CN1748141A - 靶标识别元件以及利用靶标识别元件的生物传感器 - Google Patents

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    • G01N33/5438—Electrodes

Abstract

本发明涉及一种受体被固定于含有介质的包合配位化合物上的靶标识别元件，该靶标识别元件包括：具有亲水基(19a)和包合部位(21a)的第1主体分子(13a)；具有亲水基(19b)和包合部位(21b)的第2主体分子(13b)；与上述第2主体分子(13b)的亲水基(19b)结合，且与靶标(23)反应的受体(15)；和由上述第1主体分子(13a)的包合部位(21a)和上述第2主体分子(13b)的包合部位(21b)包合，传递由上述靶标(23)和上述受体(15)的反应而产生的电荷的客体分子(13c)。

Description

靶标识别元件以及利用靶标识别元件的生物传感器
技术领域
本发明涉及一种与测量对象物质特异结合的靶标识别元件以及利用该靶标识别元件的生物传感器。
背景技术
生物传感器有酶传感器、免疫传感器、微生物传感器等传感器，在医疗、食品、工业领域等许多领域中，为进行物质鉴定或对象物质(下称为“靶标”)的各种测量，有十分重要的地位。
例如，有根据血液中的葡萄糖浓度测量血糖值的葡萄糖传感器。葡萄糖传感器具有电极和为覆盖电极而设置的酶膜。酶膜中固定有葡萄糖氧化酶(GOD)以作为与葡萄糖进行特异反应的受体。
在葡萄糖传感器中，如反应式(1)所述，葡萄糖通过GOD而被氧化，分解为葡萄糖酸和H2O2。
(反应式1)
接着，在反应式(1)中产生的H2O2在电极和酶膜之间的溶液中扩散到电极面，在电极上，如反应式(2)所述地进行电解，电子移动到电极上。
(反应式2)
                       (2)
葡萄糖向酶膜的扩散和H2O2在溶液中的扩散与葡萄糖浓度存在比例关系，通过测量基于反应式(2)的电极反应的电流值，可得到葡萄糖浓度。但由于在该葡萄糖传感器中，电子从酶膜向电极的移动依赖于H2O2向电极扩散的速度或扩散浓度等，因此难以高速地且以较大电流进行测量。
为此，人们致力于通过介质实施受体和电极间的电荷移动的生物传感器的开发。图7为介质型生物传感器的动作原理示意图，介质M在酶E和与酶E反应的基质S之间进行如下的反应。
通过被氧化的酶Eox与基质S的氧化还原反应实现电子授受，生成被还原的酶Ered和生成物P。然后，通过被还原的酶Ered与被氧化的介质Mox的氧化还原反应，生成被氧化的酶Eox和被还原的介质Mred。最后，通过被还原的介质Mred和电极的氧化还原反应，生成被氧化的介质Mox，电子移动到电极上。即，在该酶反应中产生的电子经介质高速且大量地由酶移动到电极上。这时，酶E和介质M反复进行氧化-还原。在上述酶反应中，有时，基质S被氧化而使电子移动到电极，而在基质S被还原而消耗电子的情况下，通过相反的循环，电子从电极向酶移动。
图8表示使用了Journal of Electroanalytical Chemistry 454，9-13，1998所述的C60富勒烯的介质型生物传感器的电极部的结构。介质C60富勒烯2通过含-sS-(CH2)2-NH2的自组织化单分子膜3而固定在电极1上。这时，为使C60富勒烯2与自组织化单分子膜3结合，C60富勒烯2的表面用＝CH-COOH改性。而酶4未与C60富勒烯2结合，酶4悬浮于液体中。
在上述文献所示的生物传感器中，通过作为基质5的葡萄糖和作为酶4的GOD的氧化还原反应产生电子，该电子通过C60富勒烯2传递到电极1，来测量葡萄糖浓度。
上述文献所述的介质型生物传感器使用在吸电子性和给电子性方面具有优异特性的C60富勒烯2。但是，酶4悬浮于液体中，未与C60富勒烯2结合。因此，即使在通过酶4和基质5之间的氧化还原反应进行电子授受的情况下，只要酶4与C60富勒烯2未结合，C60富勒烯2就不能将电子高速且大量地由酶4移动到电极1。
而且，为了在电极1上固定C60富勒烯，C60富勒烯2的表面需要有改性基。因此，其问题在于，有助于导电的π键的电子分布变得不均匀，有损于C60富勒烯2所具有的吸电子性、给电子性等特性。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种受体被固定于含有介质的包合配位化合物上的靶标识别元件。
本发明的目的还在于，提供一种介质表面未使用改性基，可稳定介质相对于电极的位置的生物传感器。
为解决上述问题，本申请第1发明提供一种靶标识别元件，其特征在于，包括：具有亲水基和包合部位的第1主体分子；具有亲水基和包合部位的第2主体分子；与上述第2主体分子的亲水基结合，且与靶标反应的受体；和由上述第1主体分子的包合部位及上述第2主体分子的包合部位所包合，并传递由上述靶标和上述受体的反应而产生的电荷的客体分子。
由于第2主体分子和受体结合而固定受体，所以通常可在由第1体分子和第2主体分子包合的客体分子的附近进行受体和靶标的反应。因此，可利用客体分子高速且大量地移动由该反应产生的电荷。再者，由于第1和第2主体分子具有亲水基，所以，即使客体分子呈不溶性，也可在溶液中处理靶标识别元件，例如可容易地在基板上排列靶标识别元件。
本申请第2发明提供一种靶标识别元件，其特征在于，在上述第1发明中，上述第1主体分子为第1杯芳烃(Calix arene)，上述第2主体分子为第2杯芳烃，上述客体分子为富勒烯。
第1和第2杯芳烃的包合部分通过疏水性相互作用和π-π相互作用包合富勒烯，由此，不使用特别的改性基，就可将作为介质的不溶于水的富勒烯改变为水溶性。这样，由于与导电相关的π电子的分布保持均匀，所以无损于电子亲和力大、且电离能小的富勒烯所具有的特性。因此，通过富勒烯可高速且大量地移动电荷。
本申请第3发明提供一种靶标识别元件，其特征在于，在上述第1发明中，上述受体选自酶、抗体、DNA(脱氧核糖核酸)和肽的一种或多种的组合。
通过酶、抗体、DNA或肽可特异捕捉生物体物质。
本申请第4发明提供一种靶标识别元件，其特征在于，在上述第1或第2发明中，在上述第2主体分子和上述受体之间，还含有至少一层高分子膜。
高分子膜赋予第2主体分子和受容体的粘接表面平坦性，且不破坏受体的主体结构，所以可防止受体钝化。还可使粘接面积增加，所以可更牢固地粘接第2主体分子和受体。
本申请第5发明提供一种靶标识别元件，其特征在于，在上述第4发明中，上述高分子膜包括聚二烯丙基二甲基氯化铵层和聚乙烯基硫酸钾层。
本申请第6发明提供一种靶标识别元件，其特征在于，在上述第1发明中，还包括覆盖上述受体的聚离子络合物膜。
由于通过聚离子络合物膜可强化受体和第2主体分子的结合，所以可提高靶标识别元件的耐久性。
本申请第7发明提供一种靶标识别元件，其特征在于，在上述第1发明中，上述受体在pH4～8且温度为15～45℃的条件下与上述第2主体分子的亲水基结合。
在上述条件下，使受体和第2主体分子结合，可防止受体的钝化。
本申请第8发明提供一种生物传感器，其特征在于，包括：具有亲水基和包合部位的第1主体分子；具有亲水基和包合部位的第2主体分子；与上述第1主体分子的亲水基结合的电极；与上述第2主体分子的亲水基结合且与靶标反应的受体；将被上述第1主体分子的包合部位和上述第2主体分子的包合部位包合、且通过上述靶标和上述受体的反应而产生的电荷传递到上述电极的客体分子。
由于受体被固定在第2主体分子上，所以通常能在客体分子附近进行受体和靶标的反应。因此，通过客体分子可使由该反应产生的电荷高速且大量地从受体向电极移动。且由于通过第1和第2主体分子包合客体分子并将其稳定地固定在电极上，所以客体分子无需用于将其固定在电极上的改性基。因此，无损于客体分子所具有的高速且大量地移动电荷的性质。且由于第1和第2主体分子具有亲水基，所以，即使客体分子为不溶性分子，也可很容易地在溶液中使用生物传感器。
本申请第9发明提供一种生物传感器，其特征在于，在上述第8发明中，还具有连接在上述电极上的检测机构。
通过检测机构可测量移动到电极上的电荷。
本申请第10发明提供一种生物传感器，其特征在于，在上述第8发明中，上述第1主体分子为第1杯芳烃，上述第2主体分子为第2杯芳烃，上述客体分子为富勒烯。具有与上述第2发明同样的效果。
本申请第11发明提供一种生物传感器，其特征在于，在上述第8发明中，上述受体选自酶、抗体、DNA和肽的一种或多种的组合。具有与上述第3发明同样的效果。
本申请第12发明提供一种生物传感器，其特征在于，在上述第8～10任一发明中，在上述第2主体分子和上述受体之间，还含有至少一层高分子膜。具有与上述第4发明同样的效果。
本申请第13发明提供一种生物传感器，其特征在于，在上述第12发明中，上述高分子膜包括聚二烯丙基二甲基氯化铵层和聚乙烯基硫酸钾层。具有与上述第5发明同样的效果。
本申请第14发明提供一种生物传感器，其特征在于，在上述第8发明中，还包括覆盖上述受体的聚离子络合物膜。具有与上述第6发明同样的效果。
本申请第15发明提供一种生物传感器，其特征在于，在上述第8发明中，上述受体在pH4～8且温度15～45℃的条件下与上述第2主体分子的亲水基结合。具有与上述第7发明同样的效果。
本申请第16发明提供一种检测方法，其特征在于，使用权利要求9所述生物传感器，检测由上述靶标和上述受体的反应而产生的电荷。
使用第9发明的生物传感器可高效地检测出电荷。
本申请第17发明提供一种检测方法，其特征在于，在上述第16发明中，上述客体分子为富勒烯，还包括光激发上述富勒烯的激发工序。
通过向富勒烯照射光，使富勒烯被光激发，因此可提高电子亲和力大且电离能小的富勒烯的这一性质。因此，可加速生物传感器的反应速度，提高反应灵敏度。
本申请第18发明提供一种生物传感器的制造方法，它用于制造权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，包括：包合配位化合物生成工序，混合并搅拌含有上述第1主体分子和上述第2主体分子的溶液以及含有上述客体分子的溶液，生成含有上述第1主体分子、上述第2主体分子及上述客体分子的包合配位化合物；电极形成工序，使阴离子性或阳离子性分子结合在电极表面；包合配位化合物结合工序，使上述电极形成工序中形成的电极与上述包合配位化合物内的上述第1主体分子的亲水基结合；受体结合工序，使上述包合配位化合物内的上述第2主体分子的亲水基与上述受体结合，在上述包合配位化合物生成工序中生成的包合配位化合物中，由上述第1主体分子的包合部位和上述第2主体分子的包合部位包合上述客体分子。
可制造具有与上述第8发明同样效果的生物传感器。
本申请第19发明提供一种生物传感器的制造方法，其特征在于，在上述第18发明中，在上述受体结合工序中，在pH4～8且温度为15～45℃的条件下，上述第2主体分子的亲水基与上述受体结合。具有与上述第7发明同样的效果。
附图说明
图1(a)为本发明的介质型生物传感器的电极部基本结构示意图，(b)是说明(a)的生物传感器动作的说明图。
图2为第1实施方式例的生物传感器的结构。
图3(a)为设有检测部的生物传感器的一例(1)，(b)为设有检测部的生物传感器的一例(2)。
图4(a)为第3实施方式例的生物传感器结构(1)，(b)为第3实施方式例的生物传感器结构(2)。
图5为第4实施方式例的生物传感器结构示意图。
图6为第1实施方式例的生物传感器电特性示意图。
图7为说明介质型生物传感器动作原理的说明图。
图8为使用现有C60富勒烯的介质型生物传感器电极部的结构。
具体实施方式
<基本结构>
图1(a)为本发明的介质型生物传感器的电极部基本结构示意图。介质型生物传感器具有电极11和固定在电极11上的靶标识别元件10。靶标识别元件10具有包合配位化合物13和固定在包合配位化合物13上的受体15。包合配位化合物13具有第1主体分子13a、第2主体分子13b和客体分子13c。第1主体分子13a具有亲水基19a和包合部位21a，同样，第2主体分子13b也具有亲水基19b和包合部位21b。包合配位化合物13为由第1主体分子13a的包合部位21a和第2主体分子13b的包合部位21b包合客体分子13c的结构，整体由亲水基19a和19b包围。在本发明中，被包合的客体分子13c发挥着作为将电荷从受体15传递到电极的介质的作用。例如，作为客体分子13c，可举出富勒烯；作为第1和第2主体分子13a、13b，可举出杯芳烃。且第1和第2主体分子13a、13b也可为不同的物质。另外，优选为它们是同一物质，因为如此包合配位化合物13的形成会变得容易。例如，当使用A、B两种物质作为第1和第2主体分子13a、13b的材料形成包合配位化合物13时，在调制中生成三种复合体(AA、AB、BB)。因此，需要分离这些复合体，而难以形成包合配位化合物13。另一方面，当使用同一物质时，无需分离，所以容易形成。且当它们是同一物质时，无需区别电极11侧的第1主体分子13a的物质和电极11相反侧的第2主体分子13b的物质，容易控制包合配位化合物13的固定。
电极11通过静电相互作用与第1主体分子13a的亲水基19a形成离子键。电极11和包合配位化合物13的结合并不限于离子键，也可考虑共价键、配位键等各种结合。电极11只要是惰性电极即可，可使用Au、Ag、Pt、ITO、碳等电极。当使用碳时，可得到价格便宜、易加工、比较稳定的电极，故为优选。
受体15通过第2主体分子13b的亲水基19b被固定在包合配位化合物13上。受体15和亲水基19b的结合通过离子键、共价键等进行结合。当受体15是酶、抗体、DNA、细胞或肽的任一种或其组合时，可特定地捕捉生物体物质，故为优选。
图1(b)是说明图1(a)的生物传感器动作的示意图。靶标23是由受体15捕捉的物质。该生物传感器如下所述进行动作。靶标23由受体15捕捉，在靶标23和受体15之间产生氧化还原反应。通过该氧化还原反应产生电子e-，该产生的电子e-可通过例如由第1和第2主体分子13a、13b包合的客体分子传递到电极11。通过测量电极11的电荷变化，可测量靶标23的存在、含量等。在图1(b)中，说明负电荷移动的情况，但正电荷也可移动。
这样的生物传感器通过第2主体分子13b和受体15结合，将受体15与包合配位化合物13固定。因此，通常在由第1主体分子13a和第2主体分子13b包合的客体分子13c的附近进行受体15靶标23的反应。因此，通过客体分子13c使得由该反应产生的电荷可高速且大量地从受体15移向电极11。另外，由于第1和第2主体分子13a、13b具有亲水基19a、19b，所以即使客体分子13c为不溶性，也可进行测量溶液中的靶标23等在溶液中的客体分子13c的使用。并且，还可例如很容易地在基板上排列靶标识别元件10。
<第1实施方式例>
图2为第1实施方式例的生物传感器的结构。参照上述图1和图2说明第1实施方式的生物传感器。
[生物传感器的结构]
在第1实施方式的生物传感器中，将受体15与包合配位化合物13固定的靶标识别元件10在电极11上。在本实施方式中，客体分子13c为C60富勒烯，第1和第2主体分子13a、13b含有杯[3]芳烃。杯[3]芳烃是在间位呈环状地连接了三个苯酚衍生物的结构，苯酚部分的氧原子侧由亲水基构成，用与苯酚部分相对的苯环侧的包合部位包合C60富勒烯。在本实施方式中，包合部位由疏水基构成。图2所示的杯[3]芳烃的亲水基由阳离子性季铵改性而带有正电。而电极11使用金，由阴离子性的羧酸改性而带负电。因此，电极11和杯[3]芳烃的亲水基通过静电相互作用而结合。例如，在受体15中使用作为靶标与血液中的丙酮酸反应的酶——乳酸脱氢酶。具有酸性等电(位)点的乳酸脱氢酶在中性水溶液中带负电，与杯[3]芳烃的亲水基通过静电相互作用而结合。
在上述说明中，杯[3]芳烃的亲水基带正电，酶表面和电极11的表面带负电，但也可使杯[3]芳烃的亲水基带负电，使酶表面和电极11的表面带正电。另外，受体15和包合配位化合物13的结合以及包合配位化合物13和电极11的结合业可不是静电相互作用，而是共价键等其它结合。
介质客体分子13c除C60富勒烯以外，也可为例如C70、C76、C78、C82、C84、C86、C88、C90、C92、C94、C96等高次富勒烯。另外，当是内包La原子等的富勒烯时，电子从内包原子供给到富勒烯，使富勒烯呈电子过剩状态，因此，不仅可提高富勒烯的导电率，还能加速初期响应速度，故为优选。
另外，在图2中，第1和第2主体分子13a、13b可为相同的杯[3]芳烃，也可以是第1主体分子13a为杯[4]芳烃、第2主体分子13b为杯[3]芳烃地使用不同的杯芳烃。另外，当使用相同的杯芳烃时，如上所述，易于调制包合配位化合物13，故为优选。
在上述说明中，为了检测丙酮酸，受体15使用作为酶的乳酸脱氢酶，也可根据检测靶标，分类使用其它酶。作为其它酶，可使用例如氧化酶(葡萄糖氧化酶)、脱氢酶(例如乙醇脱氢酶)、还原酶(例如肾上腺素氧化物(アドレノイドキシン))、氧合酶、过氧化酶(例如过氧化氢酶)、尿素酶、肌酸酐脱氨酶等。当酶使用尿素酶时，可测量血中尿素氮BUN(Blood Urea Nitrogen)，当酶使用肌酸酐脱氨酶时，可测量肌酸，从而可判定肾病等。
在上述生物传感器中，通过作为第1和第2主体分子13a、13b的杯[3]芳烃的包合部位的疏水性相互作用以及π-π相互作用包合C60富勒烯，稳定地固定在电极11上。此时，通过杯[3]芳烃在悬浮状态下包合C60富勒烯，没有结合改性基。因此，参与导电的π电子的分布保持均匀，所以无损于C60富勒烯所具有的电子亲和力大且电离能小的特性。因此，可使电荷高速且大量地从受体移动到C60富勒烯和电极。另外，与杯[3]芳烃包合部位的相反侧，由亲水基的苯酚构成，所以用杯[3]芳烃包合水不溶性的C60富勒烯，就可不使用改性基即改变为水溶性。因此，可易于在溶液中使用生物传感器。
[使用了生物传感器的检测方法]
图3(a)、(b)表示设有检测部的生物传感器的一例。在图3(a)中，上述图2的靶标识别元件42固定在电极40上，电极40连接在检测部45上。在固定了靶标识别元件42的电极40的部分滴下试料，利用检测部45测量电流，换算为试料内的靶标的浓度等。
而在图3(b)中，将固定了靶标识别元件42的电极40的前端浸渍在试料溶液中，通过检测部45测量电流。
另外，在测量时，当从外部向靶标识别元件42照射光时，C60富勒烯被光激发，因此可提高富勒烯的电子亲和力大且电离能小的性质。因此，可加快靶标识别元件的反应速度，提高反应灵敏度。富勒烯被光激发的波长很宽，但尤其是相对于620nm以下的波长，能高效地被激发。作为具有该波长的光源，使用红色LED或Ar激光。
[生物传感器的制造方法]
第1实施方式的生物传感器的制造如下所述。在水溶液中混合杯[3]芳烃和C60富勒烯，搅拌该混合液。搅拌优选使用超声波处理。通过该处理，C60富勒烯被作为杯[3]芳烃包合部位的疏水基包合，生成包合配位化合物13。用阴离子性或阳离子性分子改性电极11、杯[3]芳烃的亲水基。此时，电极11与杯[3]芳烃的结合以及杯[3]芳烃和乳酸脱氢酶的结合是利用静电相互作用而结合，由此进行改性。被改性的包合配位化合物13、电极11和乳酸脱氢酶结合，得到可测量作为靶标的丙酮酸的生物传感器。这时，当乳酸脱氢酶和包合配位化合物13在pH4～8且温度为15～45℃的条件下进行结合时，可防止酶的钝化，故为优选。
<实验例1>
形成以杯[3]芳烃包合C60富勒烯的包合配位化合物，下面说明的是将作为受体的乳酸脱氢酶固定在包合配位化合物上时的实验例。
(1)杯[3]芳烃的合成
首先，以杯[3]芳烃的三酯体为原料，过量添加N，N-二甲基丙二胺，利用氨解作用合成杯[3]芳烃的先驱体。使用硫酸二甲酯使该先驱体N-甲基化，合成末端具有季铵的杯[3]芳烃。
(2)杯[3]芳烃和C60富勒烯的调制
将如上所述合成的杯[3]芳烃水溶液(10ml，0.5mmol/dm3)与C60富勒烯(72mg，0.1mmol)混合，反复进行搅拌和超声波处理，通过离心分离除去未溶解的富勒烯，调制成杯[3]芳烃和作为C60富勒烯配位化合物的包合配位化合物水溶液。此时生成的包合配位化合物的横宽约为1nm，高度约为2nm。
(3)电极的制备
另一方面，将金电极浸渍在含有2-巯基乙烷磺酸钠的乙醇溶液中，制成表面具有阴离子性分子的电极11。
(4)包合配位化合物的固定
将按照上述(3)制备的电极浸渍于包合配位化合物水溶液(0.25mmol/dm3)中，在电极上致密地排列包合配位化合物，制造生物传感器。此时，包合配位化合物通过静电相互作用与电极连接。
(5)受体的固定
然后，在室温下，将排列有包合配位化合物的电极浸渍在含有乳酸脱氢酶(0.2mg/ml)的HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)缓冲液(pH＝7.0)中20分钟，通过静电相互作用，将酶固定在包合配位化合物上。
通过上述制造方法得到的第1实施方式例的生物传感器的由循环伏安测量法得到的电特性如图6所示。它是将固定了乳酸脱氢酶(LDH)的生物传感器片浸渍在混合了125μM还原型烟酰胺腺嘌呤核苷酸(NADH)和0～250μM丙酮酸的混合溶液中时的特性图。可得到能以高灵敏度测量微量丙酮酸的生物传感器片。
<第2实施方式例>
下面说明受体15为抗体、DNA、细胞及/或肽的第1实施方式例所示结构的生物传感器。
[抗体]
当受体15为抗体时，以受体15进行特异反应的抗原为靶标，可测量受体15的存在、浓度等。抗原种类可举出病毒、细菌、花粉、霉、螨等。说明例如抗体为“鼠IgG”、抗原为“蛋白A”的情况。
首先，将抗原“蛋白A”注射至实验鼠，利用老鼠生来就有的免疫响应制作“鼠IgG”抗体。提取该抗体“鼠IgG”并精制，固定于包合配位化合物13。为通过静电相互作用或共价键固定，用羧基或氨基等对鼠IgG的Fc部预改性。因此，当注入蛋白A时，蛋白A和老鼠IgG发生特异结合。由极性分子构成的蛋白A发出的电荷经抗体、包合配位化合物13到达电极11。测量流至该电极11的电流，可对作为抗原的蛋白A定量。
[DNA]
下面说明当受体15是与作为靶标的DNA进行特异反应的探测DNA时，检测靶标DNA的方法。
DNA为双螺旋结构，但用作生物传感器受体15时，采用单链。首先，人工有机合成靶标DNA的碱基序列和与之具有互补性的DNA单链，生成探测DNA。将该探测DNA固定在包合配位化合物13上。然后，在由生物体试料提取精制所期望的DNA后，在例如95度下加热，形成单链。当该DNA和探测DNA的碱基序列互补时，即试料内的DNA具有待测DNA碱基序列时，两者结合，形成双螺旋结构。由此，相对于双螺旋结构特异结合，将成为电荷发生源的嵌入子插入双螺旋结构的间隙内。由此，通过流过电极11的电流的变化判定是否存在双螺旋结构，即试料内的DNA是否具有目的碱基序列。
[细胞]
下面说明当受体15是细胞时作为靶标的抗原的检测方法。由生物体提取精制NK细胞或B细胞等免疫细胞，固定于包合配位化合物13。当利用结合在细胞表面的蛋白质分子的端基固定在包合配位化合物13上时，可易于实现固定，故为优选。抗原可举出病毒、细菌、花粉、霉、螨等。当导入试料内固定有细胞的生物传感器时，作为受体15的细胞侵吞抗原，通过细胞内部的酶分解抗原。在该分解过程中产生的电荷经包合配位化合物13移动到电极11。此时，通过测量电极11上流动的电流，可进行抗原的定量。
[肽]
说明当受体15是肽时的作为靶标的肽的检测方法。利用基因工程学的方法，将与所期望的靶标进行特异反应的探测肽制作于噬菌体上。将其提取精制，并固定于包合配位化合物13。当将具有该包合配位化合物13的生物传感器注入试料中时，对应于构成探测肽的氨基酸的侧链所具有的电荷状态的肽和探测肽结合。此时，可测量流到电极11的电流，可检测、定量作为目的的靶标肽。
<第3实施方式>
图4(a)、(b)表示第3实施方式例的生物传感器的结构。与图1相同的符号表示与第1实施方式例相同的结构构件。在图4(a)的生物传感器中，图1的靶标识别元件10中还设有高分子膜50。高分子膜50设在第2主体分子13b和受体15之间。由于该高分子膜50赋予第2主体分子13b和受体15的粘接表面平坦性，且不会破坏受体15的立体结构，所以可防止受体15的钝化。且由于可增加粘接面积，所以可更牢固地粘接第2主体分子13b和受体15。
如图4(b)所示，高分子膜50可以是双层结构的高分子膜52、54。例如，在包合配位化合物13上形成阳离子性高分子膜PDDA(聚二烯丙基二甲基氯化铵)52，在其上面形成阴离子性高分子膜PVS(聚乙烯基硫酸钾)54，将酶固定在包合配位化合物13上。这样，通过使高分子膜50形成阴离子性和阳离子性的双层结构，不是固定带负电的酶，而是可固定带正电的酶。并且，高分子膜50也可为两层以上的膜。
<实验例2>
制备用杯[3]芳烃包合C60富勒烯的包合配位化合物，下面说明将高分子膜和作为受体的乳酸脱氢酶固定在包合配位化合物上时的实验例。
(1)杯[3]芳烃的合成
首先，以杯[3]芳烃的三酯体为原料，过量添加N，N-二甲基丙二胺，利用氨解作用合成杯[3]芳烃的先驱体。使用硫酸二甲酯使该先驱体N-甲基化，合成末端具有季铵的杯[3]芳烃。
(2)杯[3]芳烃和C60富勒烯的调制
将如上所述合成的杯[3]芳烃水溶液(10ml，0.5mmol/dm3)与C60富勒烯(72mg，0.1mmol)混合，反复进行搅拌和超声波处理，通过离心分离除去未溶解的富勒烯，调制成杯[3]芳烃和作为C60富勒烯配位化合物的包合配位化合物水溶液。此时生成的包合配位化合物的横宽约为1nm，高度约为2nm。
(3)电极的制备
另一方面，将金电极浸渍在含有2-巯基乙烷磺酸钠的乙醇溶液中，制成表面具有阴离子性分子的电极11。
(4)包合配位化合物的固定
将按照上述(3)制备的电极浸渍于包合配位化合物水溶液(0.25mmol/dm3)中，在电极上致密地排列包合配位化合物，制造生物传感器。此时，包合配位化合物通过静电相互作用与电极连接。
(5)高分子膜的固定
然后，在室温下，将固定在电极上的包合配位化合物浸渍在含有PDDA(6mg/ml)的HEPES缓冲液(pH＝7.0)中20分钟，利用静电相互作用，在包合配位化合物上形成PDDA层的膜。用超纯水洗净后，在室温下，将电极浸渍在含有PVS(4mg/ml)的HEPES缓冲液(pH＝7.0)中20分钟，利用静电相互作用，在PDDA层上形成PVS层膜。
(6)受体的固定
然后，在室温下，将排列有包合配位化合物的电极浸渍在PVS层上含有乳酸脱氢酶(0.2mg/ml)的HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)缓冲液(pH＝7.0)中20分钟，通过静电相互作用，将酶固定在包合配位化合物上。
<第4实施方式例>
图5为第4实施方式例的生物传感器结构示意图。与图1相同的符号表示与第1实施方式例相同的结构构件。在图5的生物传感器中，图1的靶标识别元件10还设有聚离子络合物膜56。聚离子络合物膜56设在受体15的上部，增强受体15和第2主体分子13b的结合。因此，可提高生物传感器的耐久性。作为聚离子络合物膜56，可举出例如阳离子性的聚-L-赖氨酸、阴离子性的谷氨酸或丙烯酸等聚离子络合物膜。
<实验例3>
制备用杯[3]芳烃包合C60富勒烯的包合配位化合物，下面说明包合配位化合物上固定作为受体的乳酸脱氢酶、还固定聚离子络合物膜时的实验例。
(1)杯[3]芳烃的合成
首先，以杯[3]芳烃的三酯体为原料，过量添加N，N-二甲基丙二胺，利用氨解作用合成杯[3]芳烃的先驱体。使用硫酸二甲酯使该先驱体N-甲基化，合成末端具有季铵的杯[3]芳烃。
(2)杯[3]芳烃和C60富勒烯的调制
将如上所述合成的杯[3]芳烃水溶液(10ml，0.5mmol/dm3)与C60富勒烯(72mg，0.1mmol)混合，反复进行搅拌和超声波处理，通过离心分离除去未溶解的富勒烯，调制成杯[3]芳烃和作为C60富勒烯配位化合物的包合配位化合物水溶液。此时生成的包合配位化合物的横宽约为1nm，高度约为2nm。
(3)电极的制备
另一方面，将金电极浸渍在含有2-巯基乙烷磺酸钠的乙醇溶液中，制成表面具有阴离子性分子的电极11。
(4)包合配位化合物的固定
将按照上述(3)制备的电极浸渍于包合配位化合物水溶液(0.25mmol/dm3)中，在电极上致密地排列包合配位化合物，制造生物传感器。此时，包合配位化合物通过静电相互作用与电极连接。
(5)受体的固定
然后，在室温下，将排列有包合配位化合物的电极浸渍在含有乳酸脱氢酶(0.2mg/ml)的HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)缓冲液(pH＝7.0)中20分钟，通过静电相互作用，将酶固定在包合配位化合物上。
(6)聚离子络合物膜的固定
将酶固定在包合配位化合物上之后，使用环式扩增和靶标作用物选择作用技术(CAST)，使1mM溶液的聚-L-赖氨酸(Poly-L-lysine)在酶表面上形成聚离子络合物膜。
产业上的可利用性
利用本发明，可提供受体被固定在含有介质的包合配位化合物上的靶标识别元件。

Claims (19)

1.一种靶标识别元件，其特征在于，包括：
具有亲水基和包合部位的第1主体分子；
具有亲水基和包合部位的第2主体分子；
与所述第2主体分子的亲水基结合的且与靶标反应的受体；和
由所述第1主体分子的包合部位和所述第2主体分子的包合部位所包合，并传递由所述靶标和所述受体的反应而产生的电荷的客体分子。
2.如权利要求1所述的靶标识别元件，其特征在于，所述第1主体分子为第1杯芳烃，所述第2主体分子为第2杯芳烃，所述客体分子为富勒烯。
3.如权利要求1所述的靶标识别元件，其特征在于，所述受体选自酶、抗体、DNA和肽的一种或多种的组合。
4.如权利要求1或2所述的靶标识别元件，其特征在于，在所述第2主体分子和所述受体之间，还含有至少一层高分子膜。
5.如权利要求4所述的靶标识别元件，其特征在于，所述高分子膜包括聚二烯丙基二甲基氯化铵层和聚乙烯基硫酸钾层。
6.如权利要求1所述的靶标识别元件，其特征在于，还包括覆盖所述受体的聚离子络合物膜。
7.如权利要求1所述的靶标识别元件，其特征在于，所述受体在pH4～8且温度15～45℃的条件下与所述第2主体分子的亲水基结合。
8.一种生物传感器，其特征在于，包括：
具有亲水基和包合部位的第1主体分子；
具有亲水基和包合部位的第2主体分子；
与上述第1主体分子的亲水基结合的电极；
与所述第2主体分子的亲水基结合的且与靶标反应的受体；和
将由所述第1主体分子的包合部位和所述第2主体分子的包合部位包合，且通过所述靶标和所述受体的反应而产生的电荷传递到所述电极的客体分子。
9.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，还具有连接在所述电极上的检测机构。
10.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，所述第1主体分子为第1杯芳烃，所述第2主体分子为第2杯芳烃，所述客体分子为富勒烯。
11.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，所述受体选自酶、抗体、DNA和肽的一种或多种的组合。
12.如权利要求8～10任一项所述的生物传感器，其特征在于，在所述第2主体分子和所述受体之间，还含有至少一层高分子膜。
13.如权利要求12所述的生物传感器，其特征在于，所述高分子膜包括聚二烯丙基二甲基氯化铵层和聚乙烯基硫酸钾层。
14.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，还包括覆盖所述受体的聚离子络合物膜。
15.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，所述受体在pH4～8且温度15～45℃的条件下与所述第2主体分子的亲水基结合。
16.一种检测方法，其特征在于，使用权利要求9所述生物传感器，检测由所述靶标和所述受体的反应而产生的电荷。
17.如权利要求16所述的检测方法，其特征在于，所述客体分子为富勒烯，还包括光激发所述富勒烯的激发工序。
18.一种生物传感器的制造方法，用于制造权利要求8所述生物传感器，其特征在于，包括：
包合配位化合物生成工序，混合并搅拌含有所述第1主体分子和所述第2主体分子的溶液、以及含有所述客体分子的溶液，生成含有所述第1主体分子、所述第2主体分子和所述客体分子的包合配位化合物；
电极形成工序，使阴离子性或阳离子性的分子结合在电极的表面；
包合配位化合物结合工序，使所述电极形成工序中形成的电极与所述包合配位化合物内的所述第1主体分子的亲水基结合；
受体结合工序，使所述包合配位化合物内的所述第2主体分子的亲水基与所述受体结合，
在所述包合配位化合物生成工序中生成的包合配位化合物中，由所述第1主体分子的包合部位和所述第2主体分子的包合部位包合所述客体分子。
19.如权利要求18所述的生物传感器的制造方法，其特征在于，在所述受体结合工序中，在pH4～8且温度15～45℃的条件下，所述第2主体分子的亲水基与所述受体结合。
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