CN105104756B

CN105104756B - 一种可替代鱼粉的菌糠蛋白肽及其制备方法和在水产养殖中的应用

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Publication number: CN105104756B
Application number: CN201510583474.8A
Authority: CN
Inventors: 张东升; 张平; 张一平; 何静霞; 周群兰; 汪洁; 王红连; 蒋益; 全卫丰; 匡群
Original assignee: Wuxi Wuzhiyuan Biological Agricultural Technology Co Ltd; JIANGSU INSTITUTE OF SUWEI MICROBIOLOGY RESEARCH; Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Wuxi Wuzhiyuan Biological Agricultural Technology Co Ltd; JIANGSU INSTITUTE OF SUWEI MICROBIOLOGY RESEARCH; Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2015-09-15
Publication date: 2018-08-07
Anticipated expiration: 2035-09-15
Also published as: CN105104756A

Abstract

一种可替代鱼粉的菌糠蛋白肽及其制备方法和在水产养殖中的应用，属于微生物和水产养殖饲料技术领域。本发明以食用菌菌糠废料为基础原料，首先采用先灵芝菌，后酿酒酵母的分步固体发酵技术，将食用菌菌糠的原始营养物质充分转化为高品质的菌体蛋白和多糖类；然后采用纤维素酶、食用菌水解酶和酵母抽提酶相结合的酶解技术，使蛋白质充分释放并水解为短分子量的小肽；最后经浓缩、干燥，获得富含易消化小肽，并具有较强DPPH自由基清除能力的菌糠蛋白肽产品。本发明具有菌糠利用率高、产品得率高、操作简单，实用性强，便于推广的优点；用于水产养殖饲料，可部分替代鱼粉，起到促进水生动物生长、提高饲料利用率的作用。

Description

一种可替代鱼粉的菌糠蛋白肽及其制备方法和在水产养殖中的应用

技术领域

一种可替代鱼粉的菌糠蛋白肽及其制备方法和在水产养殖中的应用，本发明涉及一种具有较高短肽含量和抗氧化能力的菌糠蛋白水解产品，及其生产制备方法和作为鱼粉替代品在水产养殖中的应用，属于微生物和水产养殖饲料技术领域。

背景技术

菌糠是利用秸秆、木屑等原料进行食用菌袋料栽培，收货后的培养基剩余物，俗称食用菌栽培废料或菌渣。近年来，随着我国食用菌生产规模的扩大和产量的提高，食用菌已成为除粮棉油果茶后的第六大农产品。据中国食用菌协会统计，2010年全国食用菌总产量已达1800万吨，估计产生的食用菌菌糠废料总量约3087.1万吨。

作为养殖业大国，我国每年对饲料的需求量非常庞大，饲料蛋白源的供需矛盾非常突出。据统计，目前我国配合饲料年产量已达7000余万吨，年需蛋白质1100多万吨，而全国各种饼粕、酵母、鱼粉等仅能满足70%-80%，余下的20%-30%必须依赖进口。另一方面，我国还存在着有限的蛋白质饲料资源严重浪费的现象，主要表现为蛋白质的消化吸收利用率低。饲料蛋白源的短缺和蛋白质的低效率利用，已成为制约我国饲料养殖业可持续健康发展的重要瓶颈。

菌糠含有丰富的营养成分，粗蛋白含量6.45%-10.2%，粗脂肪含量0.1%-1.4%，粗纤维含量9.3%-29.2%，无氮浸出物为13.8%-63.5%，还含有钙、磷、铁、镁、锌、铜等微量元素。适当调整碳氮比例，菌糠即可成为优良的培养基，经多种微生物的发酵作用，粗蛋白和粗脂肪含量可提高1倍以上，粗纤维和木质素可降低30%-50%。因此，利用菌糠固体发酵制备菌体蛋白，既开辟了蛋白质来源新途径，又解决了大量菌糠的去处，实现变废为宝、提高附加值、增加经济效益的目的。

国内关于菌糠发酵的专利主要有如下几项：CN103053858A公开了一种由金针菇菌糠与纤维素酶、黑曲霉菌等一起发酵而得的菌糠饲料；CN101099543A公开了一种由菌糠接种芽孢杆菌、酵母菌、乳杆菌和沼泽红假单孢菌发酵而得的水产生物饲料；CN104509714A将姬松茸菌糠接种EM菌发酵，制备得到一种畜禽饲料；CN102273544B将杏鲍菇菌糠与乳酸菌、酵母菌或芽孢杆菌经恒温发酵、干燥处理后得到一种生物饲料；CN102972623B将真姬菇菌糠与辅料配伍，接入酵母和白地霉发酵，得到含丰富蛋白质的饲料；CN101467589A公开了一种使用厌氧菌发酵菌糠制备生物饲料的方法；CN102370047A公开了采用由粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌组成的复合菌剂固态发酵食用菌菌糠，生产全价生物饲料；CN100389672A公开了一种用酵母菌和木霉发酵废弃菌糠制备蛋白饲料的方法。以上专利采用的菌糠发酵菌种多属于细菌类、酵母类和霉菌类，发酵工艺多采用复合菌一步发酵技术，主要目的是改善菌糠的适口性、易消化性和提高蛋白含量，使菌糠成为初级饲料原料。

小肽营养理论是近年来动物营养学领域出现的新理论，基于动物对肽有着特殊营养需求的观点，认为蛋白质在动物胃肠道消化酶作用下的水解产物大部分是低分子量的小肽，它们以完整形式被吸收进入血液循环系统从而被组织利用，参与各项生命活动。小肽的吸收机制优于蛋白质和氨基酸，吸收更容易更快，吸收率高，并具有低抗原性、低渗透压性，不会引起过敏、腹泻等不良反应。小肽营养理论的另一重要认识是蛋白质在酶解过程中可以产生一些具有特殊生理功能的生物活性肽，这些肽类在调节胃肠道运动、调节免疫系统、抗高血压、抗菌、抗血栓、抗病毒、抗癌、清除自由基和促进矿物元素吸收等方面发挥着重要作用。

将菌糠转化成基于小肽营养理论的高品种饲料替代品，国内这方面的专利还很少，目前仅CN102669409A报道将香菇菌渣与水混合，高压均质，再用纤维素酶和碱性蛋白酶双重酶解，获得香菇渣促发酵肽；CN102199647A报道将食用菌副产物捣碎，用蛋白酶酶解，再经粗滤、超滤、浓缩、干燥，获得分子量小于8000的食用菌活性肽；CN101396378A报道了一种食用菌粉通过酶解、分离、浓缩、干燥等，制备纳米粒径基因肽产品的方法。这些专利均不经过发酵处理，而是直接用菌糠制备蛋白肽，由于起始原料的蛋白含量低，最终肽产品的收获量偏少，并且用到了均质、超滤等工序，生产成本偏高。

另有专利CN104472859A报道了一种将菌糠加热回流提取，提取液浓缩，接种复合菌发酵、干燥，制备成蛋白饲料添加剂的方法。该方法同样没有对菌糠的原始营养成分进行充分利用，仅是对菌糠的提取物进行发酵处理。

发明内容

本发明的主要目的是针对当前我国饲料蛋白源紧缺，蛋白质利用率低的现状，以及现有技术和产品的不足，提供一种能更有效地促进动物生长、提高饲料利用率的新型菌糠蛋白肽产品。该产品富含大量低分子量小肽、多糖和其它生长因子，并具有较高的清除DPPH自由基的抗氧化能力，可部分替代鱼粉使用。

本发明的进一步目的是提供一种新型菌糠蛋白肽的制备方法，该方法充分利用了菌糠中的原始营养成分，将菌糠发酵和蛋白肽制备相结合，采用先接种灵芝菌、后接种酿酒酵母的混菌固体分步发酵技术和酶水解技术，工艺简单实用，生产成本低廉，适合大面积推广。

本发明的更进一步目的是提供一种新型菌糠蛋白肽产品在水产养殖中的应用方法，包括添加方式、添加剂量、饲喂周期、养殖技术模式和养殖管理操作规程等。

为了达到本发明目的，本发明采用的技术方案是：

一种可替代鱼粉的菌糠蛋白肽，是以食用菌菌糠废料为基础原料，接种灵芝菌和酿酒酵母分步发酵，再经温和酶解、喷雾干燥后，制备成的粉末状产品，其相对分子质量≤2000的肽段占干重的60％以上，并具有较高的清除DPPH自由基的抗氧化能力。

1、一种可替代鱼粉的菌糠蛋白肽的制备方法，以食用菌菌糠废料为基础原料，首先采用先灵芝菌、后酿酒酵母的分步固体发酵技术，将食用菌菌糠的原始营养物质充分转化为高品质的菌体蛋白和多糖类；然后采用纤维素酶、食用菌水解酶AO₂和酵母抽提酶相结合的酶解技术，使蛋白质充分释放并水解为短分子量的小肽；最后经浓缩、干燥，获得富含易消化小肽，即可替代鱼粉的菌糠蛋白肽；其制备步骤如下：

（1）菌糠的预处理

将块状食用菌菌糠打碎，并除去肉眼可见的杂质后，转移至烘箱，50℃干燥至含水量低于5%，粉碎，过40目筛，备用；

（2）菌糠的发酵

所采用的菌糠发酵工艺是以食用菌菌糠废料为基础原料，先接种灵芝菌，发酵长满菌丝后再接种酿酒酵母的混菌固体分步发酵技术；

①菌体活化

灵芝菌种划线接种于PDA斜面培养基，PDA斜面培养基组成以g/L计为：葡萄糖20、琼脂20，用土豆汁配制，pH自然。28℃培养7天后，观察其生长情况，若长势良好即为成熟，准备移种；

土豆汁制备方法为：土豆200g，去皮，切成小块，加入1L左右的去离子水煮沸30min，过滤，所得滤液用去离子水定容至1L；

酿酒酵母划线接种于麦芽汁琼脂培养基，28℃培养2天后，观察其生长情况，若长势良好即为成熟，准备移种；

所使用的灵芝菌和酿酒酵母，均为农业和食品领域常用的生产菌种，可通过商业途径或国家指定机构购买；

所使用的麦芽汁琼脂培养基可从市售途径购买；

②种子培养液制备

用接种铲从斜面上挑取大约1cm×1cm的灵芝菌块，接入经灭菌的灵芝菌液体培养基中，140r/min旋转式摇床，28℃培养7天；

灵芝菌液体培养基组成以g/L计为：豆饼粉20、玉米粉20、葡萄糖20、K₂HPO₄ 1、MgSO₄ 0.5、V_B 0.12，用自来水配制，pH自然；

用接种环从斜面上挑取一环成熟的酿酒酵母菌体，接入经灭菌的麦芽汁液体培养基中，150r/min旋转式摇床，28℃培养2天；

所使用的麦芽汁液体培养基可从市售途径购买麦芽汁培养基粉末后，用自来水配制，pH自然；

③分步发酵

将灵芝菌种子培养液以体积比5%的接种量接入已灭菌的菌糠固体发酵培养基中，28℃静置培养7天；然后，以10⁸个/g的接种量接入酿酒酵母种子培养液，28℃培养4天；

菌糠固体发酵培养基组成以g/kg计为：菌糠880，麸皮100，尿素20，料水重量比1︰1.8，pH自然；

（3）菌糠的酶水解

将发酵结束后的固体培养物置于烘箱中50℃烘干，粉碎，水洗除杂。按料水重量比1︰5加水，调节pH至4.8，以烘干固体培养物的重量百分比，加入纤维素酶0.7%，50℃酶解1h；接着调节pH至6.5，以烘干固体培养物的重量百分比，加入食用菌水解酶AO₂0.5%和酵母抽提酶1%，55℃酶解4h；酶水解结束后，升温至85℃，灭酶10 min；

（4）菌糠蛋白肽的提取

将灭酶后的水解液，4000r/min离心15 min，收集上清液减压浓缩至1/4体积，喷雾干燥得到菌糠蛋白肽粉。

2．成品指标

所述的菌糠，包括香菇、猴头菇、鸡腿菇、茶树菇、杏鲍菇、木耳、灵芝、姬松茸、或灰树花食药用菌，采摘完子实体后剩余的固体废料。

所述菌糠蛋白肽是以食用菌菌糠废料为基础原料，接种灵芝菌和酿酒酵母分步发酵，再经温和酶解、喷雾干燥后，制成的粉末状产品。

所述菌糠蛋白肽是以食用菌菌丝体蛋白和酵母微生物蛋白为基础蛋白源，经酶解法生产的，主要成分为短肽的粉末状产品，其相对分子质量≤2000的肽段占产品干重的60％以上，并具有较高的清除DPPH自由基的抗氧化能力。

可替代鱼粉的菌糠蛋白肽成品为淡黄色或黄色粉末状，色泽均一，具有特有的滋味与气味，无其他异味。粗蛋白（以干基计，N×6.25）≥70%，肽含量（以干基计）≥60%，相对分子质量≤2000的肽段含量（以干基计）≥60%，粗灰分（以干基计）≤8.0%，水分≤7.0%。并具有较高的清除DPPH自由基的抗氧化能力。

3．可替代鱼粉的菌糠蛋白肽的应用，部分替代水生动物饲料中的主要蛋白原料——鱼粉，菌糠蛋白肽在水产养殖中的用法如下：

（1）用于水生动物饲料，加入量为饲料干重的1.6%-8%，同时替代16%-80%的鱼粉。

（2）所述水生动物，包括甲鱼、虾、蟹甲壳类水生动物和其它各种淡水鱼、海水鱼等。

本发明的有益效果：

①灵芝菌对纤维素和木质素等具有较强的分解转化能力，产生的多糖具有一定的保健功能；酵母菌生长迅速，是生产菌体蛋白的理想微生物。本发明采用先灵芝菌，后酿酒酵母菌的固态分步发酵技术，将菌糠中的原始营养成分充分转化为高品质的菌丝体蛋白、微生物蛋白和多糖类等，使发酵菌糠的真蛋白含量和粗多糖含量比原始菌糠有显著提高。

②本发明采用发酵和酶解相结合的方法制备菌糠蛋白肽，不同于以往单一发酵法或单一酶法的专利。首先采用灵芝菌和酿酒酵母的生物发酵处理，使菌糠中可利用的原始营养成分被充分地转化为菌体蛋白和多糖，然后再用纤维素酶、食用菌水解酶和酵母抽提酶相结合的酶解技术，使蛋白充分地释放出来并水解为短分子量的小肽。本发明的方法，具有较强的实际可操作性，便于推广使用，能深度利用菌糠资源，获得更多的小肽产量。

③本发明是基于最新的小肽营养理论。有研究指出，蛋白质在动物消化道中的水解产物大部分为2个或3个氨基酸残基的小肽，它们以完整形式被吸收而被组织利用。小肽的吸收机制与游离氨基酸完全不同，它是一个依赖H^＋和Ca^＋浓度、电导率和耗能的独立过程，可以通过载体直接被吸收进入肠粘膜细胞。小肽与氨基酸相互独立的吸收机制，有助于减轻由于游离氨基酸相互竞争共同吸收位点而产生的吸收抑制，再加上肽本身对转运机制的促进作用，使动物对小肽的吸收速度更快、效率更高、耗能更低、不易饱和。因此，本发明的菌糠蛋白肽，部分替代鱼粉加入饲料后，可提高饲料中小肽的含量，从而提高饲料蛋白质的生物效价，使饲料蛋白质更容易被吸收利用，使动物获得更佳的生产性能。

④本发明是基于最新小肽营养理论对生物活性肽的认识。有研究报道认为，具有抗氧化生物活性的多肽片段一般由5-16个氨基酸残基组成，分子量约为600 -1700，且含有较多的谷氨酸（Glu）、亮氨酸（Leu）等氨基酸及其衍生物。本发明的菌糠蛋白肽，主要成分为分子量小于2000的短肽，其1mg/mL的水溶液对DPPH自由基的清除率高达75.54%，并且其DPPH自由基清除能力最强的组分经结构分析，含有Glu-Ser-Ala-Gly-Leu的肽链。因此，本发明的菌糠蛋白肽，加入饲料后，能提高动物的抗氧化能力，从而有利于减少自由基对机体的损伤。

⑤本发明的菌糠蛋白肽来源于食用菌菌丝体蛋白和酵母微生物蛋白，具有两种生物蛋白肽的双重功效。此外，本发明的菌糠蛋白肽是一种复合型混合物，还含有大量的多糖类，主要是原始菌糠中的食用菌多糖、发酵以后新产生的灵芝多糖和酵母葡聚糖，这些多糖均对动物有多种生理功效。有些肽会与多糖结合形成糖肽类物质，从而表现出特殊的生理功效。因而，本发明的菌糠蛋白肽是一种新型功能性高蛋白饲料原料，对动物具有多种生理作用。

附图说明

图1 样品中肽的相对分子质量及其分布范围。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。

实施例1 菌糠蛋白肽的制备

（1）菌糠预处理

将2000g块状食用菌菌糠打碎，并除去肉眼可见的杂质后，转移至烘箱，50℃干燥至含水量低于5%，粉碎，过40目筛，备用。

（2）菌糠发酵

①培养基的配制

PDA斜面培养基：称取土豆200g，去皮，切成小块，加入1L去离子水煮沸30 min，煮沸过程中适当补入去离子水；然后过滤，所得滤液用去离子水定容至1L；再加入葡萄糖20g，琼脂20g，pH自然。121℃灭菌30 min，制成斜面。

麦芽汁琼脂培养基：称取麦芽汁琼脂培养基145.1g，加入去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，115℃灭菌15 min，制成斜面。

灵芝菌液体培养基：称取豆饼粉20g、玉米粉20g、葡萄糖20g、K₂HPO₄ 1g、MgSO₄0.5g、V_B 0.12g，用自来水溶解并定容至1L，pH自然，分装于500 mL三角瓶中，每瓶装液100mL，121℃灭菌20 min，备用。

麦芽汁液体培养基：称取麦芽汁培养基粉末130.1g，加入适量自来水，搅拌加热煮沸至完全溶解，再用自来水定容至1L，pH自然，分装于500 mL三角瓶，每瓶装液100 mL，115℃灭菌15 min，备用。

菌糠固体发酵培养基：称取预处理后的菌糠1760g，麸皮200g，尿素40g，料水重量比1︰1.8，pH自然，充分混匀后，装袋，500 g/袋，不压实，121℃灭菌40 min，备用。

②菌体活化和种子培养液的制备

灵芝菌种划线接种于PDA斜面培养基，于培养箱中28℃培养7天后，用接种铲挑取大约1cm×1cm的成熟菌块接种于含有100 mL灵芝液体培养基的三角瓶中，140r/min旋转式摇床，28℃培养7天。

酿酒酵母菌种划线接种于麦芽汁琼脂斜面培养基，于培养箱中28℃培养2天后，用接种环挑取一环成熟菌体接种于含有100 mL麦芽汁液体培养基的三角瓶中，150 r/min旋转式摇床，28℃培养2天。

③分步发酵

将制备好的灵芝菌种子培养液按照体积比5%的接种量接入已灭菌的菌糠固体发酵培养基中，即每袋接入25 mL的灵芝菌种子培养液，28℃，50%-60%湿度环境中避光静置培养7天。然后以10⁸个/g的接种量接入酿酒酵母种子培养液，继续28℃静置培养4天。

（3）发酵菌糠的酶水解

发酵结束后的固体培养物，经测定其真蛋白含量达15.75g/100g，粗多糖含量达4.48 g/100g，分别比原始菌糠提高了70.27%和154.55%。将该固体培养物置于50℃烘箱中烘干，粉碎；然后称取1000 g，加10倍重量的水进行洗涤除杂，抽干。再加入5L水，搅拌均匀并调节pH至4.8，添加纤维素酶7g，水浴锅中50℃酶解1h；接着调节pH至6.5，加入食用菌水解酶AO₂ 5g，酵母抽提酶10g，55℃酶解4h。酶水解结束后，升温至85℃，灭酶10 min。

（4）菌糠蛋白肽的提取

将灭酶后的水解液在4000r/min条件下离心15 min，收集上清液；将上清液于55℃水浴中减压浓缩至1/4体积，然后进行喷雾干燥，获得80g菌糠蛋白肽。

实施例2 菌糠蛋白肽的测定

（1）分子量分布的测定

称取20mg菌糠蛋白肽粉于10mL容量瓶中，用流动相（乙腈︰水︰三氟乙酸＝45︰55︰0.1，体积比）定容至刻度，超声振荡10min，使样品充分溶解，过0.22μm尼龙过滤膜，上凝胶色谱仪分析。分析条件：Waters1525，色谱柱TSK gel G2000 SWXL 300mm×7.8mm；流动相为乙腈︰水︰三氟乙酸＝45︰55︰0.1（体积比）；检测波长UV 220nm；流速0.5mL/min，柱温30℃，进样体积10μL，凝胶色谱柱的柱校按标准品（乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸）峰计算不低于5000，低聚肽的分配系数（Kd）在0~1间。将测得的色谱数据代入GPC数据处理软件自带的校正曲线方程进行计算，即得到样品中肽的相对分子质量及其分布范围，见附图1。

用峰面积归一化法计算相对分子质量范围在5000以下的蛋白水解物的峰面积相对百分比之和，见下表1：

表1 样品中相对分子质量的峰面积表

（2）肽含量的测定

称取20mg菌糠蛋白肽粉于10mL容量瓶中，用流动相（乙腈︰水︰三氟乙酸＝45︰55︰0.1，体积比）定容至刻度，超声振荡10min，使样品充分溶解混匀，过0.22μm尼龙过滤膜；取滤液，根据“GB/T22729-2008海洋鱼低聚肽粉”的方法，测得其样品中肽含量（以干基计）为67%，相对分子质量≤2000的肽段含量（以干基计）为64.15%。

（3）抗氧化能力测定及氨基酸结构分析

DPPH自由基清除率的测定方法：取2 mL待测溶液于EP管中，加入2 mL浓度为0.01 mmol/L 的DPPH无水乙醇溶液，混合均匀，室温下暗处反应30 min，在波长517 nm处，测其样品吸光度A_sample。另取2 mL待测溶液于EP管中，加入无水乙醇2 mL，暗处反应30 min，在波长517 nm处，测其空白吸光度A_blank。以2 mL浓度为0.01mmol/L 的DPPH无水乙醇溶液和2 mL无水乙醇反应作为参照，测其对照吸光度A_control。按照下式计算样液的DPPH自由基清除率：

将菌糠蛋白肽粉用蒸馏水配制成1mg/mL的肽溶液，采用上述方法测得DPPH清除率达75.54%。将该肽溶液采用RP-HPLC进行色谱分离纯化（waters制备液相系统，洗脱条件：Galaksil色谱柱EP-C18，10mm×250mm；检测波长220 nm；柱温20℃；进样量3mL；流速5.0mL/min；流动相A为0.1% 三氟乙酸-水；流动相B为0.1% 三氟乙酸-乙腈，梯度洗脱），得到100个主要的色谱纯组分，其中9个组分的DPPH清除率在20%以上，第22个组分清除率最高达45.73%。

用液质联用仪（Waters Maldi Synapt Q-TOF MS）对DPPH清除率最高的第22个组分进行氨基酸结构分析，显示含有Glu-Ser-Ala-Gly-Leu的小肽结构，具有较高的清除DPPH自由基的抗氧化能力。

实施例3：菌糠蛋白肽饲喂鲫鱼

试验在中国水产科学院淡水渔业研究中心实验室内完成。鱼种由该中心渔场提供。选择健康、规格、重量基本一致的鲫鱼540尾，个体初重为（20±0.5）g。将鱼种随机分成6组，每组3个重复，每个重复30尾，以重复为单位放养于规格为1.00 m×1.00 m×1.00 m的网箱内。

基础饲料参考中国水产行业标准SC/T 074-2004配制。对照组饲喂基础饲料（鱼粉10%，不加入菌糠蛋白肽）；试验组在基础饲料中加入菌糠蛋白肽，同时减去对应量的鱼粉，其中：试验1组（鱼粉8.4%、菌糠蛋白肽1.6%）、试验2组（鱼粉6.8%、菌糠蛋白肽3.2%）、试验3组（鱼粉5.2%、菌糠蛋白肽4.8%）、试验4组（鱼粉3.6%、菌糠蛋白肽6.4%）、试验5组（鱼粉2%、菌糠蛋白肽8%）。

鲫鱼在网箱驯养30 d后，开始投喂试验饲料，投饲率为鱼体重的2%-4%，每天投喂4次，在08︰00-08︰30、11︰00-11︰30、14︰00-14︰30、17︰00-17︰30各投喂1次。试验期间每天08:00和17:00各测水温1次，每周测1次水质，保持水温在（25.0±1.5)）℃、溶氧≥6 mg/L、氨氮≤0.1 mg/L、pH 6.8-7.0。每天观察鱼摄食及死亡情况，并根据实际情况每隔1周增加投饲量。正式试验时间为71 d。

在试验开始第1日和试验结束日，称量每个网箱鲫鱼的总重，以计算各项生长指标和饲料利用率指标。试验数据采用单因子方差分析进行差异显著性检验，结果如下：

表2 菌糠蛋白肽部分替代鱼粉对鲫鱼生长的影响

表3 菌糠蛋白肽部分替代鱼粉对鲫鱼饲料利用率的影响

由表2和表3可知，试验2组、3组、4组和5组的特定生长率分别比对照组提高了23.88%、7.46%、16.41%和5.97%。试验1组、3组、4组和5组的摄食率分别比对照组提高了3.01%、2.19%、3.01%和6.28%。试验2组、3组和4组的蛋白质效率分别比对照组提高了24.02%、4.96%和11.14%。试验2组、3组和4组的饲料系数分别比对照组降低了19.31%、4.69%和9.92%。综合各项指标，与对照组相比较，采用“鱼粉6.8%+菌糠蛋白肽3.2%”的试验2组，养殖效果最理想，特定生长率和蛋白质效率提高幅度最大，饲料系数降低最明显，具有促进生长、提高饲料利用率的作用。

Claims

1.一种可替代鱼粉的菌糠蛋白肽的制备方法，其特征在于以食用菌菌糠废料为基础原料，首先采用先灵芝菌、后酿酒酵母的分步固体发酵技术，将食用菌菌糠的原始营养物质充分转化为高品质的菌体蛋白和多糖类；然后采用纤维素酶、食用菌水解酶AO₂和酵母抽提酶相结合的酶解技术，使蛋白质充分释放并水解为短分子量的小肽；最后经浓缩、干燥，获得富含易消化小肽，即可替代鱼粉的菌糠蛋白肽；其制备步骤如下：

（1）菌糠的预处理

（2）菌糠的发酵

①菌体活化

灵芝菌种划线接种于PDA斜面培养基，PDA斜面培养基组成以g/L计为：葡萄糖20、琼脂20，用土豆汁配制，pH自然；28℃培养7天后，观察其生长情况，长势良好即为成熟，准备移种；

土豆汁制备方法为：土豆200g，去皮，切成小块，加入1L去离子水煮沸30min，过滤，所得滤液用去离子水定容至1L；

酿酒酵母划线接种于麦芽汁琼脂培养基，28℃培养2天后，观察其生长情况，长势良好即为成熟，准备移种；

所使用的灵芝菌和酿酒酵母，均为农业和食品领域常用的生产菌种，通过商业途径或国家指定机构购买；

所使用的麦芽汁琼脂培养基从市售途径购买；

②种子培养液制备

用接种铲从斜面上挑取大1cm×1cm的灵芝菌块，接入经灭菌的灵芝菌液体培养基中，140r/min旋转式摇床，28℃培养7天；

灵芝菌液体培养基组成以g/L计为：豆饼粉20、玉米粉20、葡萄糖20、K₂HPO₄ 1、MgSO₄0.5、V_B 0.12，用自来水配制，pH自然；

所使用的麦芽汁液体培养基从市售途径购买麦芽汁培养基粉末后，用自来水配制，pH自然；

③分步发酵

（3）菌糠的酶水解

将发酵结束后的固体培养物置于烘箱中50℃烘干，粉碎，水洗除杂；

按料水重量比1︰5加水，调节pH至4.8，以烘干固体培养物的重量百分比，加入纤维素酶0.7%，50℃酶解1h；接着调节pH至6.5，以烘干固体培养物的重量百分比，加入食用菌水解酶AO₂0.5%、酵母抽提酶1%，55℃酶解4h；酶水解结束后，升温至85℃，灭酶10min；

（4）菌糠蛋白肽的提取

2.根据权利要求1所述的可替代鱼粉的菌糠蛋白肽的制备方法，其特征在于步骤（1）所述的菌糠，包括香菇、猴头菇、鸡腿菇、茶树菇、杏鲍菇、木耳、灵芝、姬松茸、或灰树花食药用菌，采摘完子实体后剩余的固体废料。

3.用权利要求1所述方法制备的可替代鱼粉的菌糠蛋白肽，其特征在于所述菌糠蛋白肽是以食用菌菌糠废料为基础原料，接种灵芝菌和酿酒酵母分步发酵，再经温和酶解、喷雾干燥后，制成的粉末状产品。

4.根据权利要求3所述的可替代鱼粉的菌糠蛋白肽，其特征在于所述菌糠蛋白肽是以食用菌菌丝体蛋白和酵母微生物蛋白为基础蛋白源，经酶解法生产的，主要成分为短肽的粉末状产品，其相对分子质量≤2000的肽段占产品干重的≥60％，并具有较高的清除DPPH自由基的抗氧化能力。

5.用权利要求1所述方法制备的可替代鱼粉的菌糠蛋白肽的应用，其特征在于部分替代水生动物饲料中的主要蛋白原料——鱼粉，加入量为饲料干重的1.6%-8%，替代16%-80%的鱼粉。

6.根据权利要求5所述可替代鱼粉的菌糠蛋白肽的应用，其特征在于所述水生动物包括甲鱼、虾、蟹甲壳类水生动物和其它各种淡水鱼、海水鱼。