酸化酶基因。通过适当的细胞方法将该质粒导入大肠杆菌MC1061(由Pharmacia生产)。将该大肠杆菌覆盖于含抗生素氨苄青霉素和IPTG的LB培养基平板上，继而在37℃培养过夜。通过对该平板上生长的大肠杆菌进行选择，可获得具有导入的葡聚糖磷酸化酶基因的大肠杆菌。对该导入基因的序列进行的分析证实所获得的大肠杆菌具有葡聚糖磷酸化酶基因。进一步地，测量葡聚糖磷酸化酶的活性，证实所获得的大肠杆菌表达葡聚糖磷酸化酶。

将该大肠杆菌接种至含抗生素氨苄青霉素的一升LB培养基中，继而于37℃，120rpm震荡培养4-5小时。其后，将IPTG添加至培养基中，所得浓度为0.01mM，继而进一步于37℃震荡培养20小时。其后，于5,000rpm离心培养物5分钟，以收集大肠杆菌细胞。

将所获细胞悬浮在50ml 20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.0)中，继而通过超声处理破坏，以获得50ml被破坏的细菌细胞的溶液。该被破坏的细菌细胞的溶液含4.2U/mg葡聚糖磷酸化酶。

其后，将该被破坏的细菌细胞的液体于70℃加热30分钟。加热后，利用离心机(AVANTI J-25I；由Beckman生产)于8,500rpm离心该液体20分钟以除去不可溶蛋白质等，从而获得上清液。所获上清液被称为重组水生栖热杆菌葡聚糖磷酸化酶溶液。

(2.5制备重组变异链球菌蔗糖磷酸化酶的方法)

将变异链球菌蔗糖磷酸化酶基因(Ferretti，J.J.et al.，Ingbritt.Infect.Immun.56：1585-88)和可选择的标记基因Ampr和Tetr整合进pKK388-1，以获得质粒pKK388-SMSP。该质粒中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导启动子的控制下，可操作地连接蔗糖磷酸化酶基因。通过适当的细胞方法将该质粒导入大肠杆菌TG-1(由STRATAGENE生产)。将该大肠杆菌覆盖于含抗生素氨苄青霉素和IPTG的LB培养基平板上，继而在37℃培养过夜。通过对该平板上生长的大肠杆菌进行选择，可获得具有导入的蔗糖磷酸化酶基因的大肠杆菌。对该导入基因的序列进行的分析证实所获得的大肠杆菌具有蔗糖磷酸化酶基因。进一步地，测量蔗糖磷酸化酶的活性，证实所获得的大肠杆菌表达蔗糖磷酸化酶。

将该大肠杆菌接种至含抗生素氨苄青霉素和四环素的一升LB培养基中，继而于37℃，120rpm震荡培养6-7小时。其后，将IPTG添加至培养基中，所得浓度为0.04mM，继而进一步于30℃震荡培养18小时。其后，于5,000rpm离心培养物5分钟，以收集大肠杆菌细胞。将所获细胞悬浮在50ml 20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.0)中，继而通过超声处理破坏，以获得50ml被破坏的细菌细胞的溶液。该被破坏的细菌细胞的溶液含10U/mg蔗糖磷酸化酶。

其后，将蔗糖添加至该被破坏的细菌细胞的溶液中，以获得含10％蔗糖的被破坏的细菌细胞的溶液。将该被破坏的细菌细胞的溶液于55℃加热30分钟。加热后，利用离心机(AVANTI J-25I；由Beckman生产)于8,500rpm离心该被破坏的细菌细胞的溶液20分钟，以除去不可溶蛋白质等，从而获得上清液。所获上清液被称为重组水生栖热杆菌葡聚糖磷酸化酶溶液。将所获上清液通过预平衡过的Q-琼脂糖阴离子交换树脂，使得蔗糖磷酸化酶可被吸附在树脂上。采用含100mM氯化钠的缓冲溶液洗涤树脂，以除去杂质。其后，采用含300mM氯化钠的缓冲溶液洗脱蛋白质。所获洗脱物被称为变异链球菌蔗糖磷酸化酶溶液。

(2.6制备重组嗜热脂肪芽孢杆菌葡聚糖磷酸化酶)

通过Takata等人的方法(J.Ferment.Bioeng.，85(2)，156(1998))制备的酶被称为重组嗜热脂肪芽孢杆菌葡聚糖磷酸化酶。

(3.测量葡聚糖的分子量)

通过下述方法测量本发明中合成的葡聚糖的分子量。

将本发明合成的葡聚糖完全溶解在1N氢氧化钠中，继而采用合适量的盐酸中和。其后，使约300μg葡聚糖经过凝胶过滤层析法，和差示折光计与多角度光散射检测器，以获得平均分子量。

特定地，以Shodex SB806M-HQ(由Showa Denko K.K.生产)为柱。就检测器而言，采用多角度光散射检测器(DAWN-DSP，由WyattTechnology生产)和差示折光计(Shodex RI-71，由Showa Denko K.K.生产)，并以此次序连接。将柱保持在40℃，并以0.1M亚硝酸钠溶液为洗脱液，流速为1mL/分钟。收集所获得的信号，并通过数据分析软件分析，以计算平均分子量。

(比较实施例0-1和0-2：反应温度分别为37℃和45℃时，产率之间的比较)

比较实施例0-1和0-2中采用的反应溶液，在反应开始时，反应溶液组成如下表1所示。

表1

	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例0-1	4	2	20	10	10	37℃
比较实施例0-2	4	2	20	10	10	45℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，将蔗糖、无机磷酸盐、肠系膜状明串珠菌蔗糖磷酸化酶(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)、上文2.1中制备的马铃薯块茎来源的葡聚糖磷酸化酶、麦芽七糖溶解在100mM柠檬酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，结果获得含4％蔗糖、20mM无机磷酸盐、10U/g蔗糖的肠系膜状明串珠菌蔗糖磷酸化酶、10U/g蔗糖的马铃薯块茎来源的葡聚糖磷酸化酶、和2mM麦芽七糖的溶液。使该溶液在37℃(比较实施例0-1)或45℃(比较实施例0-2)反应18小时，从而合成直链淀粉。反应体积为1ml。

反应后，以上文1.6中描述的方式测定合成的直链淀粉的产率。结果如图2所示。

本说明书中，利用肠系膜状明串珠菌蔗糖磷酸化酶(购自OrientalYeast Co.，Ltd.)、马铃薯块茎来源葡聚糖磷酸化酶，和4％蔗糖于37℃生产直链淀粉的方法被称为常规方法。

如图2所示，尽管在37℃进行反应时直链淀粉产率为79％，在45℃进行反应时直链淀粉产率却低到33.8％。

因此，常规方法的底物浓度在工业上不利于高温下直链淀粉的生产。采用的肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶的最佳温度为约37℃。因此，该酶被认为具有低水平的耐热性。高温时直链淀粉的低产率被认为应归因于酶的低耐热性。

(实施例1-1到1-5和比较实施例1-1：采用不同蔗糖浓度和高的反应温度合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表2所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表2

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例1-1	4	2	20	10	10	45℃
实施例1-1	8	4	40	10	10	45℃
							实施例1-2	10	5	50	10	10	45℃
实施例1-3	15	7.5	75	10	10	45℃
							实施例1-4	20	10	100	10	10	45℃
实施例1-5	25	12.5	125	10	10	45℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图3所示。

蔗糖浓度从常规方法所采用的4％(比较实施例1-1)增加到至少8％(实施例1-1到1-5)，使得在45℃实现反应是可能的。因此，直链淀粉的产率增加了。

特定地，在上述条件下，不改变底物(即蔗糖、麦芽七糖和无机磷酸盐)之间的比例和酶量，而蔗糖浓度在8％和25％之间变化，以使直链淀粉产率增加。如图3所示，在45℃，蔗糖浓度为8％时，产率为76.4％。这一产率是在45℃、蔗糖浓度为4％时所得产率的至少两倍，以致获得了基本上与常规方法所得相同的产率。当蔗糖浓度至少为15％时，直链淀粉产率基本上为100％。因此在45℃，从蔗糖合成直链淀粉的情况中，低的蔗糖浓度导致低的产率和低效率，而较高的蔗糖浓度可使工业生产在45℃进行。

(实施例2-1到2-5和比较实施例2-1到2-7：采用少量的酶合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表3所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表3

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例2-1	4	2	20	5	5	37℃
比较实施例2-2	8	4	40	5	5	37℃
							比较实施例2-3	10	5	50	5	5	37℃
比较实施例2-4	15	7.5	75	5	5	37℃
							比较实施例2-5	20	10	100	5	5	37℃
比较实施例2-6	25	12.5	125	5	5	37℃
							比较实施例2-7	4	2	20	5	5	45℃
实施例2-1	8	4	40	5	5	45℃
							实施例2-2	10	5	50	5	5	45℃
实施例2-3	15	7.5	75	5	5	45℃
							实施例2-4	20	10	100	5	5	45℃
实施例2-5	25	12.5	125	5	5	45℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，在实施例2-1到2-5和比较实施例2-1到2-7中，酶量是比较实施例1-1和实施例1-1到1-5中酶量的一半，并且反应在37℃和45℃进行。除此而外，以与比较实施例1-1和实施例1-1到1-5相同的方式进行每例直链淀粉的合成。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图4所示。

当蔗糖浓度至少为15％时，45℃反应所得直链淀粉产率不低于37℃反应所得直链淀粉产率。

如图4所示，在这些条件下，尽管常规方法所得直链淀粉的产率约为60％，而蔗糖浓度为4％，反应温度为45℃时，产率却低至22.1％。然而不改变底物(即蔗糖、麦芽七糖和无机磷酸盐)之间的比例和酶量，而蔗糖浓度在8％和25％之间变化时，45℃反应所得直链淀粉产率是增加的。在蔗糖浓度至少为15％，反应温度为45℃的反应情况中，直链淀粉的产率高于37℃时所得产率。因此，当反应在蔗糖浓度至少为15％的条件下进行时，不仅可使反应在45℃进行，也可实现比37℃反应所得产率高的产率。

(实施例3-1-1到3-2-5和比较实施例3-1-1和3-2-1：采用耐热蔗糖磷酸化酶合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表4所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表4

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例3-1-1	4	2	20	10	10	45℃
实施例3-1-1	8	4	40	10	10	45℃
							实施例3-1-2	10	5	50	10	10	45℃
实施例3-1-3	15	7.5	75	10	10	45℃
							实施例3-1-4	20	10	100	10	10	45℃
实施例3-1-5	25	12.5	125	10	10	45℃
							比较实施例3-2-1	4	2	20	10	10	50℃

实施例3-2-1	8	4	40	10	10	50℃
							实施例3-2-2	10	5	50	10	10	50℃
实施例3-2-3	15	7.5	75	10	10	50℃
							实施例3-2-4	20	10	100	10	10	50℃
实施例3-2-5	25	12.5	125	10	10	50℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，采用根据上文2.5的内容所得10U/g蔗糖(活性单位)的变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶替代肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶，采用10U/g蔗糖(活性单位)的葡聚糖磷酸化酶，在45℃或50℃进行酶反应。除此而外，以与比较实施例2-1和实施例2-1到2-5相同的方式进行比较实施例3-1-1和3-2-1和实施例3-1-1到3-2-5中直链淀粉的合成。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图5所示。

即使蔗糖磷酸化酶从常规方法所采用的肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶改变为变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶时，反应温度为45℃时仍可生成直链淀粉。

进一步地，当蔗糖磷酸化酶从常规方法所采用的肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶改变为变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶，并且蔗糖浓度从4％增加到至少8％时，50℃下高效的反应是可能的，从而增加直链淀粉的产率。

如图5所示，当反应温度为45℃，蔗糖浓度为4％时，直链淀粉产率为97.4％。进一步地，即使不改变底物之间的比例和酶量，并且蔗糖浓度在8％和25％之间变化时，直链淀粉的产率始终处于较高的水平上。因此，当蔗糖磷酸化酶为变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶时，在45℃进行高效的直链淀粉生产是可能的。

进一步地，如图5所示，当反应温度为50℃，蔗糖浓度为4％时，直链淀粉的产率低至21.8％。然而，当不改变底物之间的比例和酶量，并且蔗糖浓度在8％和25％之间变化时，直链淀粉的产率是增加的。蔗糖浓度为8％时，产率为55.4％，该产率是蔗糖浓度为4％时所得产率的至少两倍。当蔗糖浓度为至少15％时，直链淀粉产率基本上为100％。因此，尽管蔗糖浓度为4％，且反应温度为50℃时，合成直链淀粉的产率低且无效，但是通过利用变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶，并增加蔗糖浓度，仍可能在50℃进行高效的直链淀粉生产。

(实施例4-1-1到4-2-5，和比较实施例4-1-1和4-2-1：采用少量酶和耐热蔗糖磷酸化酶合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表5所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表5

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例4-1-1	4	2	20	5	5	45℃
实施例4-1-1	8	4	40	5	5	45℃
							实施例4-1-2	10	5	50	5	5	45℃
实施例4-1-3	15	7.5	75	5	5	45℃
							实施例4-1-4	20	10	100	5	5	45℃
实施例4-1-5	25	12.5	125	5	5	45℃
							比较实施例4-2-1	4	2	20	5	5	50℃
实施例4-2-1	8	4	40	5	5	50℃
							实施例4-2-2	10	5	50	5	5	50℃
实施例4-2-3	15	7.5	75	5	5	50℃
							实施例4-2-4	20	10	100	5	5	50℃
实施例4-2-5	25	12.5	125	5	5	50℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，酶量是比较实施例3-1-1和实施例3-2-1及实施例3-1-1到3-2-5中酶量的一半。除此而外，以与比较实施例3-1-1和3-2-1及实施例3-1-1到3-2-5相同的方式进行直链淀粉的合成。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图6所示。

当蔗糖磷酸化酶从常规方法所采用的肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶改变为变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶，并且酶量是常规方法中酶量的一半时，在50℃反应所得直链淀粉的产率不低于在45℃反应，且蔗糖浓度至少为15％时所得直链淀粉的产率。

如图6所示，尽管在45℃，蔗糖浓度为4％时所得直链淀粉产率约为50％，但是在50℃，蔗糖浓度为4％时所得直链淀粉产率却低至9.2％。然而，不改变底物之间的比例和酶量，并且蔗糖浓度在8％和25％之间变化时，在50℃进行反应所获得直链淀粉的产率是增加的。当蔗糖浓度至少为15％时，在50℃反应所得直链淀粉产率高于在45℃反应所得产率。如此，当采用变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶，并且蔗糖浓度至少为15％时，不仅可使反应在50℃进行，还可实现比在45℃反应所得产率高的产率。

(实施例5-1到5-5和比较实施例5-1：采用肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶和极端嗜热细菌来源的葡聚糖磷酸化酶合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表6所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表6

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例5-1	4	2	20	10	10	45℃
实施例5-1	8	4	40	10	10	45℃
							实施例5-2	10	5	50	10	10	45℃

实施例5-3	15	7.5	75	10	10	45℃
							实施例5-4	20	10	100	10	10	45℃
实施例5-5	25	12.5	125	10	10	45℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，采用水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶取代马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶。除此而外，以与比较实施例1-1和实施例1-1到1-5相同的方式进行直链淀粉的合成。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图7所示。

当采用水生栖热杆菌来源的蔗糖磷酸化酶，且蔗糖浓度从常规方法中的4％增加到至少8％时，反应可以在45℃进行，以致直链淀粉的产率是增加的。

特定地，在上述条件下，不改变底物之间的比例和酶量，并且蔗糖浓度在8％和25％之间变化时，直链淀粉的产率是增加的。如图7所示，尽管当蔗糖浓度为4％，反应温度为45℃时，产率为28.0％，但蔗糖浓度为8％时，产率为69.0％。进一步地，当蔗糖浓度至少为15％时，直链淀粉产率基本上为100％。因此，证实当采用水生栖热杆菌(极端嗜热细菌)来源的葡聚糖磷酸化酶取代马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶时，直链淀粉可在45℃生成。

(实施例6-1到6-5和比较实施例6-1到6-7：采用肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶和极端嗜热细菌来源的葡聚糖磷酸化酶，及少量的酶合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表7所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表7

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例6-1	4	2	20	5	5	37℃
比较实施例6-2	8	4	40	5	5	37℃
							比较实施例6-3	10	5	50	5	5	37℃
比较实施例6-4	15	7.5	75	5	5	37℃
							比较实施例6-5	20	10	100	5	5	37℃
比较实施例6-6	25	12.5	125	5	5	37℃
							比较实施例6-7	4	2	20	5	5	45℃
实施例6-1	8	4	40	5	5	45℃
							实施例6-2	10	5	50	5	5	45℃
实施例6-3	15	7.5	75	5	5	45℃
							实施例6-4	20	10	100	5	5	45℃
实施例6-5	25	12.5	125	5	5	45℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，在实施例6-1到6-5和比较实施例6-1到6-7中，酶量为实施例5-1到5-5和比较实施例5-1中酶量的一半，并且反应在37℃和45℃进行。除此而外，以与实施例5-1到5-5和比较实施例5-1相同的方式进行直链淀粉的合成。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图8所示。

当采用水生栖热杆菌来源的蔗糖磷酸化酶，且蔗糖浓度至少为15％，反应温度为45℃时，所得直链淀粉产率高于在37℃反应所得产率。

如图8所示，在这些条件下，尽管对常规方法而言，直链淀粉产率为34.2％，但是蔗糖浓度为4％，且反应温度为45℃时，产率却低至15.6％。然而，不改变底物之间的比例和酶量，并且蔗糖浓度在8％和25％之间变化，反应温度为45℃时，直链淀粉的产率是增加的。当蔗糖浓度至少为15％，且反应温度为45℃时，反应所得直链淀粉产率高于在37℃反应所得产率。因此，当采用水生栖热杆菌(极端嗜热细菌)来源的葡聚糖磷酸化酶取代马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶，且蔗糖浓度至少为15％时进行反应，不仅可使反应在45℃进行，还可实现比在37℃反应所得产率高的产率。

(实施例7-1到7-5和比较实施例7-1：采用变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶和极端嗜热细菌来源的葡聚糖磷酸化酶合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表8所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表8

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例7-1	4	2	20	10	10	50℃
实施例7-1	8	4	40	10	10	50℃
							实施例7-2	10	5	50	10	10	50℃
实施例7-3	15	7.5	75	10	10	50℃
							实施例7-4	20	10	100	10	10	50℃
实施例7-5	25	12.5	125	10	10	50℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，采用根据上文2.4内容所获得的水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶取代马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶。除此而外，在比较实施例7-1和实施例7-1到7-5中，以与比较实施例3-2-1和实施例3-2-1到3-2-5相同的方式进行直链淀粉的合成。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图9所示。

当蔗糖磷酸化酶从常规方法所采用的肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶改变为变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶，而马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶改变为水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶，并且蔗糖浓度从4％增加到至少8％时，反应可在50℃进行，并且直链淀粉产率是增加的。

特定地，在上述条件下，不改变底物之间的比例和酶量，并且蔗糖浓度在8％和25％之间变化时，直链淀粉产率是增加的。如图9所示，尽管蔗糖浓度为4％，反应温度为50℃时，产率为56.2％，但是蔗糖浓度为8％，反应温度为50℃时，产率为78.4％，蔗糖浓度为15％时，产率基本上为100％。因此，当蔗糖磷酸化酶改变为变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶，而葡聚糖磷酸化酶改变为水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶时，直链淀粉的生产是可能在50℃进行的。

(实施例8-1-1到8-2-5及比较实施例8-1-1和8-2-1：采用变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶和极端嗜热细菌来源的葡聚糖磷酸化酶，以及少量的酶合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表9所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表9

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例8-1-1	4	2	20	5	5	45℃
实施例8-1-1	8	4	40	5	5	45℃
							实施例8-1-2	10	5	50	5	5	45℃
实施例8-1-3	15	7.5	75	5	5	45℃
							实施例8-1-4	20	10	100	5	5	45℃
实施例8-1-5	25	12.5	125	5	5	45℃
							比较实施例4-2-1	4	2	20	5	5	50℃
实施例8-2-1	8	4	40	5	5	50℃

实施例8-2-2	10	5	50	5	5	50℃
							实施例8-2-3	15	7.5	75	5	5	50℃
实施例8-2-4	20	10	100	5	5	50℃
							实施例8-2-5	25	12.5	125	5	5	50℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，酶量是比较实施例7-1和实施例7-1到7-5中酶量的一半，并且反应温度为45℃和50℃。除此而外，以与比较实施例7-1和实施例7-1到7-5相同的方式进行直链淀粉的合成。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图10所示。

当蔗糖磷酸化酶从常规方法所采用的肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶改变为变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶，而马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶改变为水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶，并且酶量为常规方法中所采用酶量的一半，蔗糖浓度至少为15％，在50℃反应所得直链淀粉产率高于在45℃反应所得产率。

如图10所示，尽管蔗糖浓度为4％，反应温度为45℃时，产率为48.9％，但是蔗糖浓度为4％，反应温度为50℃时，产率却低至21.5％。然而，不改变底物之间的比例和酶量，并且蔗糖浓度在8％和25％之间变化时，在50℃反应所得直链淀粉产率是增加的。当蔗糖浓度至少为15％时，在50℃反应所得直链淀粉产率高于在45℃反应所得产率。因此，当采用变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶和水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶，蔗糖浓度至少为15％时进行反应，不仅可使反应在50℃进行，还可实现比在45℃反应所得产率高的产率。

(实施例9-1到9-5和比较实施例9-1：采用肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶和嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表10所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表10

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例9-1	4	2	20	10	10	45℃
实施例9-1	8	4	40	10	10	45℃
							实施例9-2	10	5	50	10	10	45℃
实施例9-3	15	7.5	75	10	10	45℃
							实施例9-4	20	10	100	10	10	45℃
实施例9-5	25	12.5	125	10	10	45℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，采用嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶取代水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶。除此而外，以与比较实施例5-1和实施例5-1到5-5相同的方式进行直链淀粉的合成。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图11所示。

当采用嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶，且蔗糖浓度从常规方法所采用的4％增加到至少8％时，反应可以在45℃进行，并且直链淀粉产率是增加的。

特定地，在上述条件下，不改变底物之间的比例和酶量，并且蔗糖浓度在8％和25％之间变化时，直链淀粉产率是增加的。如图11所示，尽管蔗糖浓度为4％，反应温度为45℃时，产率为40.7％，但是蔗糖浓度为8％，反应温度为45℃时，产率却为70.6％。进一步地，当蔗糖浓度至少为15％时，直链淀粉产率约为90％。如此证实当采用嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶取代马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶时，直链淀粉合成可以在45℃进行。

(实施例10-1到10-5和比较实施例10-1到10-7：采用肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶和嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶，以及少量的酶合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表11所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表11

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例10-1	4	2	20	5	5	37℃
比较实施例10-2	8	4	40	5	5	37℃
							比较实施例10-3	10	5	50	5	5	37℃
比较实施例10-4	15	7.5	75	5	5	37℃
							比较实施例10-5	20	10	100	5	5	37℃
比较实施例10-6	25	12.5	125	5	5	37℃
							比较实施例10-7	4	2	20	5	5	45℃
实施例10-1	8	4	40	5	5	45℃
							实施例10-2	10	5	50	5	5	45℃
实施例10-3	15	7.5	75	5	5	45℃
							实施例10-4	20	10	100	5	5	45℃
实施例10-5	25	12.5	125	5	5	45℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，在实施例10-1到10-5和比较实施例10-1到10-7中，酶量为比较实施例9-1和实施例9-1到9-5中酶量的一半，在反应温度为37℃和45℃进行反应。除此而外，以与比较实施例9-1和实施例9-1到9-5相同的方式进行直链淀粉的合成。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图12所示。

当采用嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶，且蔗糖浓度至少为15％时，在45℃反应所得直链淀粉产率不低于在37℃反应所得产率。

如图12所示，在这些条件下，尽管对常规方法而言，直链淀粉产率为60.2％，但是蔗糖浓度为4％，反应温度为45℃时，产率却低至22.1％。然而，不改变底物之间的比例和酶量，并且蔗糖浓度在8％和25％之间变化时，在45℃反应所得直链淀粉产率是增加的。当蔗糖浓度至少为15％时，在45℃反应所得直链淀粉产率高于在37℃反应所得产率。因此，当采用嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶取代马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶，且蔗糖浓度至少为15％时，不仅可以在45℃进行反应，还可实现比在37℃反应所得产率高的产率。

(实施例11-1到11-5和比较实施例11-1：采用变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶和嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表12所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表12

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例11-1	4	2	20	10	10	50℃
实施例11-1	8	4	40	10	10	50℃
							实施例11-2	10	5	50	10	10	50℃
实施例11-3	15	7.5	75	10	10	50℃
							实施例11-4	20	10	100	10	10	50℃
实施例11-5	25	12.5	125	10	10	50℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，采用根据上文2.5中内容获得的变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶取代肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶，在50□进行酶反应。除此而外，在比较实施例11-1和实施例11-1到11-5中，以与比较实施例9-1和实施例9-1到9-5相同的方式进行直链淀粉的合成。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图13所示。

当蔗糖磷酸化酶从常规方法所采用的肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶改变为变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶，且马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶改变为嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶，且蔗糖浓度从4％增加到至少8％，在50℃进行反应时，直链淀粉产率是增加的。

特定地，在上述条件下，不改变底物之间的比例和酶量，并且蔗糖浓度在8％和25％之间变化时，直链淀粉产率是增加的。如图13所示，尽管蔗糖浓度为4％，反应温度为50℃时，产率为39.1％，但是蔗糖浓度为8％，反应温度为50℃时，产率却为70.4％，并且蔗糖浓度为15％时，直链淀粉产率至少为90％。因此，当以变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶为蔗糖磷酸化酶，以嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶为葡聚糖磷酸化酶时，在50℃进行直链淀粉的生产是可能的。

(实施例12-1-1到12-2-5和比较实施例12-1-1和12-2-1：采用变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶和嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶，以及少量的酶合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表13所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表13

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例12-1-1	4	2	20	5	5	45℃
实施例12-1-1	8	4	40	5	5	45℃
							实施例12-1-2	10	5	50	5	5	45℃
实施例12-1-3	15	7.5	75	5	5	45℃
							实施例12-1-4	20	10	100	5	5	45℃
实施例12-1-5	25	12.5	125	5	5	45℃
							比较实施例12-2-1	4	2	20	5	5	50℃
实施例12-2-1	8	4	40	5	5	50℃
							实施例12-2-2	10	5	50	5	5	50℃
实施例12-2-3	15	7.5	75	5	5	50℃
							实施例12-2-4	20	10	100	5	5	50℃
实施例12-2-5	25	12.5	125	5	5	50℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，酶量是比较实施例11-1和实施例11-1到11-5中酶量的一半，反应温度为45℃和50℃。除此而外，以与比较实施例11-1和实施例11-1到11-5相同的方式进行直链淀粉的合成。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图14所示。

当蔗糖磷酸化酶从常规方法所采用的肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶改变为变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶，马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶改变为嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶，且酶量为常规方法所采用酶量的一半，蔗糖浓度至少为15％，在50℃反应时直链淀粉产率高于在45℃反应所得产率。

如图14所示，尽管蔗糖浓度为4％，反应温度为45℃时，直链淀粉产率为32.9％，但蔗糖浓度为4％，反应温度为50℃时，产率低至19.6％。然而，不改变底物之间的比例和酶量，并且蔗糖浓度在8％和25％之间变化时，在50℃反应所得直链淀粉产率是增加的。蔗糖浓度至少为15％时，在50℃反应所得直链淀粉产率高于在45℃反应所得产率。因此，当采用变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶和嗜热脂肪芽孢杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶，蔗糖浓度至少为15％时进行反应，不仅可使反应在50℃进行，还可实现比在45℃反应所得产率高的产率。

(实施例13：高温条件下合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表14所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表14

编号	蔗糖(％)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例13-1	4	2	20	50	50	65℃
实施例13-1	50	25	250	50	50	65℃
							比较实施例13-2	4	2	20	50	50	65℃
实施例13-2	50	25	250	50	50	65℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶(比较实施例13-1和实施例13-1)

水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶(比较实施例13-2和实施例13-2)

特定地，酶量是比较实施例3-1-1中酶量的五倍，且反应温度为65℃。除此而外，在比较实施例13-1中，以与比较实施例3-1-1相同的方式进行直链淀粉的合成。在实施例13-1中，不改变比较实施例3-1-1中的底物之间比例和酶量，且蔗糖浓度增加到50％时，进行直链淀粉合成。进一步地，在比较实施例13-2和实施例13-2中，采用根据上文2.4内容制备的水生栖热杆菌来源的葡聚糖磷酸化酶进行直链淀粉合成，以取代在比较实施例13-1和实施例13-1中采用的马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图15所示。

在常规方法中，不管采用何种葡聚糖磷酸化酶，在65℃反应均不能合成直链淀粉。当蔗糖浓度增加时，直链淀粉可以在65℃生成。

(实施例14：以麦芽四糖为引物生产直链淀粉)

上述实施例中，直链淀粉生产是以麦芽七糖为引物。然而，高纯度的麦芽低聚糖昂贵且没有被划分为工业可利用的范围。含麦芽四糖的糖浆是便宜的麦芽低聚糖。然而，这种糖浆含有不被认为具有引物功能的葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖等。此外，麦芽四糖对葡聚糖磷酸化酶的亲和性低于麦芽七糖对葡聚糖磷酸化酶的亲和性。这种糖浆是否可以被用于进行葡聚糖合成反应还尚不清楚。这种研究还未有报导。因此，本发明人对取代麦芽七糖的含麦芽四糖的糖浆是否可以被用于合成直链淀粉进行了研究。

特定地，采用至少含70％麦芽四糖的Tetrup H(Hayashibara Shoji，Inc.)。除此而外，以与实施例7-2相同的方式合成直链淀粉。结果证实即使采用Tetrup H也可生成高分子量的直链淀粉。

(实施例15：采用膜过滤纯化直链淀粉)

采用2％蔗糖、10mM无机磷酸盐、50U/g蔗糖的肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)、根据上文2.2内容制备的50U/g蔗糖的重组马铃薯块茎来源的葡聚糖磷酸化酶，并以麦芽七糖为引物，在37℃反应18小时以合成直链淀粉。该情况中，反应体积为2,000ml。

采用截留分子量为30,000的超滤膜(UF膜单位；由DaicelChemical Industries Ltd.生产)将反应后2,000ml的直链淀粉溶液浓缩为1,200ml。其后，对10L蒸馏水进行透滤，并将透滤过的蒸馏水添加至浓缩后的溶液中，以得到2,000ml。在膜过滤前后测量果糖含量和直链淀粉的平均分子量。结果如表15所示。

表15

通过膜过滤除去果糖

编号	果糖(mM)	重均分子量(KDa)
			膜过滤前	57.5	715
膜过滤后	＜0.1	712

如表15所示，证实超滤膜可被用于纯化直链淀粉，以除去反应溶液中存在的果糖。证实膜过滤对直链淀粉的平均分子量没有很多改变。

因此，采用超滤膜纯化直链淀粉，可以无需许多被常规地应用在直链淀粉纯化中的有机溶剂，如丁醇、甲醇、乙醇、乙醚等，便可将直链淀粉纯化。

(实施例16-1到16-7和比较实施例16-1：采用肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶和马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶，并改变蔗糖浓度与无机磷酸盐浓度的比例，合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表16所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表16

编号	蔗糖(mM)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例16-1	125	0.35	7.2	20	20	37℃
实施例16-1	125	0.35	10	20	20	37℃
							实施例16-2	125	0.35	20	20	20	37℃
实施例16-3	125	0.35	30	20	20	37℃
							实施例16-4	125	0.35	50	20	20	37℃
实施例16-5	125	0.35	75	20	20	37℃
							实施例16-6	125	0.35	100	20	20	37℃

实施例16-7

125

0.35

125

20

20

37℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，将蔗糖、无机磷酸盐、肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶、根据上文2.1内容制备的马铃薯块茎来源的葡聚糖磷酸化酶和麦芽七糖溶解于100mM柠檬酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，以获得含125mM蔗糖、20U/g蔗糖的肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶、20U/g蔗糖的马铃薯块茎来源的葡聚糖磷酸化酶、0.35mM麦芽七糖、7.2mM无机磷酸盐(比较实施例16-1)或10～125mM无机磷酸盐(实施例16-1到16-7)的溶液。使该溶液在37℃反应4小时以合成直链淀粉。反应体积为1ml。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图16所示。

如图16所示，当添加7.2mM无机磷酸盐，使其与125mM蔗糖反应时，直链淀粉产率低至20.1％，但当添加至少10mM无机磷酸盐，并使其与125mM蔗糖反应时，产率增加了。进一步地，当添加20～75mM无机磷酸盐，并使其与125mM蔗糖反应时，产率至少为40％。

(实施例17-1到17-7和比较实施例17-1：采用变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶和马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶，并改变蔗糖浓度与无机磷酸盐浓度的比例时，合成直链淀粉)

采用组成(反应开始时)如下表17所示的反应混合物进行直链淀粉的合成。

表17

编号	蔗糖(mM)	G7(mM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例17-1	125	0.35	7.2	20	20	45℃
实施例17-1	125	0.35	10	20	20	45℃
							实施例17-2	125	0.35	20	20	20	45℃
实施例17-3	125	0.35	30	20	20	45℃
							实施例17-4	125	0.35	50	20	20	45℃
实施例17-5	125	0.35	75	20	20	45℃
							实施例17-6	125	0.35	100	20	20	45℃
实施例17-7	125	0.35	125	20	20	45℃

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，在实施例17-1到17-7和比较实施例17-1中，采用变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶取代肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶，反应温度为45℃。除此而外，以与实施例16-1到16-7和比较实施例17-1相同的方式合成直链淀粉。

反应后，根据上文1.6的内容测定合成的直链淀粉的产率。结果如图17所示。

如图17所示，当添加7.2mM无机磷酸盐，使其与125mM蔗糖反应时，直链淀粉产率低至26.7％，但当添加至少10mM无机磷酸盐，并使其与125mM蔗糖反应时，产率增加了。进一步地，当添加20～75mM无机磷酸盐，并使其与125mM蔗糖反应时，产率至少为50％～60％。

因此，尽管常规方法采用的蔗糖-磷酸盐比例的最大值不仅不导致高水平的产率，还对工业生产不利，但通过在预定范围内设定蔗糖-磷酸盐比例的最大值，可以实现常规方法所得产率水平的约两倍。

(实施例18：蔗糖存在条件下变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶的耐热性)

在根据上文2.5内容通过破坏生成蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌而制备的溶液中添加蔗糖，并使其溶解，相对于溶解后的溶液而言，获得最终蔗糖浓度分别为4％、8％、12％、16％、20％、25％或30％的溶液。以无蔗糖的蔗糖磷酸化酶酶液为对照(0％蔗糖)。在55℃水浴中加热这些溶液。在加热开始(0分钟)，加热开始后30分钟，60分钟和90分钟对这些溶液取样，根据此处描述的方法检测蔗糖磷酸化酶的活性。

基于测定的活性，计算剩余活性。

如下计算剩余活性：

(剩余活性(％))＝{(每一样品的蔗糖磷酸化酶活性)/(加热0分钟时蔗糖磷酸化酶活性)}×100

剩余活性结果如图18所示。发现下列结果。当不存在蔗糖(0％)时，在55℃加热30分钟后活性减少为约10％。

当存在至少4％蔗糖时，加热30分钟后剩余活性至少为50％。特定地，当存在至少8％蔗糖时，即使加热30分钟仍有至少80％的剩余活性。

(实施例19：蔗糖存在条件下肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶的耐热性)

在含有肠系膜状明串珠菌来源的蔗糖磷酸化酶(购自OrientalYeast Co.，Ltd.)的酶液中添加蔗糖，并使其溶解，相对于溶解后的溶液而言，获得最终蔗糖浓度分别为12％、16％、20％、25％或30％的溶液。以无蔗糖的蔗糖磷酸化酶酶液为对照(0％蔗糖)。在50℃水浴中加热这些溶液。在加热开始(0分钟)，加热开始后30分钟，60分钟和90分钟对这些溶液取样，根据此处描述的方法检测蔗糖磷酸化酶的活性。

基于测定的活性，根据上述公式计算剩余活性。

剩余活性结果如图19所示。发现下列结果。当不存在蔗糖(0％)时，在50℃加热30分钟后活性减少为约10％。

当存在至少12％蔗糖时，加热30分钟后剩余活性至少为50％。特定地，当存在至少20％蔗糖时，即使加热30分钟仍有至少80％的剩余活性。

(比较实施例20：果糖对蔗糖磷酸化酶稳定性的影响)

除蔗糖以外，果糖、无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸都是蔗糖磷酸化酶的底物。以下述方式研究果糖对蔗糖磷酸化酶稳定性的影响。

在根据上文2.5内容制备的含有变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶的蔗糖磷酸化酶酶液中添加果糖，并使其溶解，相对于溶解后的溶液而言，获得最终果糖浓度为5％或10％的溶液。以无果糖的蔗糖磷酸化酶酶液为对照(0％蔗糖)。同样，就对照而言，也研究了将蔗糖添加至相同浓度的情况。在55℃水浴中加热这些溶液。在加热开始(0分钟)，加热开始后30分钟，60分钟和90分钟对这些溶液取样，根据此处描述的方法检测蔗糖磷酸化酶的活性。

基于测定的活性，计算剩余活性。

剩余活性结果如图20所示。结果是没有发现果糖具有如蔗糖所显示的对蔗糖磷酸化酶稳定性的影响。

(比较实施例21：无机磷酸盐对蔗糖磷酸化酶稳定性的影响)

以下述方式研究无机磷酸盐对蔗糖磷酸化酶稳定性的影响。

在根据上文2.5内容制备的含有变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶的蔗糖磷酸化酶酶液中添加磷酸钠，并使其溶解，相对于溶解后的溶液而言，获得最终浓度为40mM、100mM和400mM的溶液。以无添加磷酸钠的蔗糖磷酸化酶酶液为对照(无添加)。同样，就对照而言，也研究了将蔗糖添加至10％浓度的情况。在55℃水浴中加热这些溶液。在加热开始(0分钟)，加热开始后30分钟，60分钟和90分钟对这些溶液取样，根据此处描述的方法检测蔗糖磷酸化酶的活性。

基于测定的活性，计算剩余活性。

剩余活性结果如图21所示。结果是没有发现无机磷酸盐具有如蔗糖所显示的对蔗糖磷酸化酶稳定性的影响。

(实施例22-1到22-5和比较实施例22-1：以出芽短梗霉聚糖为引物合成葡聚糖)

采用组成(反应开始时)如下表18所示的反应混合物进行葡聚糖的合成。

表18

编号	蔗糖(％)	P-5(％)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例22-1	4	0.2	20	20	20	50℃
实施例22-1	8	0.4	40	20	20	50℃
							实施例22-2	10	0.5	50	20	20	50℃
实施例22-3	15	0.75	75	20	20	50℃
							实施例22-4	20	1.0	100	20	20	50℃
实施例22-5	25	1.25	125	20	20	50℃

P-5：出芽短梗霉聚糖(平均分子量约为5,000)；％是通过重量/体积计算。

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，采用0.2～1.25％出芽短梗霉聚糖P-5(平均分子量约为5,000；购自Shoko Co.，Ltd.)取代麦芽七糖，采用的蔗糖磷酸化酶活性为20U/g蔗糖，采用的葡聚糖磷酸化酶活性为20U/g蔗糖。除此而外，在比较实施例22-1和实施例22-1到22-5中，以与比较实施例3-2-1和实施例3-2-1到3-2-5相同的方式合成葡聚糖。

反应后，根据上文1.6内容测定合成的葡聚糖产率。结果如图22所示。

即使采用出芽短梗霉聚糖取代麦芽七糖，通过将蔗糖浓度从4％增加到8％，仍然可以在50℃进行高效的反应，并且葡聚糖产率是增加的。

如图22所示，当反应温度为50℃，蔗糖浓度为4％时，葡聚糖产率低至9.8％。然而当不改变底物之间比例和酶量，并且蔗糖浓度在8％和25％之间变化时，葡聚糖产率是增加的。当蔗糖浓度为8％，产率为32.0％，该产率是蔗糖浓度为4％时所得产率的至少三倍。当蔗糖浓度至少为15％时，葡聚糖产率约为80％。如此，即使采用出芽短梗霉聚糖取代麦芽低聚糖，仍能获得与采用麦芽低聚糖等同的效果。

(实施例23-1到23-7和比较实施例23-1：以出芽短梗霉聚糖为引物合成葡聚糖)

采用组成(反应开始时)如下表19所示的反应混合物进行葡聚糖的合成。

表19

编号	蔗糖(mM)	P-5(％)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例23-1	125	0.2	7.2	20	20	45℃
实施例23-1	125	0.2	10	20	20	45℃
							实施例23-2	125	0.2	20	20	20	45℃
实施例23-3	125	0.2	30	20	20	45℃
							实施例23-4	125	0.2	50	20	20	45℃
实施例23-5	125	0.2	75	20	20	45℃
							实施例23-6	125	0.2	100	20	20	45℃
实施例23-7	125	0.2	125	20	20	45℃

P-5：出芽短梗霉聚糖(平均分子量约为5,000)；％是通过重量/体积计算。

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，采用0.2％出芽短梗霉聚糖P-5(平均分子量约为5,000；购自Shoko Co.，Ltd.)取代麦芽七糖。除此而外，在比较实施例23-1和实施例23-1到23-7中，以与比较实施例17-1和实施例17-1到17-7相同的方式合成葡聚糖。

反应后，根据上文1.6内容测定合成的葡聚糖产率。结果如图23所示。

如图23所示，当添加7.2mM无机磷酸盐，使其与125mM蔗糖反应时，葡聚糖产率低至5.3％。然而，当添加10mM无机磷酸盐，并使其与125mM蔗糖反应时，产率为11.7％，该产率为上一产率的至少两倍。进一步地，当添加20～75mM无机磷酸盐，并使其与125mM蔗糖反应时，产率至少为20～25％。

如此，即使采用出芽短梗霉聚糖取代麦芽低聚糖，仍能获得与采用麦芽低聚糖等同的效果。

(实施例24-1到24-7和比较实施例24-1：采用G-1-P合成葡聚糖)

采用组成(反应开始时)如下表20所示的反应混合物进行葡聚糖的合成。

表20

编号	蔗糖(mM)	G7(mM)	G-1-P(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	反应温度
							比较实施例24-1	125	0.35	7.2	20	20	45℃
实施例24-1	125	0.35	10	20	20	45℃
							实施例24-2	125	0.35	20	20	20	45℃
实施例24-3	125	0.35	30	20	20	45℃
							实施例24-4	125	0.35	50	20	20	45℃
实施例24-5	125	0.35	75	20	20	45℃
							实施例24-6	125	0.35	100	20	20	45℃
实施例24-7	125	0.35	125	20	20	45℃

G7：麦芽七糖

G-1-P：葡糖-1-磷酸二钠

SP：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶

特定地，采用葡糖-1-磷酸取代无机磷酸盐，并且采用醋酸盐缓冲溶液调节反应溶液为pH7.0。除此而外，在比较实施例24-1和实施例24-1到24-7中，以与比较实施例17-1和实施例17-1到17-7相同的方式合成葡聚糖。

反应后，根据上文1.6内容测定合成的葡聚糖产率。结果如图24所示。

如图24所示，当添加7.2mM葡糖-1-磷酸，使其与125mM蔗糖反应时，葡聚糖产率低至16.4％。然而，当添加10mM葡糖-1-磷酸，并使其与125mM蔗糖反应时，产率为35.3％，该产率为上一产率的至少两倍。进一步地，当添加20～75mM葡糖-1-磷酸，并使其与125mM蔗糖反应时，产率至少为40～60％。

因此，合成葡聚糖即使采用了出芽短梗霉聚糖取代麦芽低聚糖，常规方法采用的蔗糖-磷酸盐比例的最大值情况中，产率是低的。然而通过在预定范围内设定蔗糖-磷酸盐比例的最大值，仍可获得至少两倍的产率。

(实施例25-1到25-5：采用含分支酶的SP-GP反应体系合成葡聚糖)

采用组成如下表21所示的反应混合物进行葡聚糖的合成。应当指出采用的分支酶是根据在Japanese Laid-Open Publication No.2000-316581(Japanese Patent Application No.11-130833)中公开的方法制备的。

表21

编号	蔗糖(％)	G7(μM)	Pi(mM)	SP(U/g蔗糖)	GP(U/g蔗糖)	BE(U/g蔗糖)
							实施例25-1	8	40	40	20	20	2500
实施例25-2	8	40	40	20	20	5000
							实施例25-3	8	40	40	20	20	10000
实施例25-4	12	80	60	20	20	5000
							实施例25-5	12	80	60	20	20	10000

G7：麦芽七糖

Pi：磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液

SP：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶

GP：马铃薯来源的葡聚糖磷酸化酶

BE：Aquifex aeolicus来源的分支酶

使该溶液在45℃反应18小时以合成葡聚糖。反应体积为1ml。

反应后，根据上文1.6描述方式测定合成葡聚糖产率。进一步地，通过Takata等人描述的方法(Carbohydr.Res.，Vol.295，pp.91～101(1996))测定所合成的葡聚糖的平均单位链长度。结果如下表22所示。

表22

编号	产率(％)	平均单位链长度
			实施例25-1	69.7	N/A
实施例25-2	79.7	18
			实施例25-3	64.8	9
实施例25-4	85.3	20
			实施例25-5	87.9	13

N/A：未分析

发现在这些条件下可以高产率地合成高度分枝的葡聚糖。

工业适用性

根据本发明，可以生产葡聚糖。通过在某个范围内，在从反应开始到结束的时间段内，设定蔗糖的摩尔浓度与无机磷酸盐和葡糖-1-磷酸的总摩尔浓度的比例的最大值，可获得的葡聚糖生产产率水平高于常规方法的产率水平。本发明人通过在改进蔗糖磷酸化酶热稳定性、或开发和采用具有较高水平耐热性的蔗糖磷酸化酶的条件下进行反应，可以在高温生产葡聚糖(优选直链淀粉)。

对作为淀粉加工工业、膳食组合物、用于食品添加剂的组合物、粘合组合物、包埋化合物和吸收化合物、医药和化妆品组合物、薄膜类型产物组合物的原料而言，这些葡聚糖是有用的，并且还可作为生物可降解塑料所用淀粉的替代物。

Claims (25)

1.一种生产葡聚糖的方法，包括以下步骤：

使含有蔗糖、引物、无机磷酸盐或葡糖-1-磷酸、蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶的反应溶液起反应以生成葡聚糖，

其中反应在约40℃到约70℃的温度下进行。

2.根据权利要求1的方法，其中反应温度约为45℃到约65℃。

3.根据权利要求1的方法，其中反应开始时反应溶液中的蔗糖浓度约为5％到约100％。

4.根据权利要求3的方法，其中反应开始时反应溶液中的蔗糖浓度约为8％到约80％。

5.根据权利要求4的方法，其中反应开始时反应溶液中的蔗糖浓度约为15％到约50％。

6.根据权利要求1的方法，其中葡聚糖是直链淀粉。

7.根据权利要求1的方法，其中蔗糖磷酸化酶来源自属于链球菌属的细菌。

8.根据权利要求7的方法，其中蔗糖磷酸化酶来源自选自变异链球菌、嗜热链球菌、肺炎链球菌和缓症链球菌的属于链球菌属的细菌。

9.根据权利要求1的方法，其中葡聚糖磷酸化酶来源自植物。

10.根据权利要求9的方法，其中葡聚糖磷酸化酶来源自藻类。

11.根据权利要求9的方法，其中葡聚糖磷酸化酶来源自马铃薯。

12.根据权利要求1的方法，其中葡聚糖磷酸化酶来源自水生栖热杆菌。

13.根据权利要求1的方法，其中葡聚糖磷酸化酶来源自嗜热脂肪芽孢杆菌。

14.根据权利要求1的方法，其中蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一个是通过重组微生物生成的。

15.根据权利要求1的方法，其中蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶二者或二者中至少一个被固定在载体上。

16.根据权利要求1的方法，其中引物选自麦芽低聚糖、直链淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、出芽短梗霉聚糖、偶联糖、淀粉及它们的衍生物。

17.根据权利要求16的方法，其中麦芽低聚糖是麦芽低聚糖混合物。

18.根据权利要求17的方法，其中除了含有聚合度大于或等于麦芽四糖的麦芽低聚糖外，麦芽低聚糖混合物还含有麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖中的至少一种。

19.根据权利要求16的方法，其中淀粉选自可溶性淀粉、蜡质淀粉、高直链淀粉、脱支酶降解淀粉、磷酸化酶降解淀粉、通过水解部分降解的淀粉、已加工淀粉及它们的衍生物。

20.根据权利要求1的方法，进一步包括不采用有机溶剂纯化已生成的葡聚糖的步骤。

21.根据权利要求1的方法，进一步包括于反应后冷却反应溶液以沉淀葡聚糖，并通过固-液分离方法纯化已沉淀葡聚糖的步骤。

22.根据权利要求1的方法，进一步包括以下步骤：

于葡聚糖生成反应期间或之后冷却反应溶液以凝胶化葡聚糖；

回收凝胶状葡聚糖；并

通过选自水洗涤、冷冻-融化、过滤、压榨、抽吸和离心的操作从凝胶状葡聚糖中除去果糖。

23.根据权利要求1的方法，进一步包括于葡聚糖生成反应之后，利用超滤膜或层析法，使溶解在水中的葡聚糖无需沉淀，经过膜分级分离除去果糖的步骤。

24.根据权利要求1的方法，其中反应溶液进一步含有选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶和糖原脱支酶的酶。

25.通过权利要求1的方法生产的葡聚糖。

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