CN1663421A

CN1663421A - 苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法

Info

Publication number: CN1663421A
Application number: CN2005100418070A
Authority: CN
Inventors: 宋纪蓉; 徐抗震; 黄洁; 马海霞
Original assignee: Northwestern University
Current assignee: Northwestern University
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2005-09-07
Anticipated expiration: 2025-03-18
Also published as: CN100353858C

Abstract

本发明公开了一种苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法。其生产工艺过程如下：首先将粉碎的苹果渣配料成液态发酵培养基，然后接入种子培养成熟的混合菌种进行液态深层发酵，最后将深层发酵液再接入到苹果渣的固态发酵培养基中进行固态发酵。与单独固态发酵相比较，该液固态发酵工艺具有种子培养基用量少，菌种纯培养少，降低生产成本；生产的饲料蛋白产品，蛋白含量高，营养丰富，成本较低，更适合苹果渣发酵生产饲料蛋白的工业规模化生产和推广应用。

Description

苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法

技术领域

本发明属于苹果渣发酵生产饲料蛋白的方法。

背景技术

通常所言饲料蛋白(Feeding protein)即单细胞蛋白(Single cellprotein，SCP)，又称微生物蛋白或菌体蛋白，是指酵母菌、真菌、霉菌、及非病性细菌等单细胞生物体内所含蛋白质，含量高达45％-74％，且各种氨基酸搭配合理、种类齐全，维生素和微量元素丰富，不含胆固醇等，这些优点都是一般农作物饲料所不能比拟的。

中国是世界上最大的苹果产地，年产量2200多万吨，比世界总产量的三分之一还多。陕西省又是我国最大的苹果生产基地，目前全省苹果种植总面积达602万亩，年总产量550多万吨，居全国第一位。从上世纪90年代以来，全国大量引进苹果浓缩汁加工生产线，仅陕西省就有二十多条，2003年生产苹果浓缩汁达30万吨，几乎占到世界贸易总量的三分之一，出口三十多个国家和地区，成为全国最大的苹果浓缩汁集中产区。在生产大量浓缩果汁的同时，每年仅陕西就要排放60多万吨的苹果渣。除少量晒干后，作为简单饲料添加利用外，绝大部分因为水分含量高，蛋白含量低，营养价值低，极易腐烂发臭，无法全部利用。特别是水果加工旺季，果汁加工厂周围，渣皮堆积如山，经微生物分解，酸臭难闻，不但严重污染环境，而且造成巨大纤维素和半纤维素资源的浪费。

利用果渣生产蛋白饲料是一条废物利用的良好途径，当前利用(果渣)纤维素资源转化为蛋白饲料的研究比较多。Joshi，VK(Bioresourcetechnology.1996，56，251-255)、Rahmat，H(World journal ofmicrobiology & biotechnology.1995，11(2)：168-170)、Roussos，S.(Advances in solid-state fermentation.1997：257-271)、Sandhu，D.K(Journal of Scientific & Industrial Research.1997，(56)2：86-90)等，以及张玉臻(食品与发酵工业，1996，3：29-32)、籍保平(生物工程进展，1999，19(5)：30-33)、张长霞(山东食品发酵，2003，4：20-22)、高再兴(西北大学学报，2003，33(6)：701-704)、李巨秀(西北农林科技大学学报，2003，31(增)：79-81)、常显波(西北农林科技大学学报(自然科学版)32(1)：40-46)、张乃锋(农业新技术，2004，2：46-47)、王艳华(中国饲料，2004，8：35-35)、罗雯(科学技术与工程，2004，4(5)：371-374)等分别报道了他们利用筛选的单菌种或混合菌种，采用单独固态发酵法以苹果渣为主要原料发酵生产饲料蛋白的研究，由于初始培养基成分、采用菌种以及单独固态发酵工艺参数的不同，因此产物的蛋白含量不尽相同，从15％到35％均有报道。苹果渣发酵生产饲料蛋白的过程是“氮素”的浓缩过程，例如发酵原料从20％的粗蛋白含量发酵到40％的含量，就需要一半质量的碳水化合物在发酵过程中变成H₂O和CO₂，同时由于微生物的生长环境的客观要求，蛋白含量不可能太高，蛋白含量在此没有可比性。同时，对于发酵时间的选取也不尽相同，一般在48-108h之间。如中国专利申请03127919.8公开了一种苹果渣双菌发酵制备饲料蛋白的方法，其发酵时间也长达48-72h。总体考虑，单独固态发酵法存在种子培养基消耗多、接种量大、设备应用相对较多及发酵时间较长等不足，从经济角度而言，投资与生产成本较高，对于生产饲料蛋白这种附加值较低的产品，工业化生产难于实施，目前仍处于实验研究和初步产业化阶段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种设备投资低、混合菌种共生与协同能力强、发酵时间短、蛋白含量等营养价值高、生产成本低廉、经济可行、适合工业化生产的苹果渣发酵生产饲料蛋白的方法。本方法能克服现有的单独固态发酵生产饲料蛋白的种子培养基用量多，菌种纯培养复杂，设备投资和生产成本高，发酵时间相对较长的不足。、

苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法：

(1)首先将粉碎的苹果渣配料成液态发酵培养基；

(2)然后接入种子培养成熟的混合菌种进行液态深层发酵；

(3)最后将深层发酵液再接入到苹果渣固态发酵培养基中进行固态发酵。

液态深层发酵参数为：

种子接种量：5％-20％(v/v)；

液态深层发酵时间：24-48h；

液态深层发酵温度：30-34℃。

固态发酵参数为：

转接量：15-40(mL/100g固态底物)；

料层厚度：3-5.5cm；

固态发酵温度：30-34℃；

固态发酵时间：72-96h。

液态发酵培养基和固态发酵培养基主要由粉碎的苹果渣、尿素、无机盐和水组成。液态发酵培养基中固态成分及含量为苹果渣78％-91％，蔗糖5％-10％，尿素1％-4％，(NH₄)₂SO₄ 1％-4％，KH₂PO₄ 1％-4％，加入10-15倍固态物料的水成为液态发酵培养基。

苹果渣固态培养基成分及含量为苹果渣75％-85％，麸皮10％-20％，尿素2％-4％，(NH₄)₂SO₄ 1％-3％，KH₂PO₄ 2％-4％，加水调节初始含水量为50％-75％。

混合菌种含有产朊假丝酵母、果酒酵母、绿色木霉。菌种的体积混合比是产朊假丝酵母∶绿色木霉∶果酒酵母＝(3-4.5)∶(2-4)∶(1-2)；菌种的体积混合比也可以是产朊假丝酵母∶绿色木霉∶果酒酵母∶康宁木霉＝(2-4)∶(1-2)∶(6-8)∶(1-3)。

苹果渣粒径对液态发酵效果有显著影响。粒径越小，果渣在溶液中的分散越好，其营养物质越有利于被微生物利用，在对数增长期，菌种生长繁殖的更加旺盛。由实验结果表明过60目筛的原料适宜生产应用。

在菌种处于对数增长期时进行转接，活菌种数量较多，分裂生长旺盛，适宜转接。经过深层液态的混合发酵，菌种之间的共生与协同能力变强，在固态发酵过程中，生长旺盛、速度快，能缩短停滞期和发酵时间。实验结果表明在36h以前粗蛋白含量迅速增加，而后趋于平缓。即此时为较佳转接时间。

减少转接量意味着生产便利和固态发酵产量的增加，应该在允许的范围内尽可能降低接种量。但太少，使发酵时间延长，蛋白含量低，同时发挥不了菌种优势，容易感染其他杂菌，产生异味，影响发酵产物的品质。实验表明15-40mL/100g固态发酵底物即可满足生产需要。

发酵时间是生产控制的重要参数。时间短，达不到理想的蛋白含量；但太长，蛋白增加不显著，而生产周期变长，生产成本变大。实验结果表明发酵72h以后，粗蛋白含量不再有明显上升趋势，即72h较佳时间选择。而单独固态发酵需要96h以上，与单独固态相比时间缩短24h，明显缩短了生产周期，且粗蛋白含量有所增加。

与单独固态发酵相比较，该液固态发酵工艺的主要优点：

1.种子培养基用量少，菌种纯培养少，可以降低生产成本。

2.将三个或四个菌种进行的单独放大培养改变成为一个大发酵罐的混合培养，可以简化生产工艺，减少设备投资。

3.提前将菌种进行混合放大培养，既使混合工艺变得简单，又使菌种之间提前相互适应，共生与协同作用能力变强。

4.在进行固态发酵时，单位接种变大及混合菌种较强的共生和协同作用能力，能明显缩短发酵时间和生产周期，设备利用率高，产量大。

5.同时生产的饲料蛋白产品，蛋白含量高，营养丰富，成本较低，更适合苹果渣发酵生产饲料蛋白的工业规模化生产和推广应用，为短缺的蛋白饲料提供一条新途径。

附图说明

附图1为苹果渣发酵生产饲料蛋白的液固态发酵工艺流程图。

具体实施方式

实施例1：

种子培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，水若干；其制作方法为：将马铃薯切成小块，加适量的自来水沸煮20-30min，过滤，取滤液并加自来水至1000mL。

种子菌种的培养：取300mL种子培养基置入500mL锥形瓶并在121℃下保持20min灭菌，冷却室温后接入每一个斜面菌种，在空气浴摇床30-32℃，120-140rpm培养36-54h，得到培养成熟的种子菌种。

液态深层发酵培养基组成为：干苹果渣90％，蔗糖5％，尿素2％，(NH₄)₂SO₄ 2％，KH₂PO₄ 1％。并加入10倍固态物料的水。

接入的混合菌种及比例：产朊假丝酵母∶绿色木霉∶果酒酵母＝4∶3∶1.5，

固态培养基组成为：干苹果渣75％，麸皮20％，尿素2％，(NH₄)₂SO₄ 2％，KH₂PO₄ 1％，加水调节初始含水量为60％。

鲜湿苹果渣经过热风干燥线75℃干燥并粉碎过筛后，取过60目的原料配制成液态发酵培养基置入大型发酵罐，同时按10％(v/v)的量接入种子罐培养成熟的混合菌种，在32℃下，液态深层发酵36h，然后将深层发酵液按30mL/100g固态底物的量倒入配好的苹果渣固态培养基中，在初始含水量65％不灭菌条件下，32℃固态培养72h后取出发酵样品，经干燥、造粒、包装即得到苹果渣饲料蛋白产品。

对比的单独固态发酵实验：鲜湿苹果渣经过热风干燥线75℃干燥并粉碎后配料成固态发酵培养基，其组成为：干苹果渣75％，麸皮20％，尿素2％，(NH₄)₂SO₄ 2％，KH₂PO₄ 1％。按10％(v/v)的量接入种子罐培养成熟的混合菌种(混合比例产朊假丝酵母∶绿色木霉∶果酒酵母＝4∶3∶1.5)，初始含水量65％，不灭菌条件下，32℃固态培养96h后取出发酵样品，经干燥、造粒、包装即得到苹果渣饲料蛋白产品。

进行上述两种不同发酵形式的产品主要成分、微量元素和氨基酸组成测定结果如表1、表2和表3所示：

表1 主要成分含量(％)

粗蛋白真蛋白粗脂肪粗纤维灰分

发酵原料 16.28 10.02 8.94 16.68 4.25

单独固态发酵产物 28.43 26.59 13.47 10.84 6.52

液固态发酵产物 29.08 26.63 13.56 10.32 7.85

表2 微量元素含量(mg/kg)

Ca(％) Mg(％) Fe Zn Mn Cu Se Pb Cd As

苹果

0.113 0.061 169.2 14.6 13.1 9.8 0.18 0.6 0.02 0.17

渣

发酵

0.493 0.204 276.8 31.3 20.8 16.7 0.29 1.6 0.68 0.59

产物

表3 氨基酸含量(％)

项目	苹果渣	发酵原料	单独固态发酵产物	液固态发酵产物
项目	苹果渣	发酵原料	单独固态发酵产物	液固态发酵产物	天冬氨酸ASP苏氨酸 THR丝氨酸 SER谷氨酸 GLU脯氨酸 PRO甘氨酸 GLY丙氨酸 ALA半胱氨酸CYR缬氨酸 VAL蛋氨酸 MET异亮氨酸ILE亮氨酸 LEU酪氨酸 TYR苯丙氨酸PHE赖氨酸 LYS组氨酸 HIS精氨酸 ARG	0.48870.19870.17790.80550.27820.23470.20140.06070.31360.05940.22610.43820.19580.27000.18460.07110.2477	0.8480.33910.37271.6830.52660.50570.48380.08430.97720.14820.23640.53680.41490.60140.27530.1940.5048	1.69500.75330.83952.40600.85000.84890.95950.10500.97670.18460.85451.21200.59960.82691.00100.39350.8729	1.86400.87570.88952.67300.74210.89870.97000.25391.33400.22440.83641.30700.75230.82291.03300.38900.9563
总量	4.4523	8.7322	15.3789	16.8222

测定方法：

粗蛋白的测定：采用国标GB/T6432-86，即微量凯氏定氮法。

真蛋白的测定：采用改进的微量凯氏定氮法——称取固态发酵产物5g，用40mL 75％乙醇浸提24h，充分搅拌，抽滤，滤渣再用40mL 75％乙醇反复洗涤2次，以洗去无机氮和尿素，同时沉淀蛋白质。将沉淀于65℃下干燥至恒重，准确称取1g左右进行硝化，再用微量凯氏定氮法测定，即上述国标GB/T6432-86。

粗脂肪含量的测定：采用国标GB/T6433-86，即索氏提抽法。

粗纤维含量的测定：采用国标GB/T6434-86，即酸碱洗涤法。

灰分含量的测定：采用国标GB/T6438-86，即化灰法。

氨基酸的测定：由西北农林科技大学分析测试中心121-MB型氨基酸分析仪测定。

由上述测定结果可知，以苹果渣为主要原料，经混合菌种液固态发酵后，产物主要成分都发生明显变化，粗蛋白、真蛋白、粗脂肪、灰分含量分别提高了78.62％、165.76％、51.67％和84.70％，而粗纤维则降低了38.13％，经17种必要的氨基酸测定分析，其含量急剧提高且丰富、齐全，尤其是对于禽畜生长十分重要的丝氨酸、赖氨酸、酪氨酸和精氨酸等分别比发酵原料增率高达162.3％、275.2％、81.3％和89.4％，营养价值显著增加。

由两种不同工艺形式的发酵产品主要成分和氨基酸含量的比较可知，液固态发酵比单独固态发酵营养成分有所增加，也再次说明液固态发酵优于单独固态发酵。

由微量元素的测定可知，有益元素含量丰富，而重金属元素含量符合国家同类饲料基料卫生标准要求。经权威部门农业部饲料质量监督检测中心(西安)检测发酵产品，沙门氏菌均未检出，黄曲霉毒素B₁0.0034mg/kg远远小于同类饲料基料如麸皮、玉米(0.05mg/kg)等国家饲料卫生标准(GB13078-91)的要求。经陕西省疾病预防控制中心进行毒理检验，产品属实际无毒级，可作为蛋白饲料广泛应用于养殖领域。

实施例2：

鲜湿苹果渣经过热风干燥线65℃干燥并粉碎过筛后，取过40目的原料按液态发酵培养基置入大型发酵罐，液态发酵培养基的组成为：干苹果渣90％，蔗糖4％，尿素2％，(NH₄)₂SO₄ 2％，KH₂PO₄ 2％，并加入12倍固态物料的水分。同时按8％(v/v)的量接入种子罐培养成熟的混合菌种，其接入的菌种比例：产朊假丝酵母∶绿色木霉∶果酒酵母∶康宁木霉＝2∶1.5∶6∶3，在33℃下，液态深层发酵36h，然后将发酵液按20mL/100g固态底物的量倒入配好的苹果渣固态培养基，培养基的组成为：干苹果渣84％，麸皮10％，尿素3％，(NH₄)₂SO₄ 2％，KH₂PO₄ 1％。在含水量70％不灭菌条件下，33℃下固态培养78h后取出发酵样品，干燥、造粒、包装即得到苹果渣饲料蛋白产品。其粗蛋白含量可达27.69％，真蛋白含量25.21％。

测定方法同上。

Claims

1、苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法，其特征在于：

(1)首先将粉碎的苹果渣配料成液态发酵培养基；

(2)然后接入种子培养成熟的混合菌种进行液态深层发酵；

2、根据权利要求1所述的苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法，其特征在于：

液态深层发酵参数为：

种子接种量：5％-20％(v/v)；

液态深层发酵时间：24-48h；

液态深层发酵温度：30-34℃。

3、根据权利要求1所述的苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法，其特征在于：固态发酵参数为：

转接量：15-40(mL/100g固态底物)；

料层厚度：3-5.5cm；

固态发酵温度：30-34℃；

固态发酵时间：72-96h。

4、根据权利要求1-3任意之一所述的苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法，其特征在于：液态发酵培养基和固态发酵培养基主要由粉碎的苹果渣、尿素、无机盐和水组成。

5、根据权利要求4所述的苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法，其特征在于：液态发酵培养基中固态成分及含量为苹果渣78％-91％，蔗糖5％-10％，尿素1％-4％，(NH₄)₂SO₄ 1％-4％，KH₂PO₄ 1％-4％，加入10-15倍固态物料的水成为液态发酵培养基。

6、根据权利要求4所述的苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法，其特征在于：苹果渣固态培养基成分及含量为苹果渣75％-85％，麸皮10％-20％，尿素2％-4％，(NH₄)₂SO₄ 1％-3％，KH₂PO₄ 2％-4％，加水调节初始含水量为50％-75％。

7、根据权利要求1-3任意之一所述的苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法，其特征在于：混合菌种含有产朊假丝酵母、果酒酵母、绿色木霉。

8、根据权利要求7所述的苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法，其特征在于：菌种的体积混合比是产朊假丝酵母∶绿色木霉∶果酒酵母＝(3-4.5)∶(2-4)∶(1-2)。

9、根据权利要求7所述的苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的方法，其特征在于：菌种的体积混合比是产朊假丝酵母∶绿色木霉∶果酒酵母∶康宁木霉＝(2-4)∶(1-2)∶(6-8)∶(1-3)。