CN117736253B - 一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法 - Google Patents
一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117736253B CN117736253B CN202311790148.5A CN202311790148A CN117736253B CN 117736253 B CN117736253 B CN 117736253B CN 202311790148 A CN202311790148 A CN 202311790148A CN 117736253 B CN117736253 B CN 117736253B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bile
- chenodeoxycholic acid
- acid
- solution
- animal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 title claims abstract description 106
- RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N chenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N 0.000 title claims abstract description 81
- RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N (3beta,5beta,7alpha)-3,7-Dihydroxycholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 77
- 229960001091 chenodeoxycholic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 39
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 71
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 54
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 37
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 32
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 30
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 30
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 claims description 29
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 claims description 29
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 claims description 29
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 29
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 27
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 26
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 26
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 26
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 25
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 24
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 22
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 22
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 22
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 22
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 20
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 20
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 19
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 claims description 18
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 claims description 18
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 17
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 16
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 16
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 13
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 12
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 11
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 10
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 10
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 9
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 9
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 9
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 claims description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 8
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 claims description 8
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 claims description 8
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 8
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 8
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 8
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 claims description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 claims description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 9
- 108010000231 Choloylglycine hydrolase Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 abstract description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 abstract description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 22
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 9
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 9
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 8
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 7
- RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N ursodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N 0.000 description 7
- 229960001661 ursodiol Drugs 0.000 description 7
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N furfural Chemical compound O=CC1=CC=CO1 HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 201000001883 cholelithiasis Diseases 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 159000000009 barium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 208000001130 gallstones Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 sodium oxyhydroxide Chemical compound 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，属于化学药品原料药、制剂制造技术领域。本发明筛选两株产活性胆盐水解酶的微生物菌株，两者等比例混合发酵后，快速产生高活性的胆盐水解酶，可将动物胆汁中的结合态形式胆盐高效的解离为游离态形式，更利于后续鹅去氧胆酸的分离和纯化。本发明工艺方法简单易操作，可以用作药学研究机构对其进行生物活性，以及毒理药理研究。
Description
技术领域
本发明属于化学药品原料药、制剂制造技术领域，具体涉及一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法。
背景技术
鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)是动物体胆汁中的一种生化物质，是天然初级胆汁酸。在人、畜、禽的胆汁中广泛存在，是鸡、鸭和鹅等家禽胆汁中的主要有机成分。临床上不仅用做溶解胆结石和纠正饱和胆汁的药物，还具有显著的平喘、抗炎、镇咳、降血脂和祛痰的作用。鹅去氧胆酸阻碍机体吸收胆固醇，减少胆固醇的产生，使胆汁内胆固醇的含量降低来抵抗胆结石的生成，并帮助机体溶解已生成的胆结石，降低胆固醇的饱和度。熊胆酸(UDCA)是一种国内比较名贵的中药，在熊去氧胆酸的制备工艺中，CDCA与UDCA互为立体异构体，仅结构中7位羟基的立体构象不同，医药生产中常常以CDCA为原料合成获得UDCA。临床上医治胆疾和消化道疾病的药物里常会出现熊去氧胆酸。因此制备大量的鹅去氧胆酸有利于克服熊胆天然来源不足的缺陷，有利于熊去氧胆酸的制备。
大量的专利和文献报道了关于鹅去氧胆酸的分离纯化方法，其中较为常用的是钡盐和钙盐沉淀法等，例如，中国专利CN101143886公开的“禽类胆汁中鹅去氧胆酸的非有机溶剂提取法”：包括如下步骤：a.皂化反应：将禽胆汁与氢氧化钠按一定比例煮沸进行皂化，皂化时间20-24小时；b.中和反应；皂化液用盐酸中和及调节pH2-4；沉淀得总胆汁酸；c.钙盐沉淀：将总胆汁酸加氢氧钠溶液溶解，加活性炭，回流，过滤，滤液加10％-14％的氯化钙，得钙盐沉淀物；d.脱钙：钙盐按比例加入碳酸钠10％-15％，加热回流1-3小时，滤液用5％-10％的盐酸液调节pH2.0-3.5得沉淀：e.收集沉淀物，真空干燥，水洗干燥，得鹅去氧胆酸粗品。
但是现有技术的这些传统方法，提取方法都比较复杂且成本较高，限制了其开发利用，另外，传统工艺需要使用强碱下长时间的皂化反应，使用强碱且耗能高，急需研究安全、高效、绿色的胆汁酸提取替代工艺。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种高效提取鹅去氧胆酸的方法，采用生物发酵酶解的方法，工艺条件温和，提取效率高，工艺过程更加绿色和环保。
为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：
一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，包括以下步骤：
(1)制备微生物菌液：将两种微生物菌株活化后，分别接种到LB液体培养基中，35-37℃、180rpm-200rpm下培养10-12h，得到两种菌的种子液；
(2)将两种菌的种子液按照体积比1:1混合后，取10mL混合菌液接种到100mL液体发酵培养基中，混合培养24-36h，培养完成将发酵液于4℃-6℃冷冻离心收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀，再离心得到菌体沉淀，加磷酸缓冲液制成OD600为1.0-1.5的菌悬液，将菌悬液在冰浴中超声破碎，得到粗酶液；
(3)胆汁预处理：取动物胆汁，按照胆汁量体积添加粗酶液5-10mL/L，混合均匀，在35-37℃下，反应3-5h，得到预处理胆汁液；
(4)将预处理胆汁液中加入乙酸丁酯，混合均匀静置分层，取乙酸丁酯层，再加入碱液进行萃取，下层溶液用酸液调节pH为3-4，此时，胆酸类物质形成沉淀析出，过滤去除废水，收集固体，水洗干燥，得鹅去氧胆酸粗品；
(5)纯化：将得到的鹅去氧胆酸粗品，加入二氯甲烷，二氯甲烷用量与鹅去氧胆酸粗品的固液比为(9-11)mL：1g，升温搅拌，回流反应0.5-1小时，缓慢降温至0-5℃，搅拌结晶1-2小时，过滤，得鹅去氧胆酸精品。
进一步的，步骤(1)所述两种微生物菌株分别为干酪乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.1.8727，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2008年11月10日；所述植物乳杆菌的的保藏编号为CGMCC No.1.12974，原始保藏日期为2014年9月5日。
更进一步的，菌株活化的方法为：取冷冻保藏的菌株，解冻后接种于LB固体培养基，37±1℃活化培养24h-36h，得到活化的菌株。LB固体培养基的组成为：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠0.5g，加蒸馏水至100mL，调pH至5-6，加琼脂1.5％-2.0％，高压灭菌。
更进一步的，步骤(1)LB液体培养基的组成为：NaCl10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，蒸馏水1000mL，调节pH5-6。
本发明两种菌株均可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心开放购买，无需进行重复保藏。
进一步的，步骤(2)液体发酵培养基的组成为：蛋白陈6g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5mL、Na2HPO41g、MnSO40.025g、MgSO4·7H2O0.05g、蒸馏水500mL，调节pH5-6。
进一步的，步骤(3)所述动物胆汁为鸡胆汁、猪胆汁和鸭胆汁中的一种或者几种。
更进一步的，步骤(3)所述动物胆汁为鸡胆汁。
进一步的，步骤(4)所述碱液为氢氧化钠溶液或者碳酸氢钠溶液，质量浓度为10-20％。
进一步的，步骤(4)所述酸液为稀盐酸或稀硫酸，质量浓度为10-20％。
进一步的，步骤(4)预处理胆汁液、乙酸丁酯、碱液的体积比为3：2：2。
胆盐水解酶(Bile salt hydrolase，BSH)是微生物在生长过程中产生的代谢产物，通常为胞内酶，胆汁中结合态形式胆盐可被胆盐水解酶解离为游离态形式存在，从而实现胆汁中鹅去氧胆酸的分离和提纯。
有益效果：本发明筛选两株产活性胆盐水解酶的微生物菌株，两者等比例混合发酵后，快速产生高活性的胆盐水解酶，可将动物胆汁中的结合态形式胆盐高效的解离为游离态形式，更利于后续鹅去氧胆酸的分离和纯化。本发明工艺方法简单易操作，可以用作药学研究机构对其进行生物活性，以及毒理药理研究。
附图说明
图1为本发明所得鹅去氧胆酸与标准品的红外光谱图；
图2为鹅去氧胆酸标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。
实施例1
一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，包括以下步骤：
(1)制备微生物菌液：将两种微生物菌株活化后，分别接种到LB液体培养基中，35-37℃、180rpm下培养10h，得到两种菌的种子液；
(2)将两种菌的种子液按照体积比1:1混合后，取10mL混合菌液接种到100mL液体发酵培养基中，混合培养24h，培养完成将发酵液于4℃-6℃冷冻离心收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀，再离心得到菌体沉淀，加磷酸缓冲液制成OD600为1.0的菌悬液，将菌悬液在冰浴中超声破碎，得到粗酶液；
(3)胆汁预处理：取动物胆汁，按照胆汁量体积添加粗酶液5mL/L，混合均匀，在35-37℃下，反应3h，得到预处理胆汁液；
(4)将预处理胆汁液中加入乙酸丁酯，混合均匀静置分层，取乙酸丁酯层，再加入碱液进行萃取，下层溶液用酸液调节pH为3-4，此时，胆酸类物质形成沉淀析出，过滤去除废水，收集固体，水洗干燥，得鹅去氧胆酸粗品；
(5)纯化：将得到的鹅去氧胆酸粗品，加入二氯甲烷，二氯甲烷用量与鹅去氧胆酸粗品的固液比为9mL：1g，升温搅拌，回流反应0.5小时，缓慢降温至0-5℃，搅拌结晶1小时，过滤，得鹅去氧胆酸精品。
步骤(1)所述两种微生物菌株分别为干酪乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCCNo.1.8727，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2008年11月10日；所述植物乳杆菌的的保藏编号为CGMCC No.1.12974，原始保藏日期为2014年9月5日。
菌株活化的方法为：取冷冻保藏的菌株，解冻后接种于LB固体培养基，37±1℃活化培养24h，得到活化的菌株。LB固体培养基的组成为：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠0.5g，加蒸馏水至100mL，调pH至5-6，加琼脂1.5％，高压灭菌。
步骤(1)LB液体培养基的组成为：NaCl10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，蒸馏水1000mL，调节pH5-6。
本实施例两种菌株均可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心开放购买，无需进行重复保藏。
步骤(2)液体发酵培养基的组成为：蛋白陈6g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5mL、Na2HPO41g、MnSO40.025g、MgSO4·7H2O0.05g、蒸馏水500mL，调节pH5-6。
步骤(3)所述动物胆汁为鸡胆汁。
步骤(4)所述碱液为氢氧化钠溶液或者碳酸氢钠溶液，质量浓度为10％。
步骤(4)所述酸液为稀盐酸，质量浓度为10％。
步骤(4)预处理胆汁液、乙酸丁酯、碱液的体积比为3：2：2。
实施例2
一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，包括以下步骤：
(1)制备微生物菌液：将两种微生物菌株活化后，分别接种到LB液体培养基中，35-37℃、200rpm下培养11h，得到两种菌的种子液；
(2)将两种菌的种子液按照体积比1:1混合后，取10mL混合菌液接种到100mL液体发酵培养基中，混合培养30h，培养完成将发酵液于4℃-6℃冷冻离心收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀，再离心得到菌体沉淀，加磷酸缓冲液制成OD600为1.2的菌悬液，将菌悬液在冰浴中超声破碎，得到粗酶液；
(3)胆汁预处理：取动物胆汁，按照胆汁量体积添加粗酶液7mL/L，混合均匀，在35-37℃下，反应4h，得到预处理胆汁液；
(4)将预处理胆汁液中加入乙酸丁酯，混合均匀静置分层，取乙酸丁酯层，再加入碱液进行萃取，下层溶液用酸液调节pH为3-4，此时，胆酸类物质形成沉淀析出，过滤去除废水，收集固体，水洗干燥，得鹅去氧胆酸粗品；
(5)纯化：将得到的鹅去氧胆酸粗品，加入二氯甲烷，二氯甲烷用量与鹅去氧胆酸粗品的固液比为10mL：1g，升温搅拌，回流反应0.5小时，缓慢降温至0-5℃，搅拌结晶1小时，过滤，得鹅去氧胆酸精品。
步骤(1)所述两种微生物菌株分别为干酪乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCCNo.1.8727，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2008年11月10日；所述植物乳杆菌的的保藏编号为CGMCC No.1.12974，原始保藏日期为2014年9月5日。
菌株活化的方法为：取冷冻保藏的菌株，解冻后接种于LB固体培养基，37±1℃活化培养24h-36h，得到活化的菌株。LB固体培养基的组成为：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠0.5g，加蒸馏水至100mL，调pH至5-6，加琼脂2.0％，高压灭菌。
步骤(1)LB液体培养基的组成为：NaCl10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，蒸馏水1000mL，调节pH5-6。
本实施例两种菌株均可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心开放购买，无需进行重复保藏。
步骤(2)液体发酵培养基的组成为：蛋白陈6g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5mL、Na2HPO41g、MnSO40.025g、MgSO4·7H2O0.05g、蒸馏水500mL，调节pH5-6。
步骤(3)所述动物胆汁为鸡胆汁。
步骤(4)所述碱液为碳酸氢钠溶液，质量浓度为15％。
步骤(4)所述酸液为稀硫酸，质量浓度为15％。
步骤(4)预处理胆汁液、乙酸丁酯、碱液的体积比为3：2：2。
实施例3
一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，包括以下步骤：
(1)制备微生物菌液：将两种微生物菌株活化后，分别接种到LB液体培养基中，35-37℃、200rpm下培养12h，得到两种菌的种子液；
(2)将两种菌的种子液按照体积比1:1混合后，取10mL混合菌液接种到100mL液体发酵培养基中，混合培养36h，培养完成将发酵液于4℃-6℃冷冻离心收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀，再离心得到菌体沉淀，加磷酸缓冲液制成OD600为1.5的菌悬液，将菌悬液在冰浴中超声破碎，得到粗酶液；
(3)胆汁预处理：取动物胆汁，按照胆汁量体积添加粗酶液10mL/L，混合均匀，在35-37℃下，反应5h，得到预处理胆汁液；
(4)将预处理胆汁液中加入乙酸丁酯，混合均匀静置分层，取乙酸丁酯层，再加入碱液进行萃取，下层溶液用酸液调节pH为3-4，此时，胆酸类物质形成沉淀析出，过滤去除废水，收集固体，水洗干燥，得鹅去氧胆酸粗品；
(5)纯化：将得到的鹅去氧胆酸粗品，加入二氯甲烷，二氯甲烷用量与鹅去氧胆酸粗品的固液比为11mL：1g，升温搅拌，回流反应1小时，缓慢降温至0-5℃，搅拌结晶2小时，过滤，得鹅去氧胆酸精品。
步骤(1)所述两种微生物菌株分别为干酪乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCCNo.1.8727，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2008年11月10日；所述植物乳杆菌的的保藏编号为CGMCC No.1.12974，原始保藏日期为2014年9月5日。
菌株活化的方法为：取冷冻保藏的菌株，解冻后接种于LB固体培养基，37±1℃活化培养36h，得到活化的菌株。LB固体培养基的组成为：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠0.5g，加蒸馏水至100mL，调pH至5-6，加琼脂2.0％，高压灭菌。
步骤(1)LB液体培养基的组成为：NaCl10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，蒸馏水1000mL，调节pH5-6。
本实施例两种菌株均可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心开放购买，无需进行重复保藏。
步骤(2)液体发酵培养基的组成为：蛋白陈6g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5mL、Na2HPO41g、MnSO40.025g、MgSO4·7H2O0.05g、蒸馏水500mL，调节pH5-6。
步骤(3)所述动物胆汁为鸡胆汁。
步骤(4)所述碱液为氢氧化钠溶液，质量浓度为20％。
步骤(4)所述酸液为稀盐酸，质量浓度为20％。
步骤(4)预处理胆汁液、乙酸丁酯、碱液的体积比为3：2：2。
为进一步确认所得产品是鹅去氧胆酸，实验过程中测定了产品红外光谱(IR)，并与标准品相比较，图1显示，所得鹅去氧胆酸产品的红外光谱与鹅去氧胆酸标准品的基本相同，所得产品纯度接近标准品。
对比例1
一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，包括以下步骤：
(1)制备微生物菌液：将菌株活化后，接种到LB液体培养基中，35-37℃、200rpm下培养12h，得到种子液；
(2)取种子液10mL接种到100mL液体发酵培养基中，混合培养36h，培养完成将发酵液于4℃-6℃冷冻离心收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀，再离心得到菌体沉淀，加磷酸缓冲液制成OD600为1.5的菌悬液，将菌悬液在冰浴中超声破碎，得到粗酶液；
(3)胆汁预处理：取动物胆汁，按照胆汁量体积添加粗酶液10mL/L，混合均匀，在35-37℃下，反应5h，得到预处理胆汁液；
(4)将预处理胆汁液中加入乙酸丁酯，混合均匀静置分层，取乙酸丁酯层，再加入碱液进行萃取，下层溶液用酸液调节pH为3-4，此时，胆酸类物质形成沉淀析出，过滤去除废水，收集固体，水洗干燥，得鹅去氧胆酸粗品；
(5)纯化：将得到的鹅去氧胆酸粗品，加入二氯甲烷，二氯甲烷用量与鹅去氧胆酸粗品的固液比为11mL：1g，升温搅拌，回流反应1小时，缓慢降温至0-5℃，搅拌结晶2小时，过滤，得鹅去氧胆酸精品。
步骤(1)所述菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.1.8727，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2008年11月10日。
菌株活化的方法为：取冷冻保藏的菌株，解冻后接种于LB固体培养基，37±1℃活化培养36h，得到活化的菌株。LB固体培养基的组成为：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠0.5g，加蒸馏水至100mL，调pH至5-6，加琼脂2.0％，高压灭菌。
步骤(1)LB液体培养基的组成为：NaCl10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，蒸馏水1000mL，调节pH5-6。
本对比例菌株均可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心开放购买，无需进行重复保藏。
步骤(2)液体发酵培养基的组成为：蛋白陈6g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5mL、Na2HPO41g、MnSO40.025g、MgSO4·7H2O0.05g、蒸馏水500mL，调节pH5-6。
步骤(3)所述动物胆汁为鸡胆汁。
步骤(4)所述碱液为氢氧化钠溶液，质量浓度为20％。
步骤(4)所述酸液为稀盐酸，质量浓度为20％。
步骤(4)预处理胆汁液、乙酸丁酯、碱液的体积比为3：2：2。
本对比例，除了微生物菌液制备中仅仅使用干酪乳杆菌外，其余原料和工艺步骤均同实施例3。
对比例2
一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，包括以下步骤：
(1)制备微生物菌液：将菌株活化后，接种到LB液体培养基中，35-37℃、200rpm下培养12h，得到种子液；
(2)取种子液10mL接种到100mL液体发酵培养基中，混合培养36h，培养完成将发酵液于4℃-6℃冷冻离心收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀，再离心得到菌体沉淀，加磷酸缓冲液制成OD600为1.5的菌悬液，将菌悬液在冰浴中超声破碎，得到粗酶液；
(3)胆汁预处理：取动物胆汁，按照胆汁量体积添加粗酶液10mL/L，混合均匀，在35-37℃下，反应5h，得到预处理胆汁液；
(4)将预处理胆汁液中加入乙酸丁酯，混合均匀静置分层，取乙酸丁酯层，再加入碱液进行萃取，下层溶液用酸液调节pH为3-4，此时，胆酸类物质形成沉淀析出，过滤去除废水，收集固体，水洗干燥，得鹅去氧胆酸粗品；
(5)纯化：将得到的鹅去氧胆酸粗品，加入二氯甲烷，二氯甲烷用量与鹅去氧胆酸粗品的固液比为11mL：1g，升温搅拌，回流反应1小时，缓慢降温至0-5℃，搅拌结晶2小时，过滤，得鹅去氧胆酸精品。
步骤(1)所述菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述植物乳杆菌的的保藏编号为CGMCC No.1.12974，原始保藏日期为2014年9月5日。
菌株活化的方法为：取冷冻保藏的菌株，解冻后接种于LB固体培养基，37±1℃活化培养36h，得到活化的菌株。LB固体培养基的组成为：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠0.5g，加蒸馏水至100mL，调pH至5-6，加琼脂2.0％，高压灭菌。
步骤(1)LB液体培养基的组成为：NaCl10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，蒸馏水1000mL，调节pH5-6。
本对比例菌株均可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心开放购买，无需进行重复保藏。
步骤(2)液体发酵培养基的组成为：蛋白陈6g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5mL、Na2HPO41g、MnSO40.025g、MgSO4·7H2O0.05g、蒸馏水500mL，调节pH5-6。
步骤(3)所述动物胆汁为鸡胆汁。
步骤(4)所述碱液为氢氧化钠溶液，质量浓度为20％。
步骤(4)所述酸液为稀盐酸，质量浓度为20％。
步骤(4)预处理胆汁液、乙酸丁酯、碱液的体积比为3：2：2。
本对比例，除了微生物菌液制备中仅仅使用植物乳杆菌外，其余原料和工艺步骤均同实施例3。
对比例3
一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，包括以下步骤：
(1)制备微生物菌液：将两种微生物菌株活化后，分别接种到LB液体培养基中，35-37℃、200rpm下培养12h，得到两种菌的种子液；
(2)将两种菌的种子液按照体积比1:2混合后，取10mL混合菌液接种到100mL液体发酵培养基中，混合培养36h，培养完成将发酵液于4℃-6℃冷冻离心收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀，再离心得到菌体沉淀，加磷酸缓冲液制成OD600为1.5的菌悬液，将菌悬液在冰浴中超声破碎，得到粗酶液；
(3)胆汁预处理：取动物胆汁，按照胆汁量体积添加粗酶液10mL/L，混合均匀，在35-37℃下，反应5h，得到预处理胆汁液；
(4)将预处理胆汁液中加入乙酸丁酯，混合均匀静置分层，取乙酸丁酯层，再加入碱液进行萃取，下层溶液用酸液调节pH为3-4，此时，胆酸类物质形成沉淀析出，过滤去除废水，收集固体，水洗干燥，得鹅去氧胆酸粗品；
(5)纯化：将得到的鹅去氧胆酸粗品，加入二氯甲烷，二氯甲烷用量与鹅去氧胆酸粗品的固液比为11mL：1g，升温搅拌，回流反应1小时，缓慢降温至0-5℃，搅拌结晶2小时，过滤，得鹅去氧胆酸精品。
步骤(1)所述两种微生物菌株分别为干酪乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCCNo.1.8727，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2008年11月10日；所述植物乳杆菌的的保藏编号为CGMCC No.1.12974，原始保藏日期为2014年9月5日。
菌株活化的方法为：取冷冻保藏的菌株，解冻后接种于LB固体培养基，37±1℃活化培养36h，得到活化的菌株。LB固体培养基的组成为：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠0.5g，加蒸馏水至100mL，调pH至5-6，加琼脂2.0％，高压灭菌。
步骤(1)LB液体培养基的组成为：NaCl10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，蒸馏水1000mL，调节pH5-6。
本对比例两种菌株均可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心开放购买，无需进行重复保藏。
步骤(2)液体发酵培养基的组成为：蛋白陈6g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5mL、Na2HPO41g、MnSO40.025g、MgSO4·7H2O0.05g、蒸馏水500mL，调节pH5-6。
步骤(3)所述动物胆汁为鸡胆汁。
步骤(4)所述碱液为氢氧化钠溶液，质量浓度为20％。
步骤(4)所述酸液为稀盐酸，质量浓度为20％。
步骤(4)预处理胆汁液、乙酸丁酯、碱液的体积比为3：2：2。
本对比例，除了加大植物乳杆菌的使用比例外，即：在步骤(2)中：两种菌的种子液按照体积比1:2混合。其余原料和制备方法均同实施例3。
对比例4
类似于对比例3，本对比例，除了加大干酪乳杆菌的使用比例外，即：在步骤(2)中：两种菌的种子液按照体积比2:1混合。其余原料和制备方法均同实施例3。
对比例5
传统皂化法制备粗品：
取胆汁20mL装入耐压管，管中各加入2gNaOH于110℃油浴中加热进行皂化反应，连续皂化22h，皂化结束取样，冰浴冷却终止反应，并将各样品调至pH为2-3进行沉淀，离心，沉淀层使用清水洗涤两次，干燥，称重、计算得率，测CDCA含量。精制提纯方法同实施例3：
即：将得到的鹅去氧胆酸粗品，加入二氯甲烷，二氯甲烷用量与鹅去氧胆酸粗品的固液比为11mL：1g，升温搅拌，回流反应1小时，缓慢降温至0-5℃，搅拌结晶2小时，过滤，得鹅去氧胆酸精品。
性能测试
实验胆汁：新鲜鸡胆低温冷冻结块，切片置于过滤网，室温解冻使胆汁自然流出，收集胆汁即可。
A.粗酶液中酶活力检测：
检测方法：茚三酮法(董自星等，“植物乳杆菌BBE7的胆盐水解酶基因在毕赤酵母中的分泌表达”应用与环境生物学报，2014，20(1)：107-111)定量检测酶活力：分别检测实施例1-3以及对比例1-4所得粗酶液的酶活力。
按照实施例1-3以及对比例1-5的方法提取鹅去氧胆酸粗品以及精品。
B.粗品得率以及其中CDCA含量：
检测方法：
标准曲线的绘制
粗品CDCA的测定
精密量取CDCA标准品12.5mg，置于25mL容量瓶中，加入60％醋酸定容，摇匀，精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置带塞试管中，用60％醋酸溶液稀释1.0mL，加1％糠醛溶液1mL，在冰浴中放置5min，加硫酸溶液(V(H2SO4)∶V(H2O)＝50：65)13mL混匀，在70℃水浴中加热10min迅速移至冰浴中放置2min取出，以相应试剂为空白，在380nm波长处紫外分光光度计测定吸光度，根据吸光光度值绘出标准曲线图，并计算R2值。标准曲线为：y＝0.641x-0.0035，R2＝0.9991(图2)。
精密称取粗品12.5mg，加60％醋酸液适量，充分搅拌，移入25mL容量瓶中，残渣再用60％醋酸液搅拌，全部移入容量瓶中并稀释至25mL，精密量取溶液1mL，置于试管中加1％糠醛液1mL，在冰浴中放置5min，加(V(H2SO4)∶V(H2O)＝50∶65)硫酸溶液13mL混匀，在70℃水浴中加热10min，迅速移至冰浴中放置2min，取出，以相应试剂为空白，紫外分光光度计在380nm波长处测定吸光度，根据吸光度计算样品中CDCA的含量(mg)。
胆汁酸得率％＝粗品质量/胆汁质量×100％
表1不同方法胆汁酸得率和CDCA含量
| 实验组 | 胆汁酸得率％ | 粗品中CDCA含量％ |
| 实施例1 | 11.33 | 75.33 |
| 实施例2 | 11.41 | 75.69 |
| 实施例3 | 11.45 | 75.72 |
| 对比例1 | 9.25 | 70.01 |
| 对比例2 | 9.17 | 69.25 |
| 对比例3 | 10.36 | 70.08 |
| 对比例4 | 10.55 | 70.15 |
| 对比例5 | 11.11 | 52.36 |
从表中数据我们可以看出，本发明实施例方法提取胆汁酸的效率与皂化方法基本相当，而CDCA的含量远高于皂化反应(对比例5)，可见，本发明两种微生物等比例混合后协同发酵得到高活性的胆盐水解酶，得到的粗酶液实现胆汁酸的有效提制，提取物纯度高。而改变了微生物组成的对比例2-3，两种微生物的协同作用减弱或者消失，酶活性下降，从而导致提制效率的下降。
表2粗酶液酶活力数据
需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。
Claims (7)
1.一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备微生物菌液：将两种微生物菌株活化后，分别接种到LB液体培养基中，35-37℃、180rpm-200rpm下培养10-12h，得到两种菌的种子液；
(2)将两种菌的种子液按照体积比1:1混合后，取10mL混合菌液接种到100mL液体发酵培养基中，混合培养24-36h，培养完成将发酵液于4℃-6℃冷冻离心收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀，再离心得到菌体沉淀，加磷酸缓冲液制成OD600为1.0-1.5的菌悬液，将菌悬液在冰浴中超声破碎，得到粗酶液；
(3)胆汁预处理：取动物胆汁，按照胆汁量体积添加粗酶液5-10mL/L，混合均匀，在35-37℃下，反应3-5h，得到预处理胆汁液；
(4)将预处理胆汁液中加入乙酸丁酯，混合均匀静置分层，取乙酸丁酯层，再加入碱液进行萃取，下层溶液用酸液调节pH为3-4，此时，胆酸类物质形成沉淀析出，过滤去除废水，收集固体，水洗干燥，得鹅去氧胆酸粗品；
(5)纯化：将得到的鹅去氧胆酸粗品，加入二氯甲烷，二氯甲烷用量与鹅去氧胆酸粗品的固液比为（9-11）mL：1g，升温搅拌，回流反应0.5-1小时，缓慢降温至0-5℃，搅拌结晶1-2小时，过滤，得鹅去氧胆酸精品；
步骤（1）所述两种微生物菌株分别为干酪乳杆菌和植物乳杆菌，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.1.8727，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2008年11月10日；所述植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC No. 1.12974，原始保藏日期为2014年9月5日。
2.根据权利要求1所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤（2）液体发酵培养基的组成为：蛋白陈6g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5mL、Na2HPO41g、MnSO40.025g、MgSO4·7H2O0.05g、蒸馏水500mL，调节pH5-6。
3.根据权利要求1所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤（3）所述动物胆汁为鸡胆汁、猪胆汁和鸭胆汁中的一种或者几种。
4.根据权利要求3所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤（3）所述动物胆汁为鸡胆汁。
5.根据权利要求1所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤（4）所述碱液为氢氧化钠溶液或者碳酸氢钠溶液。
6.根据权利要求1所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤（4）所述酸液为稀盐酸或稀硫酸。
7.根据权利要求1所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤（4）预处理胆汁液、乙酸丁酯、碱液的体积比为3：2：2。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311790148.5A CN117736253B (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311790148.5A CN117736253B (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117736253A CN117736253A (zh) | 2024-03-22 |
| CN117736253B true CN117736253B (zh) | 2024-06-25 |
Family
ID=90277623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311790148.5A Active CN117736253B (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117736253B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102703556A (zh) * | 2012-05-30 | 2012-10-03 | 绵阳劲柏生物科技有限责任公司 | 大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸的方法 |
| CN106676156A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-05-17 | 眉山市新功生物科技有限公司 | 石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220166803A (ko) * | 2020-03-10 | 2022-12-19 | 페더레이션 바이오 인코포레이티드 | 질병 치료용 미생물 컨소시엄 |
| CN112898370B (zh) * | 2021-01-25 | 2022-04-12 | 中山百灵生物技术股份有限公司 | 一种从鸭胆汁中提取别鹅去氧胆酸的方法 |
-
2023
- 2023-12-25 CN CN202311790148.5A patent/CN117736253B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102703556A (zh) * | 2012-05-30 | 2012-10-03 | 绵阳劲柏生物科技有限责任公司 | 大孔树脂分离鸭胆汁中鹅去氧胆酸的方法 |
| CN106676156A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-05-17 | 眉山市新功生物科技有限公司 | 石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117736253A (zh) | 2024-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106636288B (zh) | 一种发酵提取剑麻皂素的方法 | |
| CN109251954B (zh) | 一种海参多肽的生产方法 | |
| CN113024680B (zh) | 一种具有显著益生活性羊栖菜多糖及其制备方法与应用 | |
| CN109504725B (zh) | 一种发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法和发酵培养基 | |
| CN109527602B (zh) | 提高青稞若叶粉中可溶性膳食纤维含量的方法 | |
| CN108018234A (zh) | 一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用 | |
| CN111484954A (zh) | 一株产褐藻胶裂解酶的产黑假交替单胞菌 | |
| CN111671069A (zh) | 一种从破壁松花粉中提取松花粉壁的方法 | |
| CN116784435A (zh) | 一种柑橘渣的回收利用方法、添加剂 | |
| CN117736253B (zh) | 一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法 | |
| CN102669685B (zh) | 山杏果肉膳食纤维制品及其制备方法 | |
| CN115385980B (zh) | 一种坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽及其制备方法和应用 | |
| CN116410871A (zh) | 一种木贼镰孢菌及其羟基化石胆酸的方法 | |
| CN116144506A (zh) | 土曲霉dk3-18及其在提取柿叶总黄酮中的应用 | |
| CN111647092B (zh) | 一种利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法及其应用 | |
| CN107502631A (zh) | 一种产朊假丝酵母β‑D‑葡聚糖的生产方法 | |
| CN115260324B (zh) | 一种具有肠道益生活性的佛手多糖的制备方法 | |
| CN115074256B (zh) | 一种猴头菇液体发酵培养基以及制备三萜的方法 | |
| CN108912204A (zh) | 一种从剑麻渣提取剑麻皂素的方法 | |
| CN114773408B (zh) | 一种从发酵液中制取唾液酸的方法 | |
| AU2020102037A4 (en) | A method of efficiently increasing the alpha-glucosidase inhibitor content in fresh mulberry leaves by the solid-state fermentation | |
| CN104152510A (zh) | 一种利用胨冻样类芽孢杆菌发酵蔗糖生产多聚果糖的生产方法 | |
| CN115948280B (zh) | 一株产淀粉酶菌株r26及其应用 | |
| CN116478888B (zh) | 一株多功能植物乳植杆菌及其应用 | |
| CN116790387A (zh) | 一株纤维素降解菌及其在油茶粕可溶性膳食纤维改性中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |