CN1700920A - 羟基甾族化合物的预防和治疗应用 - Google Patents

羟基甾族化合物的预防和治疗应用 Download PDF

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Abstract

3－羟基－7－羟基甾族化合物和3－氧代－7－羟基甾族化合物，特别是其7β－同分异构体，及其药用酯有效用于保护以防局部缺血诱导的对外周器官，如心脏或肾的损伤，以及治疗脊髓损伤。

Description

羟基甾族化合物的预防和治疗应用
本发明涉及3-羟基-7-羟基甾族化合物及其某些酮衍生物的某些新的预防和治疗应用，特别是这些化合物预防或治疗由局部缺血应激导致的外周器官，如心脏或肾损伤，以及治疗脊髓损伤的应用。
使用神经保护特异的模型，我们已经证明该类型的化合物具有神经保护活性。我们现在已经发现导致该神经保护作用的相同作用方式在外周器官，如心脏和肾的组织中也起作用，因此化合物还具有心脏保护作用和保护以防缺血性肾损伤的能力。
因此，本发明提供3-羟基-7-羟基甾族化合物或3-氧代-7-羟基甾族化合物或其药用酯在制备药物中的应用，所述药物用于保护以防对外周器官(例如除了脑和脊髓以外身体中的任何功能性组织)的缺血性损伤，特别是心脏损伤或肾损伤，和用于治疗脊髓损伤诱导的损害。
优选用于本发明的一类具体化合物是7β-羟基甾族化合物，在这些之中，本发明特别感兴趣的化合物是3β，7β-二羟基甾族化合物及其药用酯。
优选的酯是羧酸酯和氨基酸酯。
可以用于本发明的任选取代的3β，7β-二羟基甾族化合物及其药用酯和其它衍生物的实例是式(I)的那些化合物及其药用盐和酯：
Figure A0282026200061
其中
R1和R2彼此相同或不同并且各自表示氢原子，含有1-6个碳原子的烷基，含有2-6个碳原子的烯基，含有2-6个碳原子的炔基，含有6-10个碳原子的芳基，甲酰基，含有2-7个碳原子的烷基羰基，含有3-7个碳原子的烯基羰基，含有3-7个碳原子的炔基羰基，含有7-11个碳原子的芳基羰基，含有8-15个碳原子的芳烷基羰基，含有9-15个碳原子的芳烯基羰基，氨基酸残基，或定义如下的杂环-羰基；
Ra和Rb之一表示式-Rc的基团，优选为β构型，另一个表示氢原子，或者Ra和Rb一起表示氧代基团；
Rc表示含有1-6个碳原子的烷酰基，芳基羰基，其中芳基部分是含有6-10个环碳原子的芳族碳环基团，定义如下的杂环-羰基，或式-OR4的基团，其中R4表示对于R1和R2上述定义的基团和原子中的任何一个；
环A，
Figure A0282026200071
是苯环或环己烷环；
当环A是环己烷时，环B中的虚线表示碳-碳单或双键，并且n为1；或当环A是苯环时，环B中的虚线表示碳-碳单键并且n为0；
所述杂环-羰基是式R3-CO的基团，其中R3表示含有3-7个环原子的杂环基团，在环原子中1-3个是选自氮原子，氧原子和硫原子的杂原子，其余原子中至少一个是碳原子；
所述烷基，烯基和炔基，和所述烷基羰基、烯基羰基和炔基羰基的烷基、烯基和炔基部分为未被取代或含有下列取代基ψ中的至少一个：
取代基ψ：羟基，巯基，卤原子，氨基，含有1-6个碳原子的烷基氨基，其中每个烷基含有1-6个碳原子的二烷基氨基，氨基甲酰基，硝基，含有1-6个碳原子的烷氧基，含有1-6个碳原子的烷硫基，羧基，烷氧羰基和含有6-10个碳原子的未取代的芳基；
所述芳基，所述杂环基，和所述芳基羰基和所述芳烷基羰基的芳基部分为未被取代或含有下列取代基ξ中的至少一个：
取代基ξ：取代基ψ中任何一个，含有1-6个碳原子的烷基，含有1-6个碳原子的羟烷基，含有1-6个碳原子的卤代烷基。
通过附图说明本发明的化合物的活性，其中：
图1A显示与实施例22有关的数据，其表示为每400μm长度的CA1区域完好的神经元的平均数±SEM；
图1B显示实施例22的数据，其表示为与设定为100％的假手术动物相比每400μm长度的CA1区域完好的神经元的百分率；
图1C显示实施例22的数据，其表示为当将局部缺血组的存活神经元的数目设定为0和假手术组的那些设定为100％时神经保护的绝对百分率；
图2显示实施例23中在区域局部缺血之前，之中和之后对照载体处理的心脏和7β-OH EPLA处理的心脏的梗塞大小；在25分钟时将7β-OHEPLA加入灌注液，在55分钟时引入区域局部缺血，在85分钟时再灌注局部缺血区域；
图3显示实施例23中在区域局部缺血之前，之中和之后对照载体处理的心脏和7β-OH EPLA处理的心脏的冠状血流量；在25分钟时将7β-OHEPLA加入灌注液，在55分钟时引入区域局部缺血，在85分钟时再灌注局部缺血区域；
图4显示实施例23中在区域局部缺血之前，之中和之后对照载体处理的心脏和7β-OH EPLA处理的心脏的心率；在25分钟时将7β-OH EPLA加入灌注液，在55分钟时引入区域局部缺血，在85分钟时再灌注局部缺血区域；
图5显示实施例23中在区域局部缺血之前，之中和之后对照载体处理的心脏和7β-OH EPLA处理的左心室发展压(developed pressure)；在25分钟时将7β-OH EPLA加入灌注液，在55分钟时引入区域局部缺血，在85分钟时再灌注局部缺血区域；和
图6显示实施例23中在区域局部缺血之前，之中和之后对照载体处理的心脏和7β-OH EPLA处理的末期舒张压；在25分钟时将7β-OH EPLA加入灌注液，在55分钟时引入区域局部缺血，在85分钟时再灌注局部缺血区域。
在上述式(I)化合物中，在7-位的基团-OR2可以是α或β构型，但优选β构型。
更优选地，在式(I)化合物中：
R1和R2彼此相同或不同并且各自表示氢原子，含有1-6个碳原子的烷基，任选地取代的苯基，甲酰基，含有2-5个碳原子的烷基羰基，含有7-11个碳原子的芳基羰基，含有8-15个碳原子的芳烷基羰基，氨基酸残基，或定义如下的杂环-羰基；我们特别优选R1和R2应该都表示氢原子；
Ra和Rb之一表示含有1-6个碳原子的烷酰基或式-OR4的基团，其中R4表示对于R1和R2上述定义的基团和原子中的任何一个，优选是β构型，另一个表示氢原子，或者Ra和Rb一起表示氧代基团；我们特别优选Ra和Rb应该一起表示氧代基团，或者Ra和Rb之一应该表示氢原子，另一个应该表示羟基或含有1-4个碳原子的烷酰基，特别是羟基或乙酰基；
所述杂环-羰基是式R3-CO的基团，其中R3表示含有3-7个环原子的杂环基团，在环原子中1-3个是选自氮原子，氧原子和硫原子的杂原子，其余原子中至少一个是碳原子。
最优选式(I)的化合物是那些化合物及其药用酯，其中：R1和R2都表示氢原子；并且Ra和Rb一起表示氧代基团，或Ra和Rb之一表示氢原子，另一个表示羟基或含有1-4个碳原子的烷酰基，特别是羟基或乙酰基。
可以用于本发明的3-氧代-7β-羟基甾族化合物的实例是式(II)的那些化合物及其药用酯：
其中Ra，Rb和R2定义如上，优选Ra和Rb一起表示氧代基团，或Ra和Rb之一表示氢原子，另一个表示羟基，优选是β构型，或乙酰基。
在上述式(II)化合物中，在7-位上的基团-OR2可以是α或β构型，但优选是β构型。
更优选地，在式(II)化合物及其药用酯中：
R2表示氢原子，含有含有1-6个碳原子的烷基，任选地取代的苯基，甲酰基，含有2-5个碳原子的烷基羰基，含有7-11个碳原子的芳基羰基，含有8-15个碳原子的芳烷基羰基，或定义如下的杂环-羰基；我们特别优选R2应该表示氢原子；
Ra和Rb之一表示含有1-6个碳原子的烷酰基或式-OR4的基团，其中R4表示对于R2上述定义的基团和原子中的任何一个，优选是β构型，另一个表示氢原子，或者Ra和Rb一起表示氧代基团；我们特别优选Ra和Rb应该一起表示氧代基团，或者Ra和Rb之一应该表示氢原子，另一个应该表示羟基或含有1-4个碳原子的烷酰基，特别是羟基或乙酰基；
所述杂环-羰基是式R3-CO的基团，其中R3表示含有3-7个环原子的杂环基团，在环原子中1-3个是选自氮原子，氧原子和硫原子的杂原子，其余原子中至少一个是碳原子。
最优选式(II)的化合物是那些化合物及其药用酯，其中：R2表示氢原子；并且Ra和Rb一起表示氧代基团，或Ra和Rb之一表示氢原子，另一个表示羟基或含有1-4个碳原子的烷酰基，特别是羟基或乙酰基。
在本发明的化合物中，其中R1，R2，R4或取代基ξ是烷基，其可以是含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，实例包括甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，1-乙基丙基，2-乙基丙基，1，1-二甲基丙基，己基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，3-乙基丁基，叔己基，和1，1-二甲基戊基，其中优选含有1-4个碳原子的那些基团，最优选甲基和乙基。
在R1，R2，R4表示烯基的情形中，其可以是含有2-6个碳原子的直链或支链烯基，实例包括乙烯基，1-丙烯基，烯丙基，异丙烯基，甲代烯丙基，1-，2-，3-丁烯基，异丁烯基，1-，2-，3-，4-戊烯基，1-，2-，3-，4-，5-己烯基，其中优选含有2-4个碳原子的那些烯基，最优选乙烯基和烯丙基。
在R1，R2或R4表示炔基的情形中，其可以是含有2-6个碳原子的直链或支链炔基，实例包括乙炔基，1-，2-丙炔基，1-，2-，3-丁炔基，异丁炔基，1-，2-，3-，4-戊炔基和1-，2-，3-，4-，5-己炔基，其中优选含有2-4个碳原子的那些炔基。
在R1，R2或R4或取代基ψ表示芳基的情形中，其是含有6-10个碳原子的芳族碳环基团。这种基团的实例包括苯基，1-萘基，2-萘基和茚基，其中优选苯基。除了取代基ψ的情形以外，这些基团可以是取代的或未取代的。在基团是取代的情形中，取代基的数量仅受可取代的位置的数量和可能有时空间约束所限制。因此，在苯基的情形中，取代基的最大数量是5，在萘基的情形中，取代基的最大数量是7等等。然而，优选的取代基数量为1-3，取代基如下文所述。
在R1，R2或R4表示烷基羰基的情形中，其是烷酰基，其可以是含有2-7个碳原子(即在烷基部分1-6个碳原子)的直链或支链基团，实例包括乙酰基，丙酰基，丁酰基，异丁酰基，戊酰基，异戊酰基，叔戊酰基，己酰基，和庚酰基，其中优选含有2-5个碳原子的那些基团，最优选乙酰基和丙酰基。该基团的烷基部分可以是取代的或未取代的，如果被取代，取代基选自取代基ψ。该取代的基团的实例包括丙氨酰，β-丙氨酰，苯丙氨酰，天冬酰胺酰，半胱氨酰，乙醇酰，甘氨酰，甲硫氨酰，鸟氨酰，甘油酰，托品酰，谷氨酰胺酰，谷氨酰，高半胱氨酰，丝氨酰，高丝氨酰，苏氨酰，乳酰，亮氨酰，异亮氨酰，正亮氨酰，赖氨酰，缬氨酰，正缬氨酰和肌氨酰。
在R1，R2或R4表示烯基羰基的情形中，其可以是含有3-7个碳原子的直链或支链烯基羰基，实例包括丙烯酰基，甲基丙烯酰基，丁烯酰，异丁烯酰，3-丁烯酰，戊烯酰和己烯酰，其中优选含有3-5个碳原子的那些烯基羰基，最优选丙烯酰基和甲基丙烯酰基。
在R1，R2或R4表示炔基羰基的情形中，其可以是含有3-7个碳原子的直链或支链炔基羰基，实例包括丙炔酰，3-丁炔基羰基，戊炔基羰基和己炔基羰基，其中优选含有3-5个碳原子的炔基羰基。
在Rc，R1，R2或R4表示芳基羰基的情形中，该芳基部分可以是以上定义和例举的任何芳基。优选芳基羰基包括苯甲酰基，邻-，间-或对-甲苯酰基，邻-，间-或对-甲氧苯酰基，邻-，间-或对-羟基苯甲酰基基，苦基，3，4，5-三羟苯甲酰基，3，4-二羟苯甲酰基，香草酰基，藜芦酰基，氨茴酰基，1-萘酰基和2-萘酰基。
在R1，R2或R4表示芳烷基羰基或芳烯基羰基的情形中，芳基和视情况而定，烷基或烯基可以是上述定义和例举的那些基团中的任何一个。这种基团的具体实例包括苯乙酰基，3-苯丙酰基，二苯乙醇酰基，酪氨酰，阿托酰，氢化阿托酰和肉桂酰。
在Rc，R1，R2或R4表示杂环-羰基的情形中，其是式R3-CO-的基团，其中R3表示含有3-7个环原子的杂环基团，其中1-3个环原子是氮，氧或硫原子，其余的是碳原子。至少一个环原子应该是碳原子。在存在3个杂原子的情形中，优选至少一个是氮原子。这种基团的实例包括2-和3-糠酰基，2-和3-噻吩甲酰基，2-吡啶羰基，烟酰基，异烟酰基，脯氨酰基，哌啶羰基，哌嗪羰基和吗啉代羰基。
在R1和/或R2表示氨基酸残基的情形中，其可以是任何氨基酸，其中羟基已经从该羧基或一个羧基(-COOH)上去除。这种氨基酸残基的实例包括丙氨酰，β-丙氨酰，胱硫酰(cystathionyl)，胱氨酰，甘油酰，组氨酰，高丝氨酰，异亮氨酰，羊毛硫氨酰，亮氨酰，赖氨酰，甲硫氨酰，正亮氨酰，正缬氨酰，鸟氨酰，脯氨酰，肌氨酰，丝氨酰，苏氨酰，甲状腺原氨酰，酪氨酰，缬氨酰，半胱氨酰，高半胱氨酰，色氨酰，α-天冬氨酰，β-天冬氨酰，天冬氨二酰基，天冬酰胺酰，α-谷氨酰，γ-谷氨酰，和谷氨酰胺酰基团。
在Rc表示烷酰基的情形中，其可以是含有1-6个碳原子的直链或支链基团，实例包括甲酰基，乙酰基，丙酰基，丁酰基，异丁酰基，戊酰基，异戊酰基，叔戊酰基，己酰基，和庚酰基，其中优选含有2-5个碳原子的那些基团，更优选乙酰基和丙酰基，最优选乙酰基。
在取代基ψ或取代基ξ是含有1-6个碳原子的烷基氨基的情形中，烷基部分可以是上述定义和例举的任何烷基。这种烷基氨基的优选实例包括甲氨基，乙氨基，丙氨基，异丙基氨基，丁氨基，异丁基氨基，仲丁基氨基，叔丁基氨基，戊氨基，异戊基氨基，新戊基氨基，叔戊基氨基，己氨基，和异己基氨基，其中优选含有1-4个碳原子的那些基团，最优选甲氨基和乙氨基。
在取代基ψ或取代基ξ是二烷基氨基的情形中，每个烷基部分含有1-6个碳原子，并且两个烷基可以彼此相同或不同。烷基可以是上述定义和例举的任何烷基。这种二烷基氨基的优选实例包括二甲氨基，甲基乙基氨基，二乙氨基，甲基丙基氨基，二丙氨基，二异丙基氨基，乙基丁基氨基，二丁氨基，二叔丁基氨基，甲基戊基氨基，二戊基氨基，二异戊基氨基，和二己基氨基，其中优选在每个烷基中含有1-4个碳原子的那些基团，最优选二甲氨基和二乙氨基。
在取代基ψ或取代基ξ是烷氧基的情形中，其可以是含有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基，实例包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，异戊氧基，新戊氧基，叔戊氧基，己氧基，和异己氧基，其中优选含有1-4个碳原子的那些基团，最优选甲氧基和乙氧基。
在取代基ψ或取代基ξ是含有1-6个碳原子的烷硫基的情形中，烷基部分可以是上述定义和例举的任何烷基。这种烷硫基的优选实例包括甲硫基，乙硫基，丙硫基，异丙硫基，丁硫基，异丁硫基，仲丁硫基，叔丁硫基，戊硫基，异戊硫基，新戊硫基，叔戊硫基，己硫基，和异己硫基，其中优选含有1-4个碳原子的那些基团，最优选甲硫基和乙硫基。
在取代基ψ或取代基ξ是烷氧羰基的情形中，其可以是含有2-7个碳原子的直链或支链烷氧羰基，实例包括甲氧羰基，乙氧羰基，丙氧羰基，异丙氧羰基，丁氧羰基，异丁氧羰基，仲丁氧羰基，叔丁氧羰基，戊氧羰基，异戊氧羰基，新戊氧羰基，叔戊氧羰基，己氧羰基，和异己氧羰基，其中优选含有1-4个碳原子的那些基团，最优选甲氧羰基和乙氧羰基。
在取代基ξ是含有1-6个碳原子的羟烷基的情形中，烷基部分可以是上述定义和例举的任何烷基。这种羟烷基的优选实例包括羟甲基，1-和2-羟乙基，1-，2-和3-羟丙基，1，2-二羟乙基，1，2，3-三羟丙基，4-羟丁基，5-羟戊基和6-羟己基。
在取代基ξ是含有1-6个，优选1-4个碳原子的卤代烷基的情形中，烷基部分可以是如上定义和例举，卤原子优选为氯，氟，溴或碘。这种基团的实例包括氟甲基，氯甲基，溴甲基，碘甲基，二氯甲基，二氟甲基，三氯甲基，三氟甲基，2，2，2-三氯乙基，2-氯乙基，2-氟乙基，2-溴乙基，2-碘乙基，2，2-二溴乙基，2，2，2-三溴乙基，3-氟丙基，3-氯丙基，4-溴丁基，4-氟丁基，5-氟苯基和6-氟己基。
应当理解，在化合物包含式-OR的基团的情形中，在R是关于R1等如上定义的任何基团和原子的情形中，活性物质可能是包含自由羟基的化合物。因此，可以使用任何可以体内转化成羟基的基团来代替羟基。
可以用于本发明的化合物的具体实例包括：
Figure A0282026200141
7β-羟基-表雄甾酮                                                  7α-羟基-表雄甾酮
(7β-羟基-EPIA)                                                    (7α-羟基-EPIA)
Figure A0282026200142
7β-羟基-17β-雌甾二醇                                             7α-羟基-17β-雌甾二醇
7β-羟基-17β-雌甾酮                                             7α-羟基-17β-雌甾酮
Figure A0282026200152
7β-羟基-脱氢表雄甾酮                                            7α-羟基-脱氢表雄甾酮
(7β-羟基-DHEA)                                                  (7α-羟基-DHEA)
Figure A0282026200153
在上面所列化合物中，优选7β-同分异构体。
在本发明的化合物包含羟基的情形中，它们可以被转化成相应的盐或酯，其在本领域是众所周知的，对产生的盐或酯的种类没有特别限制。在将这些盐或酯施用于患者的情形中，那么它们应该是药用的。然而，如果化合物是用于某些其它目的，例如作为另外合成的中间体，那么甚至该限制也是不必要的。盐和酯可以选自在本领域对于这类化合物众所周知的那些。优选酯是羧酸酯和氨基酸酯，如例如丙氨酸，β-丙氨酸，胱硫醚，胱氨酸，甘氨酸，组氨酸，高丝氨酸，异亮氨酸，羊毛硫氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，鸟氨酸，脯氨酸，肌氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲腺原氨酸，酪氨酸，缬氨酸，半胱氨酸，高半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，和谷氨酰胺。
本发明的化合物可以通过本身众所周知的各种方法从母体甾族化合物开始制备。例如，通过在与上述有关的文献中所述的方法可以制备它们，其将产生7β和相应的7α化合物的混合物，如果需要，其然后可以通过众所周知的方法分离。然而，在一些情形中理想或便利地使用7α和7β同分异构体的混合物而不分开它们。
例如，使用常规方法在保护3β-羟基和17-酮基后通过烯丙型氧化从DHEA可以获得7α-羟基EPIA和7β-羟基EPIA。然后用可溶性的金属化合物催化剂(如氢化钠)将产物还原，将3β-羟基和17-酮基脱保护。然后通过常规方法，例如柱层析可以分开7α-羟基和7β-羟基差向异构体，可以将7α-羟基EPIA和7β-羟基EPIA结晶纯化。
在下列反应路线中显示备选的合成方法：
在上式中，TBDMSO表示叔丁基二甲基甲硅烷氧基，Ac表示乙酰基。当以下使用时这些缩写具有相同的含义。
在上述反应路线的第一步中，以常规方法通过叔丁基二甲基甲硅烷氧基保护式(III)化合物，雌甾酮，以产生保护的式(IV)化合物。其然后在酸催化剂(如对甲苯磺酸)的存在下与乙二醇反应以保护17位的酮基和产生式(V)的化合物。然后如以下实施例3所述可以将羟基引入6位以产生式(VI)的化合物，其然后被脱水而产生式(VII)的化合物。其被环氧化以产生式(VIII)的化合物，其然后被还原成含有7α-羟基的式(IX)的化合物。去除叔丁基二甲基甲硅烷基保护基，产生式(X)的化合物，用催化量的酸加热化合物以产生7α-羟基-雌甾酮(XI)，其可以用于本发明。然后例如使用铬酸/硫酸可以将其氧化以产生7-酮-雌甾酮(XII)，其然后与乙酸酐反应以产生式(XIII)的化合物。例如在钯催化剂的存在下使用氢将该化合物氢化以产生式(XIV)的化合物，最后去除乙酰基以产生7β-羟基-雌甾酮(XV)，本发明的一种化合物。如果需要，可以将其还原成7β-羟基-雌甾二醇(XVI)，也是本发明的一种化合物。可以以类似的方法从7α-羟基-雌甾酮(XI)制备相应的7α化合物。
可以以类似的方法制备本发明的其它7α-和7β-羟基-化合物，例如，可以如以下反应路线所述制备7β-羟基-DHEA。
在该反应路线中，DHEA(XVII)被乙酰化产生相应的式(XVIII)的乙酸酯，其然后与乙二醇反应以产生式(XIX)的缩酮。缩酮(XIX)然后如实施例16所述被氧化以产生相应的7-酮化合物(XX)，其然后脱乙酰以产生式(XXI)的化合物。将其还原产生式(XXII)的7-羟基-17-缩酮-EPIA，其然后用酸处理以去除缩酮基团和产生7-羟基EPIA，其最后通过色谱法被分成7β-和7α-同分异构体以提供7α-羟基-EPIA(XXIV)和7β-羟基-EPIA(XXV)。
上述反应路线的每一步各自是众所周知的，并且可以使用已知的溶剂和催化剂(如果合适)和在已知的反应条件，例如时间和温度条件下来进行。
上述定义的化合物具有神经保护作用。按照本发明，我们已经发现它们还具有心脏保护作用，因此可以用于预防或治疗由缺血性损伤引起的心脏病，如心肌梗塞。它们还具有保护以防缺血性肾损伤，例如肾小球性肾炎或急性肾损伤的能力。通常，基于证明的能力，可以预测它们将对其它外周器官的组织具有类似的保护作用。
实际上，本发明的化合物还可以用于治疗脊髓损伤。
患者如果怀疑它们有缺血性事件，特别是心肌梗塞或缺血性肾损伤的危险，可以施用本发明的化合物。该预防性施用可能特别有效。然而，已经证明即使在缺血性事件后施用，本发明的化合物具有有效活性，但应当理解优选尽快施用化合物，以便尽可能多地避免心肌或肾损伤。在一些情形中需要施用多次剂量，特别是在患者仍处于缺血性事件的危险中的情形中。
预期脊髓损伤还可以预防性地施用该化合物或在它已经发生后可以使用其来治疗该损伤。
适当的给药方法通常是通过注射，以便尽快地取得理想的结果。因此，特别优选静脉注射。
本发明的化合物的剂量将根据多种因素变化，所述因素包括患者的年龄，体重和全身情况，以及给药的方式，频率和途径。然而，通常推荐0.01-50mg/kg体重的剂量，更优选0.05-20mg/kg体重的剂量。其可以以单剂量或分剂量施用。
通过下列非限制性的实施例进一步举例说明本发明，其中实施例1-20举例说明本发明化合物的制备，实施例21-23说明它们的活性。在实施例1-20中，罗马数字是指以上所示的反应路线中的式子。
                       实施例1
3-叔丁基二甲基甲硅烷基-雌甾酮(IV)
将4.25g叔丁基二甲基甲硅烷基氯(28.2mmol，3当量)加入在100ml三颈烧瓶中的50ml包含2.54g雌甾酮III(9.41mmol，1当量)和3.84g咪唑(56.5mmol，6当量)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液。然后让混合物在室温下在氮气气氛下过夜。将10％w/v碳酸钾水溶液加入反应介质中，其然后用乙酸乙酯萃取。用水洗涤有机相，然后用无水硫酸钠干燥并蒸发干。获得3.76g 3-叔丁基二甲基甲硅烷基-雌甾酮(IV)(9.41mmol，100％)。
                       实施例2
17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-雌甾酮(V)
使用Dean-Stark装置用水蒸汽蒸馏将60ml包含3g 3-叔丁基二甲基甲硅烷基-雌甾酮(IV)，3ml乙二醇和催化量的对甲苯磺酸的甲苯溶液加热至回流24小时。然后将反应介质倒入50ml 10％w/v的碳酸钾水溶液中。滗析有机相。用乙酸乙酯萃取水相。合并有机相并蒸发干。获得3.16g17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-雌甾酮(V)(7.12mmol，95％)。
                       实施例3
6α-羟基-17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-雌甾酮(VI)
在1升的三颈烧瓶中，通过氮冲洗将100ml无水四氢呋喃(THF)溶液脱气并冷却至-80℃。将二异丙胺(20ml，143.30mmol)加入反应介质。将在环己烷(89.9ml，143.30mmo1)中的15％w/v丁基锂溶液逐滴加入反应介质中。在10分钟后，将预先脱气的包含17.5g叔丁酸钾的100ml无水THF溶液逐滴加入反应介质中。在另外15分钟后，将预先脱气的包含12.27g 17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-雌甾酮(V)(27.63mmol)的50ml无水THF溶液逐滴加入反应介质中。将反应混合物放在-80℃下2小时。在该时间结束时，在-80℃下将48ml硼酸三甲酯(429.90mmol)逐滴加入反应介质中，将该反应介质放在0℃下1小时。然后加入100ml30％v/v过氧化氢水溶液。将反应混合物在室温下放1小时，然后加入500ml水。用乙酸乙酯萃取反应介质。用10％w/v硫代硫酸钠水溶液洗涤，用水洗涤，用无水硫酸钠干燥并蒸发干。通过快速色谱法(flashchromatography)(SiO2/乙酸乙酯：环己烷1/9然后2/8)纯化残渣。获得6.35g 6α-羟基-17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-雌甾酮(VI)(13.81mmol，50％)。
                       实施例4
17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-6-脱氢雌甾酮(VII)
使用Dean-Stark装置用水蒸汽蒸馏将40ml包含1.54g 6α-羟基-17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-雌甾酮(VI)(3.35mmol)，4ml乙二醇和催化量的对甲苯磺酸的甲苯溶液加热至回流24小时。然后将反应介质倒入50ml 10％w/v的碳酸钾水溶液中。滗析有机相。然后用乙酸乙酯萃取水相。合并有机相并蒸发干。获得1.48g 17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-6-脱氢雌甾酮(VII)(3.35mmol，100％)。
                       实施例5
17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-6α，7α-环氧雌甾酮(VIII)
在0℃下将包含1.16g邻氯苯甲酸(55％，3.69mmol，1.1当量)的20ml二氯甲烷逐滴加入包含1.85g 17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-6-脱氢雌甾酮(VII)(3.36mmol，1当量)的20ml二氯甲烷溶液中。在2小时后将反应介质倒入10％w/v碳酸氢钠水溶液中，然后用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机相，然后蒸发干。通过快速色谱法(SiO2/乙酸乙酯：环己烷1/9)纯化残渣。获得769mg 17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-6α，7α-环氧雌甾酮(VIII)(1.68mmol，50％)。
                       实施例6
7α-羟基-17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-雌甾酮(IX)
将200mg氢化铝锂(5.40mmol，2当量)加入包含1.13g 17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-6α，7α-环氧雌甾酮(VIII)(2.60mmol，1当量)的50ml无水THF溶液。将反应介质加热至回流2小时，然后冷却，倒入冰中，滤过Celite(商标)助滤剂并用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机相，然后蒸发干。通过快速色谱法(SiO2/乙酸乙酯：环己烷1/9)纯化残渣。获得837mg 7α-羟基-17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-雌甾酮(IX)(1.82mmol，70％)。
                       实施例7
7α-羟基-17-缩酮-雌甾酮(X)
在室温下将包含1.5g氯化四丁基铵(4.78mmol，1.10当量)的20mlTHF溶液加入包含2g 7α-羟基-17-缩酮-3-叔丁基二甲基甲硅烷基-雌甾酮(IX)(4.35mmol，1当量)的50ml THF溶液中。将反应介质倒入70ml10％w/v碳酸钠水溶液中。用乙酸乙酯萃取反应介质。用无水硫酸钠干燥有机相，然后蒸发干。获得1.39g 7α-羟基-17-缩酮-雌甾酮(X)(4.22mmol，97％)。
                       实施例8
7α-羟基-雌甾酮(XI)
将包含1ml水，1.0g 7α-羟基-17-缩酮-雌甾酮(X)(3.03mmol)和催化量的对甲苯磺酸的50ml丙酮溶液加热至回流2小时。然后将反应介质倒入10％w/v碳酸钠水溶液。用乙酸乙酯萃取反应介质。用无水硫酸钠干燥有机相，然后蒸发干。获得814mg 7α-羟基-雌甾酮(XI)(2.85mmol，94％)，其是从乙酸乙酯中重结晶。
                       实施例9
7-酮雌甾酮(XII)
将硫酸中的8N铬酸溶液逐滴加入冷却至0℃的包含300mg 7α-羟基-雌甾酮(XI)(1.05mmol)的40ml丙酮溶液直至黄色持续。将反应介质倒入50ml水中，然后用乙酸乙酯萃取。用碳酸钠水溶液洗涤有机相，然后用无水硫酸钠干燥并蒸发干。通过快速色谱法(SiO2/乙酸乙酯：环己烷3/7)纯化残渣。获得200mg 7-酮雌甾酮(XII)(0.70mmol，67％)。
                       实施例10
7-羟基-6-脱氢雌甾酮3，7-双乙酸酯(XIII)
将包含5g无水乙酸钠和1g 7-酮雌甾酮(XII)(3.52mmol)的10ml乙酸酐溶液加热至回流1小时。然后冷却反应介质，然后倒入水中并用乙酸乙酯萃取。用碳酸钠水溶液洗涤有机相，然后用无水硫酸钠干燥并蒸发干。通过快速色谱法(SiO2/乙酸乙酯：环己烷1/9)纯化残渣。获得1.25g 7-羟基-6-脱氢雌甾酮-3，7-双乙酸酯(XIII)(3.41mmol，97％)。
                       实施例11
7-羟基雌甾酮3，7-双乙酸酯(XIV)
在1巴的氢压力下使用200mg 10％在活性炭上的钯催化剂将包含1.0g 7-羟基-6-脱氢雌甾酮3，7-双乙酸酯(XIII)(2.72mmol)的80ml冰醋酸溶液氢化。在2小时后将反应介质过滤并蒸发干。通过快速色谱法(SiO2/乙酸乙酯：环己烷1/9)纯化残渣。获得855mg 7-羟基雌甾酮3，7-双乙酸酯(XIV)(2.31mmol，85％)。
                       实施例12
7β-羟基雌甾酮(XV)
将包含1％氢氧化钾和1g 7-羟基雌甾酮-3，7-双乙酸酯(XIV)(2.70mmol)的50ml甲醇溶液加热至回流2小时。然后将反应介质冷却，中和，然后用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机相，然后蒸发干。获得695mg7β-羟基雌甾酮(XV)(2.43mmol，90％)，其是从甲醇中重结晶。
                       实施例13
7β-羟基雌甾二醇(XVI)
将264mg氢硼化钠(7.00mmol，2当量)加入包含1.0g 7β-羟基雌甾酮(XV)(3.50mmol)的50ml甲醇溶液中。将反应介质倒入水中并用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机相，然后蒸发干。获得917mg 7β-羟基雌甾二醇(XVI)(3.18mmol，91％)，其是从甲醇中重结晶。
                       实施例14
DHEA-3-乙酸酯(XVIII)
将50ml吡啶和包含10g DHEA(XVII)(34.72mmol)的50ml乙酸酐溶液加热至回流4小时。冷却反应介质，倒入水中并用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机相并蒸发干。获得11.0g DHEA-3-乙酸酯(XVIII)(33.33mmol，96％)，其是从乙醇中重结晶。
                       实施例15
17-缩酮-DHEA-3-乙酸酯(XIX)
使用Dean-Stark装置用水蒸汽蒸馏将100ml包含5g DHEA-3-乙酸酯(XVIII)(15.15mmol)，5ml乙二醇和催化量的对甲苯磺酸的甲苯溶液加热至回流24小时。然后将反应介质倒入100ml 10％w/v的碳酸钾水溶液中。滗析有机相。然后用乙酸乙酯萃取水相。合并有机相并蒸发干。获得5.10g 17-缩酮-3-DHEA-乙酸酯(XIX)(13.64mmol，90％)，其是从乙醇中重结晶。
                       实施例16
7-酮-17-缩酮-DHEA-3-乙酸酯(XX)
在以氧气喷射下使用中压汞汽灯照射包含5g 17-缩酮-DHEA-3-乙酸酯(XIX)(13.37mmol)和催化量的Bengal Rose的70ml吡啶溶液。在24小时后将催化量的乙酸铜加入反应介质中。在24小时后将反应介质蒸发干。通过快速色谱法(SiO2/乙酸乙酯：环己烷3/7)纯化残渣。获得3.11g 7-酮-17-缩酮-DHEA-3-乙酸酯(XX)(8.02mmol，60％)。
                       实施例17
7-酮-17-缩酮-DHEA(XXI)
将含有1％氢氧化钾和1g 7-酮-17-缩酮-DHEA-3-乙酸酯(XX)(2.58mmol)的甲醇溶液加热至回流2小时。然后冷却反应介质，中和，然后用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机相，然后蒸发干。从甲醇中重结晶获得802mg 7-酮-17-缩酮-DHEA(XXI)(2.32mmol，90％)。
                       实施例18
7-羟基-17-缩酮-EPIA(XXII)
在-33℃下将10g 7-酮-17-缩酮-DHEA(XXII)(28.90mmol)加入含有2.65g钠的液态氨溶液。在4小时后，加入氯化铵直至蓝色消失。然后加入2.65g钠。在4小时后，再次加入氯化铵直至蓝色消失。加入水并使氨蒸发。用乙酸乙酯萃取反应介质。用无水硫酸钠干燥有机相，然后蒸发干。获得6.07g 7-羟基-17-缩酮-EPIA(XXII)(17.34mmol，60％)。
                       实施例19
7-羟基-EPLA(XXIII)
将含有5ml水，10g 7-羟基-17-缩酮-EPIA(XXII)(28.57mmol，50％)和催化量的对甲苯磺酸的100丙酮溶液加热至回流4小时。冷却反应介质倒入100ml 10％w/v碳酸钠水溶液，然后用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机相，然后蒸发干。通过快速色谱法(SiO2/乙酸乙酯：环己烷)纯化残渣。获得5.24g 7-羟基-EPLA(XXIII)(17.14mmol，60％)。
                      实施例20
7α-羟基-EPIA(XXIV)和7β-羟基-EPIA(XXV)
通过快速色谱法(Al2O3/CHCl3)纯化包含比率为65/35的7α和7β差向异构体的7-羟基-EPIA(XXIII)。在7α-羟基-EPIA(XXIV)(1.34g)之前，首先获得7β-羟基-EPIA(XXV)(2.5g)。从乙酸乙酯中重结晶7β-羟基-EPIA(XXV)和7α-羟基-EPIA(XXIV)。
                       实施例21
研究含氧量低的神经元损伤的方案
使用如下改进的Pringle等(1996，1997)的基本方法制备器官型海马切片培养物：
将Wistar幼鼠(8-11天大)断头并将海马迅速分割至冰冷的补充有4.5mg/ml葡萄糖的Gey平衡盐溶液中。分离切片并涂布在Millicell CM培养插入物(每孔4个)上，并保持在37℃/5％CO2下14天。维持培养基由25％热灭活的马血清，25％Hank's平衡盐溶液(HBSS)和补充有1mM谷氨酰胺和4.5mg/ml葡萄糖的含有加入的Earle′s盐的50％最低必需培养基(MEM)组成。每3-4天更换培养基。
如先前所述(Pringle等，1996；1997)进行实验性缺氧。简短地，将培养物转移至含有5μg/ml荧光排斥染料碘化丙锭(PI)的无血清培养基(SFM-75％MEM，补充1mM谷氨酰胺和4.5mg/ml葡萄糖的25％HBSS)中。在成像前让培养物在SFM中平衡60分钟。使用装有罗丹明过滤装置的Leica倒置显微镜检测PI荧光。将其中在该步检测到PI荧光的任何培养物排除在进一步研究之外。通过将培养物转移至已经用95％N2/5％CO2饱和的SFM(+PI)来诱导缺氧。然后将培养板(无盖)封闭到气密室中，在气密室中通过在密封前连续吹过10升/分钟的气体10分钟，其中气体用95％N2/5％CO2饱和，放置在恒温箱中170分钟(因此缺氧的总时间为180分钟)。在缺氧期结束时将培养物返回至含有PI的含氧量正常的SFM并放回到恒温箱中24小时。
如先前所述(Pringle等，1996；1997)使用在Apple Iisi计算机上运行的NIH Image 1.60或在Macintosh G4/400上运行的OpenLab2.1(Improvision)评估神经元损伤。使用黑白照相机捕捉图像并存储到光盘上用于脱机分析。在加入药物之前捕捉光透射图像，在24小时缺氧后恢复期结束时记录PI荧光图像。从透射图像测定CA1细胞层的面积。使用在NIH Image或OpenLab中的密度切片功能测量在CA1中PI荧光的面积，并表示为其中在背景上检测PI荧光的CA1的百分率。
通过制备初始1mg/ml的在乙醇中的溶液和进一步在SFM中稀释制备甾族化合物。在缺氧前，缺氧期间和缺氧后的恢复期间将化合物加入培养物45分钟。对照实验由单独用载体处理的培养物组成。
                       结果
实验1：
进行初始实验来测定7αOH-EPIA和7βOH-EPIA在100nM的高浓度下是否是神经保护性的。缺氧产生CA1 25.5±6.4％的CA1损伤。当在缺氧之前，之中和之后存在时7αOH-EPIA和7βOH-EPIA都显著减轻该损伤(参见表I)。
                       表I
化合物  N  ％CA1损伤
对照缺氧  17  25.5±6.4
缺氧+100nM 7αOH-EPIA  16  4.0±2.9**
缺氧+100nM 7βOH-EPIA  16  9.0±4.7*
实验2：
已经确定7OH-EPIA的α-和β-同分异构体都是神经保护性的，我们评估该作用的浓度依赖性。对照缺氧导致对31.9±4.7％的CA1的神经元损伤。7βOH-EPIA在10nm和100nm下是显著神经保护性的，但如果浓度降低到1nM活性丢失。如下表II所示。
                       表II
化合物   N  ％CA1损伤
对照缺氧   29  31.9±4.7
缺氧+1nM 7βOH-EPIA   15  20.6±7.2
缺氧+10nM 7βOH-EPIA   12  11.9±4.7*
缺氧+100nM 7βOH-EPIA   13  14.3±5.0*
实验3：
已经观察到7βOH-EPIA的神经保护活性，我们接着研究7βOH-DHEA是否是神经保护性的。在缺氧之前，之中和之后将培养物与100nM7βOH-DHEA或载体温育。缺氧产生29.0±6.2％的CA1损伤。在用7βOH-DHEA处理的培养物中，观察到神经元损伤大的、高度显著的减少，如下表III所示。
                   表III
化合物  N  ％CA1损伤
对照缺氧  21  29.0±6.2
缺氧+100nM 7βOH-DHEA  16  4.2±1.9**
                       实施例22
大鼠的整体脑局部缺血(4脉管闭合)
通过在雄性Wistar大鼠(250-280g)中4-脉管-闭合(4VO)诱导脑局部缺血。在戊巴比妥麻醉(60mg/kgi.p.)中通过电熔术闭合两条椎动脉。让动物恢复24小时，自由接近水但无食物。次日在30％氧/70％一氧化二氮麻醉中将颈动脉暴露在2％氟烷下，使用微脉管夹闭合10分钟。接着，去除两个夹子，检查两个动脉立即重灌注。在手术和随后3小时期间通过使用恒温控制的、与直肠温度计连接的加热毛毯保持动物体温正常(37.5±0.5℃)。对于对照，在假手术动物中在戊巴比妥麻醉中烧烙两个椎动脉，在30％氧/70％一氧化二氮麻醉中将主颈动脉暴露在2％氟烷下但不夹住。用利多卡因凝胶处理伤口，然后缝合。在30℃的环境温度下将动物保持在加热灯下直至它们恢复知觉。
研究7组动物：
1.(n＝8)甾族化合物，7β-OH EPIA(0.1mg/kg，通过尾静脉i.v.，3次注射：在诱导局部缺血之前15分钟，之间和重灌注之后5分钟)；
2.(n＝8)甾族化合物，7β-OH EPIA(0.3mg/kg，如1所述3次注射)；
3.(n＝8)甾族化合物，7β-OH EPIA(1mg/kg，如1所述3次注射)；
4.(n＝8)NBQX(二钠盐，因为更水溶性)作为参考物和阳性对照(TOCRIS，德国，30mg/kg，i.p.，如1所述3次注射)；
5.(n＝8)接受的载体(0.9％NaCl，包含100μl乙醇)如1所述3次注射)；
6.(n＝8)仅局部缺血；
7.(n＝8)假手术对照
NBQX是2，3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰-苯并(F)喹喔啉，并已知具有神经保护活性[Gill，R.，Nordholm，L.，Lodge D.：The neuroprotective actionof 2，3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(F)quinoxaline(NBQX)in a ratfocal ischaemia model.Brain Res.580，35-43，1992]。
7β-OH EPIA是7β-羟基表雄甾酮，本发明的化合物。
将各物质溶解在100μl乙醇中并最终用0.9％NaCl稀释。
在局部缺血后7天的存活时间后，使用4％多聚甲醛经心脏灌注固定所有动物。然后仔细摘除脑，并在相同的固定剂中继续固定2小时。在30％蔗糖中冷冻保护之后，将脑迅速冷冻在异戊烷中并保存在-80℃。用甲苯胺蓝或Neuro Trace荧光将包含海马结构的20μm低温恒温器部分尼氏染色。
数据分析：
使用尼氏染色通过存活神经元的数量评估在局部缺血后海马CA1区域中神经元损伤的严重性。对于每组计算在CA1区域中每400μm长度在形态上完好的神经元的平均数。使用装配有20x物镜的光学显微镜在每只动物3-5个连续部分和每部分6次400μm CA1区域中进行细胞计数。通过配对Student′s t-检验统计学分析数据。数据表示为平均值±SEM。
结果和讨论
通过尼氏染色(甲苯胺蓝或Neuro Trace)以下列标准表征形态上完好的海马CA1神经元：神经元核周质的清晰形状，含有正标记核仁的大细胞核，正尼氏染色核周围的小细胞质区域，显示具有核糖体的完好的粗糙内质网和因此完好的蛋白质合成机器。
10分钟的整体局部缺血(轻度局部缺血)和7天的存活时间导致选择性地在海马CA1区域中锥体细胞的神经变性(图1A-1C)。假手术动物的CA1中的锥体细胞平均数为121.5±4.3(设定为100％)。因此，在10分钟整体局部缺血后60％CA1神经元死亡(图1B)。局部缺血和i.v.注射如实验所述施用的载体(NaCl加上100μl乙醇)的动物组中的神经元数量与仅局部缺血组相当(图1A，1B)。与局部缺血组相比NBQX(30mg/kg，i.v.，如实验所述3次注射)在CA1锥体细胞中显示显著(p＝0.03)的神经保护。与仅局部缺血相比NBQX导致47.5％神经保护而与假手术动物相比保护作用是68.5％。NBQX导致的神经保护与Gill等，1992和Gill 1994一致，证明了在我们实验中我们使用的整体局部缺血模型的有效性。7β-OHEPIA导致在整体局部缺血10分钟和7天存活时间后海马CA1锥体细胞的浓度依赖性神经保护(图1A)。T-检验分析显示浓度为0.1 0.1mg/kg(p＝0.01)和0.3mg/kg(p＝0.0008)的7β-OH EPIA的高度显著的神经保护作用。与假手术组相比7β-OH EPIA对CA1锥体细胞分别显示74.8％(0.1mg/kg)和83.9％(0.3mg/kg)的神经保护作用(图1C)。浓度为1.0mg/kg的7β-OH EPIA只显示神经保护的趋势，但作用不显著。
在局部缺血之前，之中和之后注射7β-OH EPIA的所有实验中，我们未观察到动物的任何行为异常。
附图的图例：
在大鼠中整体脑局部缺血和不同化合物影响后7天的大鼠形态上完好海马CA1锥体细胞的数量。
图1A：数据表示为每400μm长度的CA1区域完好神经元的平均数±SEM。
图1B：数据表示为与设定为100％的假手术动物相比每400μm长度的CA1区域完好神经元的百分率。
图1C：数据表示为当将局部缺血组的存活神经元的数目设定为0和假手术组的那些设定为100％时神经保护的绝对百分率。
尽管上述数据证明神经保护，最近已经显示Cyp7b1，负责3-羟基甾族化合物的7-羟基化和因此导致雌甾二醇、DHEA和EPIA转化成它们的神经保护衍生物的酶，存在于遭受缺血性损伤的包括心脏和肾组织的其它组织中。因此，可以从上述数据推断本发明的化合物将保护心脏和肾组织免于缺血性损伤。
                       实施例23
心脏保护作用
本研究是设计来检验7β-OH EPIA在Langendorf灌注的雄性大鼠心脏中的可能的抗缺血性和心脏饱和作用。该模型中评估保护的终点是梗塞大小(保护防止致命损伤，细胞死亡)。所用梗塞大小模型是基于标准的局部缺血性损害，接着重灌注。在本研究中，在梗塞之前离体加入治疗(至离体心脏的灌注液中)30分钟和持续30分钟区域性的局部缺血(梗塞)和120分钟的重灌注。基于试验性研究产生的结果，使用100nM的浓度并与载体处理的心脏比较。将药物溶解在DMSO(载体)中，DMSO在灌注液中的终浓度为1∶10-6。研究结果表明浓度为100nM的化合物将梗塞大小从46.3+/-2.49％显著减小到14.4+/-1.22％的缺血性风险区(p＜0.001)。还检查和药物加入一起的心脏功能，单独加入7β-OH EPIA未导致心脏功能可检测的变化。用7β-OH EPIA处理的心脏在区域性局部缺血期间显示整体左心室收缩压的轻微减小(25分钟区域性局部缺血p＜0.05)，其在重灌注后消失。
研究证实浓度为100nM的化合物在离体灌注的雄性大鼠心脏中的心脏保护，抗-局部缺血的性能。
动物处理
将动物收容在Tromso大学的动物系和按照由欧洲公约制定的关于保护用于实验或其它目的的脊椎动物的准则处理。Wistar大鼠是由Harland(荷兰)供应，在实验开始之前将大鼠留在动物系1周。将动物体重限制在240-380g，只使用雄性心脏。其相当于60-120天大。在实验当天，在过滤箱中将大鼠从动物系转移至实验室。然后通过腹膜内注射戊巴比妥(50-75mg/kg)麻醉大鼠，还通过腹膜内200 IU肝素化。
灌注
将心脏迅速(1-2分钟内)转移至灌注装置，其使用Krebs Henseleits碳酸氢盐缓冲液作为灌注液。在37℃下保持灌注液和心脏。
Krebs Henseleits碳酸氢盐缓冲液由下列各项组成：
NaCl               118.5mM/升
NaHCO3            25.0mM/升
KCl                4.7mM/升
KH2PO4           1.2mM/升
MgSO4             1.2mM/升
CaCl2             2.4mM/升
葡萄糖             11.1mM/升
用O2中的约5％CO2的气体混合物平衡缓冲液。
灌注压为100mm H2O。将乳胶气球安装在聚乙烯导管的顶端，该导管与压力传感器连接并插入左心室的腔中以测量左心室压力。在实验中未改变气球的大小，实验装置因此是等容左心室预备。将来自心脏右侧(经过肺动脉干和右心房的窦冠状动脉)的静脉流出物(effluate)的定时收集用于冠状血流量测量。从压力记录计算心率。
将基于计算机的数据采集和分析用于心脏功能(基于Lab View的软件)。
实验方案
稳定期为20-25分钟，放弃在该期间未达到稳定性能的心脏。使用在稳定期结束时具有80mmHg-175mmHg LVDP(左心室发展压)，0-10mmHg的舒张压和9-18ml/min的冠状血流量的心脏。
制备7β-OH EPIA在DMSO中的100mM的贮存液并在20℃下等分保存在eppendorf管中。刚好在实验前将该溶液进一步稀释在灌注液中至100nM活性药物。在梗塞前提供使用7β-OH EPIA(n＝8)或载体(n＝8)的预处理30分钟并持续直至实验结束。
通过将丝缝线放置在左冠状动脉的主分支的周围实现区域性局部缺血(梗塞)。通过使用小段聚乙烯管获得可逆连接。标准的区域性局部缺血持续30分钟，然后将心脏重灌注2小时。
梗塞大小和风险区大小
在实验结束时接着下列步骤：
1)将左冠状动脉重连接
2)将蓝染料的悬浮液加入灌注管中。缺血性区域被鉴定为无染料的区域。
3)将心脏迅速摘除，称重和冷冻。
4)1天后将心脏切成2mm厚的切片并用四唑鎓染色。在37℃下在0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中的1％TTC(氯化三苯基四唑鎓)中将心脏切片温育20分钟。梗塞组织将不产生任何颜色反应，而存活的组织由于在组织中存在脱氢酶和辅因子显示紫色。
5)在染色后，将心脏放置在福尔马林(4％)中固定。
6)TTC染色将随时间丧失，因此将所有心脏切片计算机扫描并作为记录数字图像保存。
7)使用基于计算机的面积法来计算心室，缺血性风险区和梗塞的体积。结果表示为缺血性风险区中的％梗塞。
                       结果
结果在下表1中表示。
                       表1
在对照和处理组中的体重，心脏重量，左心室体积，风险区体积和梗塞体积(平均值SEM)。
对照(n＝8)  7β-OH EPIA(n＝8)
大鼠体重(g) 295.6+/-5.30  285.6+/-7.93
心脏重量(g) 1.3+/-0.04  1.3+/-0.04
心室体积(mm3) 239.0+/-17.73  200.3+/-9.23
风险区体积(mm3) 109.3+/-8.43  98.6+/-6.51
梗塞体积 38.9+/-4.98  14.1+/-1.46*p＜0.001
风险区/心室(％) 35.7+/-3.11  49.3+/-2.38
梗塞/风险区(％) 46.3+/-2.49  14.4+/-1.22*p＜0.001
结果还在附图的图2至6中说明。
梗塞：
在两组之间存在显著差异(p＜0.001)，在药物处理组中梗塞显著减少。在对照载体处理的心脏中的梗塞在大小上与通常在遭受30分钟区域性局部缺血的未处理的心脏中获得的标准对照梗塞相当。
心脏功能：
整个实验时程检查心脏功能。在该实验模型中与冠状动脉闭合一起发现冠状血流量的显著减少，证实预期的心肌梗塞发生。冠状血流量不受7β-OH EPIA的加入的影响。在整个实验中心率在两组间无显著差异并保持稳定。在区域性局部缺血期间左心室发展压(LVDP)也下降。与对照相比该下降在药物处理的心脏中更大。在25分钟的区域性局部缺血时发现两组间LVDP的显著差异。在舒张压方面未观察到两组不同。
载体：
载体DMSO先前已经被用作缓冲液-灌注心脏的载体，结果显示在本研究的情形下该化合物单独无可检测的影响。
                       结论
本研究证明7β-OH EPIA的明显和显著的心脏保护作用。当用于相同的实验模型中时，保护的程度在量上可以与最有效和充分表征的心脏保护药物或治疗方案如NHE阻滞或缺血性预处理相比。

Claims (20)

1. 3-羟基-7-羟基甾族化合物或3-氧代-7-羟基甾族化合物或其药用酯在制备药物中的应用，所述药物用于保护防止对外周器官的缺血性损伤，和用于治疗脊髓损害诱导的损伤。
2.按照权利要求1的应用，其中所述甾族化合物是式(I)的化合物及其药用盐和酯：
Figure A028202620002C1
其中
R1和R2彼此相同或不同并且各自表示氢原子，含有1-6个碳原子的烷基，含有2-6个碳原子的烯基，含有2-6个碳原子的炔基，含有6-10个碳原子的芳基，甲酰基，含有2-7个碳原子的烷基羰基，含有3-7个碳原子的烯基羰基，含有3-7个碳原子的炔基羰基，含有7-11个碳原子的芳基羰基，含有8-15个碳原子的芳烷基羰基，含有9-15个碳原子的芳烯基羰基，氨基酸残基，或定义如下的杂环-羰基；
Ra和Rb之一表示式-Rc的基团，优选为β构型，另一个表示氢原子，或者Ra和Rb一起表示氧代基团；
Rc表示含有1-6个碳原子的烷酰基，芳基羰基，其中芳基部分是含有6-10个环碳原子的芳族碳环基团，定义如下的杂环-羰基，或式-OR4的基团，其中R4表示对于R1和R2上述定义的基团和原子中的任何一个；
环A，
Figure A028202620003C1
是苯环或环己烷环；
当环A是环己烷时，环B中的虚线表示碳-碳单或双键，并且 n为1；或当环A是苯环时，环B中的虚线表示碳-碳单键并且 n为0；
所述杂环-羰基是式R3-CO的基团，其中R3表示含有3-7个环原子的杂环基团，在环原子中1-3个是选自氮原子，氧原子和硫原子的杂原子，其余原子中至少一个是碳原子；
所述烷基，烯基和炔基，和所述烷基羰基、烯基羰基和炔基羰基的烷基、烯基和炔基部分为未被取代或含有下列取代基ψ中的至少一个：
取代基ψ：羟基，巯基，卤原子，氨基，含有1-6个碳原子的烷基氨基，其中每个烷基含有1-6个碳原子的二烷基氨基，氨基甲酰基，硝基，含有1-6个碳原子的烷氧基，含有1-6个碳原子的烷硫基，羧基，烷氧羰基和含有6-10个碳原子的未取代的芳基；
所述芳基，所述杂环基，和所述芳基羰基和所述芳烷基羰基的芳基部分为未被取代或含有下列取代基β中的至少一个：
取代基ξ：取代基ψ中任何一个，含有1-6个碳原子的烷基，含有1-6个碳原子的羟烷基，含有1-6个碳原子的卤代烷基。
3.按照权利要求2的应用，其中：
R1和R2彼此相同或不同并且各自表示氢原子，含有1-6个碳原子的烷基，任选地取代的苯基，甲酰基，含有2-5个碳原子的烷基羰基，含有7-11个碳原子的芳基羰基，含有8-15个碳原子的芳烷基羰基，氨基酸残基，或定义如下的杂环-羰基；
Ra和Rb之一表示含有1-6个碳原子的烷酰基或式-OR4的基团，其中R4表示对于R1和R2上述定义的基团和原子中的任何一个，为β构型，另一个表示氢原子，或者Ra和Rb一起表示氧代基团；
所述杂环-羰基是式R3-CO的基团，其中R3表示含有3-7个环原子的杂环基团，在环原子中1-3个是选自氮原子，氧原子和硫原子的杂原子，其余原子中至少一个是碳原子。
4.按照权利要求1的应用，其中所述甾族化合物是式(II)的化合物或其药用盐或酯：
Figure A028202620004C1
其中
R2表示氢原子，含有含有1-6个碳原子的烷基，任选地取代的苯基，甲酰基，含有2-5个碳原子的烷基羰基，含有7-11个碳原子的芳基羰基，含有8-15个碳原子的芳烷基羰基，氨基酸残基，或定义如下杂环-羰基；
所述杂环-羰基是式R3-CO的基团，其中R3表示含有3-7个环原子的杂环基团，在环原子中1-3个是选自氮原子，氧原子和硫原子的杂原子，其余原子中至少一个是碳原子。
Ra和Rb之一表示式-Rc的基团，优选为β构型，另一个表示氢原子，或Ra和Rb一起表示氧代基团；Rc表示含有1-6个碳原子的烷酰基，芳基-羰基，其中所述芳基部分是含有6-10个环碳原子的芳族碳环基团，定义如下的杂环-羰基，或式-OR4的基团，其中R4表示上述R2定义的基团和原子中的任何一个。
5.按照权利要求2至4中任何一项的应用，其中在7-位的所述-OR2基团是β构型。
6.按照权利要求1的应用，其中所述甾体化合物是7β-羟基-表雄甾酮。
7.按照权利要求1的应用，其中所述甾体化合物是7β-羟基-脱氢表雄甾酮。
8.按照权利要求1的应用，其中所述甾体化合物是7β-羟基-17β-雌甾二醇。
9.按照权利要求1的应用，其中所述甾体化合物是7β-羟基-孕烯醇酮。
10.按照权利要求1的应用，其中所述甾体化合物是7β-羟基-雌甾酮。
11.按照权利要求1的应用，其中所述甾体化合物是7α-羟基-雌甾酮。
12.按照前述权利要求中任何一项的应用，其中所述外周器官是心脏。
13.按照权利要求12的应用，其中所述对心脏的损伤是由心肌梗塞导致的。
14.按照权利要求1至11中任何一项的应用，其中所述外周器官是肾。
15.按照权利要求14的应用，其中所述对肾的损伤是由肾小球性肾炎或急性肾衰竭导致的。
16.按照权利要求1至11中任何一项的应用，其用于治疗对脊髓的损伤。
17.保护哺乳动物防止在外周器官中局部缺血诱导的组织损伤或防止脊髓损害诱导的对脊髓的损伤的方法，其是通过向其给药有效量的如权利要求1至11中任何一项所定义的3-羟基-7-羟基甾族化合物或3-氧代-7-羟基甾族化合物或其药用酯。
18.按照权利要求17，其中所述外周器官是心脏。
19.按照权利要求17，其中所述外周器官是肾。
20.按照权利要求17，其中保护所述哺乳动物以防止由脊髓损害导致的损伤。
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