CN1183245C - 含亲水纳米铂颗粒和憎水二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于酶生物工程技术领域，特别是涉及高敏度、高稳定性含亲水纳米铂颗粒和憎水纳米二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜及其制法和用途。将亲水纳米铂溶胶和憎水纳米二氧化硅溶胶与氧化酶水溶液混合；然后加入到高分子凝胶溶液中，搅拌均匀，再加入戊二醛进行交联处理；将上述混合溶液涂在固体载体表面上，在固体载体表面形成一层含亲水纳米铂颗粒和憎水纳米二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜。本发明的酶膜能使生物产品酶用量减少，性能提高。用于生物传感器，还可广泛用于酶生物催化工程等。

Description

含亲水纳米铂颗粒和憎水二氧化硅颗粒的 复合的酶功能敏感膜及其制法和用途

                        技术领域

本发明属于酶生物工程技术领域，特别是涉及高敏度、高稳定性含亲水纳米铂颗粒和憎水纳米二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜及其制法和用途。

                        背景技术

利用酶生物工程制造出的产品，广泛用于人体及工业中，例如：利用葡萄糖氧化酶组装的葡萄糖生物传感器，可用于测量人的血糖、工业废水、发酵或饮料中的糖分。生物传感器具有非常明显的优点，如：高专一性、短时低费用分析、对分析物质没有特殊的要求、操作安全、便于现场测定等等，在许多国家已有很多成果。传感器研究工作者都了解，研制酶生物传感器，其中是研制以高效率工作的分子识别反应的生物传感器单元，对此追求的目标是：灵敏、价廉、微型化。但是生物传感器发展至今，能进入实际使用的为数不多。以葡萄糖生物传感器为例，葡萄糖生物传感器工作时通常是基于对葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖时产生的过氧化氢的电流进行检测。这种方法有如下局限：溶氧的浓度不是足够大时，难以对高含量底物进行测定；而酶用量过多时响应电流传递效率低。近年来，金属、金属氧化物半导体纳米颗粒奇特的物理特性引起人们的注意。纳米颗粒当小到一定尺寸时，具有与其相应块体材料所不具有的新性质和新效应，如：表面效应、体积效应、隧道效应、量子效应等。由于其表面效应，金属颗粒表面带有很高的负电荷，易于通过表面修饰调控光学、电学特性等，引起人们极大的兴趣和关注。其中金属颗粒导电性较佳，可在酶与电极间传递电子。提高固定化酶的催化活性。美国A.L.Crumbliss.等人曾引入亲水的金颗粒到生物传感器中，证明了金颗粒的生物相容性，但他们用的是50纳米的亲水金颗粒，对酶电极的电流响应敏感度没有帮助，这在《生物技术和生物工程》杂志，1992年，40卷，483-490页的文章“适用于作为电沉析法组装酶电极的一种生物相容性固定介质—胶体金”已有报道(A.L.Crumbliss，S.C.Perine，J.Stonehuerner，K.P.Tubergen，Junguo Zhao and R.W.Henkens，Biotechnology and Bioengineering，Vol.40 P.483-490(1992))。

中国专利申请97116989.6中报道了含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜，将通常含葡萄糖氧化酶的酶膜电极电流响应灵敏度提高了十几倍。目前生物传感器的研究正向着高性能、微型化、走入家庭方向发展，是一种被普遍认为最有可能形成产业的高技术。

                        发明内容

本发明的目的之一在于将纳米铂颗粒和纳米二氧化硅颗粒引入复合的酶功能敏感膜中，提供一种能够节约酶用量、提高酶生物传感器电流响应灵敏度的含亲水纳米铂颗粒和憎水纳米二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜。与一般的高分子复合的酶功能敏感膜不同，这种含纳米溶胶的复合的酶功能敏感膜，酶的用量仅是通常用量的几分之一，而提高酶生物传感器的电流响应敏感度几十倍。

本发明的再一目的是提供一种含亲水纳米铂颗粒和憎水纳米二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜制法。

本发明的另一目的是提供一种含亲水纳米铂颗粒和憎水纳米二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜的用途。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的：

本发明的含亲水纳米铂颗粒和憎水二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜是由固定化氧化酶的高分子膜基质、亲水纳米铂颗粒和憎水纳米二氧化硅颗粒组成，其中，高分子∶二氧化硅∶铂的重量比为1∶8.13×10^-7∶2.48×10^-6～1∶2.0×10^-1∶6×10^-1，含有氧化酶0.1～120活力单位，纳米铂溶胶粒径为1～25nm，二氧化硅溶胶粒径为1～50nm。

所述的纳米铂溶胶粒径优选为1～12nm，二氧化硅溶胶粒径优选为1～30nm。

所述的氧化酶是葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶或黄嘌呤氧化酶等。

所述的高分子物质为醋酸纤维素、聚乙烯醇缩丁醛、聚氨脂、聚乙二醇、聚亚砜、聚脲或乙烯—乙烯醇共聚物等。

本发明的含纳米铂颗粒和纳米二氧化硅颗粒溶胶的复合的酶功能敏感膜的制备方法：将纳米铂溶胶和纳米二氧化硅溶胶与氧化酶水溶液混合；然后加入到高分子凝胶溶液中，搅拌均匀，再加入戊二醛进行交联处理；其中，纳米铂溶胶的摩尔浓度为0.1×10^-6～2.5×10^-2mol/kg；纳米二氧化硅溶胶的摩尔浓度为0.1×10^-6～2.5×10^-2mol/kg；氧化酶为2.5×10³～5×10⁵个活力单位/公斤；高分子的重量百分比浓度为0.5～5％；戊二醛的重量百分比浓度为0.01～2％；将上述混合溶液涂在固体载体上，室温下，挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含亲水纳米铂颗粒和憎水纳米二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜。

其中纳米铂溶胶溶液为亲水纳米铂溶胶溶液，二氧化硅溶胶溶液为憎水纳米二氧化硅溶胶溶液。纳米铂溶胶粒径为1～25nm，优选为1～12nm，二氧化硅溶胶粒径为1～50nm，优选为1～30nm；氧化酶为葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶或黄嘌呤氧化酶等；高分子为醋酸纤维素、聚乙烯醇缩丁醛、聚氨脂、聚乙二醇、聚亚砜、聚脲或乙烯—乙烯醇共聚物等；固体载体为铂丝。

本发明采用溶胶—凝胶法制备亲水纳米铂溶胶溶液

(1).分别配制氯铂酸、还原剂及保护剂的水溶液，其中，氯铂酸和还原剂的摩尔浓度分别为1×10^-6～5×10^-1mol/kg和1×10^-6～10mol/kg，保护剂的固体含量与水的体积比为0.01～10克/升。

(2).制备亲水纳米铂溶胶溶液；在25～90℃下将步骤(1)的氯铂酸水溶液与保护剂水溶液混合，体积比为1∶0.01～1∶10；再将此混合溶液和步骤(1)的还原剂水溶液分别加入到反应容器中混合，其中，氯铂酸与还原剂的摩尔比为1∶1～1∶70，混合溶液在搅拌下反应0.5～2小时，即得到粒径为1～25nm，优选为1～12nm的亲水纳米铂溶胶溶液，其摩尔浓度为1×10^-6～10^-2mol/Kg。

本发明采用反胶束法制备憎水纳米二氧化硅溶胶溶液

反胶束是指表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中，当其浓度超过临界胶束浓度(CMC)时，形成亲水极性头朝内，疏水链向外的液体颗粒结构。反胶团的内核可增溶大量的水分子和水可溶的电解质及不同的化合物，形成的水核是一个很好的“微型反应器”。

具体制备方法如下：

(1)配制表面活性剂的非极性有机溶剂溶液，其摩尔浓度为50～300毫摩尔/千克溶剂；

(2)取氨水加入到体积0.01～1升的步骤(1)中配制好的表面活性剂的非极性有机溶剂溶液中，氨水的浓度及用量依据憎水纳米二氧化硅的大小所要求的水与表面活性剂的摩尔比(R_W值)来确定，R_W值为1～14，得到氨水反胶束溶液。

反胶束内的水核尺寸是由增溶水的量决定的，即：R_W值的大小代表了由表面活性剂所包围的水核的直径大小，随R_W值的增大，水核直径增大，因此在水核内进行化学反应制备超细颗粒时，水核的尺寸直接限定颗粒尺寸的大小，是控制颗粒大小的最主要因素。

(3)制备憎水纳米SiO₂溶胶溶液，室温下，将硅酸酯[Si(OR)₄]加入到步骤(2)中的氨水反胶束溶液中，硅酸酯的浓度及用量依据憎水纳米二氧化硅的浓度所要求的硅酸酯与表面活性剂的摩尔比(R_E值)来确定，R_E值为0.0001～0.1。搅拌下混合1～24小时，即得到粒径在1～80纳米，优选为1～50nm的憎水纳米SiO₂溶胶溶液，其摩尔浓度为1×10^-5～10^-2mol/Kg。

本发明的高分子凝胶溶液的制备

将高分子物质溶解在相应的有机溶剂或水中，配成重量百分比浓度为0.5～5％的溶液。

所述的还原剂为对苯二胺、硼氢化钠、柠檬酸、甲酰胺、乙醇或肼等。

所述的保护剂为聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素或聚丙烯酸等。

所述的表面活性剂为非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或天然表面活性剂。

所述的非离子表面活性剂是烷基酚聚氧乙烯醚(TritonX，分子式为 n＝4-6，烷基R为C₇～C₉的烷基)系列、山梨醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯或Span80等。

所述的阴离子表面活性剂是二辛基琥珀酸酯磺酸钠AOT等。

所述的天然表面活性剂是卵磷脂等。

所述的非极性有机溶剂为正己烷、环己烷、异辛烷或氯仿等。

所述的硅酸酯[Si(OR)₄]中R是-C_nH_2n+1，n＝1～5，优选为正硅酸四乙酯[Si(OC₂H₅)₄]。

所述的有机溶剂为丙酮、乙醇或异丙醇等。

本发明的用途：

本发明所制备的含纳米铂颗粒和二氧化硅颗粒的复合的氧化酶功能敏感膜，可用于酶生物传感器、生物分离膜和生物催化工程。尤其是葡萄糖生物传感器特别适用于人体中的血糖、工业废水、培养液、发酵及饮料中糖分的测量等。

本发明的优点及效果：

本发明所制备出的纳米溶胶生物膜，具有常规有机生物膜不可比拟的优越性。这一点从用本发明的膜做的生物传感器电极就可看出。

将用上述方法制得的纳米溶胶的葡萄糖氧化酶生物膜，涂在铂丝上制成的电极作为工作电极，Ag/AgCl电极或甘汞电极做为参比电极，组成葡萄糖氧化酶生物传感器。将葡萄糖氧化酶生物传感器的双电极置于pH值为6-7的磷酸盐缓冲电池里，测其响应电流，对应于相应的葡萄糖浓度(2-35mmol葡萄糖每升)做出电极电流响应曲线。

由于此种生物传感器电极酶膜对葡萄糖具有特征的响应，因此它特别适用于人体中的血糖、工业废水、发酵、饮料中糖分的测量等。

由于此种生物传感器电极所用酶膜含有粒径1-25纳米，特别是1-12纳米的溶胶，所以它的电极电流响应比未引入纳米溶胶的电极电流高几十倍。且酶用量是通常用量的5～50分之一。如图1所示：曲线A是含纳米溶胶的葡萄糖氧化酶电极对葡萄糖浓度做的电极电流响应曲线，而曲线B是不含纳米溶胶的葡萄糖氧化酶电极对葡萄糖浓度做的电极电流响应曲线。曲线A的电流响应值较曲线B的电流响应值提高了40倍。

由于纳米级的憎水二氧化硅溶胶的引入，憎水二氧化硅表面疏水链与葡萄糖氧化酶的疏水链作用，使葡萄糖氧化酶构象变得更加稳定，这种疏水作用的结果，也增加了葡萄糖氧化酶的灵敏度。同时，在与水混溶的高极性有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮里，它同高分子凝胶共价固定在电极的表面上，仍保持很高的酶活性。而通常，亲水的氧化酶在这些高极性有机溶剂里会很快失活，而失去催化活性。含有憎水纳米二氧化硅溶胶的葡萄糖传感器同时增加了氧化酶的吸附量，使其发挥更大作用，从而减少了葡萄糖氧化酶的用量。引入铂溶胶，由于铂溶胶的电子传递催化作用，每1ml高分子凝胶中仅用通常酶用量的几—几十分之一，即几十个甚至几个单位的葡萄糖氧化酶，就可以获得几千甚至几万纳安/厘米²(nA/cm²)的响应电流。另外，含纳米溶胶的葡萄糖传感器的稳定性也大大提高，实验连续测定80次，电极电流响应结果很重复。而未引入纳米溶胶的传感器仅能重复测定7、8次左右。

从上述结果就可看出，本发明的生物膜特别适用于制造生物工程所用的产品，其效果具有突出的质变。

总之，本发明有如下优点：

1.制备方法简单易行，不需化学后处理，易于推广应用。

2.由于纳米级的铂颗粒的引入，使产品的电性能较未引入纳米溶胶的产品大大提高，所用酶量也比通常用量大大减少；而憎水二氧化硅纳米颗粒的引入能增强产品的稳定性，延长产品的使用寿命。综合这两者的作用，含纳米铂和二氧化硅溶胶的复合的酶功能敏感膜的成本就大大降低了。

3.在有机溶剂，即使在有与水可混溶的有机溶剂里，仍可保证酶蛋白无损伤固定。

                        附图说明

图中曲线为“含亲水纳米铂颗粒和憎水纳米二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜”。

图1.电极响应电流对应于葡萄糖浓度关系曲线；

    横坐标—葡萄糖浓度(单位：mmol/l)

    纵坐标—响应电流(单位：nA/cm²)

    曲线A—含纳米溶胶的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流

           响应曲线

    曲线B—不含纳米溶胶的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电

           流响应曲线

图2.实施例1中电流对应于葡萄糖浓度关系曲线；

    横坐标—葡萄糖浓度(单位：mmol/l)

    纵坐标—响应电流(单位：nA/cm²)

    曲线C—含纳米溶胶的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流

           响应曲线

图3.实施例2中电流对应于葡萄糖浓度关系曲线

    横坐标—葡萄糖浓度(单位：mmol/l)

    纵坐标—响应电流(单位：nA/cm2)

    曲线D—含纳米溶胶的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流

           响应曲线

图4.实施例4中电流对应于葡萄糖浓度关系曲线

    横坐标—葡萄糖浓度(单位：mmol/l)

    纵坐标—响应电流(单位：nA/cm2)

    曲线E—含纳米溶胶的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流

           响应曲线

                       具体实施方式

实施例1

第一步：采用溶胶—凝胶法制备亲水纳米铂溶胶溶液：

分别配制氯铂酸，硼氢化钠及羟丙基纤维素的水溶液，氯铂酸和硼氢化钠的摩尔浓度分别为8×10^-4mol/Kg和6.3×10^-2mol/Kg，羟丙基纤维素的固体含量与溶剂的体积比为0.5克/升。在55℃下将氯铂酸水溶液与羟丙基纤维素水溶液混合，体积比为1∶0.5，再将此混合溶液和硼氢化钠水溶液分别加入到反应容器中，其中氯铂酸水溶液与硼氢化钠水溶液的摩尔比为1∶15，混合溶液在搅拌下反应1小时，即得到粒径为4nm亲水纳米铂溶胶溶液，其摩尔浓度为7×10^-4mol/Kg。

第二步：采用反胶束法制备憎水纳米二氧化硅溶胶溶液：

①配制非离子表面活性剂TritonX-45的环己烷有机溶剂溶液，其摩尔浓度为200毫摩尔/千克溶剂。

②取氨水加入到体积0.1升的步骤①中的非极性有机溶剂溶液中，氨水的浓度及用量依据憎水纳米二氧化硅的大小所要求的R_W值为12。

③制备憎水纳米SiO₂溶胶溶液：室温下，将正硅酸四乙酯[Si(OC₂H₅)₄]加入到步骤②中的氨水反胶束溶液中，加入量依据R_E值为0.05，搅拌下混合6小时，即得到粒径在25纳米的憎水纳米SiO₂溶胶溶液，其重量摩尔浓度为5.8×10^-3mol/kg。

第三步：制备高分子的凝胶溶液：

将高分子物质聚乙烯醇缩丁醛溶解在无水乙醇中，使得溶液的重量百分比浓度为2％；

第四步：制备含纳米铂颗粒和二氧化硅颗粒的复合氧化酶功能敏感膜：

将重量摩尔浓度为7×10^-4mol/Kg的纳米铂溶胶溶液2.5ml与重量摩尔浓度为5.8×10^-3mol/kg的纳米二氧化硅溶胶溶液2.5ml混合，再同浓度为500个活力单位/毫升的氧化酶水溶液0.3ml混合；接着加入重量百分比浓度为2％的高分子凝胶溶液10ml，搅拌均匀，再加入重量百分浓度为1％的戊二醛1.2ml进行交联处理；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含纳米溶胶的复合氧化酶功能敏感膜。

用Ag/AgCl电极做为参比电极，将双电极置于5mlpH为6.86的磷酸盐缓冲液电池里，测其基质电流，然后依次加入2.8，5.6，11.1，16.7，22.2，27.8，33.3mmol/l浓度β-D葡萄糖水溶液，测其响应电流(Y轴)，对应于相应的葡萄糖浓度(X轴)做出响应曲线。如图2所示，葡萄糖浓度为33mmol/l，电极响应电流可达26679nA/cm²。而不含纳米溶胶，但含相同酶用量的葡萄糖氧化酶电极的电极电流响应仅1025nA/cm²。

实施例2

第一步：采用溶胶—凝胶法制备亲水纳米铂溶胶溶液：

分别配制氯铂酸，硼氢化钠及羧甲基纤维素的水溶液，氯铂酸和硼氢化钠的摩尔浓度分别为8×10^-4mol/Kg和2.1×10^-2mol/Kg，羧甲基纤维素的重量与溶剂的体积比为0.03克/升。在45℃下将氯铂酸水溶液与羧甲基纤维素水溶液混合，体积比为1∶1，再将此混合溶液和硼氢化钠水溶液分别加入反应容器中，其中氯铂酸水溶液与硼氢化钠水溶液的摩尔比为1∶5，混合溶液在搅拌下反应1.5小时，即得到粒径为8nm亲水纳米铂溶胶溶液，其重量摩尔浓度为7×10^-4mol/Kg。

第二步：采用反胶束法制备憎水纳米二氧化硅溶胶溶液：

①配制阴离子表面活性剂二辛基琥珀酸钠(AOT)的环己烷有机溶剂溶液，其摩尔浓度为100毫摩尔/千克溶剂；

②取氨水加入到体积0.1升的步骤①中的非极性有机溶剂溶液中，氨水的浓度及用量依据憎水纳米二氧化硅的大小所要求的R_W值为4。

③制备憎水纳米SiO₂溶胶溶液，在25℃下将正硅酸四乙酯[Si(OC₂H₅)₄]加入到步骤②中的氨水反胶束溶液中，加入量依据R_E值为0.5，搅拌下混合10小时，即得到粒径在50纳米的憎水纳米SiO₂溶胶溶液，其摩尔浓度为2.9×10^-2mol/kg。

第三步：制备高分子的凝胶溶液：

将高分子物质聚乙烯醇缩丁醛溶解在无水乙醇中，使得溶液的重量百分比浓度为2％；

第四步：制备含纳米铂颗粒和二氧化硅颗粒的复合氧化酶功能敏感膜：

将摩尔浓度为7×10^-4mol/Kg的纳米铂溶胶溶液2ml与摩尔浓度为2.9×10^-2mol/kg的纳米二氧化硅溶胶溶液2ml混合，再同浓度为500个活力单位/毫升的氧化酶水溶液0.3ml混合；接着加入重量百分比浓度为2％的高分子凝胶溶液10ml，搅拌均匀，再加入重量百分浓度为1％的戊二醛2ml进行交联处理；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含纳米溶胶的复合氧化酶功能敏感膜。

按实施例1的方式测其响应电流，对应于相应的葡萄糖浓度做出响应曲线D。如图3所示，葡萄糖浓度为33mmol/l，电流极响应电流可达59375nA/cm²。

实施例3

第一步：采用溶胶—凝胶法制备亲水纳米铂溶胶溶液：

分别配制氯铂酸，水合肼及聚乙烯吡咯烷酮的水溶液，氯铂酸和水合肼的摩尔浓度分别为8×10^-4mol/Kg和2×10^-1mol/Kg，聚乙烯吡咯烷酮的重量与溶剂的体积比为6克/升。80℃将氯铂酸水溶液与聚乙烯吡咯烷酮水溶液混合，体积比为1∶5，再将此混合溶液和水合肼水溶液分别加入反应容器中，其中氯铂酸水溶液及水合肼水溶液的摩尔比为1∶50，混合溶液在搅拌下反应0.5小时，即得到粒径为2nm亲水纳米铂溶胶溶液，其重量摩尔浓度为7×10^-4mol/Kg。

第二步：采用反胶束法制备憎水纳米二氧化硅溶胶溶液：

①配制卵磷脂的氯仿有机溶剂溶液，其重量摩尔浓度为100毫摩尔/千克溶剂；

②取氨水加入到体积0.1升的步骤①中的非极性有机溶剂溶液中，氨水的浓度及用量依据憎水纳米二氧化硅的大小所要求的R_W值为3。

③制备憎水纳米SiO₂溶胶溶液：室温下将正硅酸四乙酯[Si(OC₂H₅)₄]加入到步骤②中的氨水反胶束溶液中，加入量依据R_E值为0.01，搅拌下混合8小时，即得到粒径在42纳米的憎水纳米SiO₂溶胶溶液，其重量摩尔浓度为5.8×10^-4mol/kg。

第三步：制备高分子的凝胶溶液：

将高分子物质聚氨脂溶解在还氧六烷中，使得溶液的重量百分比浓度为1％；

第四步：制备含纳米铂颗粒和二氧化硅颗粒的复合氧化酶功能敏感膜：

将摩尔浓度为7×10^-4mol/Kg的纳米铂溶胶溶液5ml与摩尔浓度为5.8×10^-4mol/kg的纳米二氧化硅溶胶溶液5ml混合，再同浓度为500个活力单位/毫升的氧化酶水溶液0.6ml混合，接着加入重量百分比浓度为1％的高分子凝胶溶液10ml，搅拌均匀，再加入重量百分浓度为1％的戊二醛1ml进行交联处理；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含纳米溶胶的复合氧化酶功能敏感膜。

按实施例1的方式测其响应电流，葡萄糖浓度为33mmol/l，电流极响应电流可达40097nA/cm²。

实施例4

第一步：采用溶胶—凝胶法制备亲水纳米铂溶胶溶液：

分别配制氯铂酸，水合肼及羟丙基纤维素的水溶液，氯铂酸和水合肼的摩尔浓度分别为4×10^-4mol/Kg和3.2×10^-2mol/Kg，羟丙基纤维素的重量与溶剂的体积比为0.3克/升。70℃将氯铂酸水溶液与羟丙基纤维素水溶液混合，体积比为1∶0.08，再将此混合溶液和水合肼水溶液分别加入反应容器中，其中氯铂酸水溶液与水合肼水溶液的摩尔比为1∶15，混合溶液在搅拌下反应0.5小时，即得到粒径为6nm亲水纳米铂溶胶溶液，其重量摩尔浓度为3.5×10^-4mol/Kg。

第二步：采用反胶束法制备憎水纳米二氧化硅溶胶溶液：

①配制阴离子表面活性剂二辛基琥珀酸钠(AOT)的环己烷有机溶剂溶液，其摩尔浓度为200毫摩尔/千克溶剂；

②取氨水加入到体积0.1升的步骤①中的非极性有机溶剂溶液中，氨水的浓度及用量依据憎水纳米二氧化硅的大小所要求的R_W值为6。

③制备憎水纳米SiO₂溶胶溶液：在25℃-35℃下，将正硅酸四乙酯[Si(OC₂H₅)₄]加入到步骤②中的氨水反胶束溶液中，加入量依据R_E值为0.05，搅拌下混合5小时，即得到粒径在35纳米的憎水纳米SiO₂溶胶溶液，其摩尔浓度为5.8×10^-3mol/kg。

第三步：制备高分子的凝胶溶液：

将高分子物质聚乙烯醇缩丁醛溶解在异丙醇中，使得溶液的重量百分比浓度为1％；

第四步：制备含纳米铂颗粒和二氧化硅颗粒的复合氧化酶功能敏感膜：

将摩尔浓度为3.5×10^-4mol/Kg的纳米铂溶胶溶液10ml与摩尔浓度为5.8×10^-3mol/kg的纳米二氧化硅溶胶溶液10ml混合，再同浓度为500个活力单位/毫升的氧化酶水溶液1ml混合；接着加入重量百分比浓度为1％的高分子凝胶溶液10ml，搅拌均匀，再加入重量百分浓度为1％的戊二醛2ml进行交联处理；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含纳米溶胶的复合氧化酶功能敏感膜。

按实施例1的方式测其响应电流，对应于相应的葡萄糖浓度做出响应曲线D。如图4所示，葡萄糖浓度为33mmol/l，电流极响应电流可达44465nA/cm²。

实施例5

第一步：采用溶胶—凝胶法制备亲水纳米铂溶胶溶液：

分别配制氯铂酸，柠檬酸钠及聚丙稀酸的水溶液，氯铂酸和柠檬酸钠的摩尔浓度分别为5.6×10^-3mol/Kg和7.4×10^-1mol/Kg，聚丙稀酸的重量与溶剂的体积比为0.08克/升。在65℃下将氯铂酸水溶液与聚丙稀酸水溶液混合，体积比为1∶0.3，再将此混合溶液和柠檬酸钠水溶液分别加入反应容器中，其中氯铂酸水溶液与柠檬酸钠水溶液的摩尔比为1∶25，混合溶液在搅拌下反应2小时，即得到粒径为5nm亲水纳米铂溶胶溶液，其重量摩尔浓度为4.9×10^-3mol/Kg。

第二步：采用反胶束法制备憎水纳米二氧化硅溶胶溶液：

①配制非离子表面活性剂TritonX-45的己烷有机溶剂溶液，其摩尔浓度为300毫摩尔/千克溶剂；

②取氨水加入到体积0.2升的步骤①中的非极性有机溶剂溶液中，氨水的浓度及用量依据憎水纳米二氧化硅的大小所要求的R_W值为16。

③制备憎水纳米SiO₂溶胶溶液：在35℃下，将正硅酸四乙酯[Si(OC₂H₅)₄]加入到步骤②中的氨水反胶束溶液中，加入量依据R_E值为0.1，搅拌下混合18小时，即得到粒径在9纳米的憎水纳米SiO₂溶胶溶液，其摩尔浓度为3.5×10^-2mol/kg。

第三步：制备高分子的凝胶溶液：

将高分子物质醋酸纤维素溶解在丙酮中，使得溶液的重量百分比浓度为1％；

第四步：制备含纳米铂颗粒和二氧化硅颗粒的复合氧化酶功能敏感膜：

将摩尔浓度为4.9×10^-3mol/Kg的纳米铂溶胶溶液2ml与摩尔浓度为3.5×10^-2mol/kg的纳米二氧化硅溶胶溶液2ml混合，再同浓度为500个活力单位/毫升的氧化酶水溶液0.26ml混合；接着加入重量百分比浓度为1％的高分子凝胶溶液10ml，搅拌均匀，再加入重量百分浓度为1％的戊二醛2ml进行交联处理；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含纳米溶胶的复合氧化酶功能敏感膜。

按实施例1的方式测其响应电流，葡萄糖浓度为33mmol/l，电流极响应电流可达31847nA/cm²。

实施例6

第一步：采用溶胶—凝胶法制备亲水纳米铂溶胶溶液：

分别配制氯铂酸，柠檬酸钠及聚乙烯吡咯烷酮的水溶液，氯铂酸和柠檬酸钠的摩尔浓度分别为1×10^-5mol/Kg和7.9×10^-4mol/Kg，聚乙烯吡咯烷酮的重量与溶剂的体积比为1克/升。30℃将氯铂酸水溶液与羟丙基纤维素水溶液混合，体积比为1∶0.02，再将此混合溶液和柠檬酸钠水溶液分别加入反应容器中，其中氯铂酸、水溶液及柠檬酸钠水溶液的摩尔比为1∶15，混合溶液在搅拌下反应1小时，即得到粒径为10nm亲水纳米铂溶胶溶液，其重量摩尔浓度为8.7×10^-6mol/Kg。

第二步：采用反胶束法制备憎水纳米二氧化硅溶胶溶液：

①配制壬基酚聚氧乙烯醚(n＝6)的环己烷有机溶剂溶液，其摩尔浓度为50毫摩尔/千克溶剂；

②取氨水加入到体积0.1升的步骤①中的非极性有机溶剂溶液中，氨水的浓度及用量依据憎水纳米二氧化硅的大小所要求的R_W值为10。

③制备憎水纳米SiO₂溶胶溶液：室温下将正硅酸四乙酯[Si(OC₂H₅)₄]加入到步骤②中的氨水反胶束溶液中，加入量依据R_E值为0.005，搅拌下混合16小时，即得到粒径在15纳米的憎水纳米SiO₂溶胶溶液，其重量摩尔浓度为1.5×10^-4mol/kg。

第三步：制备高分子的凝胶溶液：

将高分子物质聚乙烯醇缩丁醛溶解在无水乙醇中，使得溶液的重量百分比浓度为2％；

第四步：制备含纳米铂颗粒和二氧化硅颗粒的复合氧化酶功能敏感膜：

将摩尔浓度为8.7×10^-6mol/Kg的纳米铂溶胶溶液15ml与摩尔浓度为1.5×10^-4mol/kg的纳米二氧化硅溶胶溶液15ml混合，再同浓度为500个活力单位/毫升的氧化酶水溶液5ml混合；接着加入重量百分比浓度为2％的高分子凝胶溶液100ml，搅拌均匀，再加入重量百分浓度为10％的戊二醛2ml进行交联处理；将上述混合溶液涂在固体载体铂丝上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含纳米溶胶的复合氧化酶功能敏感膜。

按实施例1的方式测其响应电流，葡萄糖浓度为33mmol/l，电流极响应电流可达21253nA/cm²。

Claims (19)

1.一种含亲水纳米铂颗粒和憎水二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜，其特征是：将亲水纳米铂溶胶和憎水纳米二氧化硅溶胶与氧化酶水溶液混合，加入到高分子凝胶溶液中，再加入戊二醛进行交联处理成膜；膜是由固定化氧化酶的高分子膜基质、亲水纳米铂颗粒和憎水纳米二氧化硅颗粒组成，其中，高分子∶二氧化硅∶铂的重量比为1∶8.13×10^-7∶2.48×10^-8～1∶2.0×10^-1∶6×10^-1，含有氧化酶0.1～120活力单位，纳米铂溶胶粒径为1～25nm，二氧化硅溶胶粒径为1～50nm。

2.如权利要求1所述的复合的酶功能敏感膜，其特征是：所述的纳米铂溶胶粒径为1～12nm，二氧化硅溶胶粒径为1～30nm。

3.如权利要求1所述的复合的酶功能敏感膜，其特征是：所述的氧化酶是葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶或黄嘌呤氧化酶。

4.如权利要求1所述的复合的酶功能敏感膜，其特征是：所述的高分子物质为醋酸纤维素、聚乙烯醇缩丁醛、聚氨脂、聚乙二醇、聚亚砜、聚脲或乙烯-乙烯醇共聚物。

5.一种如权利要求1所述的含纳米铂颗粒和纳米二氧化硅颗粒溶胶的复合的酶功能敏感膜的制备方法，其特征是：将亲水纳米铂溶胶和憎水纳米二氧化硅溶胶与氧化酶水溶液混合；然后加入到高分子凝胶溶液中，搅拌均匀，再加入戊二醛进行交联处理；其中，亲水纳米铂溶胶的摩尔浓度为0.1×10^-6～2.5×10^-2mol/kg；憎水纳米二氧化硅溶胶的摩尔浓度为0.1×10^-6～2.5×10^-2mol/kg；氧化酶为2.5×10³～5×10⁵个活力单位/公斤；高分子凝胶的重量百分比浓度为0.5～5％；戊二醛的重量百分比浓度为0.01～2％；将上述混合溶液涂在固体载体上，室温下挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含亲水纳米铂颗粒和憎水纳米二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是：所述的亲水纳米铂溶胶是由下面方法得到的：

(1).分别配制氯铂酸、还原剂及保护剂的水溶液，其中，氯铂酸和还原剂的摩尔浓度分别为1×10^-6～5×10^-1mol/kg和1×10^-6～10mol/kg，保护剂的固体含量与水的体积比为0.01～10克/升；

(2).在25～90℃下将步骤(1)的氯铂酸水溶液与保护剂水溶液混合，体积比为1∶0.01～1∶10；再将此混合溶液和步骤(1)的还原剂水溶液分别加入到反应容器中混合，其中，氯铂酸与还原剂的摩尔比为1∶1～1∶70，混合溶液在搅拌下反应0.5～2小时，即得到粒径为1～25nm的亲水纳米铂溶胶溶液，其摩尔浓度为1×10^-6～10^-2mol/Kg。

7.如权利要求5所述的方法，其特征是：所述的憎水纳米二氧化硅溶胶是由下面方法得到的：

(1)配制表面活性剂的非极性有机溶剂溶液，其摩尔浓度为50～300毫摩尔/千克溶剂；

(2)取氨水加入到体积为0.01～1升的步骤(1)的表面活性剂的非极性有机溶剂溶液中，氨水的浓度及用量依据憎水纳米二氧化硅的大小所要求的水与表面活性剂的摩尔比R_W值来确定，R_W值为1～14，得到氨水反胶束溶液；

(3)制备憎水纳米二氧化硅溶胶溶液，室温下，将硅酸酯加入到步骤(2)中的氨水反胶束溶液中，硅酸酯的浓度及用量依据憎水纳米二氧化硅的浓度所要求的硅酸酯与表面活性剂的摩尔比R_E值来确定，R_E值为0.0001～0.1；搅拌下混合，即得到粒径在1～80纳米的憎水纳米二氧化硅溶胶溶液，其摩尔浓度为1×10^-5～10^-2mol/Kg。

8.如权利要求5所述的方法，其特征是：所述的高分子的凝胶溶液是由下面方法制备得到的：

将高分子物质溶解在有机溶剂或水中，配成重量百分比浓度为0.5～5％的溶液。

9.如权利要求6所述的方法，其特征是：所述的亲水纳米铂溶胶粒径为1～12nm。

10.如权利要求7所述的方法，其特征是：所述的憎水纳米二氧化硅溶胶粒径为1～50nm。

11.如权利要求5所述的方法，其特征是：所述的氧化酶为葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶或黄嘌呤氧化酶；所述的固体载体为铂丝。

12.如权利要求5或8所述的方法，其特征是：所述的高分子为醋酸纤维素、聚乙烯醇缩丁醛、聚氨脂、聚乙二醇、聚亚砜、聚脲或乙烯-乙烯醇共聚物。

13.如权利要求6所述的方法，其特征是：所述的还原剂为对苯二胺、硼氢化钠、柠檬酸、甲酰胺、乙醇或肼；所述的保护剂为聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素或聚丙烯酸。

14.如权利要求7所述的方法，其特征是：所述的有机溶剂为丙酮、乙醇或异丙醇。

15.如权利要求7所述的方法，其特征是：所述的表面活性剂为非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或天然表面活性剂。

16.如权利要求15所述的方法，其特征是：所述的非离子表面活性剂是烷基酚聚氧乙烯醚，其分子式为 n＝4-6，R为C₇～C₉的烷基、山梨醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯或Span80；所述的阴离子表面活性剂是二辛基琥珀酸酯磺酸钠；所述的天然表面活性剂是卵磷脂；所述的非极性有机溶剂为正己烷、环己烷、异辛烷或氯仿。

17.如权利要求7所述的方法，其特征是：所述的硅酸酯的分子式是Si(OR)₄，其中R是-C_nH_2n+1，n＝1～5。

18.如权利要求17所述的方法，其特征是：所述的硅酸酯是正硅酸四乙酯。

19.一种如权利要求1-4任意一项所述的含亲水纳米铂颗粒和憎水二氧化硅颗粒的复合的酶功能敏感膜的用途，其特征是：所述的复合的氧化酶功能敏感膜用于酶生物传感器、生物分离膜和生物催化工程。

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