CN1690198A - 一种提取营养酸模超氧化物歧化酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取营养酸模超氧化物歧化酶的方法。该方法是以截留分子量为4－6万道尔顿的超滤膜超滤处理营养酸模粗提液得到超滤液，再以截留分子量为6000－10000道尔顿的超滤膜浓缩超滤液，浓缩液脱水得到营养酸模SOD；所述营养酸模粗提液是将营养酸模捣碎、匀浆离心得到的上清液。本发明引入超滤技术，应用两种不同截留分子量大小的超滤膜来分离、收集粗提液，可以节约硫酸铵，而且提取过程无相变，有利于保持SOD酶活的稳定；不需经过柱层析分离过程，具有操作过程简单，对环境无污染等方面的优点。

Description

一种提取营养酸模超氧化物歧化酶的方法

技术领域

本发明涉及提取植物超氧化物歧化酶(SOD)的方法，特别是涉及一种提取营养酸模SOD的方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)是生物重要保护酶之一，能增强机体抗逆能力，防衰老。营养酸模是采用不同地区野生酸模通过基因工程培育而成的多年生物种。它具有优质、高产、速生、耐寒、耐旱、耐盐碱等生物学特性，适于盐渍、风沙、荒漠化土地生长，在我国南北方大部分地区都有种植。营养酸模的茎叶在抽茎期所含叶蛋白高达30％以上，仅次于大豆籽粒，还含有丰富的氨基酸、维生素和微量元素。经过测定，营养酸模中含有较高的SOD。

现有的营养酸模SOD提取技术一般是将营养酸模处理后离心得到的粗提液，经25-35％硫酸铵沉淀、85-95％硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100柱层析等步骤，可以得到SOD粗酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单方便的提取营养酸模SOD的方法。

本发明所提供的提取营养酸模SOD的方法，是以截留分子量为4-6万道尔顿的超滤膜超滤处理营养酸模粗提液得到超滤液，再以截留分子量为6000-10000道尔顿的超滤膜浓缩超滤液，浓缩液脱水得到营养酸模SOD；所述营养酸模粗提液是将营养酸模捣碎、匀浆离心得到的上清液。

所述将营养酸模捣碎、匀浆离心是将营养酸模用组织捣碎机捣碎，捣碎组织经匀浆后，离心速度6000-10000转/分钟。

在生产中，一般使浓缩液脱水的方式是冷冻干燥。

在本发明中，应用截留分子量为4-6万道尔顿的超滤膜超滤处理粗提液，超滤时工作压力为0.15-0.17MPa，得到超滤液，超滤膜的截留分子量一般选择6万道尔顿。超滤膜的组件形式可以是多样的，如中空纤维膜、平板膜和卷式膜等，其中常用的为中空纤维膜。

应用截留分子量为6000-10000道尔顿的超滤膜对超滤液进行处理时，工作压力为0.15-0.17MPa，得到浓缩液。超滤膜的截留分子量一般选择1万道尔顿，其组件形式可以为中空纤维膜、平板膜或卷式膜等多种形式。

提取营养酸模SOD的工艺流程如图1所示，本发明巧妙地采用超滤技术来分离、浓缩营养酸模SOD粗提液，不仅可以节约现有提取营养酸模SOD工艺中所用的硫酸铵，而且提取过程无相变，有利于保持SOD酶活的稳定，得到的产品酶活性较高。同时本发明的工艺不需经过柱层析分离过程，具有操作过程简单，对环境无污染等优点。

附图说明

图1为本发明的提取工艺流程图。

具体实施方式

实施例1、SOD的酶活测定

SOD的酶活测定方法采用NBT光化学法，具体如下：

(1)设备：752型分光光度计；台式离心机；光照培养箱；冰箱；10ml小烧杯等。

(2)试剂：氯化硝基氮蓝四唑(NBT)，上海前进制剂厂

         L-甲硫氨酸(L-Met)，上海康达氨基酸厂

         乙二胺四乙酸(EDTA)，北京化工厂

         核黄素(VB₂)，北京西中化工厂

(3)反应液的配制

NBT反应液的制备：配制pH7.8，50mmol/L的磷酸缓冲液1000ml，加入1.933mg的L-Met，待完全溶解后，放入45.8mg NBT，0.47mg核黄素(配成0.47mg/ml溶液，吸取1ml加入)和29.0mgEDTA，溶液终浓度：Met为13mmol/L；NBT为6.3×10^-3mmol/L；核黄素为1.3×10^-3mmol/L；EDTA为0.1mmol/L，置于棕色试剂瓶中，用黑布罩遮光，于4℃冰箱中可保存1个月。

(4)材料的预处理

脐橙果肉用研钵研碎，按照果肉∶50mM磷酸缓冲液＝1∶2的比例加入缓冲液，10000rpm离心10分钟，取上清液进行SOD酶活测定。

(5)测定方法

吸取30μl样品，放入10ml透明玻璃小烧杯中，加入3mlNBT反应液，混匀，在28℃ SOD光化反应室中，2×15W日光灯光照20分钟(光照为4000勒克司)，在560nm处测定吸光度，以NBT反应液作空白对照，每组设3次重复，整个测定过程除光化反应外，均在避光或弱光条件下进行。同时测试过程中以美国″Sigma″公司、上海宝安公司的标准酶和贵州老来福药业公司生产的SOD口服液作为测试对照。

(6)计算

酶活力(U/g)＝(OD对照-OD样品)/(1/2OD对照)×稀释倍数

实施例2、营养酸膜SOD的提取

取新鲜营养酸模的根、茎和叶100kg，用组织捣碎机捣碎，均浆，8000rpm冷冻离心10min，去除杂质得上清液70L(粗提液)，酶活为180IU/ml。将粗提液通过截留分子量为6万道尔顿的中空纤维超滤膜。膜材料：聚砜，膜面积：0.12m²，直径：10cm，高：100cm，内压式。粗提液经0.15MPa超滤50分钟，获得超滤液63L，酶活173IU/ml；然后，将超滤液通过截留分子量为1万道尔顿的中空纤维超滤膜，膜材料：聚砜。膜面积：0.12m²，直径：10cm，高：100cm，内压式，超滤液经0.15MPa超滤1小时，得到浓缩液3L，酶活3584IU/ml。浓缩液冷冻干燥获得360克干粉，酶活28186IU/g SOD，回收率约80.2％。

实施例3、营养酸模SOD的提取

取新鲜营养酸模的根、茎和叶100kg，用组织捣碎机捣碎，均浆，8000rpm冷冻离心10min，去除杂质得上清液70L(粗提液)，酶活为180IU/ml。将粗提液通过截留分子量为5万道尔顿的平板超滤膜。膜材料：聚砜，膜面积：0.15m²，长：30cm，宽：15cm，高：5cm。粗提液经0.16MPa超滤45分钟，获得超滤液67L，酶活为163IU/ml；然后，将超滤液通过截留分子量为6000道尔顿的平板超滤膜。膜材料：聚砜，膜面积：0.15m²。长：30cm，宽：15cm，高：5cm。超滤液经0.16MPa超滤50分钟，得到浓缩液2.8L，酶活为3682IU/ml。浓缩液冷冻干燥，获得330克SOD干粉，酶活为32253IU/g，回收率约84.5％。

实施例4、营养酸模SOD的提取

取新鲜营养酸模的根、茎和叶100kg，用组织捣碎机捣碎，均浆，6000rpm冷冻离心10min，去除杂质得上清液70L(粗提液)，酶活为180IU/ml。将粗提液通过截留分子量为4万道尔顿的卷式超滤膜。膜材料：聚丙烯腈，膜面积：3200cm²，横截面积：2.4cm²。粗提液经0.17MPa超滤48分钟，获得超滤液66L，酶活为162IU/ml；然后，用截留分子量为8000道尔顿的卷式超滤膜。膜材料：聚丙烯腈，膜面积：3200cm²，横截面积：2.4cm²，超滤液经0.17MPa超滤55分钟，得到浓缩液2.5L，酶活为4124IU/ml。浓缩液冷冻干燥，获得310克SOD干粉，酶活为34874IU/g，回收率约85.8％。

Claims (6)

1、一种提取营养酸模SOD的方法，是以截留分子量为4-6万道尔顿的超滤膜超滤处理营养酸模粗提液得到超滤液，再以截留分子量为6000-10000道尔顿的超滤膜浓缩超滤液，浓缩液脱水得到营养酸模SOD；所述营养酸模粗提液是将营养酸模捣碎、匀浆离心得到的上清液。

2、根据权利要求1所述的提取营养酸模SOD的方法，其特征在于：所述将营养酸模捣碎、匀浆离心是将营养酸模用组织捣碎机捣碎，捣碎组织经匀浆后，离心的条件是6000-10000转/分钟。

3、根据权利要求1所述的提取营养酸模SOD的方法，其特征在于：所述用截留分子量为4-6万道尔顿的超滤膜处理时，工作压力为0.15-0.17MPa；用截留分子量为6000-10000道尔顿的超滤膜处理时，工作压力为0.15-0.17MPa。

4、根据权利要求1或2或3所述的提取营养酸模SOD的方法，其特征在于：所述浓缩液脱水的方式是冷冻干燥。

5、根据权利要求1或2或3所述的提取营养酸模SOD的方法，其特征在于：所述截留分子量为4-6万道尔顿的超滤膜的组件形式为中空纤维膜、平板膜或卷式膜。

6、根据权利要求1或2或3所述的提取营养酸模SOD的方法，其特征在于：所述截留分子量为6000-10000道尔顿的超滤膜的组件形式为中空纤维膜、平板膜或卷式膜。