CN102703556B - 大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸的方法，其特征在于：第一步为微生物溶液制作：取动物回肠及大肠，刮出内容物；添加水稀释过滤得到滤液；滤液加入MRS培养基得培养液；分离培养液得沉淀物；加生理盐水混悬得微生物溶液；第二步为分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸：取鸭胆汁，添加微生物溶液得混合液；混合液反应过滤出湿游离型胆汁酸；添加水稀释成稀释液，加入水饱和的硫酸镁或氯化钙反应过滤得到游离型胆汁酸盐；加入甲醇或乙醇回流溶解游离型胆汁酸盐得溶解液；将溶解液置于装有大孔树脂的层析柱中，洗脱层析柱得鹅去氧胆酸溶液；鹅去氧胆酸溶液加入碳酸钠或氢氧化钠加热过滤，滤饼用水洗至pH值中性，低温烘干就得到鹅去氧胆酸。
Description
技术领域
本发明属于精细化工和医药领域。涉及分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸的方法，具体为大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸的方法。
背景技术
目前从鸭胆汁中分离鹅去氧胆酸的方法，集中于溶剂萃取法，沉淀法、和离子交换树脂法，分离工艺繁杂，收率低，纯度低。相关文献有：
刘雁红、胡祥正发表的“鸭胆膏中鹅去氧胆酸的提取工艺”，天津科技大学学报2009年06期；
2006年05月24日中国专利CN1775798公开的“一种从禽畜胆汁中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法”。该方法包括如下步骤：a.皂化反应：将禽畜胆汁与氢氧化钠溶液按一定比例及温度下进行皂化反应，反应时间为20-30小时；b.中和反应：皂化反应结束后加入稀盐酸调节至酸性，然后过滤得到粗胆酸；c.柱层析：将粗胆酸用稀氢氧化钠溶液调至碱性，打入层析柱中，用碱性溶液洗脱，合并经薄层层析检测为单纯的鹅去氧胆酸斑点的洗脱液；d.超滤：用截留分子量为3K-100K的超滤膜超滤；e.超滤液用稀酸调至酸性，过滤，烘干，得纯度为96％以上的鹅去氧胆酸。本发明生产工艺简单、产品纯度高、成本低、绿色环保。
2008年03月19日中国专利CN101143886公开的“禽类胆汁中鹅去氧胆酸的非有机溶剂提取法”。包括如下步骤：a.皂化反应：将禽胆汁与氢氧化钠按一定比例煮沸进行皂化，皂化时间20-24小时；b.中和反应：皂化液用盐酸中和及调节pH2-4，沉淀得总胆汁酸；c.钙盐沉淀：将总胆汁酸加氢氧钠溶液溶解，加活性炭，回流，过滤，滤液加10％-14％的氯化钙，得钙盐沉淀物；d.脱钙：钙盐按比例加入碳酸钠10％-15％，加热回流1-3小时，滤液用5％-10％的盐酸液调节pH2.0-3.5得沉淀；e.收集沉淀物，真空干燥，得鹅去氧胆酸粗品。
2011年01月19日中国专利CN101948496A公开的“一种从家禽胆汁中提取鹅去氧酸的方法”。从新鲜或冷冻家禽胆汁中，利用皂化反应，得到粗胆汁酸或粗胆汁酸钙盐，再将粗胆汁酸酯溶液与有机含氮化合物A水溶液共热，利用有机含氮化合物A来除去粗胆汁酸中的大部份亲水性杂质，得到的粗胆汁酸酯溶液与有机含氮化合物B反应，析出沉淀，过滤，并进行脱色、精制等步骤后，可得纯度95％左右的鹅去氧胆酸。本发明具有操作简便，生产设备通用性高，所用化学物质低毒的特点；适用于鹅去氧胆酸的工业化生产。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸的方法。
本发明解决其技术问题的基本思路是：依据胆汁酸在动物体内属于肠肝循环的原理，取动物回肠内容物及大肠内容物来培养提取其中的微生物，进而用大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸的方法，其特征在于该工艺分为两步：
第一步为微生物溶液制作：
取动物回肠及大肠，刮出回肠和大肠中的内容物；
在刮出的内容物中，添加内容物体积0.5-10倍的水稀释混匀，过滤除掉固体杂质，得到滤液；
按滤液体积加入0.1-0.5倍的MRS培养基，保持温度在35-42℃，培养24-72小时，得培养液；
用离心机分离培养液，得到沉淀物；
加沉淀物重量1-100倍的无菌生理盐水混悬，得到能水解结合型胆汁酸的微生物溶液；
常温保存微生物溶液，备用；
第二步为大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸：
取鸭胆汁，按胆汁量体积添加微生物溶液0.5ml-6ml/L混合均匀，得混合液；
混合液在25℃-42℃温度条件下，反应24-72小时，得游离型胆汁酸溶液中间体；
从中间体中过滤出湿游离型胆汁酸；
按游离型胆汁酸湿重添加5-20倍水稀释成稀释液，并用碳酸钠或氢氧化钠调稀释液pH值至8-10；
按稀释液重量的0.1-0.2倍加入水饱和的硫酸镁，并混合均匀充分反应，得到胆汁酸镁盐，再在胆汁酸镁盐中加盐酸调pH值至4.5-6.5，过滤得到游离型胆汁酸镁盐；
或按稀释液重量的0.1-0.2倍加入水饱和的氯化钙，并混合均匀充分反应，得到胆汁酸钙盐，再在胆汁酸钙盐中加盐酸调pH值至4.5-6.5，过滤得到游离型胆汁酸钙盐；
按游离型胆汁酸镁盐或游离型胆汁酸钙盐重量4-10倍的比例加入浓度为60-90％的甲醇或乙醇回流溶解游离型胆汁酸镁盐或游离型胆汁酸钙盐得溶解液；
将溶解液置于装有大孔树脂的层析柱中，层析柱中的大孔树脂装入量为每升层析柱体积装入0.5-0.8kg大孔树脂；
然后：
第一步：用层析柱体积2-10倍量的浓度为35-55％甲醇或乙醇洗脱掉溶解液中的亲水性杂质；
第二步：再用层析柱体积5-10倍量的浓度为60-80％甲醇或乙醇洗脱层析柱得到鹅去氧胆酸溶液；
鹅去氧胆酸溶液按每升加入1-4g碳酸钠或氢氧化钠，加热回收鹅去氧胆酸溶液中的甲醇或乙醇，至鹅去氧胆酸溶液中的甲醇或乙醇浓度在10％以下，冷却至常温后过滤，滤液按1-5g/L的量加入工业用双氧水脱色10-24小时后，用盐酸调pH值至2.5-4.5，再过滤，滤饼用水洗至pH值至中性，低温烘干滤饼，就得到鹅去氧胆酸。
进一步的方案是：在第二步洗脱层析柱后，按层析柱体积5-10倍量的浓度为90％以上甲醇或乙醇再次洗脱层析柱，洗脱后的层析柱下次备用。
本发明的具体工艺流程可以是：
鸭胆→去胆度→鸭胆汁→水解：以鸭胆汁0.5ml-6ml/L微生物溶液加入该鸭胆液中，升温至25℃-42℃反应24h-72h→游离胆汁酸→NaoH、NaCO3调pH8-10→饱和硫酸镁溶液：按其湿重游离胆汁酸的0.1-0.2倍加入水饱和的硫酸镁溶液混合均匀→过滤→胆汁酸镁盐→上大孔树脂→45％-90％甲醇洗脱→分段收集得到较纯的鹅去氧胆酸(CDCA)
本发明结合微生物溶液的水解作用，得到游离胆汁酸后，调pH8-10，加水饱和硫酸镁溶液生成胆汁酸镁盐，胆汁酸镁盐调pH4.5-6.5，用甲醇溶解后，上于大孔树脂，此大孔树脂是由苯乙烯或丙烯酸为原料的一种，用45％-90％甲醇洗脱，分段收集用G型薄层硅胶板定性，(展开剂为异辛烷∶醋酸乙酯∶冰醋酸∶正丁醇；10∶5∶1.5∶1.5)，(显色剂为10％磷钼酸乙醇溶液)收集纯的CDCA洗脱段，得到较高收率的，纯度大于95％的CDCA。抛去了原有的溶剂汽油脱脂，反复沉淀、结晶等工艺，实现了简便、安全易控、稳定性好的工业化生产鸭胆中鹅去氧胆酸方法。
本发明的有益效果是，创造了一种新的从鸭胆汁中用大孔树脂分离其中的鹅去氧胆酸(CDCA)方法，使其方法简单易控，收率和纯度高，适合工业化从鸭胆汁中分离鹅去氧胆酸，使得大量的鸭胆得到真正有效地利用。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。本发明的应用范围不限于该实例。
一种大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸的方法，其特征在于该工艺分为两步：
第一步为微生物溶液制作：
取动物回肠及大肠，刮出回肠和大肠中的内容物；
在刮出的内容物中，添加内容物体积5倍的水稀释混匀，过滤除掉固体杂质，得到滤液；
按滤液体积加入0.2倍的MRS培养基，保持温度在37℃，培养72小时，得培养液；
用离心机分离培养液，得到沉淀物；
加沉淀物重量10倍的无菌生理盐水混悬，得到能水解结合型胆汁酸的微生物溶液；
常温保存微生物溶液，备用；
第二步为大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸：
取鸭胆汁1000ml，按胆汁量体积添加微生物溶液3ml/L混合均匀，得混合液；
混合液在37℃温度条件下，反应48小时，得游离型胆汁酸溶液中间体；
从中间体中过滤出湿游离型胆汁酸；
按游离型胆汁酸湿重添加10倍水稀释成稀释液，并用碳酸钠或氢氧化钠调稀释液pH值至8-10；
按稀释液重量的0.2倍加入水饱和的硫酸镁，并混合均匀充分反应，得到胆汁酸镁盐，再在胆汁酸镁盐中加稀盐酸调pH值至4.5-6.5，过滤得到游离型胆汁酸镁盐；
或按稀释液重量的0.1倍加入水饱和的氯化钙，并混合均匀充分反应，得到胆汁酸钙盐，再在胆汁酸钙盐中加稀盐酸调pH值至4.5-6.5，过滤得到游离型胆汁酸钙盐；
按游离型胆汁酸镁盐或游离型胆汁酸钙盐重量4倍的比例加入浓度为80％的甲醇或乙醇回流溶解游离型胆汁酸镁盐或游离型胆汁酸钙盐得溶解液；
将溶解液置于装有1000克大孔树脂的层析柱中，层析柱中的大孔树脂装入量为每升层析柱体积装入0.7kg大孔树脂；层析柱的径高比为(1∶10)。
然后：
第一步：用层析柱体积5倍量的浓度为45％甲醇或乙醇洗脱掉溶解液中的亲水性杂质；
第二步：再用层析柱体积10倍量的浓度为70％甲醇或乙醇洗脱层析柱得到鹅去氧胆酸溶液；
鹅去氧胆酸溶液按每升加入3g碳酸钠或氢氧化钠，加热回收鹅去氧胆酸溶液中的甲醇或乙醇，至鹅去氧胆酸溶液中的甲醇或乙醇浓度在10％以下，冷却至常温后过滤，滤液按3g/L的量加入工业用双氧水脱色12小时后，用稀盐酸调pH值至2.5-4.5，再过滤，滤饼用水洗至pH值至中性，低温烘干滤饼，就得到24克含量为95％以上的鹅去氧胆酸。
在第二步洗脱层析柱后，按层析柱体积10倍量的浓度为90％以上甲醇或乙醇再次洗脱层析柱，洗脱后的层析柱下次备用。
Claims (2)
1.一种大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸的方法，其特征在于该工艺分为两步：
第一步为微生物溶液制作：
取动物回肠及大肠，刮出回肠和大肠中的内容物；
在刮出的内容物中，添加内容物体积0.5-10倍的水稀释混匀，过滤除掉固体杂质，得到滤液；
按滤液体积加入0.1-0.5倍的MRS培养基，保持温度在35-42℃，培养24-72小时，得培养液；
用离心机分离培养液，得到沉淀物；
加沉淀物重量1-100倍的无菌生理盐水混悬，得到能水解结合型胆汁酸的微生物溶液；
常温保存微生物溶液，备用；
第二步为大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸：
取鸭胆汁，按胆汁量体积添加微生物溶液0.5ml-6ml/L混合均匀，得混合液；
混合液在25℃-42℃温度条件下，反应24-72小时，得游离型胆汁酸溶液中间体；
从中间体中过滤出湿游离型胆汁酸；
按游离型胆汁酸湿重添加5-20倍水稀释成稀释液，并用碳酸钠或氢氧化钠调稀释液pH值至8-10；
按稀释液重量的0.1-0.2倍加入水饱和的硫酸镁，并混合均匀充分反应，得到胆汁酸镁盐，再在胆汁酸镁盐中加盐酸调pH值至4.5-6.5，过滤得到游离型胆汁酸镁盐；
或按稀释液重量的0.1-0.2倍加入水饱和的氯化钙，并混合均匀充分反应，得到胆汁酸钙盐，再在胆汁酸钙盐中加盐酸调pH值至4.5-6.5，过滤得到游离型胆汁酸钙盐；
按游离型胆汁酸镁盐或游离型胆汁酸钙盐重量4-10倍的比例加入浓度为60-90％的甲醇或乙醇回流溶解游离型胆汁酸镁盐或游离型胆汁酸钙盐得溶解液；
将溶解液置于装有大孔树脂的层析柱中，层析柱中的大孔树脂装入量为每升层析柱体积装入0.5-0.8kg大孔树脂；
然后：
第一步：用层析柱体积2-10倍量的浓度为35-55％甲醇或乙醇洗脱掉溶解液中的亲水性杂质；
第二步：再用层析柱体积5-10倍量的浓度为60-80％甲醇或乙醇洗脱层析柱得到鹅去氧胆酸溶液；
鹅去氧胆酸溶液按每升加入1-4g碳酸钠或氢氧化钠，加热回收鹅去氧胆酸溶液中的甲醇或乙醇，至鹅去氧胆酸溶液中的甲醇或乙醇浓度在10％以下，冷却至常温后过滤，滤液按1-5g/L的量加入工业用双氧水脱色10-24小时后，用盐酸调pH值至2.5-4.5，再过滤，滤饼用水洗至pH值至中性，低温烘干滤饼，就得到鹅去氧胆酸。
2.根据权利要求1所述的大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸的方法，其特征在于在第二步洗脱层析柱后，按层析柱体积5-10倍量的浓度为90％以上甲醇或乙醇再次洗脱层析柱，洗脱后的层析柱下次备用。
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