CN1760195A

CN1760195A - 一种分离纯化9－硝基喜树碱的方法

Info

Publication number: CN1760195A
Application number: CN 200510023495
Authority: CN
Inventors: 徐环昕; 宁方红; 陈骏; 赵延斌; 庄思永; 刘坐镇
Original assignee: SHANGHAI HUAZHEN SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd; East China University of Science and Technology
Current assignee: SHANGHAI HUAZHEN SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd; East China University of Science and Technology
Priority date: 2005-01-21
Filing date: 2005-01-21
Publication date: 2006-04-19
Anticipated expiration: 2025-01-21
Also published as: CN1312155C

Abstract

本发明是一种分离纯化9－硝基喜树碱的方法。喜树碱经浓硫酸/硝酸硝化后，含粗产物的酸液经大孔吸附树脂吸附，解吸得9－硝基喜树碱粗品。含量在10－40％的9－硝基喜树碱上样的层析硅胶填充的色谱柱层析分离，以低毒的正己烷，乙酸乙酯及其混合液为淋洗剂，梯度洗脱分离纯化得9－硝基喜树碱精制品。淋洗后的淋洗液经旋转蒸发回收溶剂，再经减压真空干燥后可获得99.5％－99.9％的9－硝基喜树碱。该方法工艺简单，溶剂淋洗剂可回收套用，成本低，纯化过程无污染，符合环保要求。

Description

一种分离纯化9-硝基喜树碱的方法

技术领域

本发明涉及一种生物化学分离技术，具体涉及一种吸附-层析色谱法分离纯化9-硝基喜树碱粗品并制备高纯度9-硝基喜树碱的方法。

背景技术

喜树碱(camptothecin)是存在于珙桐科旱莲属落叶乔木喜树(Camptothecaacuminata)的根，皮，茎和种子中的生物碱。1966年wall等人从喜树茎中提取分离出该生物碱，在体外对小鼠白血病及瓦克癌试验，显示出较强抗癌活性，进而引起了人们的极大关注。美国，日本，加拿大和英国等国家积极投入喜树碱及其类似物的开发，合成了数百个衍生物进行生化筛选。不少药物已经或即将进行临床研究。喜树碱成为继紫杉醇之后的第二个由植物提取物衍生的重要抗癌药物。现在无论从实际应用上，还是新药研制上，喜树碱类抗癌药都是国际上最热门的抗癌药物之一。

9-硝基喜树碱在治疗某些类型的癌症如胰腺癌中已显示出重大应用前景。

9-硝基喜树碱是以喜树中分离的喜树碱为原料经硝化反应而得。喜树碱为五环稠合体系，稠合的苯环9位和12位电荷较大，因而在硝化过程中主要产物是9-硝基喜树碱和12-硝基喜树碱。由于12-硝基喜树碱同9-硝基喜树碱结构相近，且在粗品中12-硝基喜树碱含量较9-硝基喜树碱含量高，因此，分离除去没有药物活性的12-硝基喜树碱并制备出高纯度的适合药用的9-硝基喜树碱化合物成为十分具有挑战性的问题。

日本专利59-51288提供一种用稍微过量的浓硝酸在浓硫酸中处理喜树碱来制备9-硝基喜树碱的方法。但是，使用该方法时，得到可用于医药用途的9-硝基喜树碱收率仅约3％到7％。分离和提纯9-硝基喜树碱的方法耗费时间长、费用大。

世界专利WO 09907709A中进一步尝试提高9-硝基喜树碱的收率并寻找合适的分离方法。通过选择一种或几种无机硝酸盐和酸进行硝化反应可以使纯的9-硝基喜树碱的收率稳定在20±1％。虽然无机盐硝化法的产率稍高，但其用到的无机重金属硝酸盐如硝酸铊等有剧毒，会加大后续分离过程的难度。喜树碱硝化后的反应液倒入冰水中，然后以二氯甲烷萃取硝化后的混酸液，以水对二氯甲烷萃取液进行反萃取。9-硝基喜树碱粗品用氯仿/甲醇溶解后以硅藻土吸附，加到硅胶柱上，以氯仿/甲醇淋洗液洗脱得到9-硝基喜树碱单体和混合物。该工艺过程中的粗品提纯过程中因萃取需消耗大量溶剂，工艺过程繁琐且不易放大，工艺中采用的溶剂二氯甲烷和三氯甲烷均为国家药典限用溶剂，操作环境较恶劣。

发明内容

本发明的目的是建立一种工艺操作简单，溶剂和淋洗液可循环套用，环境友好，便于较大规模工业化生产的制备提纯9-硝基喜树碱精制品的方法。

为实现上述目的，本发明采取的方案是：

1).喜树碱经浓硫酸/硝酸硝化后，制得喜树碱硝化产物的混酸液。

2).喜树碱硝化产物的混酸液经大孔吸附树脂吸附，以低碳醇类，低碳酮类洗脱，旋转蒸发仪减压回收溶剂得9-硝基喜树碱粗品。

3).将9-硝基喜树碱粗品以硅胶层析法色谱分离纯化，以正己烷，乙酸乙酯为淋洗剂，依次以a)正己烷；b)正己烷∶乙酸乙酯＝2∶(1～2)混合液；c)正己烷∶乙酸乙酯＝2∶(2～3)混合液；d)乙酸乙酯(100％)进行梯度淋洗，分段收集淋洗液。

4).分段收集的淋洗液经旋转蒸发仪减压回收溶剂，浓缩物经减压真空干燥，得纯度99.5％以上9-硝基喜树碱。

本发明所述的分离纯化9-硝基喜树碱的方法工艺简单，溶剂淋洗剂可回收套用，成本低，纯化过程无污染，符合环保要求。

附图说明

图1为工艺流程图；

图2为9-硝基喜树碱粗品的高压液相色谱图；

图3为9-硝基喜树碱纯品的核磁共振氢谱图；

图4为9-硝基喜树碱纯品的高压液相色谱图。

具体实施方式

本发明中的喜树碱原料为市售90％-99％的产品。硫酸、硝酸、正己烷、乙酸乙酯、丙酮均为分析纯，水为去离子水。高压液相色谱分析用乙腈、水均为色谱纯，色谱仪为HP/Agilent 1100型，色谱柱为HP/Agilent4.6×100mmC₁₈柱，3.5μm。大孔吸附树脂为市售上海华震科技有限公司产品，如骨架结构为苯乙烯-二乙烯苯的产品HZ802、HZ803、HZ816、1300、1400，或骨架结构为丙烯酸酯-二乙烯苯的产品HZ841等。层析用硅胶为青岛海洋化工有限公司产品。旋转蒸发仪为上海贝凯科技有限公司产品，XT-4双目显微熔点测定仪为北京泰克仪器有限公司产品，美国VARRIAN 300MHZ核磁共振仪。

通过对下述实施例可以帮助对本发明的理解，而不限制本发明的内容。

实施例1

2000ml的烧瓶中加入浓硫酸1500ml，置于冰-盐浴中冷却至内温-5℃。搅拌下分批加入喜树碱的粉末5克(0.0143mole)，反应液为橙红色。待溶解完全后，搅拌下缓缓滴入浓硝酸4.5ml(65％～68％)，半小时加完，反应液变为黑色。加毕，-5℃下搅拌-小时，然后慢慢升温至室温，搅拌72小时后停止反应。将反应液倒入2000克冰水中，得喜树碱硝化产物的混酸液备用。

将处理好的大孔吸附树脂HZ-802约300克(按照离子交换树脂和吸附树脂的常规处理方法处理)装入直径为5cm，长度为60cm的玻璃柱中，下端为聚四氟乙烯活塞。活塞上端的沙芯为2号沙芯。将上述产物得混酸液室温下通入玻璃柱中，约3小时通完，水洗，以乙醇洗脱得9-硝基喜树碱粗品洗脱液，旋转蒸发仪减压蒸干溶剂得9-硝基喜树碱粗品5.1克，经高压液相色谱检验纯度为30％(见图2)。

将9-硝基喜树碱粗品吸附于硅藻土20克上，取500克100-200目的层析硅胶装填入直径为5cm，长度60cm的玻璃柱中，依次用a)500ml的正己烷；b)1000ml正己烷∶乙酸乙酯为2∶1的混合液；c)500ml正己烷：乙酸乙酯为1∶1的混合液；d)500ml的乙酸乙酯淋洗，得a，b，c，d四种淋洗液，分别通过旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，其中b部分淋洗液可得黄色粉末约1.1克，其熔点为275.5-277℃，从核磁共振氢谱图谱(见图3)可见，同世界专利WO 09907709A的数据一致，¹HNMR(CDCl₃，300Hz)，1.05(3H，t)，1.92(2H，m)，5.40(2H，s)，5.55(2H，dd)，7.70(1H，s)，7.95(1H，t)，8.48(1H，d)，8.53(1H，d)，9.36(1H，s)。高压液相色谱检验9-硝基喜树碱纯度为99.6％的(见图4)c部分为含有少量的9-硝基喜树碱的混合物可用旋转蒸发仪减压蒸干溶剂后重新过柱分离，a，d组分均不含9-硝基喜树碱，可用旋转蒸发仪减压回收溶剂。

实施例2

按与实施例1相同的方法制得喜树碱硝化产物的混酸液，采用大孔吸附树脂为HZ-816，洗脱液为丙酮。硅胶层析分离硅胶采用200-400目层析硅胶，淋洗液配比改为：a)500ml的正己烷；b)1000ml正己烷∶乙酸乙酯为4∶3的混合液；c)500ml正己烷∶乙酸乙酯为2∶3的混合液；d)500ml的乙酸乙酯淋洗，其他按与实施例1相同的设备和工艺步骤操作，b部分淋洗液经减压蒸馏可得黄色粉末1.2克，其熔点为275.5-277℃，高压液相色谱检验纯度为99.7％。

实施例3

按与实施例1相同的方法制得喜树碱硝化产物的混酸液，采用大孔吸附树脂为HZ-841，洗脱液为甲醇。硅胶层析分离的淋洗液配比改为：a)500ml的正己烷；b)1000ml正己烷∶乙酸乙酯为6∶5的混合液；c)500ml正己烷∶乙酸乙酯为2∶3的混合液；d)500ml的乙酸乙酯淋洗，其他按与实施例1相同的设备和工艺步骤操作，b部分淋洗液经减压蒸馏可得黄色粉末1.3克，其熔点为275.5-277℃，高压液相色谱检验纯度为99.6％。

实施例4

按与实施例1相同的方法制得喜树碱硝化产物的混酸液，采用大孔吸附树脂为HZ-803，洗脱液为丙醇。其他按与实施例1相同的设备和工艺步骤操作，b部分淋洗液经减压蒸馏可得黄色粉末1.1克，其熔点为275.5-277℃，高压液相色谱检验纯度为99.7％。

实施例5

按与实施例1相同的方法制得喜树碱硝化产物的混酸液，采用大孔吸附树脂为1300，洗脱液为丁酮。其他按与实施例1相同的设备和工艺步骤操作，b部分淋洗液经减压蒸馏可得黄色粉末1.2克，其熔点为275.5-277℃，高压液相色谱检验纯度为99.6％。

实施例6

按与实施例1相同的方法制得喜树碱硝化产物的混酸液，采用大孔吸附树脂为1400，洗脱液为丙酮。其他按与实施例1相同的设备和工艺步骤操作，b部分淋洗液经减压蒸馏可得黄色粉末1.0克，其熔点为275.5-277℃，高压液相色谱检验纯度为99.5％。

Claims

1.一种分离纯化9-硝基喜树碱的方法，包括喜树碱经浓硫酸/硝酸硝化后，制得喜树碱硝化产物的混酸液，然后进行吸附-层析分离，其特征在于：

1).喜树碱硝化产物的混酸液经大孔吸附树脂吸附，以低碳醇类，低碳酮类洗脱，旋转蒸发仪减压蒸干溶剂得到9-硝基喜树碱粗品；

2).将9-硝基喜树碱粗品以硅胶层析法色谱分离纯化，以正己烷，乙酸乙酯为淋洗剂，依次以a)正己烷；b)正己烷∶乙酸乙酯＝2∶(1～2)混合液；c)正己烷∶乙酸乙酯＝2∶(2～3)混合液；d)乙酸乙酯(100％)进行梯度淋洗，分段收集淋洗液；

3).所述的淋洗液经旋转蒸发仪减压回收溶剂，浓缩物经减压真空干燥，得纯度99.5％以上9-硝基喜树碱。

2.根据权利要求1所述的分离纯化9-硝基喜树碱的方法，其特征在于：所述的大孔吸附树脂的骨架结构为苯乙烯-二乙烯苯或丙烯酸酯-二乙烯苯共聚物。

3.根据权利要求1所述的分离纯化9-硝基喜树碱的方法，其特征在于：所述低碳醇类为甲醇、乙醇、丙醇，低碳酮类为丙酮、丁酮。

4.根据权利要求1所述的分离纯化9-硝基喜树碱的方法，其特征在于：所述硅胶层析法中色谱柱中填充的层析硅胶，规格为100～400目，硅胶柱上端以硅藻土吸附9-硝基喜树碱粗品。

5.根据权利要求2所述的分离纯化9-硝基喜树碱的方法，其特征在于：所述苯乙烯-二乙烯苯骨架结构的大孔吸附树脂是HZ802、HZ-803、HZ-816、1300、1400中的一种，丙烯酸酯-二乙烯苯骨架结构的大孔吸附树脂是HZ-841。