CN1687027A - 用于治疗急慢性肝病的无水硫普罗宁钠及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于治疗急慢性肝病的药物无水硫普罗宁钠，其具有如图的结构式：本发明还提供了上述无水硫普罗宁钠的制备方法：将硫普罗宁与一般的含钠无机碱在一般的有机溶剂中进行酸碱成盐反应，反应过程中辅以巯基保护剂和反应体系除水剂，反应结束再体系中加入沉淀剂进行沉淀析出析出，过滤、干燥，便可制得无水硫普罗宁钠。本发明方法制备的硫普罗宁钠具有稳定性高，毒性低，疗效确切，临床使用方便等优点。

Description

用于治疗急慢性肝病的无水硫普罗宁钠及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物及其制备方法领域，具体而言，本发明涉及无水硫普罗宁钠及其制备方法，本发明无水硫普罗宁钠主要用于急、慢性肝病的肝功能改善。

背景技术

硫普罗宁(英文名Tiopronin，化学名：巯基丙酰甘氨酸)为一种代谢改善解毒剂，其分子式：C₅H₉NO₃SH，分子量：163.20，结构式如下：

其主要用于急、慢性肝病的肝功能改善。该产品的口服制剂，冻干粉针和水针注射剂目前已经上市。由于本品呈强酸性，现有制剂多是将其配制为中性应用于临床。如目前临床上使用的冻干粉针为每1西林瓶中装入0.1g或0.2g的硫普罗宁，并配以专用的碳酸氢钠水溶液，临床使用时再用碳酸氢钠水溶液将硫普罗宁溶解，这样生产、包装和使用均较繁琐，此外我们研究还发现硫普罗宁在水相中由酸性被碱中和到中性的过程中很易分解产生大量的副产物，使产品纯度下降，这无疑会影响该产品药用的安全和有效使用。另亦有文献显示硫普罗宁在水中遇碱性物不稳定易分解。因此目前临床上直接用的硫普罗宁制剂均潜在有在中和为中性的过程中不稳定而分解的问题，很多文献报道临床上使用硫普罗宁后产生较大的毒副作用，也可能与该问题有关。

因此我们设想，将硫普罗宁在体外有机溶液中进行成盐反应，制备成硫普罗宁钠，避免分解物进入体内或在体内产生分解物进而引起毒副反应。从结构上看，硫普罗宁含有巯基，很不稳定，如不采取一定措施，很难在水相或有机相中合成出较纯的符合药用的产物来。也有研究者尝试制备含水的硫普罗宁钠盐(USP4346234A)，因其方法限制，最终产物为硫普罗宁钠的水合物。该专利明确显示，很难用常规方法合成出硫普罗宁钠盐，用NaOH，NaHCO₃，Na₂CO₃等无机碱与硫普罗宁在水或醇中进行中和反应，要么没有钠盐的生成，要么分离得到的产物量很少；用普通的醇钠(如甲醇钠、乙醇钠等)产物的量很低且难以精制。正是由于用常规方法难以合成出硫普罗宁钠盐，尽管已知硫普罗宁直接临床应用有很多缺点，但直到现在尚没办法克服。USP 4346234A以2-乙基己醇钠作为碱，以异丁醇为溶剂，与硫普罗宁反应成盐，加水后析出硫普罗宁钠一水合物产率约为70％。该方法所用2-乙基己醇纳成本高且难以制备。反应后形成的2-乙基己醉及溶剂异丁醇具有较高的沸点，难以除去，在产品中容易形成残留。此外因所形成的钠盐在所用溶剂中不能析出，只能在加水后方可析出，因此所得产物为一水合物，熔点仅为约90℃，难以用普通方法(如高温灭菌)制备无菌粉针；再者，由于产物含有水(理论含水量：8.86％)，产品结构上的巯基在有水的环境中长期放置有降解的可能，存在不稳定的因素。

我们经过研究，发现在一些一般廉价的有机溶剂(如甲醇，乙醇等)中，将硫普罗宁与一些一般廉价的无机碱(如氢氧化钠，碳酸氢钠等)酸碱成盐，辅以巯基保护剂和反应体系除水剂，在向反应体系中加入沉淀剂(如丙酮、乙酸乙酯等)便可创造性地制备得新的化合物——无水硫普罗宁钠。

发明内容

因此，本发明的目的是提供了一种新的用于治疗急慢性肝病的化合物—无水硫普罗宁钠；

本发明的另一目的是提供了一种制备无水硫普罗宁钠的方法；

本发明的另一目的是提供了一种用无水硫普罗宁钠制备治疗肝炎药物的用途。

本发明的无水硫普罗宁钠是由硫普罗宁与一般的含钠无机碱(如氢氧化钠，碳酸氢钠等)在一般的有机溶剂(如甲醇或乙醇等)中酸碱成盐，加入丙酮、乙酸乙酯或二氯甲烷等沉淀剂析出，便可制得无水硫普罗宁钠。其中可以选择性地辅以巯基保护剂和反应体系除水剂(如分子筛、硅胶、等)。有机溶剂可以选自极性的有机化合物，尤其是低分子醇如C_1-6烷醇如甲醇，乙醇，异丙醇等中的一种或多种，优选甲醇；一般含钠无机碱可以选自氢氧化钠，碳酸氢钠，碳酸钠，磷酸钠或乙酸钠等，首选氢氧化钠；沉淀剂司选用不溶解或微溶解硫普罗宁钠的有机化合物，尤其是丙酮、乙酸乙酯，二氯甲烷等中的一种或多种，优选丙酮；反应过程中的巯基保护剂可选用DTT(二硫苏糖醇)、EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或2-巯基乙醇的一种或多种；反应体系中的除水剂可选用分子筛、硅胶、无水硫酸镁、无水氯化钙等，优选分子筛。

本发明的无水硫普罗宁钠用以下方法制备：

本发明的无水硫普罗宁钠是由硫普罗宁与含钠无机碱(如氢氧化钠，碳酸氢钠等)在有机溶剂(如甲醇或乙醇等)中酸碱成盐，加入丙酮、乙酸乙酯或二氯甲烷等沉淀剂析出，便可制得无水硫普罗宁钠；其中可以选择性地辅以巯基保护剂和反应体系除水剂(如分子筛、硅胶、等)。

本发明的无水硫普罗宁钠的制备方法具体包括下列步骤：

1.称取MPG(硫普罗宁)49.8g(0.305mol)，置于三口烧瓶中，加入134ml分析纯甲醇，15℃水浴，加入巯基保护剂DTT 0.5g，搅拌15分钟，加入除水剂分子筛15g；

2.称取NaOH14.198g，分6次加入甲醇液中(每次加入2.366g)，每次间隔1小时；

3.第6次加入NaOH后，继续在15℃水浴中，搅拌下反应1小时。然后，将反应瓶移入20-25℃水浴中，搅拌1小时。抽滤，滤除分子筛，滤液加入402ml丙酮中，充分振摇，使混合均匀；

4.待反应液中出现大量白色沉淀，抽滤，滤饼于80℃干燥，得无水硫普罗宁钠40.1g，收率73.94％；

5.滤液(甲醇和丙酮混合液)65℃水浴，常压蒸馏分出丙酮(可循环使用)，改为减压蒸馏，使甲醇液浓缩到2/3，加入到3倍量丙酮中，充分振摇，使混合均匀，室温放置过夜。后续操作同步骤4，得无水硫普罗宁钠11.4g，总收率91.12％.

本发明的无水硫普罗宁钠具有纯度高、稳定性好、药用效果佳等特点，较硫普罗宁及硫普罗宁钠水合物具有更好的稳定性，以下通过实验研究结果说明本发明的有益效果。

一.本发明产物无水硫普罗宁钠的结构确证

1.元素分析

(1)碳、氢、氮的分析结果见表1：

      表1样品元素分析结果

	C(％)	H(％)	N(％)
				理论值	32.42	4.32	7.56
样品实测值	32.20	4.32	7.45
				32.16	4.24	7.46

结论：样品的元素分析结果与理论值符合。测试结果说明本品分子式为C₅H₈NO₃SNa。同时也说明本品不含结晶水。

2.红外吸收光谱

(1)测定数据见表2。

     表2、样品的红外吸收光谱测定数据及归属

吸收峰cm-1	振动类型	基团	强度
				3321 3272	υN-H	-NH-	s
2979	υasC-H	-CH3	m
				2935	υasC-H	-CH2-	m
2556	υS-H	-SH	w
				1633	υCO-NH	-CONH-	s
1616	δN-H	-CONH-	s
				1579	υC-N	-CONH-	s
1435	δSC-H	-CH2-	s
				1401	υCOO-	-COO-	s

解析：

A、3321，3272cm^-1为酰胺的胺基伸缩振动峰，1633cm^-1为酰胺c＝o伸缩振动，1616cm^-1及1579cm^-1为N-H面内弯曲振动与部分C-N伸缩振动偶合，证明分子中含-CO-NH-仲酰胺基团；

B、2979cm^-1为C-H伸缩振动，1312cm^-1为-CH₃中C-H弯曲振动，证明分子中含有-CH₃；

C、2935cm^-1为C-H伸缩振动；

D、2566cm^-1为S-H伸缩振动峰；

E、1435cm^-1为C-H伸缩振动峰。

(3)结论：红外光谱中各官能团吸收峰符合该化合物结构特征。

3.¹H-核磁共振谱(¹HNMR、H-H COSY)、¹³C-核磁共振谱(¹³CNMR、DEPT、HMQC、HMBC)

(1)测定数据见表3和表4。

         表3、样品的核磁共振氢谱数据及归属(DMSO为溶剂)

化学位移(ppm)	质子数	多重性(J/Hz)	归属	COSY位	相关δH(ppm)
						1.29	3	d	-CH3	-CH-	3.58
2.47	1	d	-SH	-CH-	3.58
						3.37	2	d	-CH2-	-NH-	7.60
3.58	1	m	-CH-	-CH3，-SH	1.29，2.47
						7.60	1	s	-NH-	-CH2-	3.37

解析：

(a)δ1.29ppm的双重峰，相当于3个H，为甲基上的H；

(b)δ2.47ppm的双重峰，相当于1个H，为巯基上的H；

(c)δ3.37ppm的双重峰，相当于2个H，为亚甲基上的H；

(d)δ3.58ppm的多重峰，相当于1个H，为次甲基上的H；

(e)δ7.60ppm的单峰，相当于1个H，为NH上的H。

表4、样品的核磁共振碳谱数据及归属(DMSO为溶剂)

解析：

1、结构中一个甲基化学位移值在最高场；

2、结构中有一个亚甲基，化学位移在次高场；

3、结构中有一个次甲基，受邻位基团吸电子诱导作用，化学位移值向低场移动；

4、结构中有两个羰基碳，羧羰基比酰胺羰基移向低场。

4.质谱分析

(1)测定数据：分子离子峰：163

主要碎片峰：145，102，88，74，61，56。

(2)结论：分子离子峰(m/z)为163，与硫普罗宁钠分子式经酸化产生的硫普罗宁的分子量相符。各主要碎片峰都有合理解释，符合该化合物的结构特征。

5.热分析

(1)、DSC(差示扫描)和TG(热重)分析

DSC法测定结果显示，在100℃以下没有明显吸收峰，在151～159℃处有强的吸热峰，峰值是156.2℃，应当为结晶的熔融。TG法测定结果确定，直到173℃左右本品质量失重很少，但是从173℃左右开始分解，质量减少。说明样品不含结晶水。

综上所述，发明的化合物的化学结构确为无水硫普罗宁钠。

二、无水硫普罗宁钠及硫普罗宁钠一水合物理化性能比较

               无水硫普罗宁钠                 硫普罗宁钠一水合物

结构式

熔点     154℃-156℃                          86℃熔化成糊状

热重     173℃失重                            83℃开始失重

差示扫描 峰值156℃                            峰值86℃和156℃

三.无水硫普罗宁钠及硫普罗宁钠一水合物稳定性试验研究

(一)、主要研究内容

对无水硫普罗宁钠和硫普罗宁钠一水合物样品分别进行三方面试验：

1.影响因素试验：分别考察强光、高温、高湿等对其影响；

2.加速试验；

3.长期试验。

对于加速和长期试验，我们采用如下包装：

双层药用复合膜(内层装样品，密封，内层与外层之间加入袋装变色硅胶干燥剂)，密封，装入牛皮袋内，放入铝桶封存。

加速试验条件为40℃，相对湿度为75％；长期试验条件为室温，相对湿度60％。

(二)试验方法及步骤

1.取样方法

本试验设计的每一项目，均用具有代表性和均一性的样品进行考察。按考察项目要求，每一项目试验前，先取样分析，定为“0”天结果。

2.考察项目及测定方法

(1)外观色泽：采用肉眼观察样品颜色变化，并将放置不同时间的样品进行比较。

(2)含量：测定含量时，采用滴定法测定硫普罗宁钠的含量。

(3)有关物质：通过TLC高低浓度自身对照法检测各种条件下放置不同时间样品中降解杂质含量的变化。

(4)水分含量：通过干燥失重法检测各种条件下放置不同时间的样品中水分含量的变化。

(5)酸度：通过酸度计分析PH值变化。

3.影响因素试验

(1)高温试验

将样品摊于扁形称量瓶中，厚度≤5mm，每瓶装1g，取2瓶，置于干燥器中，放入恒温箱，于60±2℃恒温10天，于5，10天分别取一瓶检测，与0天结果比较。分析结果见表5和表6。

(2)高湿试验：

相对湿度92.5％的影响：

将样品摊于扁形称量瓶中，厚度≤5mm，每瓶装1g，取2瓶，置于下部放有饱和KNO₃水溶液的具有具塞玻璃瓶中，于25℃±2℃条件下放置10天，于5，10天分别取一瓶检测，与0天结果比较。分析结果见表5和表6。

(3)强光照射试验

将样品摊于平面玻璃板上，厚度≤5mm，放在注射剂澄明度测定仪下，以4500±500Lx光照度放置10天，于5，10天分别取样测定，与0天结果比较。分析结果见表5和表6。

4.加速试验

在相同包转下，于40℃和相对湿度75％条件下进行考察。

将样品置于下部放有饱和NaCl水溶液的具有具塞玻璃瓶中，放入恒温箱，于40±2℃条件下恒温6个月，于0、1、2、3、6月各取一袋进行检测，并与0月结果比较。分析结果见表7。

5.长期试验

在相同包装下，于室温，相对湿度60％条件下进行考察。分析结果见表8。

(三)、结果与分析

1.影响因素试验结果：

                    表5、无水硫普罗宁钠影响因素试验结果

放置条件	贮存时间(天)	考察项目
							外观颜色	含量(％)	有关物质(％)	水分含量(％)	pH值
		光(4500±500Lx)	0	颜色基本不变	99.23	不超过0.5％						0.41	6.07
5	99.16						不超过0.5％	0.43	6.07
			10		99.09	不超过0.5％				0.52	6.08
高温(60±2℃)	0						颜色基本不变	99.23	不超过0.5％			0.41	6.07
		5	99.18	不超过0.5％	0.43	6.08
	10							99.09	不超过0.5％	0.51	6.08
		高湿(KNO3饱和溶液)	0	有部分结晶吸湿而潮解	99.23	不超过0.5％						0.41	6.07
5	99.10						不超过1.0％	-	6.07
			10		98.93	不超过1.0％				-	6.07

                   表6、硫普罗宁钠一水合物影响因素试验结果

放置条件	贮存时间(天)	考察项目
							外观颜色	含量(％)	有关物质(％)	水分含量(％)	pH值
		光(4500±500Lx)	0	颜色有所加深	98.60	不超过1.0％						9.51	6.07
5	98.25						不超过2.0％	10.52	6.09
			10		97.32	不超过3.0％				11.57	6.11
高温(60±2℃)	0						颜色有所加深	98.60	不超过1.0％			9.51	6.07
		5	98.18	不超过2.0％	9.59	6.10

	10		97.09	不超过3.0％	10.7	6.12
							高湿(KNO3饱和溶液)	0	结晶吸湿全部潮解	98.60	不超过1.0％	9.51	6.07
5	98.19	不超过2.0％	-	6.11
					10	97.06		不超过3.0％		-	6.12

由表5和6可以看出：在光、温度、湿度影响下，无水硫普罗宁钠较硫普罗宁钠一水合物更为稳定。

2.加速试验结果

                          表7、无水硫普罗宁钠加速试验结果

                               (40℃±2℃，RH75％)

批号	贮存时间(月)	考察项目
							外观颜色	含量(％)	有关物质(％)	水分含量(％)	pH值
		040500010	0	颜色基本无变化	99.37	不超过0.5％						0.36	6.07
1	99.25						不超过0.5％	0.36	6.07
			2		99.11	不超过0.5％				0.36	6.07
3	99.03						不超过0.5％	0.36	6.08
			6		98.86	不超过0.5％				0.37	6.10
040500020	0						颜色基本无变化	99.29	不超过0.5％			0.40	6.09
		1	99.23	不超过0.5％	0.40	6.09
	2							99.12	不超过0.5％	0.40	6.09
		3	99.02	不超过0.5％	0.40	6.11
	6							98.83	不超过0.5％	0.40	6.11
		040500030	0	颜色基本无变化	99.41	不超过0.5％						0.46	6.12
1	99.25						不超过0.5％	0.46	6.12
			2		99.14	不超过0.5％				0.46	6.12
3	99.05						不超过0.5％	0.46	6.13
			6		98.86	不超过0.5％				0.48	6.13

                 表8、硫普罗宁钠水合物加速试验结果

                            (40℃±2℃，RH75％)

批号	贮存时间(月)	考察项目
							外观颜色	含量(％)	有关物质(％)	水分含量(％)	pH值
		040501	0	颜色逐渐加深	98.60	不超过1.0％						9.51	6.07
1	98.25						不超过1.5％	9.53	6.08
			2		97.11	不超过2.5％				9.58	6.09
3	96.03						不超过3.5％	9.60	6.10
			6		95.86	不超过4.5％				9.61	6.13
040502	0						颜色逐渐加深	98.58	不超过1.0％			9.53	6.08
		1	98.23	不超过1.5％	9.55	6.09
	2							97.10	不超过2.5％	9.57	6.10
		3	96.02	不超过3.5％	9.60	6.11
	6							95.83	不超过4.5％	9.61	6.13
		040503	0	颜色逐渐加深	98.57	不超过1.0％						9.55	6.09
1	98.22						不超过1.5％	9.57	6.10
			2		97.10	不超过2.5％				9.58	6.11
3	96.01						不超过3.5％	9.60	6.12
			6		95.81	不超过4.5％				9.62	6.13

由表7和8可以看出：在40±2℃，RH75％条件下，无水硫普罗宁钠较硫普罗宁钠一水合物更为稳定。

3.长期试验结果

                      表9、无水硫普罗宁钠长期试验结果

                           (室温，RH60％)

批号	贮存时间(月)	考察项目
							外观颜色	含量(％)	有关物质(％)	水分含量(％)	pH值
		040500010	0	颜色基本无变化	99.39	不超过0.5％						0.36	6.07

	3		99.20	不超过0.5％	0.36	6.07
							6	99.09	不超过0.5％	0.36	6.07
	9		98.78	不超过0.5％	0.37	6.08
							12
	040500020		0	颜色基本无变化	99.36	不超过0.5％						0.40	6.09
3		99.21					不超过0.5％	0.40	6.09
			6		99.13	不超过0.5％				0.40	6.09
9		98.87					不超过0.5％	0.40	6.11
			12
040500030		0					颜色基本无变化	99.41	不超过0.5％			0.46	6.12
	3		99.20	不超过0.5％	0.46	6.12
		6						99.15	不超过0.5％	0.46	6.12
	9		98.85	不超过0.5％	0.47	6.14
		12

                  表10、硫普罗宁钠水合物长期试验结果

                        (室温，RH60％)

批号	贮存时间(月)	考察项目
							外观颜色	含量(％)	有关物质(％)	水分含量(％)	pH值
		040501	0	颜色逐渐加深	98.60	不超过1.0％						9.51	6.07
3	98.31						不超过1.5％	9.58	6.08
			6		97.82	不超过2.0％				9.59	6.10
9	97.31						不超过2.5％	10.04	6.12
			12
040502	0						颜色逐渐加深	98.58	不超过1.0％			9.53	6.08
		3	98.22	不超过1.5％	9.59	6.09
	6							97.80	不超过2.0％	9.62	6.11
		9	97.30	不超过2.5％	9.75	6.13
	12

040503	0	颜色基逐渐加深	98.57	不超过1.0％	9.55	6.09
							3	98.20	不超过1.5％	9.60	6.10
	6		97.78	不超过2.0％	9.65	6.12
							9	97.28	不超过2.5％	9.75	6.13
	12

由表9和10可以看出：在长期存放下，无水硫普罗宁钠较硫普罗宁钠一水合物更为稳定。

由上述分析数据可以看出，由于制备或者检测工艺的原因，本发明的硫普罗宁钠可以带有少量非结晶游离水分，但是，这种游离水分的含量一般低于2％，优选低于1％，更优选低于0.5％。

四.无水硫普罗宁钠制剂的药效实验

对无水硫普罗宁钠制剂(无水硫普罗宁钠冻干粉针剂，由实施例4制备，用生理盐水溶解，以下同)做了药效学试验并与硫普罗宁作了比较，采用四氯化碳、D-氨基半乳糖(DAG)引起急、慢性肝损伤模型，以血清中转氨酶GOT、GPT，总蛋白T-P、白蛋白ALB、白球比例A/G以及组织中羟脯氨酸、唾液酸、肝胶原含量的变化作为肝功能变化、肝组织纤维化的评价指标，并结合病理组织学检查，对二者的药效学进行评价。药物设计一系列同等剂量进行比较观察，以注射途径进行给药，观察在预防性给药和慢性治疗性给药方式下二者的作用情况，结果显示：

对急性肝损伤模型的作用：

(1)对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的作用：无水硫普罗宁钠经注射给药后，37.5-150mg/kg能明显抑制CCl₄引起的急性肝损伤所致的血清GOT和GPT的升高(P＜0.05、P＜0.01)，表明无水硫普罗宁钠对CCl₄引起的急性肝损伤有显著的保护作用。同样试验条件下，硫普罗宁250mg/kg对CCl₄引起的急性肝损伤同样具有明显的保护作用。

可以看出，无水硫普罗宁钠对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的治疗作用效果非常明显。

(2)对D-氨基半乳糖(DAG)致小鼠急性肝损伤的作用

预防作用：无水硫普罗宁钠经预防性注射给药后，高剂量150mg/kg能明显抑制DAG引起的急性肝损伤所致的血清GOT和GPT的升高(P＜0.05、P＜0.01)，表明硫普罗宁钠能抑制DAG引起的急性肝损伤，有显著的保护作用。同样试验条件下，硫普罗宁180mg/kg对DAG引起的急性肝损伤同样具有显著的保护作用。

可以看出，无水硫普罗宁钠对D-氨基半乳糖(DAG)致小鼠急性肝损伤的治疗作用效果非常明显。

对慢性肝损伤模型的作用：

无水硫普罗宁钠连续注射给药1个月后，50-100mg/kg剂量使升高的转氨酶ALT、AST显著降低(P＜0.05、P＜0.01)，100mg/kg剂量使降低的ALB显著升高(P＜0.01)，显著升高A/G倒转的比例(P＜0.01)；25-100mg/kg剂量显著降低升高的唾液酸含量(P＜0.01)，100mg/kg剂量显著降低升高的羟脯氨酸含量(P＜0.01)。表明无水硫普罗宁钠对四氯化碳致慢性肝损伤有显著的治疗作用。同样试验条件下，硫普罗宁150mg/kg对四氯化碳致慢性肝损伤同样有显著的治疗作用。

可以看出，无水硫普罗宁钠对对慢性肝损伤的治疗作用效果非常明显。

结论：无水硫普罗宁钠注射液注射给药对于四氯化碳、D-氨基半乳糖引起的急、慢性肝损伤有显著的预防或治疗作用，作用强度优于硫普罗宁。

五、无水硫普罗宁钠急性毒性研究

为了考察无水硫普罗宁钠注射液(无水硫普罗宁钠冻干粉针剂，由实施例4制备，用生理盐水溶解，以下同)的注射给药途径急性毒性情况，并且与药物硫普罗宁进行毒性的比较，设计了静脉注射途径、腹腔注射途径进行给药的比较，采用啮齿类小鼠和大型动物Beagle犬进行试验，结果显示：

静脉给药途径，无水硫普罗宁钠生理盐水注射液小鼠一次性尾静脉注射给药，LD₅₀及95％可信限为LD₅₀＝2.464(2.422-2.507)g/kg；硫普罗宁NaHCO₃注射液小鼠一次性尾静脉注射给药，LD₅₀及95％平均可信限为1.993(1.957-2.029)g/kg(LD₅₀计算方法：Bliss法)。结果表明无水硫普罗宁钠静脉给药小鼠的急性毒性明显小于硫普罗宁。

腹腔给药途径，无水硫普罗宁钠生理盐水注射液小鼠一次性腹腔注射给药，LD₅₀及95％可信限为LD₅₀＝＝3.092(3.082-3.102)g/kg；硫普罗宁NaHCO₃注射液腹腔给药一次性腹腔注射给药，LD₅₀及95％平均可信限为LD₅₀＝2.136g/kg(2.093-2.181)g/kg。结果表明无水硫普罗宁钠腹腔给药小鼠的急性毒性明显小于硫普罗宁。

Beagle犬分别一次性i.v硫普罗宁钠生理盐水注射液后，近似致死量范围为401～501mg/kg，无严重毒副反应剂量范围为257～205mg/kg，无任何毒副反应剂量为164mg/kg；一次性i.v硫普罗宁NaHCO₃注射液后，近似致死量范围为275～343mg/kg，无严重毒副反应剂量范围为176～141mg/kg，无任何毒副反应剂量为113mg/kg。结果表明无水硫普罗宁钠一次性i.v给药Beagle犬的急性毒性明显小于硫普罗宁。

六、无水硫普罗宁钠长期毒性研究

采用SD大鼠，进行注射给药(无水硫普罗宁钠冻干粉针剂，由实施例4制备，用生理盐水溶解，以下同)，连续腹腔注射13周、恢复4周，考察试药对动物体重、进食量等一般状况、血液生化、血象、尿常规、各脏器系数及组织病理等指标的影响。将无水硫普罗宁钠分别设定高、中、低3个剂量组286、143、72mg/kg(以70kg人每日200mg计，分别相当于人临床拟用剂量的100、50、25倍)，同时设定硫普罗宁对比组，分别设定高、中、低3个剂量组257、129、57mg/kg(以70kg人每日200mg计，分别相当于人临床拟用剂量的90、45、20倍)。并设定溶媒对照组，同样试验条件下，对二者的毒性影响进行观察和比较，结果如下：

体重和食量：

与溶媒对照组比较，无水硫普罗宁钠中剂量组在给药第2周、第6周雄性大鼠出现了体重一过性的下降(P＜0.05)，其后直至给药结束体重变化与对照组间未见有显著性差异(P＜0.05)。恢复其内也未见显著性变化。

硫普罗宁对照组，中剂量在给药第1周、第3周雄性大鼠出现了体重一过性的下降或升高(P＜0.05)，其后直至给药结束体重变化与对照组间未见有显著性差异(P＞0.05)，雌性大鼠高剂量在第3周体重显著升高(P＜0.05)、中剂量在给药第6-13周出现显著性升高，表明硫普罗宁在一定剂量时影响雌性动物体重的变化，相应的进食量未见有显著性的变化。其他未见著变。恢复其内也未见显著性变化。

比较二者，产生的影响基本类似，均在中剂量时动物比较敏感，发生波动性变化，停药后均能恢复。

血象检查：

无水硫普罗宁钠给药13周后，与溶媒对照组比较，高剂量组WBC显著性升高(P＜0.05)，低剂量WBC分类中GR％显著升高(P＜0.01)，中剂量组血小板显著减低(P＜0.05)，但均属于正常范围内波动，其它指标未见显著变化，4周恢复期内，以上各指标未见显著性差异。

硫普罗宁给药13周后，与溶媒对照组比较，高剂量组白细胞总数和WBC分类中MO％显著升高(P＜0.05、P＜0.01)，中剂量组WBC分类中MO％和WBC分类中GR％显著升高(P＜0.01、P＜0.01)，低剂量组WBC分类中GR％显著升高(p＜0.05)，但均属于正常范围内波动，4周恢复期内，以上各指标未见显著性差异。

比较二者，产生的影响基本类似，均对WBC及其分类产生一定的影响，但均为生波动性变化，没有剂量依赖关系，停药后均能恢复。

血液生化指标检查：

无水硫普罗宁钠给药13周后，与溶媒对照组比较，高、中剂量组AST显著性升高(P＜0.01、P＜0.05)，高、中、低剂量组T-P显著升高(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01)，但均在正常范围内波动，不属于异常变化。4周恢复期内各指标未见有著变。

硫普罗宁给药13周后，与溶媒对照组比较，高、中剂量组AST显著性升高(P＜0.01、P＜0.05)，低剂量组T-P显著升高(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01)，但均在正常范围内波动，不属于异常变化。4周恢复期内各指标未见有著变。

比较二者，产生的影响基本类似，大剂量时均对AST产生一定的影响，但均为生波动性变化，不属于异常变化，停药后均能恢复。

尿液检查：

硫普罗宁及无水硫普罗宁钠在给药13周后，与溶媒对照组比较，各指标未见有显著性差异(P＞0.05)。经4周恢复后，也未见显著性差异(P＞0.05)。

脏器系数测定：

无水硫普罗宁钠在给药13周后，与溶媒对照组比较，各脏器系数未见有显著性差异(P＞0.05)。经4周恢复后，也未见显著性差异(P＞0.05)。

硫普罗宁在给药13周后，与溶媒对照组比较，脾脏器系数显著性升高(P＜00.01)，其他各脏器系数未见有显著性差异(P＞0.05)。经4周恢复后，也未见显著性差异(P＞0.05)。

比较二者，产生的影响略有差异，硫普罗宁大剂量给药影响脾脏的生长，而无水硫普罗宁钠有升高，但没有显著性差异。但停药后均能恢复。

病理组织学检查结论：

病理检查结果提示受试物无水硫普罗宁钠和硫普罗宁高剂量组对受试动物SD大鼠各受检脏器试验期无毒性作用，恢复期无蓄积毒性。

试验结论：

无水硫普罗宁钠对大鼠长期腹腔注射给药13周，在286、143mg/kg(以70kg人每日200mg计，分别相当于人临床拟用剂量的100倍)时，可使动物的WBC、AST、T-P升高，但属于正常范围内波动，病理学检查也未见有药物引起的病理性改变，停药后4周恢复期内未见有显著性的差异，无蓄积毒性产生。因此可以认为，无水硫普罗宁钠在相当于临床拟用剂量的50倍以下剂量对大鼠是安全剂量。

与硫普罗宁影响的比较，二者产生的影响基本类似，在剂量反应上略有差别。

七、无水硫普罗宁钠注射液过敏、溶血、刺激性研究

为了考察无水硫普罗宁钠注射粉针(无水硫普罗宁钠冻干粉针剂，由实施例4制备，用生理盐水溶解，以下同)的安全性，并且与硫普罗宁注射粉针(以下简称硫普罗宁)进行比较，进行以下实验。选用豚鼠、家兔及家兔红细胞，观察了试药的全身过敏、被动皮肤过敏(PCA)、体外红细胞溶血性以及局部和血管刺激性作用，选用牛血清白蛋白作为豚鼠主动致敏的阳性对照物，天花粉作为PCA的阳性物，结果显示：

过敏性试验，无水硫普罗宁钠生理盐水溶液，低浓度条件下50mg/ml对豚鼠的全身过敏性反应为阴性，高浓度100mg/ml，对豚鼠的全身过敏性反应为弱阳性；硫普罗宁5％的碳酸氢钠注射液，低浓度条件下50mg/ml对豚鼠的全身过敏性反应为弱阳性，高浓度100mg/ml，对豚鼠的全身过敏性反应为阳性。

溶血性试验，无水硫普罗宁钠对红细胞无溶血和凝聚作用，溶血性试验符合要求。硫普罗宁注射粉针40mg/ml以上浓度不发生溶血和凝聚作用。说明无水硫普罗宁钠注射粉针更具安全性。

刺激性实验，无水硫普罗宁钠及硫普罗宁在临床浓度下对家兔血管、肌肉均没有明显病理损伤。

因此，无水硫普罗宁钠及其药物组合物制剂比硫普罗宁钠水合物及硫普罗宁具有稳定性高、治疗效果好、毒性降低等优点。

综上所述，本发明的产品及其制备方法具有如下特点：

1、由于本发明制备方法中所用溶剂均为无水，反应中形成的水又加除水剂立即除去，因此在整个制备过程中也就避免了硫普罗宁因遇水而分解的可能，所以所得产品为无水硫普罗宁钠，而且纯度很高(99％以上)；

2、由于本发明使用的溶剂(如甲醇，乙醇等)沸点低，极易除去，产品中有机溶剂残留极少甚至为零；

3、由于无水硫普罗宁钠在所用沉淀剂中溶解度极小，所以用本发明方法所得产品收率很高(90％以上)；

4、所得产物无水硫普罗宁钠的熔点为154-156℃，因此可以直接用一般方法制备无菌粉针；

5、因产品不含水，也就避免了产品结构上的巯基在有水的环境中长期放置有降解的可能，所以所得产品无水硫普罗宁钠具有很好的稳定性，各项实验结果亦证明本品确有很好的稳定性。

6、无水硫普罗宁钠及其药物组合物制剂比硫普罗宁钠水合物及硫普罗宁具有稳定性高、治疗效果好、毒性降低等优点。

本发明的制备方法突破了专利USP 4346234A所述难以用NaOH，NaHCO₃，NaCO₃等一般无机碱，在甲醇、乙醇等一般有机溶剂中与硫普罗宁进行反应成盐的技术难题，因此本发明的方法具有原料易得、成本低廉、方法简便、易于控制等优点。

具体实施方案

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。

需要说明的是，由于制备或者检测工艺的原因，本发明的硫普罗宁钠可以带有少量非结晶游离水分，但是，这种游离水分的含量一般低于2％，优选低于1％，更优选低于0.5％。

实施例1：制备无水硫普罗宁钠

1.称取MPG(硫普罗宁)49.8g(0.305mol)，置于三口烧瓶中，加入134ml分析纯甲醇，15℃水浴，加入巯基保护剂DTT(二硫苏糖醇)0.5g及分子筛10g搅拌15分钟；

2.称取NaOH14.198g，分6次加入甲醇液中(每次加入2.366g)，每次间隔1小时；

3.第6次加入NaOH后，继续在15℃水浴中，中速搅拌下反应1小时。然后，将反应瓶移入20-25℃水浴中，中进觉拌1小时。抽滤，滤除不溶物，滤液加入402ml丙酮中，充分振摇，使混合均匀，室温放置过夜；

4.过夜的反应液中出现大量白色沉淀，抽滤，滤饼于60℃鼓风干燥2小时，升温到80℃，继续干燥8小时。取出后置于干燥器中冷至室温，称重(40.1g，产率73.94％)。

实施例2：制备无水硫普罗宁钠

称取MPG49.8g(0.305mol)，置于三口烧瓶中，加入134ml分析纯甲醇，15℃水浴，加入巯基保护剂2-巯基乙醇0.5g及分子筛10g，搅拌15分钟。

制备方法除加入的巯基保护剂不同外，其他同实施例1

实施例3：制备无水硫普罗宁钠

称取MPG49.8g(0.305mol)，置于三口烧瓶中，加入134ml分析纯乙醇，15℃水浴，加入巯基保护剂DTT 0.5g及分子筛10g，搅拌15分钟。

制备方法除加入的反应溶剂不同外，其他同实施例1

实施例4：制备无水硫普罗宁钠冻干粉针剂

将实施例1制备的无水硫普罗宁钠114克，甘露醇300g溶于适量的注射用水中，搅拌溶解，加入0.3％的针用活性碳60℃加热30分钟，微孔滤膜过滤除热原，冷却至40℃以下，补足注射用水至全量(2000ml)，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，冻干，加塞，压铝盖，制成冻干粉针剂1000支。

Claims (17)

1.一种用于治疗急、慢性肝病的药物无水硫普罗宁钠，其化学名称是：无水N-(2-巯基丙酰基)甘氨酸钠，具有下面的结构式：

2.一种制备无水硫普罗宁钠的方法，其特征是将硫普罗宁与含钠无机碱在有机溶剂中进行酸碱成盐反应，反应结束后加入沉淀剂进行沉淀析出，过滤、干燥，制得无水硫普罗宁钠。

3.根据权利要求2的制备方法，其中，反应过程中加入除水剂。

4.根据权利要求3的方法，其中，在反应过程中加入巯基保护剂。

5.根据权利要求2-4之一的方法，其中所用的有机溶剂选自极性的有机溶剂。

6.根据权利要求5的方法，其中有机溶剂选自甲醇、乙醇或异丙醇中的一种或多种。

7.根据权利要求6的方法，其中有机溶剂选自甲醇。

8.根据权利要求2-4之一的方法，其中所用的含钠无机碱选自氢氧化钠，碳酸氢钠，碳酸钠、磷酸钠、乙酸钠中的一种或多种。

9.根据权利要求8的方法，其中含钠无机碱选自氢氧化钠。

10.根据权利要求2的方法，其中所用的沉淀剂选用不溶解或微溶解硫普罗宁钠的有机溶剂。

11.根据权利要求10的方法，其中所用的沉淀剂选自丙酮、乙酸乙酯，二氯甲烷中的一种或多种。

12.根据权利要求11的方法，其中沉淀剂选自丙酮。

13.根据权利要求3的方法，其中所用的除水剂选自分子筛、硅胶、无水硫酸镁、无水氯化钙中的一种或多种。

14.根据权利要求13的方法，其中除水剂选自分子筛。

15.根据权利要求4的方法，其中所用的巯基保护剂选自二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸二钠或2-巯基乙醇中的一种或多种。

16.根据权利要求1的无水硫普罗宁钠用于制备预防和/或治疗急慢性肝病的药物的用途。

17.一种用于预防和/或治疗急慢性肝病的药物组合物，其含有治疗有效量的权利要求1的无水硫普罗宁钠和可药用辅料或者赋性剂。