CN1765912A - 火棘提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种火棘(Pyracantha fortuneana(Maxim.)Li)提取物，包括组分芦丁、金丝桃苷；其制备方法包括干燥并粉碎的火棘果实中加入相当于其1～50倍重量的水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮中的一种或一种以上，提取得到提取液；提取液经过滤，离心分离，浓缩，冷冻干燥；经大孔树脂、正相硅胶和反相C18填料柱层析，洗脱分离纯化。火棘提取物可用于制备缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤等不良反应的药物，也可用于制备缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤等不良反应的食品或食品添加剂。

Description

火棘提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及火棘提取物及其制备方法，本发明还涉及火棘(Pyracantha fprtuneana(Maxim.)Li)提取物在制备缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤等不良反应的药物、食品或食品添加剂的应用。

背景技术

当今社会飞速发展，人们的生活质量逐年提高。但不能忽视的问题是，在这一过程中，人们所感受到的来自不同方面和层次的心理压力也在随之增长。面对紧张的工作、生活等多方面的精神压力，处于亚健康状态人群逐年增加，甚至在体内潜伏着各种病灶，这种状况已经成为社会一大潜在的危机。

人们所承受的各种心理和生理压力在科学上都可以概括为“应激”。应激是Salye 20世纪20年代就已经提出的概念，是指一种在外环境剧变的刺激下，机体出现的综合应答状态，包括精神、神经、内分泌和免疫等多方面的反应。应激是一种常见的致病、致伤因子。尤其是慢性持续性应激常引起内脏器官、组织的病理性损伤，可引起代谢紊乱，诱发多种疾病，严重危害人们的身心健康，对社会带来不利的影响。

现代医学研究也证实情绪性应激可以明显影响机体的神经、内分泌和免疫等功能，应激或心理防御机制的破坏与多种疾病的发生发展有着密切的关系。在神经、内分泌及免疫系统这三者的相互关系中，活性氧(reactive oxygen species，ROS)或者说是氧自由基的有害氧化是三者之间内在共同的根本机制之一。

正常状态下，机体的氧来自于肺部的呼吸，通过肺泡交换被血液带入全身各个组织器官供应生命活动所必需的氧。同时新陈代谢的过程也产生一定氧自由基，活性自由基的强氧化能力在正常状态下具有杀死有害细菌，防治感染，维持内环境的作用。当机体感受应激原时，下丘脑-垂体-肾上腺轴兴奋性提高，肾上腺分泌糖皮质激素水平升高，大脑警觉性提高，肌肉运动能力提高，血糖血压上升，脉搏数增加，从而动员储能，适应环境。此时，机体的血液大量流入外周循环中，使内脏器官处于一种缺血缺氧的状态。当外界应激解除或缓解时，机体各项生理功能恢复正常，内脏器官的缺血再灌注会导致活性氧自由基的爆发性增高。活性氧在机体内的大量爆发和蓄积便会造成DNA链损伤，损害细胞膜，促进早衰过程，引起各种组织和器官发生病变。

肝脏是人体中血流最为丰富的器官之一，对缺血缺氧极为敏感，是各种活性氧攻击的主要目标，氧自由基的毒害作用在肝损害发病过程中起着关键性作用。实验证实肝脏在急性缺血再灌流的应激状态下氧自由基爆发性增高。机体通过酶系统与非酶系统产生的氧自由基，能够攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)而引发脂质过氧化反应，生成脂质过氧化产物如：丙二醛(MDA)、酮基、羟基或氢过氧基，以及新的氧自由基等。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支链式反应放大活性氧作用。肝细胞膜在受损伤的同时产生大量新的活性氧基团，促发脂质过氧化的链式反应，因此而产生的脂质过氧化物可以损伤肝脏中的各种细胞，故肝细胞膜的脂质过氧化是肝细胞损伤时的主要作用机制之一。因而测试最主要的脂质过氧化物——MDA的含量可反映肝脏内脂质过氧化的程度，间接反映出肝脏细胞受损伤的程度。氧自由基引起的脂质过氧化作用宏观表现为：使肝细胞膜的流动性下降，通透性增加，谷丙转氨酶释放入血，血中酶活力增加。因而测定血浆或血清中谷丙转氨酶的活力可以作为肝损伤诊断的一个重要指标。

鉴于目前现代社会的发展趋势，人们处于越来越大、各种各样的应激中，机体对活性氧的防御功能下降，内脏器官长期处于亚健康状态。因此，从身体健康及生活习惯角度出发，具有抗应激作用，能够改善和缓解应激引起的肝损伤等各种不良反应的药物、食品和食品添加剂成为人们的关注焦点和迫切需要。

火棘(Pyracantha fortuneana(Maxim.)Li)是一种常绿野生灌木，属蔷薇科苹果亚科火棘属，其果实又名赤阳子、红姑娘、救军粮等，广布于我国东南、西南和西北各省，资源十分丰富。

近年，火棘作为天然抗氧化物质引起了国内外学者的广泛重视，其对氧自由基的抵抗作用等已有一些报道。但至今为止有关火棘或火棘有效成分芦丁和金丝桃苷的抗应激反应、改善应激反应引起的氧自由基爆发性增高从而导致的各种临床症状的作用尚未报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以芦丁和金丝桃苷为主要成分的火棘提取物。

本发明的目的还在于提供所述火棘提取物的制备方法。

本发明的目的还在于提供所述火棘提取物的在制备缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤等不良反应的药物中的应用。

本发明的目的还在于提供所述火棘提取物的在制备缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤等不良反应的食品或食品添加剂中的应用。

本发明所述的火棘提取物的重量组分如下：

芦丁               1％-50％

金丝桃苷           0.3％-50％

其他组分           余量；

所述其他组分主要是提取过程中得到的其他黄酮、酚酸和糖苷类化合物；芦丁和金丝桃苷的结构式如下：

    芦丁(rutin)                                                          金丝桃苷(hyperoside)；

本发明所述的火棘提取物是采用水或水与甲醇、乙醇等低级醇类、丙酮等极性溶剂的一种或两种以上的任意混合溶剂进行提取的。更具体地，本发明所述的火棘提取物的制备方法包括如下步骤：

(1)燥并粉碎的火棘果实中加入相当于其1～50倍重量的水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮中的一种或一种以上，提取得到提取液；

(2)步骤(1)得到的提取液经过滤，离心分离，浓缩，冷冻干燥；

(3)经大孔树脂、正相硅胶和反相C18填料柱层析，洗脱分离纯化。

步骤(1)中所述的提取采用冷浸、渗滤、加热回流、超声、微波中的一种或一种以上方法进行。

步骤(1)中的最佳提取时间为30秒至24小时。

因为火棘果实中富含芦丁和金丝桃苷，和丰富的氨基酸、脂肪酸、多糖、微量元素等类营养成分，都属于中高极性化合物，一般用水或者不同浓度的低级醇类、丙酮等极性溶剂或任意混合溶剂来提取。在提取时，适宜的醇浓度，可以提高火棘中活性成分的回收率。但对于火棘中活性成分的提取而言，上述提取方法及其任意组合都可达到本发明所述的提取物。

鉴于火棘提取物是以药物或食品作为最终产品开发，故从安全性角度考虑提取溶剂应尽量选择含水乙醇为宜。

提取时火棘果实与溶剂的比率没有特定限制，火棘与溶剂的比例以1∶1～50重量范围为宜。

本发明对提取温度没有特定限制，从室温到溶剂沸点温度都适用。当然室温、常压以及在溶剂沸点范围内提取最为理想。

提取时间从30秒至24小时为最佳。

在提取火棘提取物时，根据需要也可以在溶剂中添加碳酸氢钠、抗坏血酸钠盐等物质。这些提取方法不会影响火棘本来具有的生物活性。

所述的火棘提取物可用于制备缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤及其临床症状的药物。

所述的火棘提取物还可用于制备缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤及其临床症状的药物。所制备的药物可以长期服用，安全性高，无毒副作用。

本发明所述的火棘提取物还可用于制备缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤等不良反应的食品或食品添加剂。所制备的食品或食品添加剂可以长期服用，安全性高，无毒副作用。

本发明提供的火棘提取物固形剂使用量一般在0.1％至99％(W/W)，通常口服剂型添加浓度一般在0.1％至50％(W/W)范围较为适宜。在这个浓度范围内，火棘提取物适于直接服用，容易被消费者接受。当然，作为添加剂的火棘提取物随着加入量的增大，可能会出现苦涩感觉。其解决办法可以根据市场需要及消费者的心理要求改换剂型，例如使用片剂、颗粒剂、胶囊剂等剂型。低浓度火棘提取物溶液可以作为日常饮料提供给消费者。

本发明提供的火棘提取物及火棘活性成分，可以用于各种口服剂型投放市场，用于预防及改善由应激引起的疲劳和肝损伤及其临床症状。当然，火棘提取物也可以与常用的赋形剂等医药用载体结合做成制剂。必要时，还可以加入一些防腐剂、抗氧化剂、色素、甜味剂等制剂添加物。

比较适宜的火棘赋形剂，一般考虑有乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、结晶纤维素等。润滑剂一般应采用硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉等。溶剂通常使用精制水、乙醇、丙二醇等。防腐剂一般采用氯丁醇、苄醇、二羟基乙酸等。抗氧化剂通常以亚硫酸盐、抗坏血酸等比较适宜。

本发明提供的火棘提取物，可以其溶液或粉末添加到制品中用于口服。火棘提取物也可与其他饮料原料结合制成一定的饮料制品，如火棘饮料、碳酸饮料、果汁饮料、乳酸菌饮料、运动饮料、豆乳等。火棘提取物还可以考虑制成饼干、巧克力、糖果、口香糖、快餐点心、果冻点心、面包、豆腐、酸奶酪等日常食品。

本发明提供的火棘提取物及其所含活性成分可以作为药物、健康食品、食品或食品添加剂，用于预防及改善由应激引起的疲劳和肝损伤及其临床症状。本发明中，火棘提取物的给药剂量，可以根据使用者的相对健康状态、年龄、性别及体重等条件适当选择。成人平均体重以60公斤计算，一天口服火棘提取物一般可以考虑在1克至5克范围内，分次服用。当然5克以上也不存在副作用等问题。

本发明以束缚应激(restraint stress)负荷小鼠作为氧化应激实验模型，评价火棘提取物对小鼠血浆中抗氧化能力指数(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)，肝脏中丙二醛(MDA)含量，血浆中谷丙转氨酶(ALT)活性的影响。结果显示，火棘提取物对应激负荷诱发的小鼠抗氧化能力低下、血浆谷丙转氨酶升高表现出统计学上有意义的改善效果。在体外抗氧化实验中，火棘提取物所含的活性成分芦丁和金丝桃苷也显示出较强的抗氧化作用。基于上述结果，确认本发明所述的以芦丁和金丝桃苷为有效成分的火棘提取物的新用途的成立。

根据上述实验可以证明本发明提供以芦丁和金丝桃苷为活性成分的火棘提取物是一种安全性高，来自天然的通过抗氧化作用，从而达到缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤等不良反应，用于制备可以长期服用、安全无毒副作用的药物、食品或食品添加剂。

此外，本发明也提示以芦丁和金丝桃苷为活性成分的火棘提取物也可以作为抗氧化剂或抗氧化组成物原料，用于缓解及改善由应激引起的肝损伤等不良反应。由于本发明提供的火棘提取物是天然来源的物质，且民间长期有食用的经验，适用于各个年龄阶段和健康状况的人。因此，以芦丁和金丝桃苷为活性成分的火棘提取物可以作为健康食品、食品添加剂，提供多种用途。再有，尽管芦丁和金丝桃苷是已知化合物，但是其通过ORAC方法显示出的抗氧化活性是通过本发明初次证实的。

附图说明

图1是本发明的火棘提取物的HPLC分析图谱；

图2是图1所述的火棘提取物对拘束应激小鼠血浆抗氧化能力指数(ORAC)的影响分析图；

图3是图1所述火棘提取物对拘束应激小鼠血浆中Vitamin C含量影响分析图；

图4是图1所述的火棘提取物对拘束应激小鼠肝脏组织中Vitamin C含量影响分析图；

图5是图1所述的火棘提取物的体外抗氧化能力指数(ORAC)测定结果图；

图6是图1所述的火棘提取物有效成分——芦丁的体外抗氧化能力指数(ORAC)测定结果图；

图7是图1所述的火棘提取物有效成分——金丝桃苷的体外抗氧化能力指数(ORAC)测定结果图；

图8是图1所述的火棘提取物对拘束应激小鼠血浆丙二醛(MDA)含量的影响分析图；

图9是图1所述的火棘提取物对应激小鼠肝脏丙二醛(MDA)含量的影响分析图；

图10是图1所述的火棘提取物对应激小鼠血浆谷丙转氨酶(ALT)活性的影响分析图。

具体实施方式

实施例1：火棘提取物的制备

取火棘干燥果实100克，适当粉碎，加入60％乙醇水溶液2000毫升回流提取1小时，提取液经纱布过滤后，再经离心(1000转/分，5分钟)分离，回收上清液冷冻干燥即得火棘提取物。该提取物按照一定比例加入淀粉、硬脂酸镁制剂辅料可以制成片剂，也可以经过包衣工序制成薄膜衣片。

实施例2：火棘提取物的制备

取火棘干燥果实200克，适当粉碎，加入蒸馏水2000毫升90℃浸泡3小时，提取液经纱布过滤后，再经离心(1500转/分，5分钟)分离，回收上清液浓缩后与辅料一起通过喷雾干燥过程得到火棘颗粒剂。

实施例3：火棘提取物的制备

取火棘干燥果实50克，适当粉碎，加入丙酮溶液500毫升超声提取0.5小时，提取液经纱布过滤后，再经离心(800转/分，3分钟)分离，回收上清液冷冻干燥即得火棘提取物。冷冻干燥即得火棘提取物。该火棘提取物经水等溶剂溶解后，添加一定比例的甜味剂、色素、抗氧化剂等，制成火棘口服液或饮料。

实施例4：火棘提取物的制备

取火棘干燥果实150克，适当粉碎，加入30％乙醇水溶液1500毫升微波提取40分钟，提取液经纱布过滤后，再经离心(1200转/分，5分钟)分离，回收上清液冷冻干燥即得火棘提取物。该火棘提取物，可以其溶液或粉末添加到饼干、面包、巧克力、糖果、果冻、奶制品等食品中。

实施例1至4所得的火棘的冷冻干燥提取物用于下列实验，验证其作用。

实施例5：火棘活性成分的分离和分析

将上述火棘提取物经大孔树脂、正相硅胶和反相C18填料柱层析洗脱，进行分离纯化。从中分离得到组分经核磁共振(NMR)等波谱学方法测定化学结构，确认两种主要成分分别为芦丁和金丝桃苷。图1为火棘提取物的高效液相分析图谱，分析条件如下：

色谱柱：Shiseido pak C-18(5μm 4.6*250mm)；

流速：1ml/min；

检测波长：280nm；

柱温：35℃；

流动相：

时间(分钟)	0	30	45	60
					流动相(乙腈-水)	5％	25％	100％	100％

由于用醇提取、用其他极性溶剂以及用水提取，或者混合法提取，每克火棘提取物中，上述活性成分芦丁的含量为10毫克，金丝桃苷的含量为3毫克。

实施例6：火棘提取物对束缚应激负荷小鼠血浆ORAC水平的影响

应激负荷实验使用动物为7周龄雄性昆明种小白鼠，由广东省医学实验动物中心购入(许可证号为2004A019)。饲养温度23±2℃，照明时间12小时/日(7:00～19:00开灯)。经饲养一周后进行实验。在束缚应激实验中，按500mg/kg、250mg/kg和125mg/kg剂量经口给药方式给予火棘提取物水溶液。对照组给与等体积蒸馏水。小鼠每组7只，每只小鼠禁食强制放入拘束装置，空白对照组仅禁食。拘束12小时后在乙醚麻醉下由心脏采血放入肝素处理过的离心管中，经5000转/分离心5分钟后分离血浆。再经终浓度为3％高氯酸除蛋白后，通过15000转/分离心15分钟回收非蛋白上清液用于ORAC分析。血浆ORAC分析使用多功能荧光分析仪(Tecan Genios，Austria)，激发和发射波长分别为485nm和525nm，攻击荧光素(disodium fluorescein)的氧化剂使用2，2’-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride(AAPH；Wako Pure Chemical Industries，Ltd.Osaka，Japan)。效价单位参照水溶性维生素E(6-hydro-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid；Trolox，Wako PureChemical Industries，Ltd.)，详细方法参照论文(J Agric Food Chem.，51：3273-3279，2003)。实验结果以t检验做统计学处理，结果如图2所示。图2中，(A为禁食空白组，即正常对照组；B为应激空白组，即应激对照组；C为火棘提取物高剂量组；D火棘提取物中剂量组；E为火棘提取物低剂量组。实验结果表明：与应激空白组(蒸馏水对照组)相比，给与火棘提取物的拘束小鼠的血浆ORAC活性即抗活性氧自由基的能力明显增强，其中高剂量组与应激模型组相比具有统计学意义(^*p＜0.05)，且不同剂量之间具有量效关系。火棘提取物在该实验中未显示出任何毒副作用和不良影响。

实施例7：火棘提取物对束缚应激负荷小鼠血浆和肝脏Vitamin C水平的影响

应激负荷实验动物、实验方法及实验分组和给药剂量均与实施例六相同。小鼠拘束应激12小时后在乙醚麻醉下由心脏采血放入肝素处理过的离心管中，经5000转/分离心5分钟后分离血浆。再经终浓度为10％偏磷酸溶液，12000rpm离心15分钟，取上清液用于维生素C的分析。肝组织中的维生素C测定样品处理方法为取0.1g组织加入1ml 3％的高氯酸溶液，匀浆并在12000rpm下离心15分钟，取上清液稀释20倍用于HPLC分析。维生素C测定使用惠普HP1050系列高效液相色谱仪(包括柱温箱、脱气机、输液泵、VWD紫外检测器)；Marco工作站和Cl8色谱柱(4.6×150mm；COSMOSIL Company)。流动相为0.01mol/l磷酸二氢钾缓冲液(磷酸调PH值至3)：甲醇(v∶v＝99∶1)；流速为1.0ml/min；紫外检测波长为245nm。

实验结果以t检验做统计学处理，血浆Vitamin C分析结果如图3所示，图中，A为禁食空白组，即正常对照组；B为应激模型空白组，即应激对照组；C为火棘提取物高剂量组；D火棘提取物中剂量组；E为火棘提取物低剂量组；纵坐标为每毫升血浆中的维生素C含量(微克)。

肝脏中Vitamin C分析结果见图4，图中，A为禁食空白组，即正常对照组；B为应激空白组，即应激对照组；C为火棘提取物高剂量组；D火棘提取物中剂量组；E为火棘提取物低剂量组；纵坐标为每克肝组织中的维生素C含量(微克)。

实验结果表明：与应激空白组(蒸馏水对照组)相比，给与火棘提取物的小鼠血浆Vitamin C水平明显增强，高剂量组(500mg/kg)具有统计学意义(^*p＜0.05)，且不同剂量组别具有一定的量效关系。给与火棘提取物后应激小鼠肝脏中Vitamin C与模型对照组相比，水平明显增强，三个剂量组的Vitamin C水平均在统计学上具有极显著性差异(^**p＜0.01)，且存在一定的量效关系。火棘提取物在该实验中未显示出任何毒副作用和不良影响。

实施例8：火棘提取物及其有效成分的体外ORAC活性

体外抗氧化实验，是将火棘提取物及单体成分直接添加在96孔酶标板中，观察样品抑制氧化剂AAPH对荧光素(disodium fluorescein)的荧光衰减的延迟作用。如图5所示，图总，AAPH阴性空白表明只添加荧光剂，不添加氧自由基产生物质AAPH和抗氧化物质，荧光强度不衰减；AAPH阳性空白表明只添加荧光剂和氧自由基产生物质AAPH，不添加抗氧化物质，荧光衰减最快；标准抗氧化物质Trolox(2.5微摩尔)为反应终浓度为2.5微摩尔的标准抗氧化物质——Trolox的抗氧化能力，火棘提取物(0.78微克/毫升)和火棘提取物(0.39微克/毫升)表示在特定终浓度条件下火棘提取物的抗氧化能力；纵坐标为相对荧光强度，结果表明，火棘提取物在体外能够明显的延缓荧光物质被活性氧自由基淬灭的速度，并且不同浓度的火棘提取物之间具有明显的量效关系。

如图6中，AAPH阴性、阳性空白及标准抗氧化物质Trolox(2.5微摩尔)含义与上相同，芦丁(0.78微摩尔)和芦丁(0.39微摩尔)表示在特定终浓度条件下芦丁的抗氧化能力；纵坐标为相对荧光强度；图7中，AAPH阴性、阳性空白及标准抗氧化物质Trolox(2.5微摩尔)含义与上相同，金丝桃苷(0.78微摩尔)和金丝桃苷(0.39微摩尔)表示在特定终浓度条件下金丝桃苷的抗氧化能力；纵坐标为相对荧光强度；图6、7显示，火棘的单体成分芦丁和金丝桃苷以及其他一些黄酮类化合物也具有相应活性，即在体外能够明显的延缓荧光物质被活性氧自由基淬灭的速度。因此可以得出结论：火棘提取物及其两种单体成分——芦丁和金丝桃苷在体外均具有较强的抗活性氧自由基作用。说明火棘提取物的抗活性氧自由基作用可能来自于以芦丁和金丝桃苷为代表的黄酮及黄酮苷类化合物。

实施例9：火棘提取物对血浆和肝脏中丙二醛含量的测定

机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化产物——丙二醛(MDA)，导致细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。因而测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化程度，间接地反映出细胞受损伤的程度。

将束缚应激后的小鼠在乙醚麻醉状态下取血及肝脏，血离心得血浆，肝脏用生理盐水制取5％肝组织匀浆，3000转/分离心10分钟，取血浆及组织匀浆上清液测定其中丙二醛含量。测定原理利用丙二醛可与硫代巴比妥酸(TBA)缩和，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰的性质，通过比色法进行测定。测定使用丙二醛测定试剂盒(南京建成)，反应在96孔板中进行，使用酶标仪(芬兰雷博MK3酶标仪)在532nm下测定吸光率(具体测定过程参见试剂盒说明书)。

计算组织中的丙二醛含量需要已知组织中的蛋白含量。因此，同样以生理盐水制取2％肝组织匀浆，利用考马斯亮兰法测定组织中的蛋白含量(使用蛋白定量试剂盒，南京建成，具体操作方法见试剂盒说明书)。

血浆中的MDA含量，火棘提取物高(500mg/kg)、中(250mg/kg)和低(125mg/kg)剂量组均较应激模型组均明显降低，其中高剂量和中等剂量组与模型组相比在统计学上具有极显著差异(^**p＜0.01)，给药组之间具有一定的量效关系，实验结果如图8所示，A为禁食空白组，即正常对照组；B为应激模型空白组，即应激对照组；C为火棘提取物高剂量组；D火棘提取物中剂量组；E为火棘提取物低剂量组；纵坐标为血浆中的丙二醛含量(纳摩尔/毫升)。肝组织匀浆中的MDA含量，火棘提取物高剂量组与应激模型组相比在统计学上具有显著差异，中低剂量组虽有明显降低但不具有统计学意义，实验结果如图9所示，图中A为禁食空白组，即正常对照组；B为应激模型空白组，即应激对照组；C为火棘提取物高剂量组；D火棘提取物中剂量组；E为火棘提取物低剂量组；纵坐标为肝脏中的丙二醛含量(纳摩尔/克)；图8和图9说明给与火棘提取物均能够显著降低应激小鼠血浆和肝脏中的丙二醛含量，说明火棘提取物具有良好的体内抗氧化、消除自由基和保护机体的作用。火棘提取物在该实验中未显示出任何毒副作用和不良影响。

实施例10：火棘提取物对血浆谷丙转氨酶(ALT)水平的影响

血浆谷丙转氨酶的活力是肝细胞损伤程度的一个特征性指标。应激反应会引起大量的自由基和细胞介素产生。因此，这些现象说明，首先活化肝细胞中的巨噬细胞，继而激活各种细胞因子，引发炎症反应，可诱导淋巴细胞、巨噬细胞的细胞毒作用，通过肝细胞凋亡等多种途径损伤肝细胞。

束缚应激小鼠的血浆通过赖氏法测定其中的谷丙转氨酶(ALT)的活力。测定原理利用谷丙转氨酶(ALT)在37℃及PH 7.4条件下，作用于丙氨酸及α-酮戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。反应一段时间后，加入2，4-二硝基苯肼(DNPH)盐酸溶液，即终止反应，同时DNPH与酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙。苯腙在碱性条件下呈红棕色，比色法进行测定。具体实验中测定使用谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒(南京建成)，反应在96孔板中进行，使用酶标仪(芬兰雷博MK3酶标仪)在492nm下测定吸光率。

实验结果如图10所示，图中，A为禁食空白组，即正常对照组；B为应激模型空白组，即应激对照组；C为火棘提取物高剂量组；D火棘提取物中剂量组；E为火棘提取物低剂量组；纵坐标为血浆中的谷丙转氨酶(ALT)活性，结果以国际单位(IU/L)表示；该图表明：应激模型组较正常组ALT显著升高，统计学比较有显著性差异，说明拘束可以导致实验小鼠急性肝损伤。火棘提取物高中低剂量组均能显著降低由于拘束应激所致的小鼠血浆ALT的升高，其中高剂量和中剂量组与应激模型组相比显示有统计学差异(^*p＜0.05)。小剂量组也有降低血浆ALT的作用，但作用效果不具有统计学意义。火棘提取物在该实验中未显示出任何毒副作用和不良影响。

上述实验证明本发明提供的以芦丁和金丝桃苷为活性成分的火棘提取物是一种安全性高，来自天然的通过抗氧化，从而达到缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤等不良反应，用于制备可以长期服用的、安全无毒副作用的药物、食品和食品添加剂。

实施例实验结果表明，火棘提取物的不同剂量组均能降低血浆ALT活性，可以有效降低肝组织匀浆的MDA含量。因此推测，降低转氨酶、抗脂质过氧化，防止过氧化损伤，减少过氧化脂质的生成等可能是火棘提取物缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤等不良反应作用机理的重要方面。此外，本发明也提示以芦丁和金丝桃苷为活性成分的火棘提取物也可以作为抗氧化剂或抗氧化组成物原料，用于一些由于氧化引起的疾病的预防和辅助治疗。由于本发明提供的火棘提取物是天然来源的物质，且民间有长期的食用经验，适合于各年龄阶段和健康状态的人。因此，以芦丁和金丝桃苷为活性成分的火棘提取物可以作为药物、食品、食品添加剂、健康饮料等提供多种用途。再有，尽管芦丁和金丝桃苷是已知化合物，但通过ORAC方法研究其抗氧化作用是通过本发明初次证实的。

Claims (6)

1、一种火棘提取物，其特征在于重量组分如下：

芦丁                  1％-50％

金丝桃苷              0.3％-50％

其他组分              余量；

所述其他组分主要是提取过程中得到的其他黄酮、酚酸和糖苷类物质；芦丁和金丝桃苷的结构式如下：

芦丁                                                                   金丝桃苷。

2、权利要求1所述火棘提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)干燥并粉碎的火棘果实中加入相当于其1～50倍重量的水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮中的一种或一种以上，提取得到提取液；

(2)步骤(1)得到的提取液经过滤，离心分离，浓缩，冷冻干燥；

(3)经大孔树脂、正相硅胶和反相C18填料柱层析，洗脱分离纯化。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的提取采用冷浸、渗滤、加热回流、超声、微波中的一种或一种以上方法进行。

4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中提取时间为30秒至24小时。

5、权利要求1所述的火棘提取物在制备缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤不良反应的药物中的应用。

6、权利要求1所述的火棘提取物在制备缓解及改善由应激反应中氧自由基引起的肝损伤不良反应的食品或食品添加剂中的应用。

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