WO2004070372A1 - ターゲット認識素子及びターゲット認識素子を利用したバイオセンサ - Google Patents

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WO2004070372A1
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receptor
host molecule
molecule
electrode
inclusion
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PCT/JP2004/001228
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English (en)
French (fr)
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Atsushi Ikeda
Jun-Ichi Kikuchi
Haruo Kotani
Yoko Hayashi
Takaaki Shimasaki
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
Rohm Co., Ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Definitions

  • the present invention relates to a target recognition element that specifically binds to a substance to be measured, and a biosensor using the target recognition element.
  • Biosensors include sensors such as enzyme sensors, immunosensors, and microbial sensors. They are important in many fields such as medical, food, and industrial fields for identifying substances and measuring target substances (hereinafter referred to as targets). Have been watched.
  • glucose sensor that measures a blood glucose level from a glucose concentration in blood.
  • the glucose sensor has an electrode and an enzyme film provided to cover the electrode.
  • Glucose oxidase (GOD) is immobilized on the enzyme membrane as a receptor that specifically reacts with glucose.
  • the glucose sensor glucose as shown in Reaction Formula (1) is oxidized by GOD, it is decomposed into Darukon acid and H 2 0 2.
  • H 2 0 2 generated in the reaction formula (1) includes an electrode and an enzyme layer
  • the solution diffuses to the surface of the electrode during this time, and is electrolyzed at the electrode as shown in reaction formula (2), and the electrons move to the electrode.
  • Fig. 7 shows the principle of operation of the mediator-type biosensor. The following reaction is performed between mediator 1 ⁇ / 1, enzyme E and substrate S that reacts with enzyme E.
  • the redox reaction between the oxidized enzyme Eox and the substrate S exchanges electrons to produce the reduced enzyme Ered and the product P.
  • a redox reaction between the reduced enzyme Ered and the oxidized mediator Mox produces the oxidized enzyme Eox and the reduced mediator Mred.
  • the redox reaction between the reduced mediator Mred and the electrode generates the oxidized mediator Mox, and the electrons move to the electrode.
  • the electrons generated by this enzymatic reaction move rapidly and in large quantities from the enzyme to the electrode via the mediator.
  • oxidation and reduction are repeated in the yeast E and the mediator M.
  • the substrate S is oxidized and the electrons move to the electrode.However, when the substrate S is reduced and consumes the electrons, the electron is transferred from the electrode to the enzyme by the reverse cycle. I do.
  • C 60 fullerene 2 which is a mediator, is immobilized on the electrode 1 through a self-assembled monolayer 3 composed of one s S— (CH 2 ) 2 —NH 2 force.
  • the enzymes 4 and the C 60 fullerene 2 not bonded, the enzymes 4 are suspended in a liquid.
  • Mediator type biosensor according to the literature using the C 60 fullerene 2 having excellent characteristics in terms of electron-withdrawing and electron donating.
  • enzyme 4 It is suspended in the body, not connected with the C 60 fullerene 2. Therefore, the enzymes 4 and even when the redox transfer yo Li electrons to a reaction between the substrate 5 is performed, to be bonded with each enzyme 4 and Ceo fullerene 2, the electrode 1 from the C 60 fullerene 2 enzymes 4 Cannot move a large number of electrons at high speed.
  • an object of the present invention is to provide a target recognition element in which a receptor is immobilized on an inclusion complex containing a mediator.
  • the first invention of the present application is directed to a first host molecule having a hydrophilic group and an inclusion site, a second host molecule having a hydrophilic group and an inclusion site, and a hydrophilic group of the second host molecule.
  • a receptor that reacts with the target is included by the inclusion site of the first host molecule and the inclusion site of the second host molecule, and is formed by the reaction between the target and the receptor.
  • a target recognition element including a guest molecule that transmits generated charges.
  • the reaction between the receptor and the target was always included by the first host molecule and the second host molecule. This can be done near the guest molecule. Therefore, the charges generated by this reaction can be moved by the guest molecules at high speed and in large amounts.
  • the first and second host molecules have a hydrophilic group, the target recognition element can be handled in a solution even if the guest molecule is insoluble. Can be easily arranged.
  • the second invention of the present application is the first invention, wherein the first host molecule is a first Wherein the second host molecule is a second calixarene and the guest molecule is a fullerene.
  • the inclusion sites of the first and second liquor squalenes enclose the fluorene by hydrophobic interaction and ⁇ -pourt interaction, so that the water-insoluble fullerene, which is the mediator, is a special modifying group. It can be changed to water-soluble without using. Therefore, since the distribution of electrons involved in electric conduction is kept uniform, the characteristics of fullerenes, which have high electron affinity and low ionization energy, are not impaired. Therefore, a large amount of charges can be moved at high speed by fullerenes.
  • the third invention of the present application provides the target recognition element according to the first invention, wherein the receptor is one or a combination of a plurality of enzymes selected from the group consisting of an enzyme, an antibody, DNA (deoxyribonucleic acid) and a peptide.
  • Bio substances can be specifically captured by enzymes, antibodies, DNA or peptides.
  • a fourth invention of the present application provides the target recognition element according to the first or second invention, further comprising at least one polymer film between the second host molecule and the receptor.
  • the polymer film imparts flatness to the adhesive interface between the second host molecule and the receptor and does not destroy the three-dimensional structure of the receptor, the deactivation of the receptor can be prevented. Further, since the bonding area can be increased, the second host molecule and the receptor can be more strongly bonded.
  • the fifth invention of the present application provides the target recognition element according to the fourth invention, wherein the polymer film includes a poly (diallyldimethylammonium) layer and a polyvinyl potassium sulfate layer.
  • the sixth invention of the present application provides the target recognition element according to the first invention, further comprising a polyion complex film covering the receptor.
  • the receptor is bound to a hydrophilic group of the second host molecule under conditions of pH 4 to 8 and a temperature of 15 to 45 ° G.
  • Target The present invention provides a cut recognition element.
  • the inactivation of the receptor can be prevented.
  • the eighth invention of the present application relates to a first host molecule having a hydrophilic group and an inclusion site, a second host molecule having a hydrophilic group and an inclusion site, and an electrode to which the hydrophilic group of the first host molecule is bonded.
  • a biosensor including a guest molecule that transmits electric charge generated by a reaction between the target and the receptor to the electrode.
  • the receptor Since the receptor is immobilized on the second host molecule, the receptor can always react with the target near the guest molecule. Therefore, the charge generated by this reaction can be transferred from the receptor to the electrode in a large amount at high speed by the guest molecule. Furthermore, since the guest molecule is stably fixed to the electrode by being included in the first and second host molecules, a modifying group for fixing to the electrode is not required for the guest molecule. Therefore, the property of the guest molecule to transfer charges at high speed and in large amounts is not impaired. Further, since the first and second host molecules have a hydrophilic group, the biosensor can be easily removed in a solution even if the guest molecule is insoluble.
  • a ninth invention of the present application provides the biosensor according to the eighth invention, further including a detection unit connected to the electrode.
  • the charge transferred to the electrode can be measured by the detecting means.
  • the tenth invention of the present application is the biomolecule according to the eighth invention, wherein the first host molecule is a first calixarene, the second host molecule is a second calixarene, and the guest molecule is fullerene. Provide a sensor. It has the same effect as the second invention.
  • An eleventh invention of the present application provides the biosensor according to the eighth invention, wherein the receptor is one or a combination of a plurality of enzymes selected from the group consisting of an enzyme, an antibody, DNA and a peptide. It has the same effect as the third invention.
  • the 12th invention of the present application is the biomolecule according to any one of the 8th to 10th inventions, further comprising at least one polymer film between the second host molecule and the receptor. Provide a sensor. It has the same effect as the fourth invention.
  • a thirteenth invention of the present application provides the biosensor according to the twelveth invention, wherein the polymer film includes a poly (diallyldimethylammonium) layer and a polyvinyl sulfate salt layer. It has the same effect as the fifth invention.
  • the 14th invention of the present application provides the biosensor according to the 8th invention, further comprising a polyion complex film covering the receptor. It has the same effect as the sixth invention.
  • the fifteenth invention of the present application is the biosensor according to the eighth invention, wherein the receptor is bonded to a hydrophilic group of the second host molecule at a pH of 4 to 8 and a temperature of 15 to 45 ° C. I will provide a. It has the same effect as the seventh invention.
  • a sixteenth invention of the present application provides a detection method for detecting a charge generated by a reaction between the target and the receptor, using the biosensor according to claim 9.
  • the electric charge can be detected efficiently.
  • a seventeenth invention of the present application provides the detection method according to the sixteenth invention, wherein the guest molecule is fullerene, and further comprising an excitation step of photoexciting the fullerene.
  • the fullerene By irradiating light to the fullerene, the fullerene is photoexcited, so that the property of the fullerene, which has a high electron affinity and a small ionization energy, can be enhanced. Therefore, the reaction speed as a biosensor can be increased, and the reaction sensitivity can be increased.
  • the eighteenth invention of the present application is the method for producing a biosensor according to claim 8, wherein the solution containing the first host molecule and the second host molecule and the solution containing the guest molecule are mixed and stirred, An inclusion complex forming step of forming an inclusion complex including the first host molecule, the second host molecule, and the guest molecule; an electrode forming step of bonding an anionic or cationic molecule to an electrode surface; An inclusion complex bonding step of bonding the electrode formed in the electrode forming step to a hydrophilic group of the first host molecule in the inclusion complex; and An inclusion complex formed in the inclusion complex formation step, wherein the inclusion complex of the first host molecule and the second inclusion molecule are included in the inclusion complex formed in the inclusion complex formation step.
  • a method for producing a biosensor wherein the guest molecule is included by an inclusion site of a host molecule.
  • a biosensor having the same effects as the eighth invention can be manufactured.
  • the nineteenth invention of the present application is the method of the eighteenth invention, wherein in the receptor binding step, the hydrophilicity of the second host molecule is maintained at a temperature of 15 to 45 ° C.
  • a method for producing a biosensor for binding a group to the receptor is provided. It has the same effect as the seventh invention.
  • FIG. 1 (a) is a diagram showing a basic configuration of an electrode section of a mediator type biosensor according to the present invention
  • FIG. 1 (b) is an explanatory diagram for explaining the operation of the biosensor of (a).
  • FIG. 2 shows a configuration of the biosensor according to the first embodiment.
  • FIG. 3 shows (a) an example of a biosensor provided with a detection section (1).
  • FIG. 4 shows (a) the configuration (1) of the biosensor according to the third embodiment, and (b) the configuration (2) of the biosensor according to the third embodiment.
  • FIG. 5 shows the configuration of the biosensor according to the fourth embodiment.
  • FIG. 6 shows electrical characteristics of the biosensor of the first embodiment.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram for explaining the operation principle of the mediator-type biosensor.
  • Figure 8 is a structure of the electrode portion of the mediator biosensor using conventional C 60 fullerene.
  • FIG. 1 (a) shows the basic configuration of the electrode section of the mediator biosensor according to the present invention.
  • the mediator type biosensor has an electrode 11 and a target recognition element 10 fixed to the electrode 11.
  • the target recognition element 10 has an inclusion complex 13 and a receptor 15 fixed to the inclusion complex 13.
  • Inclusion complex 13 is the first e It has a strike molecule 13a, a second host molecule 13b, and a guest molecule 13c.
  • the first host molecule 13a has a hydrophilic group 19a and an inclusion site 21a
  • the second host molecule 13b has a hydrophilic group 19b and an inclusion site 21b. are doing.
  • the inclusion complex 13 is configured to include the guest molecule 13 G by the inclusion site 21 a of the first host molecule 13 a and the inclusion site 21 b of the second host molecule 13 b. They are are surrounded as a whole and a hydrophilic group 1 9 3 ⁇ Pi 1 9 b.
  • the included guest molecule 13 c acts as a mediator that transfers charge from the receptor 15 to the electrode.
  • the guest molecule 13c includes fullerene
  • the first and second host molecules 13a and 13b include calixarene.
  • the first and second host molecules 13a and 13b may be different substances.
  • it is preferable that the same substance is used because the inclusion complex 13 can be easily prepared.
  • the inclusion complex 13 is prepared using two substances A and B as the materials of the first and second host molecules 13a and 13b, three kinds of complexes (AA , AB, BB) are generated. Therefore, it is necessary to separate these complexes, and it becomes difficult to prepare the inclusion complex 13. On the other hand, when the same substance is used, it is not necessary to separate them, so that the preparation is easy. Furthermore, if the substance is the same, there is no need to distinguish between the substance of the first host molecule 13a on the electrode 11 side and the substance of the second host molecule 13b on the opposite side of the electrode 11, and the inclusion complex Control of immobilization of 13 is easy.
  • the electrode 11 is lyion-bonded to the hydrophilic group 19a of the first host molecule 13a by electrostatic interaction.
  • the bond between the electrode 11 and the inclusion complex 13 is not limited to an ionic bond, and various bonds such as a covalent bond and a coordinate bond can be considered.
  • the electrode 11 may be an inactive electrode, and an electrode of Au, Ag, Pt, ITO, carbon, or the like is used. The use of carbon is preferred because it is inexpensive, easy to process, and a relatively stable electrode can be obtained.
  • FIG. 1 (b) is a schematic diagram illustrating the operation of the biosensor of FIG. 1 (a).
  • Target 23 is a substance that is captured by receptor 15. This biosensor operates as follows. The target 23 is captured by the receptor 15 and an oxidation-reduction reaction occurs between the target 23 and the receptor 15.
  • the presence, content, and the like of the target 23 can be measured.
  • FIG. 1 (b) illustrates a case where a negative charge moves, a positive charge may move.
  • the receptor 15 is fixed to the inclusion complex 13 by binding the second host molecule 13b and the receptor 15. Therefore, the reaction between the receptor 15 and the target 23 can always be performed in the vicinity of the guest molecule 13 G included by the first host molecule 13 a and the second host molecule 13 b. . Therefore, the charge generated by this reaction can be transferred from the receptor 15 to the electrode 11 in large quantities at high speed by the guest molecule 13c.
  • the first and second host molecules 13a and 1313 have hydrophilic groups 193 and 19b, even if the guest molecule 13G is insoluble, the target in the solution is not affected.
  • the guest molecule 13c can be handled in a solution such as by measuring the sample 23. Also, for example, the target recognition elements 10 can be easily arranged on the substrate.
  • FIG. 2 shows a configuration of the biosensor according to the first embodiment.
  • the biosensor according to the first embodiment will be described with reference to FIGS. 1 and 2.
  • a target recognition element 10 in which a receptor 15 is immobilized on an inclusion complex 13 is immobilized on an electrode 11.
  • the force elix [3] arene is a structure in which three phenolic derivatives are connected in a ring at the meta position.
  • the oxygen atom side of the phenol portion is composed of a hydrophilic group, and the inclusion site on the benzene ring side opposite to the phenol portion.
  • the inclusion site is composed of a hydrophobic group.
  • the hydrophilic group in the force lix [3] arene shown in Fig. 2 is modified by cationic quaternary amine and is positively charged.
  • the electrode 11 is made of gold, and is modified by anionic anionic force rubric acid and is negatively charged. Therefore, the electrode 11 and the hydrophilic group of the calix [3] arene are bound by electrostatic interaction.
  • the receptor 15 for example, lactate dehydrogenase, which is an enzyme that reacts with pyruvate in blood as a target, is used. Lactate dehydrogenase, which has an acidic isoelectric point, is negatively charged in a neutral aqueous solution, and is bound by electrostatic interaction to the hydrophilic group of pyrex [3] arene.
  • the hydrophilic group of the force lix [3] arene is positively charged, and the surface of the enzyme and the surface of the electrode 11 are negatively charged.
  • the surface of the enzyme and the surface of the electrode 11 may be positively charged.
  • the bond between the receptor 15 and the inclusion complex 13 and the bond between the inclusion complex 13 and the electrode 11 are not electrostatic interactions but may be other bonds such as covalent bonds.
  • Guest molecules 1 3 c is a mediator, for example, other than the C 60 fullerene, C 70, Li 76, 78, 82,. 84, Cs6> then 88, then 90, 92, 94,. It may be a local no-frills of 96.
  • the first and second host molecules 13a and 13b have the same force elix [3] arene, but the first host molecule 13a has a force elix [4] arene.
  • the second host molecule 13 b may use a different force ixarene, such as force ix [3] arene.
  • lactate dehydrogenase which is an enzyme
  • Other enzymes include, for example, oxidase (eg, glucose oxidase), dehydrogenase (eg, alcohol dehydrogenase), reductase (eg, adrenoidoxin), oxygenase, hydroperoxidase
  • zealase for example, cod
  • urease is used as an enzyme
  • blood urea nitrogen BUN Blood urea nitrogen BUN (Blood Urea Nitrogen) can be measured, and when creatinine deaminase is used, creatinine can be measured, making it possible to determine kidney disease .
  • the biosensor described above, wrapped against the C 60 fullerene by hydrophobic interactions and Tautau- [pi interactions inclusion site of the first and second host molecule 1 3 a, a 1 3 b potassium box [3] Aren
  • the electrode 11 is stably fixed to 1.
  • C 60 hula one Ren, force helix [3] are inclusion in a suspended state by Aren, Osamu Kazarimoto are not coupled. Therefore, since the distribution of the valence electrons involved in electric conduction is kept uniform, the fullerene characteristic of high electron affinity and low ionization energy is not impaired. Therefore, it is possible to move the C 60 high speed and large amount charges to fullerene and the electrode from the receptor.
  • the force helix [3] the side opposite to the inclusion site of the array down is, since it is composed of a phenol of hydrophilic groups, it clathrate C 60 fullerene water insoluble force helix [3] Aren, the modifying group It can be changed to water-soluble without using it. Therefore, the biosensor can be easily handled in a solution.
  • FIG. 3A and 3B show an example of a biosensor provided with a detection unit.
  • the target recognition element 42 of FIG. 2 is fixed to the electrode 40, and the electrode 40 is connected to the detection unit 45.
  • the sample is dropped on the electrode 40 where the target recognition element 42 is immobilized, the current is measured by the detector 45, and the current is converted into the concentration of the target in the sample.
  • the tip of the electrode 40 to which the target recognition element 42 is fixed is immersed in the sample solution, and the current is measured by the detection unit 45.
  • C fullerenes a wavelength wide to cause light excitation, is efficiently excited particularly for 6 2 0 nm wavelengths below As a light source having such a wavelength, a red LED or an Ar laser is used.
  • the biosensor of the first embodiment is manufactured as follows. A force helix [3] ⁇ lane and C 60 fullerenes are mixed in an aqueous solution, stirring the mixture solution. It is preferable to use ultrasonic treatment for stirring. This process, C 60 fullerene is inclusion in the hydrophobic group is an inclusion site of force helix [3] Aren, the inclusion complex 13 is generated. Electrode 11, 1, Rix [3] Modify the hydrophilic group of the arene with an anionic or cationic molecule. At this time, the modification is performed so that the bond between the electrode 11 and the force lix [3] arene and the bond between the force lix [3] arene and lactate dehydrogenase are bound by electrostatic interaction.
  • the modified inclusion complex 13, the electrode 11, and the lactate dehydrogenase are combined to obtain a biosensor capable of measuring pyruvate as a target.
  • the lactate dehydrogenase and the inclusion complex 13 be bound at a pH of 4 to 8 and a temperature of 15 to 45 ° C., since the inactivation of the enzyme can be prevented.
  • a gold electrode was immersed in an ethanol solution containing sodium 2-mercaptoethanesulfonate to prepare an electrode 11 having anionic molecules on the surface.
  • the electrode prepared in the above (3) was immersed in an aqueous solution of an inclusion complex (0.25 mmo I Zdm 3 ), whereby the inclusion complexes were densely arranged on the electrode, thereby producing a biosensor. At this time, the inclusion complex was connected to the electrode by electrostatic interaction.
  • the electrode was immersed at room temperature for 20 minutes to immobilize the enzyme on the inclusion complex by electrostatic interaction.
  • FIG. 6 shows the electrical characteristics of the biosensor of the first embodiment obtained by the above-described manufacturing method, which were obtained by the cyclic porttammetry measurement method.
  • Characteristics of a biosensor chip on which lactate dehydratase (LDH) is immobilized immersed in a mixture of 125 juM reduced nicotinamide adenine nucleotide (NADH) and 0-250 ⁇ M pyruvate FIG. A biosensor chip capable of measuring trace amounts of pyruvic acid with high sensitivity was obtained.
  • LDH lactate dehydratase
  • the biosensor having the configuration shown in the first embodiment in which the receptor 15 is an antibody, DNA, cell and / or peptide will be described.
  • an antigen to which the receptor 15 reacts specifically can be a target, and its presence, concentration, and the like can be measured.
  • Antigens include viruses, bacteria, pollen, mold, mites and the like.
  • the case where the antibody is “mouse lgG” and the antigen is “protein AJ” will be described.
  • Protein A is an antigen in mice, using the immune response of mice innate making “mouse igGj antibody.
  • the antibody” mouse I g G "extracted, purified And immobilized on inclusion complex 13.
  • the Fc part of mouse IgG is modified with a hepoxyl or diamino group.
  • protein A and mouse IgG specifically bind.
  • the charge generated from the protein A composed of a polar molecule reaches the electrode 11 via the antibody and the inclusion complex 13. By measuring the current flowing through the electrode 11, protein A, which is an antigen, can be quantified.
  • a method for detecting the target DNA when the receptor 15 is a probe DNA that specifically reacts with the target DNA will be described.
  • DNA has a double helix structure, it is used as a single strand when used as a receptor 15 of a biosensor.
  • a single-stranded DNA having artificial complementarity with the nucleotide sequence of the target DNA is artificially synthesized to produce a probe DNA.
  • the probe 08 is immobilized on the inclusion complex 13.
  • the DNA is heated to, for example, 95 ° C. to form a single strand. If the DNA sequences of the DNA and the probe DNA are complementary, that is, if the DNA in the sample has the DNA sequence to be detected, they are combined to form a double helix structure.
  • an intercalator that specifically binds to the double helix structure and serves as a charge generation source is inserted into the gap of the double helix structure.
  • the presence or absence of the lini double helix structure that is, whether or not the DNA in the sample has the target base sequence is determined based on the change in the current flowing through the electrode 11.
  • a method for detecting a target antigen when the receptor 15 is a cell will be described. Extract and purify immune cells such as NK cells and B cells from living organisms and immobilize them on inclusion complex 13. It is preferable to use the terminal group of the protein molecule bound to the cell surface and immobilize it on the inclusion complex 13 because it can be easily immobilized.
  • Antigens include viruses, bacteria, pollen, mold, mites and the like.
  • a method for detecting a target peptide when the receptor 15 is a peptide will be described.
  • the phage is made to produce a probe peptide that specifically reacts with the desired target using genetic engineering techniques. Extract and purify it and immobilize it on inclusion complex 13.
  • the biosensor having this inclusion complex 13 is injected into a sample, the peptide corresponding to the charge state of the side chain of the amino acid constituting the probe and the probe peptide are bound.
  • the current flowing through the electrode 11 can be measured, and the target peptide of interest can be detected and quantified.
  • FIGS. 4A and 4B show the configuration of the biosensor according to the third embodiment. 1 denote the same components as in the first embodiment.
  • a polymer film 50 is further provided on the target recognition element 10 of FIG.
  • the polymer film 50 is provided between the second host molecule 13 b and the receptor 15. Since such a polymer film 50 imparts flatness to the adhesive interface between the second host molecule 13b and the receptor 15 and does not break the three-dimensional structure of the receptor 15, Inactivation can be prevented. Further, since the adhesion area can be increased, the second host molecule 13b and the receptor 15 can be more strongly adhered. As shown in FIG.
  • the polymer film 50 may be a polymer film 52, 54 having a two-layer structure.
  • a cationic polymer film PDDA (poly (diallyldimethylammonium chloride)) 52 is formed on the inclusion complex 13
  • an anionic polymer film PVS (polyvinyl potassium sulfate) is formed thereon.
  • the enzyme is immobilized on the inclusion complex 13 by forming 54.
  • the polymer film 50 may have two or more layers.
  • a precursor of Ricalix [3] arene was synthesized by aminolysis using an excess of N, N-dimethylpropanediamine, starting from the triester form of Ryelix [3] arene.
  • This precursor was N-methylated using dimethyl sulfate to synthesize a tertiary amine-terminated force lix [3] arene.
  • the gold electrode was immersed in an ethanol solution containing sodium 2-mercaptoethanesulfonate to prepare an electrode 11 having anionic molecules on the surface.
  • the electrode prepared in the above (3) was immersed in an aqueous solution of an inclusion complex (0.25 mmo I Zdm 3 ), whereby the inclusion complexes were densely arranged on the electrode, thereby producing a biosensor. At this time, the inclusion complex was connected to the electrode by electrostatic interaction.
  • FIG. 5 shows a configuration of a biosensor according to the fourth embodiment. 1 denote the same components as in the first embodiment.
  • a polyion complex film 56 is further provided on the target recognition element 10 of FIG.
  • the polyion complex membrane 56 is provided on the receptor 15 and enhances the binding between the receptor 15 and the second host molecule 13b. Therefore, the durability of the biosensor can be improved.
  • a polyion complex membrane such as cationic poly-L-lysine panionic glutamate acrylate is exemplified.
  • the gold electrode was immersed in an ethanol solution containing sodium 2-mercaptoethanesulfonate to prepare an electrode 11 having anionic molecules on the surface. .
  • the electrode prepared in the above (3) was immersed in an aqueous solution of an inclusion complex (0.25 mmo I Zdm 3 ), whereby the inclusion complexes were densely arranged on the electrode, thereby producing a biosensor. At this time, the inclusion complex was connected to the electrode by electrostatic interaction.
  • lactate dehydrogenase 0.2 mg Zm I
  • a polyion complex membrane was formed on the surface of the enzyme by casting a 1 mM solution of Poly-L-lysine using a casting method.
  • a target recognition element in which a receptor is immobilized on an inclusion complex containing a mediator can be provided.

Abstract

本発明は、受容体がメディエータを含む包接錯体に固定化されたターゲット認識素子を提供するものである。親水基１９ａおよび包接部位２１ａを有する第１ホスト分子１３ａと、親水基１９ｂおよび包接部位２１ｂを有する第２ホスト分子１３ｂと、前記第２ホスト分子１３ｂの親水基１９ｂに結合され、ターゲット２３と反応する受容体１５と、前記第１ホスト分子１３ａの包接部位２１ａと前記第２ホスト分子１３ｂの包接部位２１ｂとにより包接され、前記ターゲット２３と前記受容体１５との反応により発生した電荷を伝達するゲスト分子１３ｃとを含むターゲット認識素子を提供する。

Description

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明 細 書 ターゲット認識素子及びターゲット認識素子を利用したバイオセンサ (技術分野）
本発明は、 測定対象の物質と特異的に結合するターゲット認識素子及びそのタ —ゲット認識素子を利用したバイオセンサ関するものである。
(背景技術）
バイオセンサは、 酵素センサ、 免疫センサ、 微生物センサなどのセンサがあり、 医療、 食品、 工業の分野など多くの分野において、 物質の特定や対象物質 （以下、 ターゲットという） の各種測定のために重要視されている。
例えば、 血液中のグルコース濃度から血糖値を測定するグルコースセンサがあ る。 グルコースセンサは、 電極と電極を覆うように設けられた酵素膜とを有して いる。 酵素膜には、 グルコースと特異的に反応する受容体としてグルコースォキ シダーゼ （GOD) が固定化されている。
グルコースセンサでは、 反応式 （1 ) のようにグルコースが GODにより酸化 され、 ダルコン酸と H202に分解される。
(化 1 )
C6H1206 + 02 G0D ► C6H10O6 + H2O2 ■ ■ ■ (1 ) 次に、 反応式 （1) において発生した H202は、 電極と酵素膜との間の溶液中 を電極面まで拡散し、 電極において反応式 （2) のように電気分解し電子が電極 に移動する。
(化 2)
H202 ► 2H + + 02+2e— ■ ■ ■ (2) 酵素膜へのグルコースの拡散及び H202の溶液中での拡散とグルコース濃度と は比例関係にあり、 反応式 （2) の電極反応による電流値を測定することでダル コースの濃度を得ることができる。 しかし、 このようなグルコースセンサは、 酵 素膜から電極への電子の移動が H202の電極への拡散速度や拡散濃度などに依存 するため、 高速かつ大電流での測定が困難である。
そこで、 受容体と電極との間の電荷の移動をメディエータを介して行うバイオ センサの開発が行われている。 図 7はメディエータ型バイオセンサの動作原理を 示したものであり、 メディエータ1\/1、 酵素 E及び酵素 Eと反応する基質 Sの間で 次のような反応が行われている。
酸化された酵素 Eox と基質 Sとの酸化還元反応により電子の授受が行われ、 還元された酵素 Ered と生成物 Pが生成される。 次に、 還元された酵素 Ered と 酸化されたメディエータ Mox との酸化還元反応により、 酸化された酵素 Eox と 還元されたメディエータ Mredが生成される。 最後に、 還元されたメディエータ Mred と電極との酸化還元反応により、 酸化されたメディエータ Mox生成され、 電極に電子が移動する。つまりこの酵素反応で発生した電子は、 メディエータを 介して酵素から電極まで高速かつ大量に移動する。 このとき、 酵奉 E及びメディ エータ Mでは、 酸化■還元が繰り返し行われる。 上記の酵素反応では、 基質 Sが 酸化されて電子が電極に移動する場合であつたが、 基質 Sが還元され電子を消費 する場合には、 逆のサイクルによリ電子は電極から酵素へ移動する。
図 8は、 Journal of Electroanalytical Chemistry 4 5 4 , 9 - 1 3， 1 9 9 8に記載の C60フラーレンを用いたメディエータ型バイオセンサの電極部の構成 を示す。 メディエータである C60フラーレン 2は、 一 s S— （C H2)2— N H 2力、 らなる自己組織化単分子膜 3を介して電極 1に固定化されてい ¾。 このとき、 C 60フラーレン 2と自己組織化単分子膜 3とを結合するために、 C60フラーレン 2 の表面は、 = C H— C O O Hで修飾されている。 また、 酵素 4と C60フラーレン 2とは結合されておらず、 酵素 4は液体中に浮遊している。
前記文献に示すバイオセンサでは、 基質 5であるグルコースと酵素 4である G 0 Dとの酸化還元反応によリ電子が発生し、 この電子が C60フラーレン 2を介し て電極 1に伝達され、 グルコース濃度が測定される。
前記文献に記載のメディエータ型バイオセンサは、 電子吸引性及び電子供与性 の点で優れた特性を有する C60フラーレン 2を用いている。 しかし、 酵素 4は液 体中に浮遊しており、 C60フラーレン 2と結合されていない。 そのため、 酵素 4 と基質 5との間の酸化還元反応によリ電子の授受が行われた場合でも、 酵素 4と Ceoフラーレン 2とが結合されなければ、 C60フラーレン 2が酵素 4から電極 1 に高速かつ大量に電子を移動することができない。
さらに、 C60フラーレンを電極 1上に固定するために、 C60フラーレン 2の表 面に修飾基が必要である。 そのため、 電気伝導に寄与する π結合の電子分布が不 均一となり、 C6oフラーレン 2が有する、 電子吸引性、 電子供与性などの特性を 損なうという問題がある。
そこで、 本発明は、 受容体がメディエータを含む包接錯体に固定化されたター ゲッ卜認識素子を提供することを目的とする。
また、 メディエータの表面に修飾基を用いることなく、 電極に対するメデイエ —タの位置を安定化することのできるバイオセンサを提供することを目的とする
(発明の開示）
上記課題を解決するために、 本願第 1発明は、 親水基および包接部位を有する 第 1ホスト分子と、 親水基および包接部位を有する第 2ホスト分子と、 前記第 2 ホスト分子の親水基に結合され、 ターゲットと反応する受容体と、 前記第 1ホス 卜分子の包接部位と前記第 2ホスト分子の包接部位とにより包接され、 前記ター ゲッ卜と前記受容体との反応により発生した電荷を伝達するゲスト分子とを含む ターゲッ卜認識素子を提供する。
第 2ホス卜分子と受容体とが結合され受容体が固定化されているので、 受容体 とターゲッ卜との反応を、 常に第 1ホスト分子と第 2ホス卜分子とにより包接さ れたゲスト分子の近くで行わせることができる。 よって、 この反応により生じる 電荷を、 ゲスト分子によって高速かつ大量に移動させることができる。 また、 第 1及び第 2ホスト分子は親水基を有しているので、 ゲスト分子が不溶性であって も、 ターゲット認識素子を溶液中で取り扱うことができ、 例えば基板上にターゲ ット認識素子を容易に配列することができる。
本願第 2発明は、 前記第 1発明において、 前記第 1ホスト分子は第 1カリック スァレーンであり、 前記第 2ホスト分子は第 2カリックスァレーンであり、 前記 ゲスト分子はフラーレンであるタ一ゲット認識素子を提供する。
第 1及び第 2力リックスァレーンの包接部位が疎水性相互作用および π—兀相 互作用によリフラ一レンを包接することで、 メディエータである水不溶性のフラ 一レンを特別の修飾基を用いずに水溶性に変えることができる。 よって、 電気伝 導に関与する Γ電子の分布が均一に保たれるため、 電子親和力が大きくイオン化 エネルギーが小さいというフラーレンの有する特性が損なわれない。 そのため、 フラーレンによって高速かつ大量に電荷を移動させることができる。
本願第 3発明は、 前記第 1発明において、 前記受容体は、 酵素、 抗体、 D N A (deoxyribonucleic acid) 及びペプチドからなるグループから選ばれる 1また は複数の組み合わせであるターゲット認識素子を提供する。
酵素、 抗体、 D N Aまたはペプチドにより、 生体物質を特異的に捕捉すること ができる。
本願第 4発明は、 前記第 1または第 2発明において、 前記第 2ホスト分子と前 記受容体との間に、 少なくとも 1層の高分子膜をさらに含むターゲット認識素子 を提供する。
高分子膜が第 2ホスト分子と受容体との接着界面に平坦性を与え受容体の立体 構造を壊すことがないので、 受容体の失活を防ぐことができる。 また、 接着面積 を増加させることができるので、 第 2ホス卜分子と受容体とをより強く接着する ことができる。
本願第 5発明は、 前記第 4発明において、 前記高分子膜はポリ塩化ジァリルジ メチルアンモニゥム層とポリビニル硫酸カリウム層とを含むタ一ゲット認識素子 を提供する。
本願第 6発明は、 前記第 1発明において、 前記受容体を覆うポリイオンコンプ レックス膜をさらに含むターゲット認識素子を提供する。
ポリイオンコンプレックス膜により受容体と第 2ホスト分子との結合を強化す ることができるので、 ターゲッ卜認識素子の耐久性を高めることができる。 本願第 7発明は、 前記第 1発明において、 前記受容体は、 p H 4〜8かつ温度 が 1 5〜4 5 °Gの条件下で前記第 2ホス卜分子の親水基に結合されているターゲ ット認識素子を提供する。
前記条件下で受容体と第 2ホスト分子を結合させることで、 受容体の失活を防 ぐことができる。
本願第 8発明は、 親水基および包接部位を有する第 1ホスト分子と、 親水基お よび包接部位を有する第 2ホスト分子と、 前記第 1ホスト分子の親水基が結合さ れた電極と、 前記第 2ホスト分子の親水基に結合され、 ターゲットと反応する受 容体と、 前記第 1ホス卜分子の包接部位と前記第 2ホス卜分子の包接部位とによ リ包接され、 前記ターゲットと前記受容体との反応により発生した電荷を、 前記 電極に伝達するゲス卜分子とを含むバイオセンサを提供する。
受容体が第 2ホスト分子に固定化されているので、 常にゲスト分子の近くで受 容体とターゲットとの反応を行わせることができる。 よって、 この反応により生 じる電荷を、 ゲスト分子によって受容体から電極へ高速かつ大量に移動させるこ とができる。 さらに、 ゲスト分子を第 1及び第 2ホスト分子により包接して電極 に安定に固定するので、 電極に固定するための修飾基がゲスト分子に必要でない。 よって、 ゲスト分子が有する、 電荷を高速かつ大量に移動させる性質が損なわれ ない。 また、 第 1及び第 2ホスト分子は親水基を有しているので、 ゲスト分子が 不溶性であっても、 バイオセンサを溶液中で容易に取リ极うことができる。
本願第 9発明は、 前記第 8発明において、 前記電極に接続された検出手段をさ らに含むバイオセンサを提供する。
電極に移動した電荷を検出手段により測定することができる。
本願第 1 0発明は、 前記第 8発明において、 前記第 1ホスト分子は第 1力リツ クスァレーンであり、 前記第 2ホスト分子は第 2カリックスァレーンであり、 前 記ゲスト分子はフラーレンであるバイオセンサを提供する。 前記第 2発明と同様 の効果を有する。
本願第 1 1発明は、 前記第 8発明において、 前記受容体は、 酵素、 抗体、 D N A及びべプチドからなるグループから選ばれる 1または複数の組み合わせである バイォセンサを提供する。 前記第 3発明と同様の効果を有する。
本願第 1 2発明は、 前記第 8から第 1 0発明のいずれかにおいて、 前記第 2ホ スト分子と前記受容体との間に、 少なくとも 1層の高分子膜をさらに含むバイオ センサを提供する。 前記第 4発明と同様の効果を有する。
本願第 1 3発明は、 前記第 1 2発明において、 前記高分子膜はポリ塩化ジァリ ルジメチルアンモニゥム層とポリビニル硫酸力リウム層とを含むバイオセンサを 提供する。 前記第 5発明と同様の効果を有する。
本願第 1 4発明は、 前記第 8発明において、 前記受容体を覆うポリイオンコン プレックス膜をさらに含むバイォセンサを提供する。 前記第 6発明と同様の効果 を有する。
本願第 1 5発明は、 前記第 8発明において、 前記受容体は、 p H 4〜8かつ温 度が 1 5〜4 5 °Cにおいて前記第 2ホスト分子の親水基に結合されているバイオ センサを提供する。 前記第 7発明と同様の効果を有する。
本願第 1 6発明は、 請求項 9に記載のバイオセンサを用い、 前記ターゲットと 前記受容体との反応により生じる電荷を検出する検出方法を提供する。
第 9発明のバイオセンサを用いて効率よく電荷を検出することができる。
本願第 1 7発明は、 前記第 1 6発明において、 前記ゲスト分子がフラーレンで あって、 前記フラーレンを光励起する励起ステップをさらに含む検出方法を提供 する。
フラーレンに光を照射することによリフラ一レンが光励起されるので、 電子親 和力が大きくイオン化エネルギーが小さいというフラーレンの性質を高めること ができる。 よって、 バイオセンサとしての反応速度を速くし、 反応感度を高める ことができる。
本願第 1 8発明は、 請求項 8に記載のバイオセンサの製造方法であって、 前記 第 1ホスト分子及び前記第 2ホスト分子を含む溶液と前記ゲスト分子を含む溶液 とを混合及び攪拌し、 前記第 1ホスト分子、 前記第 2ホスト分子及び前記ゲスト 分子を含む包接錯体を生成する包接錯体生成ステップと、 電極の表面にァニオン 性またはカチオン性の分子を結合させる電極形成ステップと、 前記電極形成ステ ップで形成された電極と、 前記包接錯体内の前記第 1ホスト分子の親水基とを結 合させる包接錯体結合ステップと、 前記包接錯体内の前記第 2ホスト分子の親水 基と前記受容体とを結合させる受容体結合ステツプとを含み、 前記包接錯体生成 ステップで生成される包接錯体では、 前記第 1ホス卜分子の包接部位と前記第 2 .
ホスト分子の包接部位とにより前記ゲスト分子が包接されている、 バイオセンサ の製造方法を提供する。
前記第 8発明と同様の効果を有するバイオセンサを製造することができる。 本願第 1 9発明は、 前記第 1 8発明において、 前記受容体結合ステップにおい て、 卩 ^1 4〜8かっ温度が1 5〜4 5 °Cの条件下で、 前記第 2ホスト分子の親水 基と前記受容体とを結合するバイオセンサの製造方法を提供する。 前記第 7発明 と同様の効果を有する。
(図面の簡単な説明）
第 1図は、 （a ) は本発明に係るメディエータ型バイオセンサの電極部の基本 構成を示す図であり、 （b ) は （a ) のバイオセンサの動作を説明する説明図で める。
第 2図は、 第 1実施形態例に係るバイオセンサの構成である。
第 3図は、 （a ) 検出部が設けられたバイオセンサの一例 （1 ) である。
( b ) 検出部が設けられたバイオセンサの一例 （2 ) である。
第 4図は、 （a ) は第 3実施形態例に係るバイオセンサの構成 （1 ) であり、 ( b ) は第 3実施形態例に係るバイオセンサの構成 （2 ) である。
第 5図は、 第 4実施形態例に係るバイオセンサの構成である。
第 6図は、 第 1実施形態のバイオセンサにおける電気特性である。
第 7図は、 メデイエ一タ型バイオセンサの動作原理を説明する説明図である。 第 8図は、 従来の C60フラーレンを用いたメディエータ型バイオセンサの電極 部の構成である。
(発明を実施するための最良の形態）
<基本構成 >
図 1 ( a ) は本発明に係るメディエータ型バイオセンサの電極部の基本構成を 示す。 メディエータ型バイオセンサは、 電極 1 1及び電極 1 1に固定されたター ゲット認識素子 1 0を有している。 ターゲット認識素子 1 0は、 包接錯体 1 3と、 包接錯体 1 3に固定された受容体 1 5とを有している。 包接錯体 1 3は、 第 1ホ スト分子 1 3 a、 第 2ホスト分子 1 3 b及びゲス卜分子 1 3 cを有している。 第 1ホスト分子 1 3 aは親水基 1 9 aと包接部位 2 1 aを有しており、 同様に第 2 ホスト分子 1 3 bも親水基 1 9 bと包接部位 2 1 bを有している。 包接錯体 1 3 は、 第 1ホスト分子 1 3 aの包接部位 2 1 aと第 2ホス卜分子 1 3 bの包接部位 2 1 bとによりゲスト分子 1 3 Gを包接するように構成されており、 全体として 親水基 1 9 3及ぴ1 9 bとに取り囲まれている。 ここで、 包接されたゲスト分子 1 3 cは、 受容体 1 5から電極へ電荷を伝達するメディエータとして働く。 例え ば、 ゲスト分子 1 3 cとしてはフラーレン、 第 1及び第 2ホスト分子 1 3 a、 1 3 bとしてはカリックスァレーンが挙げられる。 また、 第 1及び第 2ホスト分子 1 3 a、 1 3 bは、 異なる物質であっても良い。 なお、 同一の物質であると、 包 接錯体 1 3の作成が容易であり好ましい。 例えば、 第 1及び第 2ホスト分子 1 3 a、 1 3 bの材料として A、 Bの 2種類の物質を用いて包接錯体 1 3を作成する 場合、 調製中に 3種類の複合体 （A A、 A B、 B B ) が生成される。 そのため、 これらの複合体を分離する必要があり包接錯体 1 3の作成が困難となる。 一方、 同一物質を用いる場合は分離する必要はないため、 作成が容易である。 さらに、 同一物質であると、 電極 1 1側の第 1ホスト分子 1 3 aの物質と電極 1 1の反対 側の第 2ホスト分子 1 3 bの物質とを区別する必要がなく、 包接錯体 1 3の固定 化の制御が容易である。
電極 1 1は、 第 1ホスト分子 1 3 aの親水基 1 9 aと静電相互作用によリイォ ン結合している。 電極 1 1 と包接錯体 1 3との結合は、 イオン結合に限定されず、 共有結合、 配位結合など種々の結合が考えられる。 電極 1 1 としては、 不活性な 電極であれば良く、 A u、 A g、 P t、 I T O、 カーボンなどの電極が使用され る。 カーボンを使用すると、 安価、 加工が容易、 比較的安定な電極を得ることが できるので好ましい。
受容体 1 5は、 第 2ホスト分子 1 3 13の親水基1 9 bにより包接錯体 1 3に固 定されている。 受容体 1 5と親水基 1 9 bとの結合は、 イオン結合、 共有結合な どにより結合されている。 受容体 1 5は酵素、 抗体、 D N A、 細胞またはべプチ ドのいずれか、 あるいはそれらの組み合わせであると、 生体物質を特異的に捕捉 することができるので好ましい。 図 1 ( b ) は、 図 1 ( a ) のバイオセンサの動作を説明する模式図である。 タ 一ゲット 2 3は、 受容体 1 5により捕捉される物質である。 このバイオセンサは、 次のように動作する。 ターゲット 2 3は受容体 1 5により捕捉され、 ターゲット 2 3と受容体 1 5との間で酸化還元反応が生じる。 この酸化還元反応により電子 e -が発生し、 この発生した電子 e -は例えば、 第 1及び第 2ホスト分子 1 3 a、 1 3 bにより包接されたゲスト分子により電極 1 1に伝達される。 電極 1 1での 電荷の変化を測定することによリタ一ゲット 2 3の存在、 含有量等を測定するこ とができる。 図 1 ( b ) では、 マイナスの電荷が移動する場合を説明しているが、 プラスの電荷が移動しても良い。
このようなバイオセンサは、 第 2ホスト分子 1 3 bと受容体 1 5とが結合する ことにより、 受容体 1 5が包接錯体 1 3に固定されている。 よって、 受容体 1 5 とターゲット 2 3との反応を、 常に第 1ホスト分子 1 3 aと第 2ホスト分子 1 3 bとにより包接されたゲスト分子 1 3 Gの近傍において行わせることができる。 よって、 この反応により生じる電荷を、 ゲスト分子 1 3 cによって受容体 1 5か ら電極 1 1へ高速かつ大量に移動させることができる。 また、 第 1及び第 2ホス 卜分子 1 3 a、 1 3 13は親水基1 9 3、 1 9 bを有しているので、 ゲスト分子 1 3 Gが不溶性であっても、 溶液中のターゲッ卜 2 3を測定するなど溶液中でゲス 卜分子 1 3 cを取り扱うことができる。 また、 例えば基板上にターゲット認識素 子 1 0を容易に配列することができる。
<第 1実施形態例 >
図 2は、 第 1実施形態例に係るバイオセンサの構成を示している。 前記図 1及 び図 2を参照して第 1実施形態例のバイオセンサを説明する。
[バイオセンサの構成]
第 1実施形態例に係るバイオセンサでは、 包接錯体 1 3に受容体 1 5が固定化 されたターゲット認識素子 1 0が電極 1 1に固定されている。 ここで、 ゲスト分 子 1 3 c力《C60フラーレンであり、 第 1及び第 2ホスト分子 1 3 a、 1 3 bが力 リックス [ 3 ] ァレーンを含んでいる。 力リックス [ 3 ] ァレーンは、 3つのフ ェノール誘導体をメタ位で環状に接続した構造であり、 フエノール部分の酸素原 子側が親水基で構成され、 フエノール部分と反対のベンゼン環側の包接部位で C 60フラーレンを包接する。 ここで、 包接部位は疎水基で構成されている。 図 2に 示す力リックス [ 3 ] ァレーンの親水基は、 カチオン性の 4級ァミンにより修飾 されプラスに帯電している。 また、 電極 1 1には金が使用され、 ァニオン性の力 ルボン酸により修飾されマイナスに帯電している。 よって、 電極 1 1とカリック ス [ 3 ] ァレーンの親水基とが静電相互作用により結合している。 受容体 1 5に は、 例えば血液中のピルビン酸をターゲッ卜として反応する酵素である乳酸デヒ ドロゲナーゼが使用されている。 酸性の等電点を有する乳酸デヒドロゲナーゼは 中性の水溶液中ではマイナスに帯電しており、 力リックス [ 3 ] ァレーンの親水 基と静電相互作用により結合している。
上記では、 力リックス [ 3 ] ァレーンの親水基がプラスに、 酵素の表面及び電 極 1 1の表面がマイナスに帯電しているが、 力リックス [ 3 ] ァレーンの親水基 をマイナスに帯電させ、 酵素の表面及び電極 1 1の表面をプラスに帯電させても 構わない。 また、 受容体 1 5と包接錯体 1 3との結合及び包接錯体 1 3と電極 1 1との結合は静電相互作用ではなく、 共有結合などその他の結合であっても良い。 メディエータであるゲスト分子 1 3 cは、 C60フラーレン以外の例えば、 C70、 リ 76、 78、 82、 。84、 C s6> し 88、 し 90、 92、 94、 。96なとの局次ノフ一レ ンでもよい。 また、 L a原子などを内包したフラーレンであると、 電子が内包原 子からフラーレンに供給されフラーレンが電子過剰の状態になるので、 フラーレ ンの電気伝導度が向上するばかリではなく、 初期応答速度が速くなリ好ましい。 また、 図 2においては、 第 1及び第 2ホスト分子 1 3 a、 1 3 bは、 同一の力 リックス [ 3 ] ァレーンであるが、 第 1ホスト分子 1 3 aは力リックス [ 4 ] ァ レーンで、 第 2ホスト分子 1 3 bは力リックス [ 3 ] ァレーンのように異なる力 リックスァレーンを使用しても良い。 なお、 同一のカリックスァレーンを使用す ると、 前述のように包接錯体 1 3を調製し易いので好ましい。
上記では、 ピルビン酸を検出するために、 受容体 1 5として酵素である乳酸デ ヒドロゲナーゼを使用したが、 検出するターゲッ卜に応じて他の酵素を使い分け ることができる。 他の酵素として、 例えばォキシダーゼ （例えばグルコースォキ シダ一ゼ） 、 デヒドロゲナーゼ （例えばアルコールデヒドロゲナーゼ） 、 レダク ターゼ （例えばアドレノィドキシン） 、 ォキシゲナ一ゼ、 ヒドロペルォキシダー ゼ （例えば力タラ一ゼ） 、 ゥレアーゼ、 クレアチニンデアミナーゼなどを使用し ても良い。 酵素としてゥレアーゼを使用した場合には血中尿素窒素 B U N (Blood Urea Nitrogen) を、 クレアチニンデァミナーゼを使用した場合にはク レアチニンを測定することができ、 腎疾患の判定などをすることができる。
前述のバイオセンサでは、 第 1及び第 2ホスト分子 1 3 a、 1 3 bであるカリ ックス [ 3 ] ァレーンの包接部位の疎水性相互作用および ττ— π相互作用により C60フラーレンを包接し、 電極 1 1に安定に固定している。 このとき、 C60フラ 一レンは、 力リックス [ 3 ] ァレーンにより浮遊した状態で包接されており、 修 飾基は結合されていない。 よって、 電気伝導に関与する兀電子の分布が均一に保 たれるため、 電子親和力が大きくイオン化エネルギーが小さいというフラーレン の有する特性が損なわれない。 そのため、 受容体から C60フラーレン及び電極へ 高速かつ大量に電荷を移動させることができる。 また、 力リックス [ 3 ] アレー ンの包接部位と反対側が、 親水基のフエノールで構成されているため、 水不溶性 の C60フラーレンを力リックス [ 3 ] ァレーンで包接することで、 修飾基を用い ずに水溶性に変えることができる。 よって、 バイオセンサを溶液中で容易に取り 扱うことができる。
[バイォセンサを用いた検出方法]
図 3 ( a ) 、 （b ) は、 検出部が設けられたバイオセンサの一例を示す。 図 3 ( a ) では、 前記図 2のターゲット認識素子 4 2が電極 4 0に固定され、 電極 4 0が検出部 4 5に接続されている。 ターゲッ卜認識素子 4 2が固定化された電極 4 0の部分に試料を滴下し、 電流を検出部 4 5により測定し、 試料内のタ一ゲッ 卜の濃度等に換算する。
—方、 図 3 ( b ) ではターゲット認識素子 4 2が固定された電極 4 0の先端を 試料溶液に浸潰し、 検出部 4 5により電流の測定を行う。
なお、 測定の際に、 外部からターゲット認識素子 4 2に光を照射すると、 C60 フラーレンが光励起されるので、 電子親和力が大きくイオン化エネルギーが小さ いというフラーレンの性質を高めることができる。 よって、 ターゲット認識素子 としての反応速度を速くし、 反応感度を高めることができる。 フラーレンが光励 起される波長は広いが、 特に 6 2 0 n m以下の波長に対して効率良く励起される c このような波長を有する光源として、 赤色 LEDや A rレーザーが用いられる。
[バイオセンサの製造方法]
第 1実施形態例のバイオセンサは次のように製造される。 力リックス [3] ァ レーンと C60フラーレンとを水溶液中に混合し、 この混合液を攪拌する。 攪拌に 超音波処理を用いると好ましい。 この処理により、 C60フラーレンが力リックス [3] ァレーンの包接部位である疎水基に包接され、 包接錯体 13が生成される。 電極 1 1、 力リックス [3] ァレーンの親水基をァニオン性またはカチオン性の 分子で修飾する。 このとき、 電極 1 1と力リックス [3] ァレーンとの結合およ び力リックス [3] ァレーンと乳酸デヒドロゲナーゼとの結合が静電相互作用で 結合するように修飾する。 修飾された包接錯体 13、 電極 1 1及び乳酸デヒドロ ゲナーゼを結合し、 ターゲットであるピルビン酸を測定可能なバイオセンサを得 る。 このとき、 乳酸デヒドロゲナーゼと包接錯体 13との結合を、 pH4〜8か つ温度が 1 5〜45°Cの条件下で行うと、 酵素の失活を防ぐことができるので好 ましい。
<実験例 1 >
C60フラーレンを、 力リックス [3] ァレーンで包接した包接錯体を作成し、 包接錯体に受容体として乳酸デヒドロゲナーゼを固定化する場合の実験例を以下 に示す。
(1) 力リックス [3] ァレーンの合成
まず、 力リックス [3] ァレーンのトリエステル体を原料として、 N， N—ジ メチルプロパンジァミンを過剰に添加し、 アミノリシスによリカリックス [3] ァレーンの前駆体を合成した。 この前駆体をジメチル硫酸を用いて N—メチル化 することにより、 4級ァミンを末端に持つ力リックス [3] ァレーンを合成した c
(2) 力リックス [3] ァレーン及び C60フラーレンの調製
上記のように合成した力リックス [3] ァレーンの水溶液 （1 Om l、 0. 5 mmo l /dms) と C60フラーレン （72mg、 0. 1 mmo I ) を混合して, 攪拌と超音波処理を繰り返し、 溶け残ったフラーレンを遠心分離により取り除き, 力リックス [3] ァレーン及び C 60フラーレンの錯体である包接錯体水溶液を調 製した。 このとき生成された包接錯体の横幅は約 1 nm、 高さは約 2 nmであつ .
13 た。
(3) 電極の準備
一方、 2—メルカプトエタンスルホン酸ナトリゥムを含有するエタノール溶液 に金電極を浸して表面にァニオン性の分子がついた電極 1 1を作成した。
(4) 包接錯体の固定
前記 （3) で準備した電極を包接錯体の水溶液 （0. 25mmo I Zdm3) に浸すことで、 包接錯体を電極上に緻密に配列し、 バイオセンサを製造した。 こ のとき包接錯体は電極と静電相互作用によって接続した。
(5) 受容体の固定
その後、 乳酸デヒドロゲナーゼ （0. ZmgZm I ) を含有する HEPES (2— [4一 ( 2— Hyaroxyethvi) —1— piperazmyij ethane sulfonic acia) 緩衝液 （ P H = 7. 0 ) に、 包接錯体が配列された電極を室温で 20分間浸して 酵素を静電相互作用により包接錯体上に固定化した。
上記の製造方法によって得られた第 1実施形態例のバイオセンサのサイクリッ クポルタンメ トリー測定法で得られた電気特性を図 6に示す。 125juMの還元 型ニコチンアミドアデニンヌクレオチド （N ADH) と 0〜250〃Mのピルビ ン酸とを混合した溶液に、 乳酸脱水酵素 （LDH) を固定化したバイオセンサチ ップを浸漬したときの特性図である。 微量なピルビン酸を感度良く測定できるバ ィォセンサチップを得ることができた。
<第 2実施形態例 >
受容体 15が抗体、 DNA、 細胞及びまたはペプチドである第 1実施形態例に 示す構成のバイオセンサについて説明する。
[抗体]
受容体 15が抗体である場合、 受容体 1 5が特異的に反応する抗原をターゲッ 卜とし、 その存在、 濃度などを測定することができる。 抗原の種類は、 ウィルス、 細菌、 花粉、 カビ、 ダニなどが挙げられる。 例えば、 抗体が 「マウス lgG」 、 抗 原が 「プロテイン AJ である場合を説明する。
まず、 マウスに抗原である 「プロテイン A」 を注射し、 マウス生来の免疫応答 を利用して 「マウス igGj 抗体を作る。 この抗体 「マウス IgG」 を抽出， 精製し て、 包接錯体 1 3に固定化する。 静電相互作用や共有結合によって固定化するた めには、 マウス IgGの Fc部を力ルポキシル基ゃァミノ基などで修飾しておく。 ここにプロテイン Aを注入すると、 プロテイン Aとマウス IgG は特異的に結合 する。 極性分子からなるプロテイン Aから発生した電荷は、 抗体、 包接錯体 1 3 を介して電極 1 1に至る。 この電極 1 1に流れる電流を測定することで、 抗原で あるプロテイン Aの定量を行うことができる。
[ D N A]
受容体 1 5がターゲットである D N Aと特異的に反応するプローブ D N Aの場 合、 ターゲット D N Aを検知する方法を説明する。
D N Aは二重らせん構造をとるが、 バイオセンサの受容体 1 5として使用する ときは 1本鎖にして用いる。 まず、 ターゲット D N Aの塩基配列と相補性を持つ D N A 1本鎖を人工的に有機合成し、 プローブ D N Aを生成する。 このプローブ 0 八を包接錯体1 3上に固定化する。 次に、 所望の D N Aを生体試料から抽 出■精製した後、 例えば 9 5度で加熱して 1 本鎖にする。 この D N Aとプロ一 ブ D N Aの塩基配列が相補的である場合、 つまリ試料内の D N Aが検知したい D N A塩基配列を持つ場合、 両者は結合して二重らせん構造をとる。 ここで、 二重 らせん構造に対して特異的に結合し、 電荷発生源となるインターカレータを二重 らせん構造の間隙挿入する。 これによリニ重らせん構造の有無、 すなわち試料内 の D N Aが目的の塩基配列を持つかどうかを、 電極 1 1に流れる電流の変化によ リ判定する。
[細胞]
受容体 1 5が細胞である場合、 ターゲットである抗原を検知する方法を説明す る。 NK細胞や B 細胞などの免疫細胞を生体から抽出■精製し、 包接錯体 1 3 に固定化する。 細胞表面に結合しているタンパク質分子の末端基を利用して包接 錯体 1 3に固定化すると、 容易に固定化でき好ましい。 抗原は、 ウィルス、 細菌、 花粉、 カビ、 ダニなどが挙げられる。 試料内に細胞を固定化したバイオセンサを 導入すると、 受容体 1 5である細胞が抗原を取り込み、 細胞内部の酵素によって 抗原を分解する。 この分解過程で生じた電荷が、 包接錯体 1 3を介して電極 1 1 に移動する。 このときの電極 1 1に流れる電流を測定することで、 抗原の定量を .
15 行うことができる。
[ペプチド]
受容体 1 5がペプチドである場合、 ターゲットであるペプチドを検知する方法 を説明する。 所望するターゲッ卜と特異的に反応するプローブペプチドを遺伝子 工学の手法を用いてファージに作らせる。 それを抽出 '精製し、 包接錯体 1 3に 固定化する。 この包接錯体 1 3を有するバイオセンサを試料に注入すると、 プロ ーブぺプチドを構成するアミノ酸の側鎖が有する荷電状態に対応したぺプチドと プローブペプチドとが結合する。 このとき、 電極 1 1に流れる電流を測定するこ とができ、 目的とするターゲットペプチドを検知、 定量することができる。
<第 3実施形態例 >
図 4 ( a ) 、 ( b ) は、 第 3実施形態例に係るバイオセンサの構成を示してい る。 図 1 と同一の符号番号は第 1実施形態例と同様の構成要素を表す。 図 4 ( a ) のバイオセンサには、 図 1のターゲット認識素子 1 0にさらに高分子膜 5 0が設けられている。 高分子膜 5 0は、 第 2ホスト分子 1 3 bと受容体 1 5との 間に設けられている。 このような高分子膜 5 0は、 第 2ホスト分子 1 3 bと受容 体 1 5との接着界面に平坦性を与え受容体 1 5の立体構造を壊すことがないので、 受容体 1 5の失活を防ぐことができる。 また、 接着面積を増加させることができ るので、 第 2ホスト分子 1 3 bと受容体 1 5とをより強く接着することができる。 図 4 ( b )-に示すように、 高分子膜 5 0は、 2層構造の高分子膜 5 2， 5 4で あっても良い。 例えば、 包接錯体 1 3上にカチオン性高分子膜である P D D A (ポリ塩化ジァリルジメチルアンモニゥ厶） 5 2を形成し、 その上にァニオン性 高分子膜である P V S (ポリビニル硫酸カリウム） 5 4を形成して、 酵素を包接 錯体 1 3に固定化する。 このように、 高分子膜 5 0をァニオン性とカチオン性の 2層構造とすることで、 マイナスに帯電した酵素の代わりにプラスに帯電した酵 素も固定化することができる。 また、 高分子膜 5 0は 2層以上であっても良い。 <実験例 2 >
C60フラーレンを、 力リックス [ 3 ] ァレーンで包接した包接錯体を作成し、 包接錯体に高分子膜及び受容体として乳酸デヒドロゲナーゼを固定した場合の実 験例を以下に示す。 .
16
(1 ) 力リックス [3] ァレーンの合成
まず、 力リックス [3] ァレーンのトリエステル体を原料として、 N， N—ジ メチルプロパンジァミンを過剰に添加し、 アミノリシスによリカリックス [3] ァレーンの前駆体を合成した。 この前駆体をジメチル硫酸を用いて N—メチル化 することにより、 4級ァミンを末端に持つ力リックス [3] ァレーンを合成した。
(2) 力リックス [3] アレーン及ぴ C60フラーレンの調製
上記のように合成した力リックス [3] ァレーンの水溶液 （1 Omし 0. 5 mmo I dm3) と C60フラーレン （72mg、 0. 1 mmo I ) を混合して、 攪拌と超音波処理を繰り返し、 溶け残ったフラーレンを遠心分離により取り除き、 力リックス [3] ァレーン及び C60フラーレンの錯体である包接錯体水溶液を調 製した。 このとき生成された包接錯体の横幅は約 1 nm、 高さは約 2 nmであつ た。
(3) 電極の準備
一方、 2—メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを含有するエタノール溶液 に金電極を浸して表面にァニオン性の分子がついた電極 1 1を作成した。
(4) 包接錯体の固定
前記 （3) で準備した電極を包接錯体の水溶液 （0. 25mmo I Zdm3) に浸すことで、 包接錯体を電極上に緻密に配列し、 バイオセンサを製造した。 こ のとき包接錯体は電極と静電相互作用によって接続した。
(5) 高分子膜の固定
電極に固定した包接錯体を、 PDDA (6mg/m I ) を含有する H E PES 緩衝液 （p H = 7. 0) に室温で 20分間浸し、 PDD A層を静電相互作用によ リ包接錯体上に成膜した。 超純水で洗浄した後、 PVS (4mg/m I ) を含有 する H EPES緩衝液 （p H = 7. 0) に電極を室温で 20分間浸し、 PVS層 を静電相互作用により PDD A層上に成膜した。
(6) 受容体の固定
その後、 PVS層の上に乳酸デヒドロゲナーゼ （0. 2mg/m l ) を含有す る H t P E S ( 2 — [ 4一 κ. Δ — Hydroxyethylノ ー ， — piperazmyi ] ethanesulfonic acid) 緩衝液 （p H = 7. 0) に、 包接錯体が配列された電極を 室温で 20分間浸して酵素を静電相互作用により包接錯体上に固定化した。
<第 4実施形態例 >
図 5は、 第 4実施形態例に係るバイオセンサの構成を示している。 図 1 と同一 の符号番号は第 1実施形態例と同様の構成要素を表す。 図 5のバイオセンサには、 図 1のターゲッ卜認識素子 1 0にさらにポリイオンコンプレックス膜 56が設け られている。 ポリイオンコンプレックス膜 56は受容体 1 5の上部に設けられて おり、 受容体 1 5と第 2ホスト分子 1 3 bとの結合を強化する。 よって、 バイオ センサの耐久性を高めることができる。 ポリイオンコンプレックス膜 56として は、 例えばカチオン性の調ポリ一 L—リジンゃァニオン性のグルタミン酸ゃァク リル酸などのポリイオンコンプレックス膜が挙げられる。
く実験例 3 >
C6oフラーレンを、 力リックス [3] ァレーンで包接した包接錯体を作成し、 包接錯体に受容体として乳酸デヒドロゲナーゼを固定し、 ポリイオンコンプレツ クス膜さらに固定する場合の実験例を以下に示す。
(1 ) 力リックス [3] ァレーンの合成
まず、 力リックス [3] ァレーンのトリエステル体を原料として、 N， N—ジ メチルプロパンジァミンを過剰に添加し、 アミノリシスによリカリックス [3] ァレーンの前駆体を合成した。 この前駆体をジメチル硫酸を用いて N—メチル化 することにより、 4級ァミンを末端に持つ力リックス [3] ァレーンを合成した c (2) 力リックス [3] ァレーン及び C60フラーレンの調製
上記のように合成した力リックス [3] ァレーンの水溶液 （1 Omし 0. 5 mmo I / d m3) と C60フラーレン （72mg、 0. 1 mm o I ) を混合して、 攪拌と超音波処理を繰り返し、 溶け残ったフラーレンを遠心分離により取り除き、 力リックス [3] アレーン及ぴ C60フラーレンの錯体である包接錯体水溶液を調 製した。 このとき生成された包接錯体の横幅は約 1 nm、 高さは約 2 nmであつ た。
(3) 電極の準備
一方、 2—メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを含有するエタノール溶液 に金電極を浸して表面にァニオン性の分子がついた電極 1 1 を作成した。 .
18
(4) 包接錯体の固定
前記 （3) で準備した電極を包接錯体の水溶液 （0. 25mmo I Zdm3) に浸すことで、 包接錯体を電極上に緻密に配列し、 バイオセンサを製造した。 こ のとき包接錯体は電極と静電相互作用によって接続した。
(5) 受容体の固定
その後、 乳酸デヒドロゲナ一ゼ （0. 2mgZm I ) を含有する HEPES 、2— [ 4— ( 2— Hydroxyethyl) ― 1— iperazmyl] ethane sulfonic acid) 緩衝液 （pH = 7. 0) に、 包接錯体が配列された電極を室温で 20分間浸して 酵素を静電相互作用により包接錯体上に固定化した。
(6) ポリイオンコンプレックス膜の固定
包接錯体に酵素を固定化した後、 ポリイオンコンプレックス膜を、 酵素の表面 に 1 mM溶液の Poly-L-lysineをキャスト法を用いて形成した。
(産業上の利用可能性）
本発明を用いれば、 受容体がメディエータを含む包接錯体に固定化されたター ゲッ卜認識素子を提供することができる。

Claims

WO 2004/070372 ， Ρ PΓCτT//.JτPρι2η0η04//η0η0ΐ1222288 19 請 求 の 範 囲
1 .
親水基および包接部位を有する第 1ホスト分子と、
親水基および包接部位を有する第 2ホスト分子と、
前記第 2ホスト分子の親水基に結合され、 ターゲッ卜と反応する受容体と、 前記第 1ホスト分子の包接部位と前記第 2ホスト分子の包接部位とによリ包接 され、 前記ターゲッ卜と前記受容体との反応により発生した電荷を伝達するゲス ト分子と、
を含むターゲット認識素子。
2.
前記第 1ホス卜分子は第 1カリックスァレーンであり、 前記第 2ホスト分子は 第 2カリックスァレーンであり、 前記ゲスト分子はフラーレンである、 請求項 1 に記載のターゲッ卜認識素子。
3.
前記受容体は、 酵素、 抗体、 D N A (deoxyribonucleic acid) 及びペプチド からなるグループから選ばれる 1または複 の組み合わせである、 請求項 1に記 載のターゲット認識素子。
4.
前記第 2ホスト分子と前記受容体との間に、 少なくとも 1層の高分子膜をさら に含む、 請求項 1または 2に記載のタ一ゲット認識素子。
5.
前記高分子膜はポリ塩化ジァリルジメチルアンモニゥム層とポリビニル硫酸力 リウム層とを含む、 請求項 4に記載のターゲット認識素子。
6.
前記受容体を覆うポリイオンコンプレックス膜をさらに含む、 請求項 1に記載 のタ一ゲット認識素子。
7.
前記受容体は、 p H 4 ~ 8かつ温度が 1 5〜 4 5 °Gの条件下で前記第 2ホスト WO 2004/070372 ^ ^ p PrCTT//.JTPP22000044//n0n0i12222s8
20 分子の親水基に結合されている、 請求項 1に記載のターゲッ卜認識素子。
8.
親水基および包接部位を有する第 1ホスト分子と、
親水基および包接部位を有する第 2ホス卜分子と、
前記第 1ホスト分子の親水基が結合された電極と、
前記第 2ホスト分芊の親水基に結合され、 ターゲッ卜と反応する受容体と、 前記第 1ホスト分子の包接部位と前記第 2ホスト分子の包接部位とにより包接 され、 前記ターゲットと前記受容体との反応により発生した電荷を、 前記電極に 伝達するゲスト分子と、
を含むバイオセンサ。
9.
前記電極に接続された検出手段をさらに含む、 請求項 8に記載のバイオセンサ。
1 0.
前記第 1ホスト分子は第 1カリックスァレーンであり、 前記第 2ホス卜分子は 第 2カリックスァレーンであり、 前記ゲスト分子はフラーレンである、 請求項 8 に記載のバイオセンサ。
1 1 .
前記受容体は、 酵素、 抗体、 D N A及びペプチドからなるグループから選ばれ る 1または複数の組み合わせである、 請求項 8に記載のバイオセンサ。
1 2.
前記第 2ホスト分子と前記受容体との間に、 少なくとも 1層の高分子膜をさら に含む、 請求項 8〜 1 0のいずれかに記載のバイオセンサ。
1 3.
前記高分子膜はポリ塩化ジァリルジメチルァンモニゥム層とポリビニル硫酸力 リウム層とを含む、 請求項 1 2に記載のバイオセンサ。
1 4.
前記受容体を覆うポリイオンコンプレックス膜をさらに含む、 請求項 8に記載 のバイオセンサ。
1 5. WO 2004/070372 Ρ PΓCτT//.JτPρ2?η0η044//η0η0ι12？2? s8
21 前記受容体は、 p H 4 ~ 8かっ温度が1 5 ~ 4 5 °Cにおいて前記第 2ホスト分 子の親水基に結合されている、 請求項 8に記載のバイ才センサ。
1 6 .
請求項 9に記載のバイオセンサを用い、 前記ターゲッ卜と前記受容体との反応 により生じる電荷を検出する、 検出方法。
1 7 .
前記ゲスト分子がフラーレンであって、 前記フラーレンを光励起する励起ステ ップをさらに含む、 請求項 1 6に記載の検出方法。
1 8 .
請求項 8に記載のバイォセンサの製造方法であって、
前記第 1ホス卜分子及び前記第 2ホスト分子を含む溶液と前記ゲスト分子を含 む溶液とを混合及び攪拌し、 前記第 1ホスト分子、 前記第 2ホスト分子及び前記 ゲスト分子を含む包接錯体を生成する包接錯体生成ステップと、
電極の表面にァニオン性またはカチオン性の分子を結合させる電極形成ステツ プと、
前記電極形成ステップで形成された電極と、 前記包接錯体内の前記第 1ホスト 分子の親水基とを結合させる包接錯体結合ステツプと、
前記包接錯体内の前記第 2ホスト分子の親水基と前記受容体とを結合させる受 容体結合ステップとを含み、
前記包接錯体生成ステップで生成される包接錯体では、 前記第 1ホスト分子の 包接部位と前記第 2ホスト分子の包接部位とにより前記ゲスト分子が包接されて 1 9 .
前記受容体結合ステップにおいて、 p H 4〜8かつ温度が 1 5〜4 5 °Cの条件 下で、 前記第 2ホスト分子の親水基と前記受容体とを結合する、 請求項 1 8に記 載のバイォセンサの製造方法。
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