CN105884848A

CN105884848A - 一种猪去氧胆酸的提取方法

Info

Publication number: CN105884848A
Application number: CN201410496041.4A
Authority: CN
Inventors: 邓家国
Original assignee: CHANGDE YUNGANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHANGDE YUNGANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-09-17
Filing date: 2014-09-17
Publication date: 2016-08-24

Abstract

一种猪去氧胆酸的提取方法，本发明涉及生化制药领域。工艺步骤如下：1、胆汁酸的皂化，用碱皂化下脚料，调节PH值，乙酸乙酯萃取，活性炭脱色；2、将母液浓缩至适当体积，析出沉淀，分离沉淀并干燥得到粗品猪去氧胆酸；3、粗品进行酯化，然后与苯进行加成反应，利用不同胆汁酸甲酯与苯加成物在苯中的不同溶解度，分离猪去氧胆酸甲酯‑苯加成物；4、用碱分解加成物，调节PH值，获得猪去氧胆酸纯品；5、所得母液还可进一步提取高价值鹅去氧胆酸。整个工艺具有原料丰富易得，环境友好，安全无毒，成本低，产品纯度高，易于工业化大规模生产等优点。

Description

一种猪去氧胆酸的提取方法

技术领域

本发明涉及生化制药领域，尤其涉及一种利用猪胆汁或提取胆红素的下脚料制备高纯度猪去氧胆酸的方法。

背景技术

猪胆汁中含胆汁酸8.5～12％，主要包括四种胆汁酸，其中猪去氧胆酸(HDCA)占总胆汁酸的40％、3α-羟基-6-氧代-5α-胆烷酸占20％、鹅去氧胆酸(CDCA)和猪胆酸(HCA)约占9％，HDCA和猪胆酸是猪胆汁的特征成分。

HDCA为降血脂药，能抑制胆酸的形成及溶解脂肪，降低血中胆固醇和甘油三酯，适用于Ia或Ib型高血脂症、动脉粥样硬化症。对百日咳杆菌、白喉杆菌、金黄色葡萄球菌等有一定的抑菌作用。可用作消炎药，治疗慢性支气管炎、小儿病毒性上呼吸道炎症等。HDCA能刺激胆汁分泌，使胆汁变稀而不增加固体量，适用于胆道炎、胆囊炎、胆石症和其它非阻塞性胆汁郁积。HDCA能促进肠道脂肪分解和脂溶性维生素吸收，可用于肝胆疾患引起的消化不良。HDCA还是人工牛黄配方的重要原料。

关于HDCA的提取，一般以猪胆汁或加热提取胆红素后的猪胆汁为原料，工业盐酸酸化至刚果红变蓝，静置12h，收集沉淀并用水洗至中性，晾干，得到猪胆汁总胆酸。

取粗制猪胆汁酸，加2倍量(W/W)氢氧化钠，8倍量蒸馏水，加热皂化22h，冷却至室温，虹吸上层淡黄色液体，弃之，沉淀用少量水使之溶解，在搅拌下用1∶1盐酸调至刚果红试纸变蓝，过滤，收集沉淀并用水洗至中性，晾干，即得HDCA粗品。

取粗品加6倍量丙酮和0.04倍量活性炭，加热搅拌回流1h，放冷，过滤，合并滤液，加入30％(W/V)的无水硫酸钠脱水12h，过滤，滤液浓缩至原体积的2/5，放冷，析晶，抽滤，真空干燥，即得HDCA，熔点170～180℃。

或粗品加4倍量乙酸乙酯回流溶解后，加活性炭脱色，继续回流10分钟，冷却至31～41℃抽滤；滤渣再加3倍量乙酸乙酯回流，过滤，合并滤液，加20％的无水硫酸钠脱水，过滤后浓缩至原体积的1/2～1/3，冷却，析出结晶，收率按晾干的粗猪胆汁酸计算约为31％，熔点161～171℃。

为了克服现有方法生产HDCA时，产品纯度不高、乙酸乙酯和丙酮耗用量大等缺陷，本发明提供一种以猪胆汁或提取胆红素的下脚料为原料的生产高纯度HDCA的方法。

发明内容

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：以新鲜猪胆汁或猪胆汁提取胆红素的下脚料为原料，用碱皂化下脚料，严格控制皂化液的温度和pH，乙酸乙酯萃取，活性炭脱色。将母液浓缩至适当体积，分离沉淀得到HDCA粗品。将粗品进行酯化，然后与苯进行加成反应，利用不同胆汁酸甲酯与苯加成物在苯中的不同溶解度，分离猪去氧胆酸甲酯-苯加成物。用碱分解加成物，调节pH，获得HDCA纯品。所得母液还可进一步提取高价值的CDCA。制备方法包括以下步骤：

1、胆汁酸的皂化

将猪胆汁提取胆红素的下脚料用水稀释制成悬浮液，投料的重量比例为：下脚料∶水＝1∶6～8，此悬浮液固形物含量约为9％～13％，其胆汁酸的含量等同于等体积的新鲜猪胆汁。

取新鲜猪胆汁或上述悬浮液作为初始猪胆汁，加入初始猪胆汁重量9％～16％的氢氧化钠或氢氧化钾，加入初始猪胆汁重量2％的消泡剂，105～140℃加热回流15～24h，进行皂化。

2、总胆酸的分离

皂化反应完成后，待反应液冷却至50℃时，在搅拌的条件下用浓硫酸或盐酸将反应液调至pH8。酸化液温度保持在55±5℃，加入初始猪胆汁重量3～5％NaHSO₃，搅拌15分钟。然后加入反应液体积40％的乙酸乙酯或乙醚，边搅拌边用稀的硫酸或盐酸继续酸化至pH5，搅拌30分钟后静置1h，虹吸取出有机层。

加入初始猪胆汁重量5～10％的活性炭，48～56℃搅拌30分钟，过滤，残渣以初始猪胆汁体积5％的乙酸乙酯洗涤，合并滤液和洗涤液。

3、HDCA粗品的分离

将上述合并液减压浓缩至乙酸乙酯或乙醚加入量的1/2～2/3，伴随慢慢搅拌后有沉淀生成，然后置于室温下16～21h。抽滤，以乙酸乙酯清洗滤渣，直至滤液呈黄色。将清洗过的沉淀真空干燥，得到灰白色HDCA粗品。

4、HDCA的甲酯化

总胆酸溶于初始猪胆汁体积30％甲醇或乙醇中，加入适量浓硫酸、盐酸或磷酸酯化，室温搅拌13～35h。以NaHCO₃或Na₂CO₃中和至pH7，混合物过滤，减压浓缩得油状物。

油状物溶于初始猪胆汁体积30～40％热苯中，滤液减压浓缩到原体积的约1/2时，放置冰箱中过夜，析出粘稠物。过滤，用苯少许洗涤滤饼、即猪去氧胆酸甲酯-苯加成物。

5、HDCA纯品的分离

猪去氧胆酸甲酯-苯加成物加入初始猪胆汁重量4～6％的NaOH或KOH、初始猪胆汁体积10～12％水，水蒸汽蒸馏，直至苯全部蒸除，加入1N HCl调pH至4～5，析出沉淀，水洗至中性，真空干燥。得到HDCA纯品。

其中第4和第5步骤HDCA的纯化方法也可采用现有的生产方法的丙酮和乙酸乙酯重结晶方法，然而，所得产品的纯度能显著提高。

本发明在总胆酸的分离过程中，通过严格控制合理的pH和料液的温度，选择性沉淀猪胆汁酸，使得皂化产物中的猪胆汁酸能充分析出，同时减少了其中的杂质含量，减轻了后续HDCA的纯化难度。

本发明在HDCA的纯化过程中，利用胆汁酸甲酯苯加成物在苯中的不同溶解度这一特性，选择性沉淀猪去氧胆酸甲酯-苯加成物。一方面克服了有机溶剂重结晶这一传统方法溶剂耗用量大，操作繁琐的缺陷，另一方面使得终产品纯度显著提高。

本发明的HDCA生产方法成本较低、可形成工业化大规模生产、所得产品纯度高、总收率达到所投入下脚料的20％以上；该发明克服了现有方法所得产品纯度不高、乙酸乙酯和丙酮耗用量大等缺陷；该发明所用原料在产出HDCA后还可从中进一步提取高价值的CDCA产品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步阐述。

实施例1

一种猪去氧胆酸的提取方法，取猪胆汁提取胆红素的下脚料125g，用氢氧化钠皂化下脚料，投料的重量比例为：下脚料∶水∶氢氧化钠＝1∶7∶1.2，按重量比例下料，先于2L三颈烧瓶中进水875ml，再将150g氢氧化钠投入水中搅拌，待完全溶解后投入下脚料，升温到80℃前，加入消泡剂防止产生过多气泡。然后小心升温至110℃，回流反应25h。

皂化反应完成后，待反应液冷却至50℃时，边搅拌边用浓硫酸将反应液调至pH8，并使温度维持在55～60℃。然后加入5g NaHSO₃，搅拌15分钟。加入400ml乙酸乙酯，边搅拌边用稀硫酸进一步酸化至pH 5.0，温度保持在55℃，搅拌30分钟后静置1h，溶液分为两层，下层为黄色的水相，上层为棕红色的乙酸乙酯相，虹吸取出有机层。

加硅藻土及活性炭各10g，搅拌30分钟，过滤，残渣以50mL乙酸乙酯洗涤，合并滤液和洗涤液。将上述合并液减压浓缩至285ml，伴随慢慢搅拌后有沉淀生成，然后室温下静置15h。抽滤，以乙酸乙酯清洗滤饼，直至滤液呈淡黄色。所得固体真空干燥，得到30.5g的灰白色HDCA粗品。熔点为187.5～190.2℃，收率占所投入下脚料的24.4％。

实施例2

一种猪去氧胆酸的提取方法，将实施例1得到的30g HDCA，溶于300ml甲醇中，加4.0ml浓硫酸酯化，室温搅拌24h。用NaHCO₃中和至pH7，混合物过滤，减压浓缩得油状物。

油状物溶于350ml热苯中，滤液减压浓缩到原体积的约1/2时，放置冰箱中过夜，析出粘稠物。过滤，用苯少许洗涤滤饼。

猪去氧胆酸甲酯-苯加成物加入5.5gNaOH和100ml水，水蒸汽蒸馏，直至苯全部蒸除加入145ml 1N HCl后，析出沉淀，水洗至中性，真空干燥。得到27.07g熔点197～198.2℃的HDCA，本步收率为90.2％，总收率为所投入下脚料的22％，HPLC检测，纯度＞99％。

实施例3

一种猪去氧胆酸的提取方法，将实施例1得到的HDCA粗品用丙酮进行重结晶。取20gHDCA粗品加500ml丙酮和溶液体积5％的活性炭，混合溶解，回流0.5h。趁热过滤，用丙酮洗涤残渣，合并滤液和洗液，减压浓缩至200ml，在0～5℃冷藏15h，析出晶体。分离结晶，真空干燥，得到13.6g熔点196.7℃以上的白色HDCA，收率68％，HPLC检测，纯度＞98％。

实施例4

一种猪去氧胆酸的提取方法，将实施例1得到的HDCA粗品用乙酸乙酯进行重结晶。取20gHDCA粗品，加入乙酸乙酯200ml，混合溶解，回流0.5h。减压浓缩至溶液刚刚开始混浊。在0～5℃冷藏5h，结晶。分离结晶，真空干燥，得到16.6g熔点190.5℃以上的白色HDCA，收率83％。

实施例5

一种猪去氧胆酸的提取方法，取1000g新鲜猪胆汁和120g KOH，加入到2L的三颈烧瓶中，搅拌升温，升温至135℃，回流反应20h。

皂化反应完成后，待反应液冷却至50℃时，边搅拌边用浓盐酸将反应液调至pH8，并使温度维持在50～63℃。然后加入5.3g NaHSO₃，搅拌15分钟。加入400ml乙醚，一边搅拌一边用稀硫酸继续酸化至pH 4.75，温度保持在50℃，搅拌30分钟后静置1h，溶液分为两层，下层为微黄色的水相，上层为棕红色的乙醚相，虹吸取出有机层。

加硅藻土及活性炭各10g，搅拌30分钟，过滤，残渣以50ml乙醚洗涤，合并滤液和洗涤液。将上述合并液减压浓缩至250ml，伴随慢慢搅拌后有沉淀生成，然后室温下放置20h。过滤，以乙醚洗涤滤饼，直至滤液呈淡黄色。所得固体真空干燥，得到46g的灰白色HDCA粗品。收率为原胆汁重量的4.6％。

Claims

1.一种猪去氧胆酸的提取方法，其特征在于：以新鲜猪胆汁或猪胆汁提取胆红素的下脚料为原料，用碱皂化下脚料，控制皂化液的温度和pH，乙酸乙酯萃取，活性炭脱色；将母液浓缩至适当体积，分离沉淀得到HDCA粗品；将粗品进行纯化，获得HDCA纯品；其中制备HDCA粗品的方法包括以下步骤：(1)胆汁酸的皂化将猪胆汁提取胆红素的下脚料用水稀释制成悬浮液，投料的重量比例为：下脚料∶水＝1∶6～8，此悬浮液固形物含量约为9％～13％，其胆汁酸的含量等同于等体积的新鲜猪胆汁；取新鲜猪胆汁或上述悬浮液作为初始猪胆汁，加入初始猪胆汁重量9％～16％的氢氧化钠或氢氧化钾，加入初始猪胆汁重量2％的消泡剂，105～140℃加热回流15～24h，进行皂化；(2)总胆酸的分离皂化反应完成后，待反应液冷却至50℃时，在搅拌的条件下用浓硫酸或盐酸将反应液调至pH8；酸化液温度保持在55±5℃，加入初始猪胆汁重量3～5％NaHSO₃，搅拌15分钟；然后加入反应液体积40％的乙酸乙酯或乙醚，边搅拌边用稀的硫酸或盐酸继续酸化至pH5，搅拌30分钟后静置1h，虹吸取出有机层；加入初始猪胆汁重量5～10％的活性炭，48～56℃搅拌30分钟，过滤，残渣以初始猪胆汁体积5％的乙酸乙酯洗涤，合并滤液和洗涤液；(3)HDCA粗品的分离将上述合并液减压浓缩至乙酸乙酯或乙醚加入量的1/2～2/3，伴随慢慢搅拌后有沉淀生成，然后置于室温下16～21h；抽滤，以乙酸乙酯清洗滤渣，直至滤液呈黄色；将清洗过的沉淀真空干燥，得到灰白色HDCA粗品。

2.根据权利要求1所述的一种猪去氧胆酸的提取方法，其特征在于：所述制备得到HDCA粗品的纯化方法中包括：(1)HDCA的甲酯化：总胆酸溶于初始猪胆汁体积30％甲醇或乙醇中，加入适量浓硫酸、盐酸或磷酸酯化，室温搅拌13～35h。以NaHCO₃或Na₂CO₃中和至pH7，混合物过滤，减压浓缩得油状物；油状物溶于初始猪胆汁体积30～40％热苯中，滤液减压浓缩到原体积的约1/2时，放置冰箱中过夜，析出粘稠物；过滤，用苯少许洗涤滤饼、即猪去氧胆酸甲酯-苯加成物；(2)所述的HDCA纯品的分离：猪去氧胆酸甲酯-苯加成物加入初始猪胆汁重量4～6％的NaOH或KOH、初始猪胆汁体积10～12％水，水蒸汽蒸馏，直至苯全部蒸除，加入1N HCl调pH至4～5，析出沉淀，水洗至中性，真空干燥，得到HDCA纯品。

3.根据权利要求1所述的一种猪去氧胆酸的提取方法，其特征在于：所述制备得到HDCA粗品的纯化方法采用现有的丙酮和乙酸乙酯重结晶方法。