NO334819B1 - Anvendelse av hydroksysteroider og farmasøytisk akseptable salter og estere derav, for fremstilling av et medikament for beskyttelse mot iskemisk skade på perifere organer - Google Patents

Abstract

3-hydroksy-7-hydroksysteroider og 3-okso-7-hydroksysteroider, spesielt 7p-isomerene derav, og farmasøytisk akseptable estere derav, er anvendelige for beskyttelse mot iskemiindusert skade på perifere organer, slik som hjertet eller nyrene, så vel som behandling av ryggmargslesjon.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår visse nye profylaktiske og terapeutiske anvendelsesområder for 3-hydroksy-7-hydroksysteroidforbindelser som definert i krav 1 og for visse ketonderivater derav, og spesielt anvendelsen av disse forbindelsene for forebygging eller behandling av skade forårsaket av iskemisk belastning på perifere organer, slik som hjertet eller nyrene, så vel som behandling av ryggmargslesjon.

Ved bruk av en bestemt modell for nervebeskyttelse har vi påvist at forbindelser av denne type har nervebeskyttende virkning. Vi har nå oppdaget at den samme virkningsmekanisme som fører til denne nervebeskyttende effekt, også virker i vevet i perifere organer, slik som hjertet og nyrene, og derfor har forbindelsene en hjertebeskyttende effekt og evnen til å beskytte mot iskemisk nyreskade.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig anvendelsen av et 3-hydroksy-7-hydroksysteroid ell eller en farmasøytisk akseptabel ester derav som definert i krav 1, for fremstilling av et medikament for beskyttelse mot iskemisk skade på vev i perifere organer (dvs. ethvert funksjonelt vev i kroppen, unntatt hjernen og ryggmargen), spesielt hjerte-eller nyreskade, og for behandling av ryggmargslesjonsindusert skade på ryggmargen.

Foretrukne estere er karboksylsyre- og aminosyreestere.

Steroidene og farmasøytisk akseptable salter og estere derav som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et medikament for beskyttelse mot iskemisk skade på perifere organer, er forbindelsene med formel (I):

hvor

R<1>og R2 er like eller forskjellige fra hverandre, og begge representerer et hydrogenatom, en alkylgruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer, en alkenylgruppe som har fra 2 til 6 karbonatomer, en alkynylgruppe som har fra 2 til 6 karbonatomer, en arylgruppe som har fra 6 til 10 karbonatomer, en formylgruppe, en alkylkarbonylgruppe som har fra 2 til 7 karbonatomer, en alkenylkarbonylgruppe som har fra 3 til 7 karbonatomer, en alkynylkarbonylgruppe som har fra 3 til 7 karbonatomer, en arylkarbonylgruppe som har fra 7 til 11 karbonatomer, en aralkylkarbonylgruppe som har fra 8 til 15 karbonatomer, en aralkenylkarbonylgruppe som har fra 9 til 15 karbonatomer, en rest av en aminosyre eller en heterosyklisk karbonylgruppe, som definert nedenfor;

én av Ra og R<b>representerer en gruppe med formel -R<c>, fortrinnsvis i p-konfigurasjon, og den andre representerer et hydrogenatom, eller Ra og R<b>sammen representerer en oksogruppe;

R<c>representerer en alkanoylgruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer, en

arylkarbonylgruppe hvor aryldelen er en aromatisk, karbosyklisk gruppe som har fra 6 til 10 ringkarbonatomer, en heterosyklisk karbonylgruppe som definert nedenfor, eller en gruppe med formel -OR<4>, hvor R4 representerer hvilken som helst av gruppene og atomene som er definert ovenfor forR<1>ogR<2>;

ringen A,

er en benzen- eller sykloheksanring; når ring A er en sykloheksanring er n lik 1; eller når ring A er en benzenring er n er 0; nevnte heterosykliske karbonylgruppe er en gruppe med formel R<3->CO, hvor R<3>representerer en heterosyklisk gruppe som har fra 3 til 7 ringatomer, hvor fra 1 til 3 er heteroatomer valgt fra nitrogenatomer, oksygenatomer og svovelatomer, og det/de resterende atom eller atomer som det finnes minst ett av, er karbonatomer; nevnte alkyl-, alkenyl- og alkynylgrupper og alkyl-, alkenyl- og alkynyldelene av nevnte alkylkarbonyl-, alkenylkarbonyl- og alkynylkarbonylgrupper er usubstituert eller har minst én av de følgende substituenter ip: substituenter ip: hydroksygrupper, merkaptogrupper, halogenatomer, aminogrupper, alkylaminogrupper som har fra 1 til 6 karbonatomer, dialkylaminogrupper hvor hver alkylgruppe har fra 1 til 6 karbonatomer, karbamoylgrupper, nitrogrupper, alkoksygrupper som har fra 1 til 6 karbonatomer, alkyltiogrupper som har fra 1 til 6 karbonatomer, karboksygrupper, rettkjedet eller forgrenet alkoksykarbonylgrupper med fra 2 til 7 karbonatomer og usubstituerte arylgrupper med fra 6 til 10 karbonatomer; nevnte arylgrupper, nevnte heterosykliske grupper og aryldelene av nevnte arylkarbonylgrupper og nevnte aralkylkarbonylgrupper er usubstituert eller har minst én av de følgende substituenter Jj: substituenter Jj: hvilken som helst av substituentene ip, og alkylgrupper som har fra 1 til 6 karbonatomer, hydroksyalkylgrupper som har fra 1 til 6 karbonatomer og haloalkylgrupper som har fra 1 til 6 karbonatomer.

Virkningen til forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er illustrert i de medfølgende tegninger, hvor: figur IA viser data vedrørende eksempel 22 presentert som gjennomsnittlig antall ± SEM av intakte nevroner pr. 400 pm lengde av CAl-region;

figur IB viser data fra eksempel 22 uttrykt som prosent intakte nevroner pr. 400 um lengde av CAl-region sammenlignet med simulert-opererte dyr satt som 100 %;

figur 1C viser data fra eksempel 22 presentert som absolutt prosent nervebeskyttelse når antall overlevende nevroner i iskemigruppen ble satt til null, og de i den simulert-opererte gruppen ble satt til 100 %;

figur 2 viser infarktstørrelse i eksempel 23 i vehikkelbehandlede kontroll hjerter og 7p-OH-EPIA-behandlede hjerter før, under og etter regional iskemi; 7P-OH-EPIA ble satt til perfusatet etter 25 minutter, regional iskemi ble introdusert etter 55 minutter, det iskemiske område ble reperfusert etter 85 minutter;

figur 3 viser koronar gjennomstrømning i eksempel 23 i vehikkelbehandlede kontroll hjerter og 7p-OH-EPIA-behandlede hjerter før, under og etter regional iskemi; 7p-OH-EPIA ble satt til perfusatet etter 25 minutter, regional iskemi ble introdusert etter 55 minutter, det iskemiske område ble reperfusert etter 85 minutter;

figur 4 viser hjertefrekvensen i eksempel 23 i vehikkelbehandlede kontroll hjerter og 7p-OH-EPIA-behandlede hjerter før, under og etter regional iskemi; 7p-OH-EPIA ble satt til perfusatet etter 25 minutter, regional iskemi ble introdusert etter 55 minutter, det iskemiske område ble reperfusert etter 85 minutter;

figur 5 viser det utviklede trykk i venstre ventrikkel i eksempel 23 i vehikkelbehandlede kontrollhjerter og 7p-OH-EPIA-behandlede hjerter før, under og etter regional iskemi; 7P-OH-EPIA ble satt til perfusatet etter 25 minutter, regional iskemi ble introdusert etter 55 minutter, det iskemiske område ble reperfusert etter 85 minutter; og

figur 6 viser det sluttdiastoliske trykk i eksempel 23 i vehikkelbehandlede kontrollhjerter og 7p-OH-EPIA-behandlede hjerter før, under og etter regional iskemi; 7p-OH-EPIA ble satt til perfusatet etter 25 minutter, regional iskemi ble introdusert etter 55 minutter, det iskemiske område ble reperfusert etter 85 minutter.

I de ovennevnte forbindelser med formel (I) kan gruppen -OR<2>i 7-stillingen være i a- eller p-konfigurasjon, men er fortrinnsvis i p-konfigurasjon.

Mer foretrukket i forbindelsene med formel (I):

R<1>og R<2>er like eller forskjellige fra hverandre, og begge representerer et hydrogenatom, en alkylgruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer, en eventuelt substituert fenylgruppe, en formylgruppe, en alkylkarbonylgruppe som har fra 2 til 5 karbonatomer, en arylkarbonylgruppe som har fra 7 til 11 karbonatomer, en aralkylkarbonylgruppe som har fra 8 til 15 karbonatomer, en rest av en aminosyre eller en heterosyklisk karbonylgruppe, som definert nedenfor; vi foretrekker spesielt at både R<1>og R2 representerer hydrogenatomer;

én av Ra og R<b>representerer en alkanoylgruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer eller en gruppe med formel -OR<4>, hvor R<4>representerer hvilke som helst av gruppene og atomene som er definert ovenfor for R<1>og R<2>, fortrinnsvis i p-konfigurasjon, og den andre representerer et hydrogenatom, eller Ra og Rb sammen representerer en oksogruppe; vi foretrekker spesielt at Ra og Rb sammen representerer en oksogruppe, eller at én av Ra og R<b>representerer et hydrogenatom og den andre representerer en

hydroksygruppe eller en alkanoylgruppe som har fra 1 til 4 karbonatomer, spesielt en hydroksygruppe eller en acetylgruppe;

nevnte heterosykliske karbonylgruppe er en gruppe med formel R<3->CO, hvor R<3>representerer en heterosyklisk gruppe som har fra 3 til 7 ringatomer, hvor fra 1 til 3 er heteroatomer valgt fra nitrogenatomer, oksygenatomer og svovelatomer, og det/de resterende atom eller atomer som det finnes minst ett av, er karbonatomer.

De mest foretrukne forbindelser med formel (I) er de forbindelser hvor:

R<1>og R2 representerer begge hydrogenatomer; og

Ra og Rb sammen representerer en oksogruppe, eller én av Ra ogR<b>representerer et hydrogenatom og den andre representerer en hydroksygruppe eller en alkanoylgruppe som har fra 1 til 4 karbonatomer, spesielt en hydroksygruppe eller en acetylgruppe;

og farmasøytisk akseptable estere derav.

I forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse hvor R<1>, R<2>, R4 eller substituent S er en alkylgruppe, kan dette være en rettkjedet eller forgrenet alkylgruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer, og eksempler omfatter metyl-, etyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, isobutyl-, sek.-butyl-, t-butyl-, pentyl-, 1-metylbutyl-, 2-metylbutyl-, 3-metylbutyl-, 1-etylpropyl-, 2-etylpropyl-, 1,1-dimetylpropyl-, heksyl-, 1-metylpentyl-, 2-metylpentyl-, 3-metylpentyl-, 4-metylpentyl-, 1-etylbutyl-, 2-etylbutyl-, 3-etylbutyl-, t-heksyl- og 1,1-dimetylpentylgruppene, hvor de gruppene som har fra 1 til 4 karbonatomer, er foretrukket, metyl- og etylgruppene er mest foretrukket.

Når R<1>, R<2>og R<4>representerer en alkenylgruppe, kan denne være en rettkjedet eller forgrenet alkenylgruppe som har fra 2 til 6 karbonatomer, og eksempler omfatter vinyl-, 1-propenyl-, allyl-, isopropenyl-, metallyl-, 1-, 2-, 3-butenyl-, isobutenyl-, 1-, 2-, 3-, 4-pentenyl- og 1-, 2-, 3-, 4-, 5-heksenylgruppene, hvor de alkenylgruppene som har fra 2 til 4 karbonatomer, er foretrukket, vinyl- og allylgruppene er mest foretrukket.

Hvor R<1>, R2 eller R4 representerer en alkynylgruppe, kan dette være en rettkjedet eller forgrenet alkynylgruppe som har fra 2 til 6 karbonatomer, og eksempler omfatter etynyl-, 1-, 2-propynyl-, 1-, 2-, 3-butynyl-, isobutynyl-, 1-, 2-, 3-, 4-pentynyl- og 1-, 2-, 3-, 4-, 5-heksynylgruppene, hvor de alkynylgruppene som har fra 2 til 4 karbonatomer er foretrukket.

Når R<1>, R<2>, R4 eller substituent ip representerer en arylgruppe, er dette en aromatisk, karbosyklisk gruppe som har fra 6 til 10 karbonatomer. Eksempler på slike grupper omfatter fenyl-, 1-naftyl-, 2-naftyl- og indenylgruppene, hvor fenylgruppen er foretrukket. Bortsett fra i tilfellet med substituent ip, kan disse gruppene være substituert eller usubstituert. Når gruppen er substituert, er antall substituenter begrenset bare av antall substituerbare stillinger, og i noen tilfeller når det er mulig, av steriske begrensninger. I tilfellet med fenylgruppene er følgelig maksimalt antall substituenter 5, i tilfellet med naftylgruppene er maksimalt antall substituenter 7 osv. Et foretrukket antall substituenter er imidlertid fra 1 til 3, og substituentene er som beskrevet nedenfor.

Når R<1>, R<2>eller R<4>representerer en alkylkarbonylgruppe, er dette en alkanoylgruppe som kan være en rettkjedet eller forgrenet gruppe som har fra 2 til 7 karbonatomer (dvs. fra 1 til 6 karbonatomer i alkyldelen), og eksempler omfatter acetyl-, propionyl-, butyryl-, isobutyryl-, valeryl-, isovaler-yl-, pivaloyl-, heksanoyl- og heptanoylgruppene, hvor de gruppene som har fra 2 til 5 karbonatomer, er foretrukket, acetyl- og propionylgruppene er mest foretrukket. Alkyldelen av denne gruppen kan være substituert eller usubstituert, og dersom den er substituert, er substituentene valgt fra substituentene ip. Eksempler på slike substituerte grupper omfatter alanyl-, (3-alanyl-, fenylalanyl-, asparaginyl-, cysteinyl-, glykoloyl-, glysyl-, metionyl-, ornityl-, glyseroyl-, tropoyl-, glutaminyl-, glutamyl-, homocysteinyl-, seryl-, homoseryl-, treonyl-, lakto-yl-, leucyl-, isoleucyl-, norleucyl-, lysyl-, valyl-, norvalyl- og sarkosylgruppene.

NårR<1>, R<2>eller R<4>representerer en alkenylkarbonylgruppe, kan dette være en rettkjedet eller forgrenet alkenylkarbonylgruppe som har fra 3 til 7 karbonatomer, og eksempler omfatter akryloyl-, metakryloyl-, krotonoyl-, isokrotonoyl-, 3-butenoyl-, pentenoyl- og heksenoylgrupper, hvor de alkenylkarbonylgrupper som har fra 3 til 5 karbonatomer, er foretrukket, akryloyl- og metakryloylgruppene er mest foretrukket.

Når R<1>, R<2>eller R<4>representerer en alkynylkarbonylgruppe, kan dette være en rettkjedet eller forgrenet alkynylkarbonylgruppe som har fra 3 til 7 karbonatomer, og eksempler omfatter propioloyl-, 3-butynylkarbonyl-, pentynylkarbonyl- og heksynylkarbonylgruppene, hvor de alkynylkarbonylgruppene som har fra 3 til 5 karbonatomer er foretrukket.

NårR<c>,R<1>,R<2>eller R<4>representerer en arylkarbonylgruppe, kan aryldelen av denne være hvilken som helst av arylgruppene som er definert og eksemplifisert ovenfor. Foretrukne arylkarbonylgrupper omfatter benzoyl-, o-, m- eller p-toluoyl-, o-, m- eller p-anisoyl-, o-, m- eller p-hydroksybenzoyl-, pikryl-, galloyl-, protokatechuoyl-, vanilloyl-, veratroyl-, antraniloyl-, 1-naftoyl- og 2-naftoylgruppene.

Når R<1>, R<2>eller R<4>representerer en aralkylkarbonyl- eller aralkenylkarbonylgruppe, kan arylgnjppen og den eventuelle alkyl- eller alkenylgruppe være hvilken som helst av de grupper som er definert og eksemplifisert ovenfor. Spesifikke eksempler på slike grupper omfatter fenylacetyl-, 3-fenylpropionyl-, benziloyl-, tyrosyl-, atropoyl-, hydratropyl- og cinnamoylgruppene.

NårR<c>, R<1>, R<2>eller R<4>representerer en heterosyklisk karbonylgruppe, er dette en gruppe med formel R<3->CO-, hvor R<3>representerer en heterosyklisk gruppe som har fra 3 til 7 ringatomer, hvor fra 1 til 3 er nitrogen-, oksygen- eller svovelatomer, og de resterende er karbonatomer. Minst ett av ringatomene bør være et karbonatom. Når det er 3 heteroatomer, er det foretrukket at minst ett er et nitrogenatom. Eksempler på slike grupper omfatter 2- og 3-furoyl-, 2- og 3-tenoyl-, 2-pyridinkarbonyl-, nikotinoyl-, isonikotinoyl-, prolyl-, piperidinkarbonyl-, piperazinkarbonyl- og morfolinokarbonylgruppene.

Når R<1>og/eller R<2>representerer en aminosyrerest, kan dette være hvilken som helst aminosyre hvor en hydroksygruppe er fjernet fra eller en karboksy (-COOH)-gruppe. Eksempler på slike aminosyrerester omfatter alanyl-, p-alanyl-, cystationyl-, cystyl-, glysyl-, histidyl-, homoseryl-, isoleucyl-, lantionyl-, leucyl-, lysyl-, metionyl-, norleucyl-, norvalyl-, ornityl-, prolyl-, sarkosyl-, seryl-, treonyl-, tyronyl-, tyrosyl-, valyl-, cysteinyl-, homocysteinyl-, tryptofyl-, a-aspartyl-, p-aspartyl-, aspartoyl-, asparaginyl-, a-glutamyl-, y-glutamyl- og glutaminylgruppene.

Når R<c>representerer en alkanoylgruppe, kan dette være en rettkjedet eller forgrenet gruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer, og eksempler omfatter formyl-, acetyl-, propionyl-, butyryl-, isobutyryl-, valeryl-, isovaleryl-, pivaloyl-, heksanoyl- og heptanoylgruppene, hvor de gruppene som har fra 2 til 5 karbonatomer er foretrukket, acetyl- og propionylgruppene er mer foretrukket, og acetylgruppen er mest foretrukket.

Når substituent ip eller substituent Jj er en alkylaminogruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer, kan alkyldelen være hvilken som helst av alkylgruppene som er definert og eksemplifisert ovenfor. Foretrukne eksempler på slike alkylaminogrupper omfatter metylamino-, etylamino-, propylamino-, isopropylamino-, butylamino-, isobutylamino-, sek.-butylamino-, t-butylamino-, pentylamino-, isopentylamino-, neopentylamino-, t-pentylamino-, heksylamino- og isoheksylaminogruppene, hvor de gruppene som har fra 1 til 4 karbonatomer er foretrukket, metylamino- og etylaminogruppene er mest foretrukket.

Når substituent ip eller substituent £ er en dialkylaminogruppe, har hver alkyldel fra 1 til 6 karbonatomer, og de to alkylgruppene kan være like eller forskjellige fra hverandre. Alkylgruppene kan være hvilken som helst av alkylgruppene som er definert og eksemplifisert ovenfor. Foretrukne eksempler på slike dialkylaminogrupper omfatter dimetylamino-, metyletylamino-, dietylamino-, metyl propylamino-, dipropylamino-, diisopropylamino-, etylbutylamino-, dibutylamino-, di-t-butylamino-, metylpentylamino-, dipentylamino-, diisopentylamino- og diheksylaminogruppene, hvor de gruppene som har fra 1 til 4 karbonatomer i hver alkylgruppe, er foretrukket, dimetylamino- og dietylamino-gruppene er mest foretrukket.

Når substituent ip eller substituent Jj er en alkoksygruppe, kan dette være en rettkjedet eller forgrenet alkoksygruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer, og eksempler omfatter metoksy-, etoksy-, propoksy-, isopropoksy-, butoksy-, isobutoksy-, sek.-butoksy-, t-butoksy-, pentyloksy-, isopentyloksy-, neopentyloksy-, t-pentyloksy-, heksyloksy- og isoheksyloksygruppene, hvor de gruppene som har fra 1 til 4 karbonatomer er foretrukket, metoksy- og etoksygruppene er mest foretrukket.

Når substituent ip eller substituent £ er en alkyltiogruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer, kan alkyldelen være hvilken som helst av alkylgruppene som er definert og eksemplifisert ovenfor. Foretrukne eksempler på slike alkyltiogrupper omfatter metyltio-, etyltio-, propyltio-, isopropyltio-, butyltio-, isobutyltio-, sek.-butyltio-, t-butyltio-, pentyltio-, isopentyltio-, neopentyltio-, t-pentyltio-, heksyltio- og isoheksyltiogruppene, hvor de gruppene som har fra 1 til 4 karbonatomer er foretrukket, metyltio- og etyltiogruppene er mest foretrukket.

Når substituent ip eller substituent Jj er en alkoksykarbonylgruppe, kan dette være en rettkjedet eller forgrenet alkoksykarbonylgruppe som har fra 2 til 7 karbonatomer, og eksempler omfatter metoksykarbonyl-, etoksykarbonyl-, propoksykarbonyl-, isopropoksykarbonyl-, butoksykarbonyl-, isobutoksykarbonyl-, sek.-butoksykarbonyl-, t-butoksykarbonyl-, pentyloksykarbonyl-, isopentyloksykarbonyl-, neopentyloksykarbonyl-, t-pentyloksykarbonyl-, heksyloksykarbonyl- og isoheksyloksykarbonylgruppene, hvor de gruppene som har fra 1 til 4 karbonatomer er foretrukket, metoksykarbonyl- og etoksykarbonylgruppene er mest foretrukket.

Når substituent Jj er en hydroksyalkylgruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer, kan alkyldelen være hvilken som helst av alkylgruppene som er definert og eksemplifisert ovenfor. Foretrukne eksempler på slike hydroksyalkylgrupper omfatter hydroksymetyl-, 1-og 2-hydroksyetyl-, 1-, 2- og 3-hydroksypropyl-, 1,2-dihydroksyetyl-, 1,2,4-trihydroksypropyl-, 4-hydroksybutyl-, 5-hydroksypentyl- og 6-hydroksyheksylgruppene.

Når substituent £ er en haloalkylgruppe som har fra 1 til 6, fortrinnsvis fra 1 til 4, karbonatomer, kan alkyldelen være som definert og eksemplifisert ovenfor, og halogenatomet er fortrinnsvis klor, fluor, brom eller jod. Eksempler på slike grupper omfatter f luormetyl-, klormetyl-, brom metyl-, jodmetyl-, diklormetyl-, difluormetyl-, triklormetyl-, trifluormetyl-, 2,2,2-trikloretyl-, 2-kloretyl-, 2-fluoretyl-, 2-brometyl-, 2-jodetyl-, 2,2-dibrometyl-, 2,2,2-tribrometyl-, 3-fluorpropyl-, 3-klorpropyl-, 4-brombutyl-, 4-fluorbutyl-, 5-fluorpentyl- og 6-fluorheksylgruppene.

Det er underforstått at når forbindelsen inneholder en gruppe med formel -OR hvor R er hvilken som helst av gruppene og atomene som er definert ovenfor i forbindelse med R<1>osv., er det sannsynlig at de aktive forbindelser er forbindelsen som inneholder den frie hydroksygruppe. I samsvar med dette kan enhver gruppe som kan omdannes in vivo til en hydroksygruppe, anvendes i stedet for hydroksygruppen.

Spesifikke eksempler på forbindelser som kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter:

Blant de forbindelsene som er oppgitt ovenfor, er 7p-isomerene foretrukket.

Når forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder en hydroksygruppe, kan de omdannes til korresponderende salter eller estere, noe som er velkjent innen området, og det finnes ingen bestemt begrensning for egenskapene til saltet eller esteren som dannes. Når disse saltene eller estrene skal administreres til en pasient, bør de være farmasøytisk akseptable. Dersom forbindelsen imidlertid er ment for et annet formål, f.eks. som et mellomprodukt i en annen syntese, er ikke denne begrensningen nødvendig. Salter og estere kan velges blant de som er velkjent på området for denne type forbindelse. Foretrukne estere er karboksylsyreesterne og aminosyreesterne, som f.eks. alanin-, p-alanin-, cystationin-, cystin-, glysin-, histidin-, homoserin-, isoleucin-, lantionin-, leucin-, lysin-, metionin-, norleucin-, norvalin-, ornitin-, prolin-, sarkosin-, serin-, treonin-, tyronin-, tyrosin-, valin-, cystein-, homocystein-, tryptofan-, asparaginsyre-, asparagin-, glutaminsyre- og glutaminesterne.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved en rekke fremgangsmåter, som sådanne velkjente, med utgangspunkt i de opprinnelige steroider. De kan f.eks. fremstilles ved metodene som er beskrevet i litteraturen som det er henvist til ovenfor, noe som vil gi en blanding av 7p- og tilsvarende 7a-forbindelser, som deretter, om ønskelig, kan separeres ved hjelp av velkjente metoder. Under noen omstendigheter er det imidlertid ønskelig eller hensiktsmessig å anvende blandingen av 7a- og 7p-isomerer uten å separere dem.

Som et eksempel kan 7a-hydroksy-EPIA og 7p-hydroksy-EPIA oppnås fra DHEA ved allylisk oksidasjon etter beskyttelse av 3p-hydroksygruppen og 17-ketongruppen ved bruk av vanlige metoder. Produktet reduseres deretter med en løselig metallforbindelse-katalysator (slik som natriumhydrid) og 3P-hydroksy- og 17-ketongruppene avbeskyttes. 7a-hydroksy- og 7p-hydroksyepimerene kan deretter separeres på vanlig måte, f.eks. ved kolonnekromatografi, og 7a-hydroksy-EPIA og 7p-hydroksy-EPIA kan utkrystalliseres til renhet.

En alternativ syntesemetode er vist i det følgende reaksjonsskjema:

I de ovennevnte formler representerer TBDMSO t-butyldimetylsilyloksy og Ac representerer acetyl. Disse forkortelser har de samme betydninger når de brukes nedenfor.

I det første trinn i reaksjonsskjemaet ovenfor beskyttes forbindelsen med formel (III), østron, av en t-butyldimetylsilyloksygruppe på vanlig måte, hvilket gir den beskyttede forbindelse med formel (IV). Denne omsettes deretter med etylenglykol i nærvær av en syrekatalysator (så som p-toluensulfonsyre) for å beskytte ketogruppen i 17-stilling, hvilket gir forbindelsen med formel (V). Deretter kan en hydroksygruppe innføres i 6-stilling som illustrert i eksempel 3 nedenfor, hvilket gir forbindelsen med formel (VI), som deretter dehydreres, hvilket gir forbindelsen med formel (VII). Denne epoksideres, hvilket gir forbindelsen med formel (VIII), som deretter reduseres til forbindelsen med formel (IX), med en 7a-hydroksygruppe. Beskyttelsesgruppen t-butyldimetylsilyl fjernes, hvilket gir forbindelsen med formel (X), og denne oppvarmes med en katalytisk mengde av en syre, hvilket gir 7a-hydroksy-østron (XI) som kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse. Denne kan deretter oksideres, f.eks. ved bruk av kromsyre/svovelsyre, hvilket gir 7-keto-østron (XII), som deretter omsettes med eddiksyreanhydrid, hvilket gir forbindelsen med formel (XIII). Denne forbindelse hydrogeneres, f.eks. ved bruk av hydrogen i nærvær av en palladiumkatalysator, hvilket gir forbindelsen med formel (XIV), og til slutt fjernes acetyl-gruppene, hvilket gir 7a-hydroksy-østron (XV), en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse. Om ønskelig, kan denne reduseres, hvilket gir 7p-hydroksy-østradiol (XVI) som også er en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse. Den tilsvarende 7a-forbindelse kan fremstilles på en analog måte fra 7a-hydroksy-østron (XI).

Andre 7a- og 7p-hydroksyforbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles på en lignende måte, 7p-hydroksy-DHEA kan f.eks. fremstilles som illustrert i det følgende reaksjonsskjema:

I dette reaksjonsskjema acetyleres DHEA (XVII), hvilket gir det tilsvarende acetat med formel (XVIII), som deretter omsettes med etylenglykol, hvilket gir ketalet med formel (XIX). Deretter oksideres ketalet (XIX) som beskrevet i eksempel 16, hvilket gir den tilsvarende 7-ketoforbindelse (XX) som deretter deacetyleres, hvilket gir forbindelsen med formel (XXI). Denne reduseres, hvilket gir 7-hydroksy-17-ketal-EPIA med formel (XXII) som deretter behandles med en syre for å fjerne ketalgruppen, hvilket gir 7-hydroksy-EPIA som til slutt separeres i 70- og 7a-isomerene ved kromatografi, hvilket gir 7a-hydroksy-EPIA (XXIV) og 7p-hydroksy-EPIA (XXV).

Hvert av trinnene i de ovennevnte reaksjonsskjemaer er velkjent hver for seg og kan utføres ved bruk av kjente løsningsmidler og katalysatorer (dersom det er hensiktsmessig) og under kjente reaksjonsbetingelser, f.eks. tids- og temperaturbetingelser.

Forbindelsene som er definert ovenfor, har en nervebeskyttende effekt. I henhold til foreliggende oppfinnelse har de funnet at de også har en hjertebeskyttende effekt og derfor kan anvendes for å forebygge eller behandle hjertesykdommer som oppstår etter iskemisk skade, f.eks. myokardinfarkt. De har også evnen til å beskytte mot iskemisk nyreskade, f.eks. glomerulonefritt eller akutt nyreskade. På grunnlag av den virkning de fremviser, kan man generelt forutsi at de vil ha en lignende beskyttende effekt på vev i andre perifere organer.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres til pasienten dersom det er mistanke om at det kan være fare for en iskemisk hendelse, spesielt et myokardinfarkt eller iskemisk nyreskade. Slik profylaktisk anvendelse kan være ytterst nyttig. Det er imidlertid også vist at forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse har nyttig virkning også dersom de administreres etter en iskemisk hendelse, men det er underforstått at det er foretrukket å administrere forbindelsene så snart som mulig for å unngå så mye myokard- eller nyrevevskade som mulig. Under noen omstendigheter kan det være ønskelig å administrere gjentatte doser, spesielt ved vedvarende fare for en iskemisk hendelse hos pasienten.

Egnede metoder for administrering er generelt ved injeksjon, i den hensikt å oppnå det ønskede resultat så raskt som mulig. Intravenøs injeksjon er følgelig spesielt foretrukket.

Dosen av forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse varierer avhengig av mange faktorer, inkludert pasientens alder, kroppsvekt og generelle helsetilstand, så vel som administreringsform, -hyppighet og -måte. Vanligvis er imidlertid en dose fra 0,01 til 50 mg/kg kroppsvekt anbefalt, en dose fra 0,05 til 20 mg/kg kroppsvekt er mer foretrukket. Dette kan administreres i en enkelt dose eller i atskilte doser.

Oppfinnelsen er ytterligere illustrert i de følgende eksempler hvor eksemplene 1 til 20 illustrerer fremstillingen av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, eksemplene 21 og 22 er for referanse og eksempel 23 illustrerer deres aktivitet. I eksemplene 1 til 20 viser romertallene til formlene i reaksjonsskjemaene som er vist ovenfor.

Eksempel 1

3- t- butvldimetvlsilvl- østron ( IV)

4,25 g t-butyldimetylsilylklorid (28,2 mmol, 3 ekv.) ble satt til en løsning av 50 ml dimetylformamid (DMF) som inneholdt 2,54 g østron (III) (9,41 mmol, 1 ekv.) og 3,84 g imidazol (56,5 mmol, 6 ekv.) i en trehalset kolbe på 100 ml. Blandingen ble deretter hensatt over natten ved romtemperatur under nitrogenatmosfære. En 10 % vekt/volum vandig kaliumkarbonatløsning ble satt til reaksjonsmediet som deretter ble ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble vasket med vann og deretter tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampettil tørrhet. Det ble oppnådd 3,76 g 3-t-butyldimetylsilyl-østron (IV) (9,41 mmol, 100 %).

Eksempel 2

17- ketal- 3- t- butvldimetvlsilvl- østron ( V)

En løsning av 60 ml toluen som inneholdt 3 g 3-t-butyldimetylsilyl-østron (IV)

(7,50 mmol), 3 ml etylenglykol og en katalytisk mengde p-toluensulfonsyre, ble oppvarmet ved tilbakeløp med dampdestillering ved bruk av et Dean-Stark-apparat i 24 timer. Reaksjonsmediet ble deretter helt i 50 ml av en 10 % vekt/volum vandig kaliumkarbonatløsning. Den organiske fase ble dekantert fra. Den vandige fase ble ekstrahert med etylacetat. De organiske fasene ble samlet og inndampet til tørrhet. Det ble oppnådd 3,16 g 17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-østron (V) (7,12 mmol, 95 %).

Eksempel 3

6a- hvdroksv- 17- ketal- 3- t- butvldimetvlsilvl- østron ( VI)

I en 1-liters trehalset kolbe ble en løsning av 100 ml vannfritt tetrahydrofuran (THF) avgasset ved hjelp av nitrogenspyling og avkjølt til -80 °C. Diisopropylamin (20 ml, 143,30 mmol) ble satt til reaksjonsmediet. En 15 % vekt/volum butyllitiumløsning i sykloheksan (89,9 ml, 143,30 mmol) ble satt dråpevis til reaksjonsmediet. Etter 10 minutter ble en løsning av 100 ml vannfritt THF som på forhånd var avgasset og som inneholdt 17,5 g kalium-t-butyrat, satt dråpevis til reaksjonsmediet. Etter ytterligere 15 minutter ble en løsning av 50 ml vannfritt THF som på forhånd var avgasset og som inneholdt 12,27 g 17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-østron (V) (27,63 mmol), satt dråpevis til reaksjonsmediet. Reaksjonsblandingen ble hensatt i 2 timer ved -80 °C. Deretter ble 48 ml trimetylborat (429,90 mmol) ved -80 °C satt dråpevis til reaksjonsmediet som ble hensatt ved 0 °C i 1 time. 100 ml 30 % volum/volum vandig hydrogenperoksidløsning ble deretter tilsatt. Reaksjonsblandingen ble deretter hensatt i 1 time ved romtemperatur, og deretter ble 500 ml vann tilsatt. Reaksjonsmediet ble ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble vasket med en 10 % vekt/volum vandig natriumtiosulfatløsning, vasket med vann, tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Residuet ble renset ved flashkromatografi (Si02/etylacetat: sykloheksan 1/9, deretter 2/8). Det ble oppnådd 6,35 g 6a-hydroksy-17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-østron (VI) (13,81 mmol, 50 %).

Eksempel 4

17- ketal- 3- t- butvldimetvlsilvl- 6- dehvdro- østron ( VID

En løsning av 40 ml toluen som inneholdt 1,54 g 6a-hydroksy-17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-østron (VI) (3,35 mmol), 4 ml etylenglykol og en katalytisk mengde p-toluensulfonsyre ble oppvarmet ved tilbakeløp under dampdestillering ved bruk av et Dean-Stark-apparat i 24 timer. Reaksjonsmediet ble deretter helt i 50 ml av 10 % vekt/volum vandig kaliumkarbonatløsning. Den organiske fase ble dekantert fra. Den vandige fase ble deretter ekstrahert med etylacetat. De organiske fasene ble samlet og inndampet til tørrhet. Det ble oppnådd 1,48 g 17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-6-dehydro-østron (VII) (3,35 mmol, 100 %).

Eksempel 5

17- ketal- 3- t- butvldimetvlsilvl- 6a, 7a- epoksv- østron ( VIII)

En løsning av 20 ml diklormetan som inneholdt 1,16 g m-klorbenzosyre (55 %, 3,69 mmol, 1,1 ekv.) ble ved 0 °C satt dråpevis til en løsning av 20 ml diklormetan som inneholdt 1,85 g 17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-6-dehydro-østron (VII) (3,36 mmol, 1 ekv.). Reaksjonsmediet ble etter 2 timer helt i en 10 % vekt/volum vandig natriumhydrogenkarbonatløsning og deretter ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og deretter inndampet til tørrhet. Residuet ble renset ved flashkromatografi (Si02/etylacetat:sykloheksan 1/9). Det ble oppnådd 769 mg av 17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-6a,7a-epoksy-østron (VIII) (1,68 mmol, 50 %).

Eksempel 6

7a- hvdroksv- 17- ketal- 3- t- butvldimetvlsilvl- østron ( IX)

200 mg litiumaluminiumhydrid (5,40 mmol, 2 ekv.) ble satt til en løsning av 50 ml vannfritt THF som inneholdt 1,13 g 17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-6a,7a-epoksy-østron (VIII) (2,60 mmol, 1 ekv.). Reaksjonsmediet ble oppvarmet ved tilbakeløp i 2 timer og deretter avkjølt, helt i is, filtrert gjennom et Celite (varemerke) -filterhjelpestoff og ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og deretter inndampet til tørrhet. Residuet ble renset ved flashkromatografi (SiC>2/etylacetat:sykloheksan 1/9). Det ble oppnådd 837 mg 7<x-hydroksy-17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-østron (IX) (1,82 mmol, 70 %).

Eksempel 7

7a- hydroksv- 17- ketal- østron ( X)

En løsning av 20 ml THF som inneholdt 1,5 g tetrabutylammoniumklorid (4,78 mmol, 1,10 ekv.), ble ved romtemperatur satt til en løsning av 50 ml THF som inneholdt 2 g 7a-hydroksy-17-ketal-3-t-butyldimetylsilyl-østron (IX) (4,35 mmol, 1 ekv.). Reaksjonsmediet ble helt i 70 ml av en 10 % vekt/volum vandig natriumkarbonatløsning. Reaksjonsmediet ble ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og deretter inndampet til tørrhet. Det ble oppnådd 1,39 g 7a-hydroksy-17-ketal-østron (X) (4,22 mmol, 97 %).

Eksempel 8

7a- hvdroksv- østron ( XI)

En løsning av 50 ml aceton som inneholdt 1 ml vann, 1,0 g 7a-hydroksy-17-ketal-østron (X) (3,03 mmol) og en katalytisk mengde p-toluensulfonsyre ble oppvarmet ved tilbakeløp i 2 timer. Reaksjonsmediet ble deretter helt i 70 ml av en 10 % vekt/volum vandig natriumkarbonatløsning. Reaksjonsmediet ble ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og deretter inndampet til tørrhet. Det ble oppnådd

814 mg 7a-hydroksy-østron (XI) (2,85 mmol, 94 %) som ble omkrystallisert fra etylacetat.

Eksempel 9

7- keto- østron fXID

En 8 N løsning av kromsyre i svovelsyre ble satt dråpevis til en løsning av 40 ml aceton som inneholdt 300 mg 7a-hydroksy-østron (XI) (1,05 mmol), som var avkjølt til 0 °C, inntil den gule fargen vedvarte. Reaksjonsmediet ble helt i 50 ml vann og deretter ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble vasket med en vandig natriumkarbonatløsning og deretter tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Residuet ble renset ved flashkromatografi (Si02/etylacetat:sykloheksan 3/7). Det ble oppnådd 200 mg 7-keto-østron (XII) (0,70 mmol, 67 %).

Eksempel 10

7- hvdroksv- 6- dehvdro- østron- 3, 7- diacetat ( XIII)

En løsning av 10 ml eddiksyreanhydrid som inneholdt 5 g vannfritt natriumacetat og 1 g 7-keto-østron (XII) (3,52 mmol), ble oppvarmet ved tilbakeløp i 1 time. Reaksjonsmediet ble deretter avkjølt og så helt i vann og ekstrahert med dietyleter. Den organiske fase ble vasket med en vandig natriumkarbonatløsning og deretter tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Residuet ble renset med flashkromatografi (Si02/etylacetat:sykloheksan 1/9). Det ble oppnådd 1,25 g 7-hydroksy-6-dehydro-østron-3,7-diacetat (XIII) (3,41 mmol, 97 %).

Eksempel 11

7- hvdroksv- østron- 3, 7- diacetat ( XIV)

En løsning av 80 ml iseddik som inneholdt 1,0 g 7-hydroksy-6-dehydro-østron-3,7-diacetat (XIII) (2,72 mmol), ble hydrogenert med 200 mg katalysator av 10 % palladium på trekull under et hydrogentrykk på 1 bar. Reaksjonsmediet ble filtrert etter 2 timer og inndampet til tørrhet. Residuet ble renset ved flashkromatografi (SiC>2/etylacetat:sykloheksan 1/9). Det ble oppnådd 855 mg 7-hydroksy-østron-3,7-diacetat (XIV) (2,31 mmol, 85 %).

Eksempel 12

7B- hvdroksv- østron ( XV)

En løsning av 50 ml metanol som inneholdt 1 % kaliumhydroksid og 1 g 7-hydroksy-østron-3,7-diacetat (XIV) (2,70 mmol), ble oppvarmet ved tilbakeløp i 2 timer. Reaksjonsmediet ble deretter avkjølt, nøytralisert og så ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og deretter inndampet til tørrhet. Det ble oppnådd 695 mg 7p-hydroksyøstron (XV) (2,43 mmol, 90 %) som ble omkrystallisert fra metanol.

Eksempel 13

7B- hvdroksv- østradiol ( XVI)

264 mg natriumborhydrid (7,00 mmol, 2 ekv.) ble satt til en løsning av 50 ml metanol som inneholdt 1,0 g 7p-hydroksy-østron (XV) (3,50 mmol). Reaksjonsmediet ble helt i vann og ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og deretter inndampet til tørrhet. Det ble oppnådd 917 mg 7p-hydroksy-østradiol (XVI) (3,18 mmol, 91 %) som ble omkrystallisert fra metanol.

Eksempel 14

DHEA- 3- acetat ( XVIII)

En løsning av 50 ml pyridin og 50 ml eddiksyreanhydrid som inneholdt 10 g DHEA (XVII) (34,72 mmol), ble oppvarmet ved tilbakeløp i 4 timer. Reaksjonsmediet ble avkjølt, helt i vann og ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Det ble oppnådd 11,0 g DHEA-3-acetat (XVIII) (33,33 mmol, 96 %) som ble omkrystallisert fra etanol.

Eksempel 15

17- ketal- DHEA- 3- acetat ( XIX)

En løsning av 100 ml toluen som inneholdt 5 g DHEA-3-acetat (XVIII) (15,15 mmol), 5 ml etylenglykol og en katalytisk mengde p-toluensulfonsyre, ble oppvarmet ved tilbakeløp ved dampdestillering ved bruk av et Dean-Stark-apparat i 24 timer. Reaksjonsmediet ble helt i 100 ml av en 10 % vekt/volum vandig kaliumkarbonatløsning. Den organiske fase ble dekantert fra. Den vandige fase ble ekstrahert med etylacetat. De organiske faser ble samlet og inndampet til tørrhet. Det ble oppnådd 5,10 g 17-ketal-3-DHEA-acetat (XIX) (13,64 mmol, 90 %) som ble omkrystallisert fra etanol.

Eksempel 16

7- keto- 17- ketal- DHEA- 3- acetat ( XX )

En løsning av 70 ml pyridin som inneholdt 5 g 17-ketal-DHEA-3-acetat (XIX)

(13,37 mmol) og en katalytisk mengde Bengal-rosa, ble bestrålt ved bruk av en kvikksølv-lampe med middels trykk og med oksygeninnblåsing. En katalytisk mengde kobberacetat ble satt til reaksjonsmediet etter 24 timer. Etter 24 timer ble reaksjonsmediet inndampet til tørrhet. Residuet ble renset ved flashkromatografi (Si02/etylacetat:sykloheksan 3/7). Det ble oppnådd 3,11 g 7-keto-17-ketal-DHEA-3-acetat (XX) (8,02 mmol, 60 %).

Eksempel 17

7- keto- 17- ketal- DHEA fXXD

En løsning av 50 ml metanol som inneholdt 1 % kaliumhydroksid og 1 g 7-keto-17-ketal-DHEA-3-acetat (XX) (2,58 mmol), ble oppvarmet ved tilbakeløp i 2 timer. Reaksjonsmediet ble deretter avkjølt, nøytralisert og så ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og deretter inndampet til tørrhet. Det ble oppnådd 802 mg 7-keto-17-ketal-DHEA (XXI) (2,32 mmol, 90 %) som ble omkrystallisert fra metanol.

Eksempel 18

7- hvdroksv- 17- ketal- EPIA fXXID

10 g 7-keto-17-ketal-DHEA (XXI) (28,90 mmol) ble ved -33 °C satt til en løsning av flytende ammoniakk som inneholdt 2,65 g natrium. Etter 4 timer ble ammoniumklorid tilsatt, inntil den blå fargen forsvant. Deretter ble 2,65 g natrium tilsatt. Etter 4 timer ble ytterligere ammoniumklorid tilsatt inntil den blå fargen forsvant. Vann ble tilsatt, og ammoniakken fikk fordampe. Reaksjonsmediet ble ekstrahert med etylacetat. Den organiske fasen ble tørket over vannfritt natriumsulfat og deretter inndampet til tørrhet. Det ble oppnådd 6,07 g 7-hydroksy-17-ketal-EPIA (XXII) (17,34 mmol, 60 %).

Eksempel 19

7- hvdroksv- EPIA ( XXIII)

En løsning av 100 ml aceton som inneholdt 5 ml vann, 10 g 7-hydroksy-17-ketal-EPIA (XXII) (28,57 mmol, 50 %) og en katalytisk mengde paratoluensulfonsyre, ble oppvarmet ved tilbakeløp i 4 timer. Reaksjonsmediet ble avkjølt, helt i 100 ml av en 10 % vekt/volum vandig natriumkarbonatløsning og deretter ekstrahert med etylacetat. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og deretter inndampet til tørrhet. Resi duet ble renset ved flashkromatografi (Si02/etylacetat). Det ble oppnådd 5,24 g 7-hydroksy-EPIA (XXIII) (17,14 mmol, 60 %).

Eksempel 20

7a- hvdroksv- EPIA fXXIVl & 7B- hvdroksv- EPIA fXXVl

7-hydroksy-EPIA (XXIII) (5 g) som inneholdt 7a- og 7P-epimerer i et forhold på 65/35, ble renset med flashkromatografi (Al203/CHCI3). 7p-hydroksy-EPIA (XXV) (2,5 g) ble oppnådd først, før 7a-hydroksy-EPIA (XXIV) (1,34 g). 7p-hydroksy-EPIA (XXV) og 7a-hydroksy-EPIA (XXIV) ble omkrystallisert fra etylacetat.

Eksempel 21

Protokoll for undersøkelse av hypoksisk nerveskade

Organotypiske kulturer av hippocampus-skiver ble fremstilt ved bruk av den grunnleggende metoden til Pringle et al. (1996, 1997) modifisert som følger: Wistar-rotteunger (8-11 dager gamle) ble halshugget, og hippocampus ble raskt dissekert i iskald Geys balansert saltløsning tilsatt 4,5 mg/ml glukose. Skiver ble atskilt og platet på Millicell CM kulturinnsatser (4 pr. brønn) og ble oppbevart ved 37 °C/5 % C02i 14 dager. Vedlikeholdsmediet besto av 25 % varmeinaktivert hesteserum, 25 % Hanks balanserte saltløsning (HBSS) og 50 % minimum essensielt medium tilsatt Earles salter (MEM) supplert med 1 mM glutamin og 4,5 mg/ml glukose. Mediet ble byttet hver 3.-4. dag.

Eksperimentell hypoksi ble fremkalt som beskrevet tidligere (Pringle et al., 1996; 1997). I korte trekk ble kulturene overført til serumfritt medium (SFM - 75 % MEM, 25 % HBSS supplert med 1 mM glutamin og 4,5 mg/ml glukose) som inneholdt 5 ug/ml av det fluorescerende eksklusjonsfargestoff propidiumjodid (PI). Kulturene fikk nå likevekt i SFM i 60 minutter før avbilding. PI-fluorescens ble detektert ved bruk av et Leica omvendt mikroskop utstyrt med et rhodaminfiltersett. Alle kulturer hvor PI-fluorescens ble detektert på dette trinnet, ble ekskludert fra videre undersøkelse. Hypoksi ble indusert ved å overføre kulturer til SFM (+PI) som var mettet med 95 % N2/5 % C02. Kulturplatene (uten deksel) ble deretter forseglet i et lufttett kammer hvor atmosfæren var mettet med 95 % N2/5 % C02ved kontinuerlig gassgjennomblåsing på 10 l/min i 10 minutter før forsegling og ble plassert i inkubatoren i 170 minutter (total tid med hypoksi var derfor 180 minutter). Etter den hypoksiske periode ble kulturene returnert til SFM med normalt oksygeninnhold som inneholdt PI og ble igjen plassert i inkubatoren i 24 timer.

Nerveskade ble bestemt som beskrevet tidligere (Pringle et al., 1996; 1997) ved bruk av enten NIH Image 1,60 kjørt på en datamaskin av type Apple Ilsi eller OpenLab 2,1 (Improvision) kjørt på en Macintosh G4/400. Bildene ble tatt med et monokromkamera og lagret på optisk disk for maskinuavhengig analyse. Lystransmisjonsbilder ble tatt før tilsetning av legemidler, og PI-fluorescensbilder ble registrert etter den 24-timers restitu-sjonsperiode etter hypoksi. Arealet av CAl-cellelaget ble bestemt fra transmisjonsbildet. Arealet av PI-fluorescens i CA1 ble målt ved bruk av "density slice"-funksjonen i NIH Image eller OpenLab, og nerveskader uttrykt som prosent av CA1 hvor PI-fluorescens ble detektert over bakgrunn.

Steroidforbindelser ble fremstilt ved å lage en 1 mg/ml startløsning i etanol og videre fortynne med SFM. Forbindelser ble satt til kulturene i 45 minutter før hypoksi, under den hypoksiske perioden og under restitusjonsperioden etter hypoksi. Kontrolleksperimenter besto av kulturer som var behandlet med bare vehikkel.

Resultater

Eksperiment 1:

Et innledende eksperiment ble utført for å bestemme hvorvidt 7aOH-EPIA og 7BOH-EPIA var nervebeskyttende ved en så høy konsentrasjon som 100 nM. Hypoksi dannet en lesjon i 25,5±6,4 % av CA1. Denne skaden ble signifikant redusert både av 7aOH-EPIA og 7POH-EPIA når de var til stede før, under og etter hypoksi (se tabell I).

Eksperiment 2:

Etter at vi hadde fastslått at både a- og p-isomerene av 70H-EPIA var nervebeskyttende, bestemte vi konsentrasjonsavhengigheten av denne effekten. Kontrollhypoksi førte til nerveskade i 31,9±4,9 % av CA1. 7pOH-EPIA var signifikant nervebeskyttende ved 10 nM og 100 nM, men virkningen forsvant dersom konsentrasjonen ble redusert til 1 nM som vist i tabell II nedenfor.

Eksperiment 3:

Etter at vi hadde observert den nervebeskyttende virkning til 7BOH-EPIA, undersøkte vi deretter hvorvidt 7POH-DHEA var nervebeskyttende. Kulturer ble inkubert med enten 100 nM 7POH-DHEA eller vehikkel, før, under og etter hypoksi. Hypoksi fremkalte skade i 29,0±6,2 % CA1. I kulturene som var behandlet med 7POH-DHEA, ble det observert en stor, svært signifikant reduksjon av nerveskade, som vist i tabell III nedenfor.

Eksempel 22

Global, cerebral iskemi hos rotter ( okklusjon av 4 blodkar)

Cerebral iskemi ble indusert ved okklusjon av fire blodkar (4VO) hos Wistar hannrotter (250-280 g). Begge vertebrale arterier ble okkludert ved elektrokauterisering i pentobarbitalanestesi (60 mg/kg i.p.). Dyrene fikk restitueres i 24 timer med fri tilgang til vann, men ikke for. Neste dag ble karotidarteriene blottlagt under anestesi med 2 % halotan i 30 % oksygen/70 % dinitrogenoksid og ble okkludert i 10 minutter ved bruk av mikro-vaskulære klemmer. Deretter ble begge klemmer fjernet, og begge arterier ble undersøkt med hensyn til umiddelbar reperfusjon. Under operasjonen og de neste 3 timer ble normal-temperatur opprettholdt hos dyrene (37,5±0,5 °C) ved bruk av et termostatstyrt varme-teppe forbundet med et rektaltermometer. Neste dag ble som kontroll begge vertebrale arterier hos simulert-opererte dyr kauterisert under pentobarbitalanestesi, og begge felles karotidarterier ble blottlagt, men ikke ligert, under anestesi med 2 % halotan i 30 % oksygen/70 % dinitrogenoksid. Såret ble behandlet med lidokaingel og deretter sydd igjen. Dyrene ble holdt under en varmelampe ved omgivelsestemperatur på 30 °C inntil de gjenvant bevisstheten.

Syv grupper dyr ble undersøkt:

1. (n=8) steroidforbindelse, 7P-OH-EPIA (0,1 mg/kg, i.v. via halevene, tre injeksjoner: 15 minutter før induksjon av iskemi, under iskemi og 5 minutter etter reperfusjon); 2. (n=8): steroidforbindelse, 7P-OH-EPIA (0,3 mg/kg, i.v. tre injeksjoner som beskrevet il.); 3. (n=8) steroidforbindelse, 7P-OH-EPIA (1 mg/kg, i.v., tre injeksjoner som beskrevet il.); 4. (n=8) NBQX (dinatriumsalt da det er mer vannløselig) som referanse-substans og positiv kontroll (TOCRIS, Tyskland, 30 mg/kg, i.p., tre injeksjoner som beskrevet il.); 5. (n=8) fikk vehikkel (0,9 % NaCI som inneholdt 100 pl etanol) tre injeksjoner som beskrevet il.); 6. (n=8) bare iskemi;

7. (n=8) simulert-opererte kontroller.

NBQX var 2,3-dihydroksy-6-nitro-7-sulfamoylbenzo(F)kinoksalin som er kjent for å ha nervebeskyttende virkning [Gill R., Nordholm L, Lodge D.: The neuroprotective action of 2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(F)quinoxaline (NBQX) in a ratfocal ischaemia model. Brain Res. 580, 35-43, 1992].

7B-OH-EPIA var 7B-hydroksyepiandrosteron, en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse.

Substansene ble oppløst i 100 pl etanol og til slutt fortynnet med 0,9 % NaCI.

Etter en overlevelsestid på 7 dager etter iskemi ble perfusjon gjennom hjertet til alle dyr fiksert med 4 % paraformaldehyd. Hjernene ble deretter forsiktig fjernet og fiksert i samme fikseringsmiddel i 2 timer. Etter kryobeskyttelse i 30 % sukrose ble hjernene raskt nedfrosset i isopentan og lagret ved -80 °C. 20 mikrometer tykke kryostat-tverrsnitt omfattende hippocampus, ble Nissl-farget med toluidin-blått eller Neuro Trace fluorescens.

Dataanalyse:

Alvorlighetsgraden av nerveskade i CAl-regionen i hippocampus etter iskemi ble beregnet ut fra antall overlevende nevroner ved bruk av Nissl-farging. Det gjennomsnittlige antall morfologisk intakte nevroner pr. 400 pm lengde ble beregnet for CAl-regionen for hver gruppe. Celletelling ble utført i 3-5 serietverrsnitt pr. dyr og 6 ganger 400 pm CAl-areal pr. tverrsnitt ved bruk av et lysmikroskop utstyrt med et 20 x objektiv. Tallmaterialet ble statistisk analysert ved paret Students t-test. Tallmateriale ble presentert som gjennomsnitt ± SEM.

Resultater og diskusjon

Morfologisk intakte CAl-nevroner fra hippocampus blekarakterisert vedNissl-farging (toluidin-blått og Neuro Trace) etterfølgende kriterier: tydelig form av en nerveperikarya, stor kjerne med et positivt merket kjernelegeme, en liten cytoplasmasone rundt kjernen med positiv Nissl-farging, noe som indikerer at det kornede, endoplasmiske retikulum med ribosomer er intakt og følgelig at proteinsynteseapparatet er intakt.

10 minutter global iskemi (svak iskemi) og en overlevelsestid på 7 dager fører til nervedegenerasjon av pyramideceller selektivt i CAl-regionen i hippocampus (figur 1A-1C). Gjennomsnittlig antall pyramideceller i CA1 i simulert-opererte dyr var 121,5±4,3 (satt som 100 %). 60 % av CAl-nevronene døde derfor etter 10 minutter global iskemi (figur IB). Antallet nevroner i dyregruppen med iskemi og i.v. injeksjon av vehikkel (NaCI pluss 100 pl etanol) anvendt som beskrevet i eksperimentet, var sammenlignbar med gruppen med bare iskemi (figur IA, IB). NBQX (30 mg/kg, i.v., tre injeksjoner som beskrevet i eksperimentet) fremviste signifikant (p=0,03) nervebeskyttelse i CAl-pyramideceller sammenlignet med iskemigruppen. Sammenlignet med iskemigruppen fører NBQX til 47,5 % nervebeskyttelse, mens sammenlignet med de simulert-opererte dyrene var den beskyttende effekt 68,5 %. Nervebeskyttelsen forårsaket av NBQX, var i samsvar med Gill et al., 1992 og Gill 1994 og demonstrerte validiteten av den globale iskemimodellen som vi benyttet i våre eksperimenter. 7B-OH-EPIA fører til en konsentrasjonsavhengig nervebeskyttelse av CAl-pyramideceller i hippocampus etter 10 minutter global iskemi og en overlevelsestid på 7 dager (figur IA). T-test-analysen avslørte en svært signifikant nervebeskyttende effekt av 7P-OH-EPIA i konsentrasjoner på 0,1 mg/kg (0=0,01) og 0,3 mg/kg (p=0,0008). Sammenlignet med den simulert-opererte gruppen viste 7P-OH-EPIA en nervebeskyttende effekt på CAl-pyramideceller på hhv. 74,8 % (0,1 mg/kg) og 83,9 % (0,3 mg/kg) (figur 1C). 7P-OH-EPIA i en konsentrasjon på 1,0 mg/kg viste bare tendens til nervebeskyttelse, men effekten var ikke signifikant.

Vi observerte ikke atferdsmessige avvik hos dyrene i noen eksperimenter med 7P-OH-EPIA injisert i.v. før, under og etter iskemi.

Forklaring av figurene:

Antall morfologisk intakte CAl-pyramideceller i hippocampus hos rotter 7 dager etter global, cerebral iskemi hos rotter og under påvirkning av forskjellige forbindelser. Figur IA: Data er presentert som gjennomsnittlig antall ± SEM av intakte nevroner pr. 400 pm lengde av CAl-region. Figur IB: Data er uttrykt som prosent av intakte nevroner pr. 400 pm lengde av CAl-region sammenlignet med simulert-opererte dyr, satt som 100 %. Figur 1C: Data er presentert som absolutt prosent nervebeskyttelse når antall overlevende nevroner i iskemigruppen ble satt til null og antall i den simulert-opererte gruppen var satt til 100 %.

Selv om de ovennevnte data påviser nervebeskyttelse, er det nylig vist at Cyp7bl, enzymet som er ansvarlig for 7-hydroksyleringen av 3-hydroksysteroider og som derfor fører til omdannelsen av østradiol, DHEA og EPIA til deres nervebeskyttende derivater, er til stede i annet vev som utsettes for iskemisk lesjon, inkludert hjerte- og nyrevev. I samsvar med dette kan det avledes fra de ovennevnte data at forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse vil beskytte hjerte- og nyrevev fra iskemisk lesjon.

Eksempel 23

Hiertebeskvttende effekt

Forsøket ble designet for å teste den potensielle anti-iskemiske og hjertebeskyttende effekt av 7B-OH-EPIA i Langendorf-perfuserte hjerter hos hannrotter. Sluttpunktet for evaluering av beskyttelse i denne modellen er infarktstørrelse (beskyttelse mot dødelig lesjon, celledød). Infarktstørrelsesmodellen som anvendes, er basert på en standardisert iskemifremkalling fulgt av reperfusjon. I dette forsøk ble behandling tilsatt ex vivo (til perfusjonsløsningen for det isolerte hjertet) i 30 minutter før infarktet og ble fortsatt i 30 minutters regional iskemi (infarkt) og 120 minutters reperfusjon. På grunnlag av resultatet fra pilotstudier ble en konsentrasjon på 100 nM brukt, og det ble sammenlignet med vehikkelbehandlede hjerter. Legemidlet ble oppløst i DMSO (vehikkel), og slutt-konsentrasjonen av DMSO i perfusjonsløsningen var 1:10~<6.>Resultatene fra forsøket viste at forbindelsen i en konsentrasjon på 100 nM reduserte infarktstørrelsen signifikant fra 46,3 +/- 2,49 til 14,4 +/- 1,22 % av den iskemiske risikosone (p<0,001). Hjertefunksjon i forbindelse med legemiddeltilsetning ble også undersøkt, og tilsetning av 7P-OH-EPIA alene førte ikke til påviselige endringer i hjertefunksjon. Hjerter behandlet med 7P-OH-EPIA, viste en svak reduksjon av globale parametrer for systolisk trykk i venstre ventrikkel under regional iskemi (p<0,05 ved 25 minutter regional iskemi), som forsvant etter reperfusjon.

Forsøket bekrefter at forbindelsen har hjertebeskyttende, anti-iskemiske egenskaper ved en konsentrasjon på 100 nM i det isolerte, perfuserte hjerte fra hannrotte.

Behandling av dyrene

Dyrene ble oppbevart i dyreavdelingen ved Tromsø universitet og ble behandlet i samsvar med retningslinjene som er gitt av den europeiske konvensjon om beskyttelse av virveldyr som anvendes i eksperimenter eller for andre formål. Wistar-rotter ble anskaffet fra Harland (Nederland), og rottene ble i dyreavdelingen i én uke før eksperimentene startet. Vekten av dyrene ble begrenset til 240-380 g, og bare hjerter fra hanner ble brukt. Dette tilsvarer en alder på 60-120 dager. På forsøksdagen ble rottene transportert fra dyreavdelingen til laboratoriet i et filterkabinett. Rottene ble deretter anestisert med pentobarbitalinjeksjon intraperitonealt (50-75 mg/kg) og heparinisert med 200 IU, også intraperitonealt.

Perfusion

Hjertene ble raskt (innen 1-2 minutter) overført til et perfusjonsoppsett med bruk av Krebs Henseleits bikarbonatbuffer som perfusjonsløsning. Perfusatet og hjertet ble holdt ved 37 °C.

Krebs Henseleits bikarbonatbuffer besto av:

Bufferen ble ekvilibrert med en gassblanding av omtrent 5 % C02i 02.

Perfusjonstrykket var 100 mm H20. En lateksballong ble plassert på tuppen av polyvinylslangen forbundet med en trykkgiver og satt inn i hulrommet i venstre ventrikkel for måling av trykk i venstre ventrikkel. Størrelsen av ballongen ble ikke endret under eksperimentet, og det eksperimentelle oppsettet var derfor en isovolumetrisk klargjøring av venstre ventrikkel. Avpassede oppsamlinger av vene-effluat fra høyre side av hjertet (sinus coronarius via lungearterien og det høyre forkammer) ble brukt for å måle koronar gjennomstrømming. Hjertefrekvens ble beregnet fra trykkregistreringer.

Datamaskinbasert datainnsamling og analyse ble anvendt for hjertefunksjon (Lab View-basert programvare).

Forsøksprotokoll

Stabiliseringsperioden var 20-25 minutter, og hjerter som ikke nådde en stabil funksjon i løpet av denne perioden, ble forkastet. Hjerter med en LVDP (utviklet trykk i venstre ventrikkel) mellom 80 mm Hg og 175 mm Hg, diastolisk trykk mellom 0-10 mm Hg og koronar gjennomstrømming mellom 9 til 18 ml/min ved slutten av stabiliseringsperioden ble benyttet.

En 100 mM stamløsning av 7B-OH-EPIA i DMSO ble fremstilt og lagret som oppdelte prøver i eppendorf-rør ved 20 °C. Denne løsningen ble ytterligere fortynnet i perfusjonsløsning til 100 nM aktivt legemiddel like før forsøket. Forbehandlinger med 7B-OH-EPIA (n=8) eller vehikkel (n=8) ble gitt 30 minutter før infarktet og fortsatte inntil avsluttet forsøk.

Regional iskemi (infarkt) ble oppnådd ved å plassere silkesutur rundt hovedgrenen av den venstre koronararterie. Reversibel ligering ble oppnådd ved å bruke et lite stykke av en polyvinylslange. Den standardiserte, regionale iskemi varte i 30 minutter, og hjertene ble deretter reperfusert i 2 timer.

Infarktstørrelse og størrelse av risikosonen

Etter avsluttet forsøk ble følgende prosedyre fulgt:

1) Den venstre koronararterie ble re-ligert.

2) En suspensjon av blå farge ble satt til perfusjonslinjen. Den iskemiske sone ble identifisert som området uten farge.

3) Hjertet ble raskt fjernet, veid og nedfrosset.

4) Én dag etter ble hjertet kuttet i 2 mm tykke skiver og farget med tetrazol. Hjerteskivene ble inkubert i 20 minutter i 1 % TTC (trifenyltetrazolklorid) i 0,2 M fosfatbuffer (pH 7,4) ved 37 °C. Vev med infarkt vil ikke utvikle noen fargereaksjon, mens levende vev utvikler en purpurfarge på grunn av nærvær av dehydrogenaser og kofaktorer i vevet.

5) Etter farging ble hjertene plassert i formalin (4 %) for fiksering.

6) TTC-farging vil bli borte med tiden, og alle hjerteskiver ble derfor datamaskinskannet og lagret som digitale bilder som dokumentasjon. 7) Datamaskinbasert planimetri ble brukt for å beregne volum av ventriklene, den iskemiske risikosonen og infarktet. Resultatene er presentert som infarkt i % av iskemisk risikosone.

Resultater

Resultatene er vist i følgende tabell 1.

Resultatene er også illustrert i figur 2 til 6 i de medfølgende tegninger.

Infarkt:

Det var signifikant forskjell mellom de to gruppene (p<0,001) med en betydelig infarktreduksjon i den legemiddelbehandlede gruppe. Infarktene i kontroll hjertene som var behandlet med vehikkel, var i størrelse sammenlignbare med de standardiserte kontrollinfarkt som vanligvis oppnås i ubehandlede hjerter som utsettes for 30 minutter regional iskemi.

Hjertefunksjon:

Hjertefunksjon ble undersøkt gjennom hele forsøkets forløp. En betydelig reduksjon av koronar gjennomstrømning ble sett i forbindelse med okklusjon av koronar-arterien i denne forsøksmodellen og bekrefter at den tilsiktede koronarokklusjonen fant sted. Koronar gjennomstrømming ble ikke påvirket av tilsetning av 7B-OH-EPIA. Hjertefrekvensen var ikke signifikant forskjellig mellom de to gruppene og forble stabil gjennom hele forsøket. Utviklet trykk i venstre ventrikkel (LVDP) faller også under regional iskemi. Dette fallet var større i legemiddelbehandlede hjerter enn i kontrollen. En signifikant forskjell i LVDP mellom gruppene ble sett etter 25 minutter regional iskemi. Ingen forskjeller mellom de to gruppene ble observert med hensyn til diastolisk trykk.

Vehikkel:

Vehikkel-DMSO er tidligere blitt brukt som en vehikkel i bufferperfuserte hjerter, og resultatene indikerer at under betingelsene for dette forsøket hadde denne forbindelse ingen innflytelse alene.

Konklusjon

Forsøket påviste en betydelig og signifikant hjertebeskyttende effekt av 7B-OH-EPIA. Grad av beskyttelse er i størrelsesorden sammenlignbar med noen av de mest potente og veldokumenterte hjertebeskyttende legemidler eller behandlingsregimer, så som NHE-blokade eller iskemisk forbehandling når dette anvendes i den samme forsøksmodellen.

Claims (11)

1. Anvendelse av en steroid forbindelse med formel (I):

R<1>og R2 er like eller forskjellige fra hverandre, og begge representerer et hydrogenatom, en alkylgruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer, en alkenylgruppe som har fra 2 til 6 karbonatomer, en alkynylgruppe som har fra 2 til 6 karbonatomer, en arylgruppe som har fra 6 til 10 karbonatomer, en formylgruppe, en alkylkarbonylgruppe som har fra 2 til 7 karbon-atomer, en alkenylkarbonylgruppe som har fra 3 til 7 karbonatomer, en alkynylkarbonylgruppe som har fra 3 til 7 karbonatomer, en arylkarbonylgruppe som har fra 7 til 11 karbonatomer, en aralkylkarbonylgruppe som har fra 8 til 15 karbonatomer, en aralkenylkarbonylgruppe som har fra 9 til 15 karbonatomer, en rest av en aminosyre eller en heterosyklisk karbonylgruppe, som definert nedenfor; én av Ra og Rb representerer en gruppe med formel -R<c>, fortrinnsvis i B-konfigurasjon, og den andre representerer et hydrogenatom, eller Ra og Rb sammen representerer en oksogruppe; R<c>representerer en alkanoylgruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer, en arylkarbonylgruppe hvor aryldelen er en aromatisk, karbosyklisk gruppe som har fra 6 til 10 ringkarbonatomer, en heterosyklisk karbonylgruppe som definert nedenfor, eller en gruppe med formel -OR<4>, hvor R4 representerer hvilken som helst av gruppene og atomene som er definert ovenfor forR<1>ogR<2>; ringen A,

er en benzen- eller sykloheksanring; når ring A er en sykloheksanring er n lik 1; eller når ring A er en benzenring er n lik 0; nevnte heterosykliske karbonylgruppe er en gruppe med formel R<3->CO, hvor R<3>representerer en heterosyklisk gruppe som har fra 3 til 7 ringatomer, hvor fra 1 til 3 er heteroatomer valgt fra nitrogenatomer, oksygenatomer og svovelatomer, og det/de resterende atom eller atomer som det finnes minst ett av, er karbonatomer; nevnte alkyl-, alkenyl- og alkynylgrupper og alkyl-, alkenyl- og alkynyldelene av nevnte alkylkarbonyl-, alkenyl karbonyl- og alkynylkarbonylgrupper er usubstituert eller har minst én av de følgende substituenter ip: substituenter ip: hydroksygrupper, merkaptogrupper, halogenatomer, aminogrupper, alkylaminogrupper som har fra 1 til 6 karbonatomer, dialkylaminogrupper hvor hver alkylgruppe har fra 1 til 6 karbonatomer, karbamoylgrupper, nitrogrupper, alkoksygrupper som har fra 1 til 6 karbonatomer, alkyltiogrupper som har fra 1 til 6 karbonatomer, karboksygrupper, rettkjedet eller forgrenet alkoksykarbonylgrupper med fra 2 til 7 karbonatomer og usubstituerte arylgrupper som har fra 6 til 10 karbonatomer; nevnte arylgrupper, nevnte heterosykliske grupper og aryldelene av nevnte arylkarbonylgrupper og nevnte aralkylkarbonylgrupper er usubstituert eller har minst én av de følgende substituenter Jj: substituenter Jj: hvilken som helst av substituentene ip, og alkylgrupper som har fra 1 til 6 karbonatomer, hydroksyalkylgrupper som har fra 1 til 6 karbonatomer og haloalkylgrupper som har fra 1 til 6 karbonatomer; og farmasøytisk akseptable salter og estere derav, for fremstilling av et medikament for beskyttelse mot iskemisk skade på perifere organer.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor: R<1>og R<2>er like eller forskjellige fra hverandre, og begge representerer et hydrogenatom, en alkylgruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer, en eventuelt substituert fenylgruppe, en formylgruppe, en alkylkarbonylgruppe som har fra 2 til 5 karbonatomer, en arylkarbonylgruppe som har fra 7 til 11 karbonatomer, en aralkylkarbonylgruppe som har fra 8 til 15 karbonatomer, en rest av en aminosyre eller en heterosyklisk karbonylgruppe, som definert nedenfor; én av Ra og R<b>representerer en alkanoylgruppe som har fra 1 til 6 karbonatomer eller en gruppe med formel -OR<4>, hvor R<4>representerer hvilken som helst av gruppene og atomene som er definert ovenfor for R<1>og R<2>, i B-konfigurasjon, og den andre representerer et hydrogenatom, eller Ra og Rb sammen representerer en oksogruppe; nevnte heterosykliske karbonylgruppe er en gruppe med formel R<3->CO, hvor R<3>representerer en heterosyklisk gruppe som har fra 3 til 7 ringatomer, hvor fra 1 til 3 er heteroatomer valgt fra nitrogenatomer, oksygenatomer og svovelatomer, og det/de resterende atom eller atomer som det finnes minst ett av, er karbonatomer.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller krav 2, hvor -OR<2>-gruppen i 7-stilling er i B-konfigurasjon.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvor steroidet er 7B-hydroksy-epiandrosteron.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvor steroidet er 7B-hydroksy-17B-østradiol.

6. Anvendelse ifølge krav 1, hvor steroidet er 7B-hydroksy-østron.

7. Anvendelse ifølge krav 1, hvor steroidet er 7a-hydroksy-østron.

8. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor det perifere organ er hjertet.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvor skaden på hjertet er forårsaket av myokardinfarkt.

10. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7, hvor det perifere organ er nyrene.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvor skaden på nyrene er forårsaket av glomerulonefritt eller akutt nyresvikt.