CN1775798A - 一种从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法，属于精细化工和医药领域。该方法包括如下步骤：a.皂化反应：将禽畜胆汁与氢氧化钠溶液按一定比例及温度下进行皂化反应，反应时间为20－30小时；b.中和反应：皂化反应结束后加入稀盐酸调节至酸性，然后过滤得到粗胆酸；c.柱层析：将粗胆酸用稀氢氧化钠溶液调至碱性，打入层析柱中，用碱性溶液洗脱，合并经薄层层析检测为单纯的鹅去氧胆酸斑点的洗脱液；d.超滤：用截留分子量为3K－100K的超滤膜超滤；e.超滤液用稀酸调至酸性，过滤，烘干，得纯度为96％以上的鹅去氧胆酸。本发明生产工艺简单、产品纯度高、成本低、绿色环保。
Description
(一)所属技术领域
本发明涉及一种鹅去氧胆酸的提取方法，特别涉及一种从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法，属于精细化工和医药领域。
(二)背景技术
鹅去氧胆酸(简称CDCA)是动物胆汁的主要有效成分之一，被广泛的应用在医药行业。鹅去氧胆酸在临床上药理作用有以下几个方面：
1、治疗胆固醇型结石。CDCA能够抑制HMG-COA还原酶的活性；刺激胆酸合成限速酶的活性，从而扩大胆汁酸池以利于胆固醇以微胶粒状态溶解。CDCA的最佳疗效见于治疗后2年，40％的结石可溶解。
2、抗菌作用。CDCA的体外抗菌实验结果表明CDCA对革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌却有显著的抗菌作用。
3、抗炎作用。CDCA能极显著地抑制二甲苯所致的小鼠耳壳炎症并增强小鼠皮肤毛细血管的通透性，对小鼠棉球肉芽肿、大鼠角叉菜胶性足跖肿胀和甲醛性足肿胀均有明显的抑制作用，且作用与其剂量呈现正相关。
4、解热作用。CDCA分别按0.15g/Kg和0.225g/Kg的剂量给大鼠灌胃，连续给药3天；然后测定其对大肠杆菌内毒素和蛋自胨所致大鼠发垫体温的影响。实验结果表明高剂量的CDCA对大肠杆菌内毒素致热后15h内大鼠的发热体温有显著抑制作用，低剂量的CDCA则作用不明显。
尽管鹅去氧胆酸具有上述突出疗效，但对其生产工艺的研究却很少。专利CN02128138.6公开了一种鹅去氧胆酸粗品的精制方法。该方法主要对鹅去氧胆酸粗品进行进一步精制，采用将鹅去氧胆酸粗品用乙酸乙酯完全溶解，按鹅去氧胆酸粗品重量的0.1-2％用量加入稀氨水，萃取鹅去氧胆酸乙酸乙酯溶液中的胆酸及其它亲水性杂质，对溶液中的鹅去氧胆酸进行回收，得成品。该工艺主要用于对鹅去氧胆酸粗品进行精加工。专利CN03151475.8公开了一种鹅去氧胆酸的制备方法。其过程包括通过碱液皂化胆汁、制备总胆汁酸的钙盐沉淀、双氧水及活性碳脱色、碳酸钠及盐酸转化鹅去氧胆酸钙盐沉淀及大孔吸附树脂纯化步骤。整个工艺较复杂，需要氯化钙成盐、脱钙、脱色等步骤，工业生产中收率低，纯度为95％。
(三)发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种能提高提取鹅去氧胆酸产率、纯度同时简化提取工艺的从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法，其特殊之处在于：包括如下步骤：a、皂化反应：将禽畜胆汁与氢氧化钠溶液按一定比例及温度下进行皂化反应，反应时间为20-30小时；b、中和反应：皂化反应结束后加入稀盐酸调节至酸性，然后过滤得到粗胆酸；c、柱层析：将粗胆酸用稀氢氧化钠溶液调至碱性，打入层析柱中，用碱性溶液洗脱，合并经薄层层析检测为单纯的鹅去氧胆酸斑点的洗脱液；d、超滤：用截留分子量为3K-100K的超滤膜超滤；e、超滤液用稀酸调至酸性，过滤，烘干，得纯度为96％以上的鹅去氧胆酸。
其中在步骤a皂化反应中：所述氢氧化钠溶液浓度为1-5M，反应温度为80-110℃。
其中在步骤b中和反应中：所述稀盐酸的浓度为0.5-2M。
其中在步骤c柱层析中：所述稀氢氧化钠溶液浓度为1-5M，层析柱中填料为离子交换树脂或氧化铝，洗脱液选自氢氧化钠、氨水、乙酸钠或磷酸钠中的一种，或乙醇和它们的复合溶液，或其他碱性无机盐水溶液和乙醇的复合溶液。
其中在步骤d超滤中：所述超滤膜为中空纤维、陶瓷或聚砜膜。
本发明的从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法，所述层析柱中填料选自强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂、强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、碱性氧化铝或酸性氧化铝中的一种。
其中中间控制采用薄层层析(TLC)方法。通过TLC，可以对提取液和柱层析洗脱液中主要活性成分进行控制。TLC条件：展开剂为环己烷∶乙醚∶丁酸∶水＝12∶5∶4∶1，用50％硫酸乙醇显色。
产品纯度测定采用高效液相色谱(HPLC)法。
HPLC条件：设备：Waters 600，Waters 996泵，Photodiode ArrayDetector检测器；
色谱柱：Dikma，Diamonsil C18，4.6mm*25cm；
流动相：甲醇∶0.3％醋酸水溶液＝74∶26(V∶V)；
检测温度：室温；
检测波长：205nm；
流速：0.8ml/min。
在传统制备工艺中，都忽视了鹅去氧胆酸呈酸性并可以用离子交换进行纯化的特点，使的生产工艺复杂，收率低。本发明创新性的找到了一种提高提取鹅去氧胆酸产率、纯度同时简化提取工艺的方法，从而用于大规模提取纯度鹅去氧胆酸。本发明采用超滤技术取代了氯化钙和氯化钡等传统沉淀法，用水代替了大量的有机溶剂乙酸乙酯，利用CDCA与杂胆酸、脂肪酸的酸碱性不同，采用离子交换柱层析技术，直接用缓冲液洗涤，分离纯化得到含量大于96％CDCA产品，产品收率达到96％以上。
本发明采用的技术原理主要是：
1、鹅去氧胆酸的分子量为329.56，是小分子物质。根据分子量大小选择3K以上的超滤柱进行超滤，分子量大于3K的大分子蛋白等物质经过超滤可以除去，达到较好的除杂效果。
2、由于胆汁中除鹅去氧胆酸外，还含有胆酸、去氧胆酸、胆红素、石胆酸等物质，但它们的结构不同，物化性质不同，主要是酸性强度不同，这样它们和离子交换树脂的结合能力就不同，也就是通过柱层析技术将其完全分开，而离子交换树脂又可以重复利用。
综上所述，本发明生产工艺简单、产品纯度高、成本低，不使用有机溶剂，是一种绿色环保型生产工艺。
(四)具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明。但它们不是对本发明的限定。
实施例1：
取鸡胆汁，粉碎，过滤，加入等重量的1M氢氧化钠溶液，在80℃温度下进行皂化反应，反应时间为30小时；加入0.5M盐酸调至PH＝3，搅拌2小时，静置，离心，收集滤饼，得粗胆酸。将粗胆酸用稀5M氢氧化钠溶液调至PH＝10，打入强碱性阴离子交换树脂层析柱中，用浓度5％氢氧化钠溶液洗脱，合并经薄层层析(TLC)检测为单纯的鹅去氧胆酸斑点的洗脱液。然后用截留分子量为3K的超滤膜超滤，超滤液用0.5M稀酸调至PH＝2，静置，离心过滤，烘干，得纯度为99.5％(HPLC测定)的鹅去氧胆酸。
实施例2：
取猪胆汁，粉碎，过滤，加入等重量的5M氢氧化钠溶液，在110℃温度下进行皂化反应，反应时间为20小时；加入2M盐酸调至PH＝2，搅拌5小时，静置，离心，收集滤饼，得粗胆酸。将粗胆酸用稀1M氢氧化钠溶液调至PH＝11，打入弱碱性阴离子交换树脂层析柱中，用浓度10％的乙酸钠和5％乙醇混合溶液洗脱，合并经薄层层析(TLC)检测为单纯的鹅去氧胆酸斑点的洗脱液。然后用截留分子量为100K的超滤膜超滤，超滤液用2M稀酸调至PH＝3，静置，离心过滤，烘干，得纯度为98％(HPLC测定)的鹅去氧胆酸。
实施例3：
取鸡胆汁，粉碎，过滤，加入等重量的2M氢氧化钠溶液，在90℃温度下进行皂化反应，反应时间为30小时；加入1M盐酸调至PH＝2.5，搅拌1小时，静置，离心，收集滤饼，得粗胆酸。将粗胆酸用稀4M氢氧化钠溶液调至PH＝11，打入弱碱性阴离子交换树脂层析柱中，用浓度12％氨水溶液洗脱，合并经薄层层析(TLC)检测为单纯的鹅去氧胆酸斑点的洗脱液。然后用截留分子量为10K的超滤膜超滤，超滤液用0.5M稀酸调至PH＝3，静置，离心过滤，烘干，得纯度为99％(HPLC测定)的鹅去氧胆酸。
实施例4：
取鸡胆汁，粉碎，过滤，加入等重量的3M氢氧化钠溶液，在100℃温度下进行皂化反应，反应时间为22小时；加入1M盐酸调至PH＝2，搅拌3小时，静置，离心，收集滤饼，得粗胆酸。将粗胆酸用稀2M氢氧化钠溶液调至PH＝11，打入弱酸性阳离子交换树脂层析柱中，用浓度10％乙醇溶液洗脱，合并经薄层层析(TLC)检测为单纯的鹅去氧胆酸斑点的洗脱液。然后用截留分子量为30K的超滤膜超滤，超滤液用1M稀酸调至PH＝3，静置，离心过滤，烘干，得纯度为98.9％(HPLC测定)的鹅去氧胆酸。
实施例5：
取牛胆汁，粉碎，过滤，加入等重量的4M氢氧化钠溶液，在80℃温度下进行皂化反应，反应时间为28小时；加入0.5M盐酸调至PH＝2，搅拌3小时，静置，离心，收集滤饼，得粗胆酸。将粗胆酸用稀2M氢氧化钠溶液调至PH＝11，打入酸性氧化铝层析柱中，用浓度25％乙醇溶液洗脱，合并经薄层层析(TLC)检测为单纯的鹅去氧胆酸斑点的洗脱液。然后用截留分子量为70K的超滤膜超滤，超滤液用1M稀酸调至PH＝2.5，静置，离心过滤，烘干，得纯度为98.6％(HPLC测定)的鹅去氧胆酸。
Claims (6)
1.一种从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：a、皂化反应：将禽畜胆汁与氢氧化钠溶液按一定比例及温度下进行皂化反应，反应时间为20-30小时；b、中和反应：皂化反应结束后加入稀盐酸调节至酸性，然后过滤得到粗胆酸；c、柱层析：将粗胆酸用稀氢氧化钠溶液调至碱性，打入层析柱中，用碱性溶液洗脱，合并经薄层层析检测为单纯的鹅去氧胆酸斑点的洗脱液；d、超滤：用截留分子量为3K-100K的超滤膜超滤；e、超滤液用稀酸调至酸性，过滤，烘干，得纯度为96％以上的鹅去氧胆酸。
2.根据权利要求1所述的从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法，其中在步骤a皂化反应中：所述氢氧化钠溶液浓度为1-5M，反应温度为80-110℃。
3.根据权利要求1所述的从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法，其中在步骤b中和反应中：所述稀盐酸的浓度为0.5-2M。
4.根据权利要求1所述的从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法，其中在步骤c柱层析中：所述稀氢氧化钠溶液浓度为1-5M，层析柱中填料为离子交换树脂或氧化铝，洗脱液选自氢氧化钠、氨水、乙酸钠或磷酸钠中的一种，或乙醇和它们的复合溶液，或其他碱性无机盐水溶液和乙醇的复合溶液。
5.根据权利要求1所述的从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法，其中在步骤d超滤中：所述超滤膜为中空纤维、陶瓷或聚砜膜。
6.根据权利要求4所述的从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法，所述层析柱中填料选自强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂、强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、碱性氧化铝或酸性氧化铝中的一种。
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