CN1660128A - 壳聚糖及其衍生物在制备抗幽门螺杆菌产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳聚糖及其衍生物在制药领域中的新用途，即壳聚糖及其衍生物在制备抗幽门螺杆菌或制备防治幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的产品中的应用。本发明通过实验证实了壳聚糖及其衍生物对幽门螺杆菌有普遍的抑菌作用。壳聚糖在抗幽门螺杆菌的作用机理为：①壳聚糖分子中的－NH+ 3基团与幽门螺杆菌外膜的带负电荷的物质相互作用，破坏其结构、功能和通透性，使细菌内容物渗出，细菌破裂；②壳聚糖通过破损的细胞外膜进入幽门螺杆菌内，与胞质作用，扰乱其代谢。③本发明通过实验还证实了壳聚糖对幽门螺杆菌感染胃黏膜局部的免疫调节作用，这也是它抗幽门螺杆菌的机理之一。
Description
技术领域
本发明涉及药物用途发明领域，尤其是涉及一种壳聚糖在制备抗幽门螺杆菌产品中的应用。
背景技术
壳聚糖(Chitosan)，又名几丁聚糖，化学名称为聚合β-(1，4)-2-氨基-D-葡萄糖，即在甲壳素2号位上脱去乙酰基暴露出-NH2基因而形成的产物，是一高分子量的直链多糖，分子式是(C6H11NO4)n，约在185℃时分解。它的平均分子质量为1MDa，分子链长度大约为5000个单位，但在实际应用中，它的分子量大小即聚合程度随着不同的需要而变化。壳聚糖为白色或淡黄色粉末，不溶于中性与碱性水溶液以及绝大部分有机溶剂，可溶于单价无机酸和有机酸。其溶解度取决于壳聚糖的脱乙酰度、分子量与溶液的pH值，一般情况下，其分子量越小、脱乙酰度越高，溶解性越好。随着脱乙酰度(DD)、分子量等理化性质的不同，壳聚糖的解离常数(pKa)也发生变化。当pH值低于pKa时，壳聚糖分子的氨基基团即质子化，从而使整个分子带正电荷，这是壳聚糖分子发挥其生物学特性的一个重要特点。壳聚糖广泛存在于甲壳动物外壳、节肢动物表皮、低等动物细胞膜、高等植物细胞壁等生物组织中，是自然界少见的带正电荷的聚合物。
由于壳聚糖安全无毒、几乎无免疫原性、可生物降解并有良好的生物相容性，并且具有增强免疫、促进伤口愈合、促进上皮细胞增生和血管生成、止血、抗菌、抑制肿瘤、降血糖、血脂等多种生理活性。因此近年来被广泛的应用于医学领域。
幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori，Hp)已被公认为慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的重要致病因子，世界卫生组织已将其列为I类致癌因子，因而有效根除幽门螺杆菌对于预防幽门螺杆菌的相关性疾病，特别是胃癌的发生具有十分重要的意义。目前根除幽门螺杆菌虽有多种药物联合疗法，但仍存在许多问题，如幽门螺杆菌耐药菌株的产生，药物价格昂贵，副作用大以及病人依从性差等。因此，目前尚无一个简单、有效、经济、无毒副作用、病人依从性好、耐药率低的理想治疗方案。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供壳聚糖的新用途，即壳聚糖在制备抗幽门螺杆菌或幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的产品中的应用，它能有效抗击幽门螺杆菌，扰乱其新陈代谢。
本发明的第二个目的在于提供壳聚糖衍生物的新用途，即壳聚糖衍生物在制备抗幽门螺杆菌或幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的产品中的应用，它们能有效抗击幽门螺杆菌，扰乱其新陈代谢。
所述产品为药品、保健品、添加剂或生物制剂。
所述壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖。
本发明的第三个目的在于提供壳聚糖对幽门螺杆菌感染胃黏膜局部的免疫调节作用。
本发明的第四个目的在于提供壳聚糖及其衍生物作为添加剂加入到口腔卫生用品、食物或饮料用于防治幽门螺杆菌感染。
本发明的第五个目的在于提供壳聚糖及其衍生物与一种附加的抗菌制剂结合在一起服用。
壳聚糖在抗幽门螺杆菌的作用机理为：①壳聚糖分子中的-NH+ 3基团与幽门螺杆菌外膜的带负电荷的物质相互作用，破坏其结构、功能和通透性，使细菌内容物渗出，细菌破裂；②壳聚糖通过破损的细胞外膜进入幽门螺杆菌内，与胞质作用，扰乱其代谢；③在生物体内壳聚糖调节胃黏膜局部免疫反应参与了其抗幽门螺杆菌的机理。
为了更好地理解本发明的实质，下面以实验和结果来证明壳聚糖的用途。
本发明分壳聚糖体外抗幽门螺杆菌作用和体内抗幽门螺杆菌作用两部分。第一部分：壳聚糖体外抗幽门螺杆菌作用
A、材料与方法
一、主要材料与仪器
1、试剂
空肠弯曲菌琼脂基础，(中国腹泻病控制上海试剂供应中心产品)
布氏肉汤培养基础(中国腹泻病控制上海试剂供应中心产品)；
无菌绵羊血(上海畜牧养殖场产品)；
CO2、N2(南昌气体厂产品)；
70％脱乙酰度壳聚糖(DD70壳聚糖)、88.5％脱乙酰度壳聚糖(DD88.5)及羧甲基壳聚糖(上海其胜生物制品有限公司产品)；
羧甲基纤维素(新西兰进口分装)；
磺化壳聚糖(自制)
冰乙酸(分析纯，广东西陇化工厂产品)
葡萄糖检测试剂(四川省迈克科技有限责任公司产品)
天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒(上海华科-东菱诊断用品有限公司产品)
幽门螺杆菌国际标准菌株NCTC11639、NCTC11637和SS1(由中国幽门螺杆菌菌株库提供)
2、仪器
MCO-175M型三气培养箱(日本三洋公司产品)：
电热干燥箱(上海医疗器械厂产品)；
湘仪-岛津-200型电子分析天平(湘仪天平仪器厂进口组装)；
MDF-U281-80℃低温冰箱(日本三洋公司产品)；
YJ-1003A型超净工作台(苏州净化设备公司产品)，
TE-A型微量振荡仪(江苏泰仓医疗器械厂产品)；
贝克曼5700核酸分析仪(美国贝克曼公司产品)
HITACHI7150全自动生化分析仪(日本日立公司产品)
pHS-3C型酸度计(厦门分析仪器厂产品)
HITACHI S-570扫描电镜(日本日立公司产品)
HITACHI H-600透射电镜(日本日立公司产品)
二、实验方法
(一)、壳聚糖及其衍生物抗幽门螺杆菌作用的体外研究
1、不同浓度和pH值的壳聚糖及其衍生物溶液的配制
(1)、不同浓度和pH值羧甲基壳聚糖的配制：称取羧甲基壳聚糖分别溶于灭菌的蒸馏水、0.5％和1％冰乙酸溶液中，羧甲基壳聚糖的浓度分别为1％、2％、3％、4％、5％，共3类15种溶液；无冰乙酸和含0.5％、1％冰乙酸的羧甲基壳聚糖溶液的pH值分别为6、5、4；
(2)、不同浓度和pH值的70％和88.5％脱乙酰度壳聚糖的配制：称取70％和88.5％脱乙酰度壳聚糖分别溶于灭菌的1％、2％、3％冰乙酸溶液，两种壳聚糖的浓度分别为0.5％、1％、1.5％和2％，共6类24种溶液，含1％、2％和3％的冰乙酸的壳聚糖溶液的pH值分别为6、5、4，放置24小时，待壳聚糖完全溶解后使用；
(3)、不同浓度和pH值羧甲基纤维素溶液的配制：称取羧甲基纤维素，分别溶于灭菌蒸馏水、0.5％和1％冰乙酸溶液，浓度分别为1％、2％、3％、4％，共3类12种溶液，无冰乙酸和含0.5％、1％冰乙酸的羧甲基纤维素溶液的pH值分别为6、5、4。
2、幽门螺杆菌培养
将幽门螺杆菌标准菌株11637、11639、SS1接种在含7.5％无菌羊血的空肠弯曲菌选择性琼脂培养基础上，微需氧条件下(O25％、CO210％、N285％)，37℃培养2-3天后，用布氏肉汤洗脱收集细菌，并在660nm波长下测细胞密度，1吸光度(OD值)为108CFU/ml(CFU：集落形成单位)。
3、抑菌试验
取直径8cm培养皿，培养基厚约6mm，取0.5ml含幽门螺杆菌5×108CFU/ml的布氏肉汤菌液，均匀涂布于培养基上待干燥后，在培养基上打810个[(24+15+12+3)*5*3]直径4mm孔，分别向各孔加入上述不同pH值、不同浓度和不同类型的壳聚糖及其衍生物溶液，加入量为加平每孔，对照孔分别加入以灭菌蒸馏水配制的pH值分别为6，5，4的乙酸溶液，培养3天，用游标卡尺测量抑菌环直径，每种溶液做5个孔，取其平均值。
(二)、壳聚糖及其衍生物诱发幽门螺杆菌内容物渗漏试验
1、根据上述抑菌试验结果，选择了7种抑菌作用较好的壳聚糖及其衍生物溶液，进一步做细菌内容物渗漏试验。这7种壳聚糖溶液见表1。
表1 渗漏实验中7种壳聚糖溶液的配制
| 壳1 | 壳2 | 壳3 | 壳4 | 壳5 | 壳6 | 壳7 | 对照组 | |
| 壳聚糖种类壳聚糖浓度pH值 | 羧甲基壳聚糖2％4 | DD70壳聚糖16 | DD88.5壳聚糖0.56 | DD70壳聚糖15 | DD88.5壳聚糖15 | DD70壳聚糖1.54 | DD88.5壳聚糖14 | 无06 |
以5mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)配制上述溶液。以5mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)为对照。
2、幽门螺杆菌与不同壳聚糖溶液混合培养
以5mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)配成相应浓度和pH值的溶液(见表1)。培养2-3天的幽门螺杆菌用5mmol/L磷酸缓冲液洗脱，并洗涤3次后，加入上述壳聚糖溶液中，细菌浓度为108CFU/ml，将每种壳聚糖-幽门螺杆菌混合液加入24孔培养板，每孔2ml，每种溶液做5孔，在37℃和微需氧条件下，120rpm振荡，48小时后取出孔内液，1000g离心10分钟后，取上清液分别测葡萄糖含量和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性。
(三)、壳聚糖及其衍生物对幽门螺杆菌形态及超微结构影响试验
与渗漏实验相似，当壳聚糖及其衍生物与幽门螺杆菌作用24小时后，离心取细菌沉渣，制成电镜片，在透射和扫描电镜下幽门螺杆菌的形态和结构。
三、统计学处理
所有数据应用公用的统计软件包SPSS10.0系统统计，均以X±SD表示，采用t检验和单因素方差分析F-q及q’检验。
B、结果
一、壳聚糖及其衍生物对幽门螺杆菌的生长抑制作用
(一)壳聚糖及其衍生物对幽门螺杆菌标准菌株SS1、11637、11639的抑菌作用
1、羧甲基壳聚糖对幽门螺杆菌标准菌株SS1、11637、11639的抑菌作用pH值为5和6的羧甲基壳聚糖对3株幽门螺杆菌均无抑菌作用，pH值为4的羧甲基壳聚糖溶液对3株幽门螺杆菌的抑菌作用见表2
表2 pH值为4的羧甲基壳聚糖溶液对幽门螺杆菌三种菌株作用的比较
| 浓度(％) | 抑菌环直径(mm，n＝5) | F | P | ||||
| ①SS1 | ②11637 | ③11639 | |||||
| 012345 | 010.728±0.35512.108±1.08711.472±1.01811.352±1.45311.868±1.459 | 010.636±0.50612±1.09212.064±0.99811.452±1.04412.112±0.935 | 014.236±1.19715.628±0.79215.078±1.01612.44±0.86112.638±1.684 | 34.8121.30518.2930.7070 398 | ①/②P＞0.05①/②P＞0.05①/②P＞0.05P＞0.05P＞0 05 | ①/③P＜0 01①/③P＜0.01①/③P＜0.01 | ②/③P＜0.01②/③P＜0.01②/③P＜0.01 |
由表2可见羧甲基壳聚糖溶液在1％、2％、3％浓度时，对11639菌株的作用强于另两种菌株(P＜0.01)而对SS1和11637菌株作用无差异(P＞0.05)。
2、70％脱乙酰度壳聚糖对幽门螺杆菌标准菌株SS1、11637、11639的抑菌作用见表3。
表3 70％脱乙酰度壳聚糖对幽门螺杆菌三种菌株作用的比较
| pH值 | 浓度(％) | 抑菌环直径(mm，n＝5) | F | P | ||
| ①SS1 | ②11637 | ③11639 | ||||
| 6 | 00.511.52 | 012.052±2.96112.476±2.69911.312±2.16611.636±2.033 | 013.148±1.87012.896±2.28912.552±2.12711.024±0.971 | 013.172±1.72313.776±3.43914.816±2.34812.188±1.041 | 0.3950.6073.2140.826 | P＞0.05P＞0.05P＞0.05P＞0.05P＞0.05 |
| 5 | 00.511.52 | 018.908±0.64417.992±0.45117.864±1.16017.128±0.840 | 018.504±1.99219.024±3.10020.776±4.67518.636±2.871 | 017.520±1.28516.332±0.94716.288±1.62515.548±1.889 | 1.2673.5823.0102.784 | P＞0.05P＞0.05①/③P＜0.05①/②P＜0.05②/③P＜0.05P＞0.05P＞0.05 |
| 4 | 00.511.52 | 022.492±1.05422.076±3.20722.160±1.30122.116±1.351 | 020.120±2.64822.652±1.29421.392±2.95321.024±1.762 | 020.952±2.54923.612±3.98422.044±3.64421.904±3.990 | 1.4860.3240.1090.241 | P＞0.05P＞0.05P＞0.05P＞0.05P＞0.05 |
由表3可见，除pH值为5的1％浓度壳聚糖溶液对幽门螺杆菌菌株之间作用有差异外(P＜0.05)，其余均无差异(P＞0.05)。
3、88.5％脱乙酰度壳聚糖对幽门螺杆菌标准菌株SS1、11637、11639的抑菌作用见表4
表4 88.5％脱乙酰度壳聚糖对幽门螺杆菌三种菌株作用的比较
| pH值 | 浓度(％) | 抑菌环直径(mm，n＝5) | F | P | ||
| ①SS1 | ②11637 | ③11639 | ||||
| 6 | 00.511.52 | 012.372±1.69711.464±1.15011.232±0.82411.076±0.943 | 011.056±1.53910.064±0.9179.700±0.4039.464±0.513 | 011.780±1.18311.404±0.86710.988±0.91511.148±1.143 | 0.9803.2246.0555.534 | P＞0.05P＞0.05P＞0.05①/②P＜0.05①/③P＜0.05②/③P＜0.05①/②P＜0.05①/③P＜0.05②/③P＜0.05 |
| 5 | 00.511.52 | 018.440±4.75018.456±5.5118.128±3.29615.536±2.023 | 015.348±1.52717.080±2.05213.904±2.24416.504±1.378 | 015.740±1.50115.944±3.03914.424±1.73615.112±1.929 | 1.5660.5424.2080.786 | P＞0.05P＞0.05P＞0.05P＞0.05P＞0.05 |
| 4 | 00.511.52 | 020.836±4.71521.800±3.89223.312±2.97123.892±4.265 | 020.172±1.40020.180±1.19418.892±0.8220.584±2.655 | 018.620±1.68820.456±0.79319.824±1.46620.768±1.192 | 0.7180.6556.9161.944 | P＞0.05P＞0.05P＞0.05P＞0.05P＞0.05 |
由表4可见，除pH值为6的1.5％和2％浓度壳聚糖溶液对幽门螺杆菌菌株之间作用有差异外(P＜0.05)，其余均无差异(P＞0.05)。
4、羧甲基纤维素对幽门螺杆菌标准菌株SS1、11637、11639的抑菌作用
在pH值为4、5、6的条件下，羧甲基纤维素溶液对3株幽门螺杆菌均无抑菌作用。
(二)、浓度与pH值对壳聚糖抑菌作用的影响
表5 不同浓度与pH值的70％脱乙酰度壳聚糖对幽门螺杆菌抑菌作用比较
| 浓度(％) | 抑菌环直径(mm，n＝15) | F | P | ||
| pH6 | pH5 | pH4 | |||
| 0(对照组)0.511.5 | 012.785±2.159*12.383±4.023*12.893±2.542*11.616±1.415* | 018.311±1.445*17.783±2.093*18.309±3.329*17.097±2.303* | 021.188±2.283*22.780±2.895*21.865±2.625*21.681±2.489* | 68.59242.0437.58584.623 | P＞0.05P＜0.01P＜0.01P＜0.01P＜0.01 |
| FP | 39.412P＜0.01 | 69.907P＜0.01 | 89.628P＜0.01 | ||
注：*为与对照组比较P＜0.01
表6 不同浓度与pH值的88.5％脱乙酰度壳聚糖对幽门螺杆菌抑菌作用比较
| 浓度(％) | 抑菌环直径(mm，n＝15) | F | P | ||
| pH6 | pH5 | pH4 | |||
| 0(对照组)0.51.5 | 011.736±1.486*10.977±1.132*10.640±0.982*10.563±1.162* | 016.509±3.128*17.160±3.694*15.485±3.032*15.717±1.772* | 019.876±2.941*20.812±2.335*20.676±2.691*21.748±3.176* | 36.47554.57465.15396.767 | P＞0.05P＜0.01P＜0.01P＜0.01P＜0.01 |
| FP | 25.103P＜0.01 | 37.164P＜0.01 | 68.83P＜0.01 | ||
注：*为与对照组比较P＜0.01
由表5、6可见，3种不同pH值的壳聚糖溶液对幽门螺杆菌的抑菌作用有显著差异(P＜0.01)，进一步进行q检验发现，各pH值之间的抑菌作用均有显著差异(P＜0.01)。壳聚糖的抑菌作用各浓度组与对照组比较有显著差异(P＜0.01)，但各浓度之间的抑菌作用无显著差异(P＞0.05)。
对于羧甲基壳聚糖，pH值为4的溶液与pH值为6和5的溶液比较有显著差异(P＜0.01)，在pH值为4时各浓度组与对照组比较有显著差异(P＜0.01)，而各浓度之间无显著差异(F＝2.431，P＞0.05)。
(三)、不同脱乙酰度壳聚糖对幽门螺杆菌抑菌作用的比较
表7 不同脱乙酰度壳聚糖对幽门螺杆菌抑菌作用的比较
| pH值 | 浓度(％) | 抑菌环直径(mm，n＝15) | P | |
| DD70壳聚糖 | DD88.5壳聚糖 | |||
| 6 | 0.511.52 | 12.785±2.15912.383±4.02312.893±2.54211.616±1.415 | 11.736±1.48610.977±1.13210.640±0.98210.563±1.162 | P＞0.05P＞0.05P＞0.05P＞0.05 |
| 5 | 0.511.52 | 18.311±1.44517.783±2.09318.309±3.32917.097±2.303 | 16.509±3.12817.160±3.69415.485±3.03215.717±1.772 | P＞0.05P＞0.05P＞0.05P＞0.05 |
| 4 | 0.511.52 | 21.188±2.28322.780±2.89521.865±2.62521.681±2.489 | 19.876±2.94120.812±2.33520.676±2.69121.748±3.176 | P＞0.05P＞0.05P＞0.05P＞0.05 |
由表7可见，70％脱乙酰度壳聚糖的抗幽门螺杆菌作用稍强于88.5％脱乙酰度壳聚糖，但无统计学差异(P＞0.05)。
(四)、各种壳聚糖及其衍生物之间抗幽门螺杆菌作用比较
对幽门螺杆菌有抑菌作用的壳聚糖分别为羧甲基壳聚糖、70％、88.5％脱乙酰度壳聚糖，其中羧甲基壳聚糖壳聚糖仅在pH值4时对幽门螺杆菌有抑制作用，这3种壳聚糖的抑菌作用见表8。
表8 不同壳聚糖抑菌作用比较
| 抑菌环直径(mm，n＝60) | F | P | ||
| DD70壳聚糖① | DD88.5壳聚糖② | 羧甲基壳聚糖③ | ||
| 12.59±2.27a17.88±2.28b21.88±2.58c | 10.98±1.26a16.22±2.99b20.78±2.81c | 12.37±1.74c12.37±1.74c12.37±1.74c | 14.38396.731331.517 | ①/②，②/③p＜0.01，①/③p＞0.05P＜0.01①/②p＜0.05，①/③，②/③p＜0.01 |
注：a：为pH6；b：为pH5；c：为pH4
由表8可见DD70和DD88.5壳聚糖在pH值为6时对幽门螺杆菌的抑菌作用不比pH值为4时羧甲基壳聚糖的抑菌作用强，其中DD88.5壳聚糖抑菌作用还弱于后者(P＜0.01)；pH值为4和5时，DD70和DD88.5壳聚糖对幽门螺杆菌的抑菌作用均明显大于羧甲基壳聚糖在pH值为4时的抑菌作用(P＜0.01)；在三种pH值条件下DD70壳聚糖作用均大于DD88.5壳聚糖的抑菌作用(P＜0.01)。
二、壳聚糖溶液对Hp内容物渗漏实验结果
表9 7种壳聚糖溶液作用幽门螺杆菌后上清液中AST活性和Glu含量比较
| 壳聚糖 | AST(IU/L) | Glu(mg/L) | ||||
| SS1 | 11639 | 11637 | SS1 | 11639 | 11637 | |
| 壳1壳2壳3壳4壳5壳6壳7对照8 | 7.8±0.4473.2±0.8377.4±1.14010±0.7076±1.4145.6±1.1409.2±1.4830.8±0.837 | 10.6±0.54810±0.0716.8±0.44720±0.7079.6±1.34215.8±1.09516.6±1.6733.4±0.548 | 4.8±0.8376.6±0.5486.6±0.8948±0.7073±0.7074±0.7074.4±1.5160 | 3.0±0.88616.4±4.87010.6±2.3487.4±1.5010.5±2.92414.1±1.76011.4±1.7181.8±1.059 | 7.9±2.44415.9±2.2489.0±0.75215.4±3.0919.9±0.78819.4±2.96619±0.5253.1±1.159 | 10.1±4.55515.7±3.4022.4±2.25619.7±2.33413.5±2.97417.6±1.27117.3±2.1646.4±2.930 |
| FP* | 42.363P＜0.05或＜0.01 | 152.286P＜0.01 | 61.71P＜0.01 | 17.702①/⑧P＞0.05余P＜0.01 | 42.272①/⑧P＞0.05余p＜0.01 | 15.997①/⑧P＞0.05余P＜0.05或＜0.01 |
注：*为q’检验。AST：天门冬氨酸氨基转移酶；Glu：葡萄糖。
由表9可见，七种壳聚糖溶液上清液中AST活性与对照组比较有显著差异(P＜0.05或＜0.01)，Glu含量除壳I溶液外(P＞0.05)，其余6种溶液与对照组比较有显著性差异(P＜0.05或＜0.01)。
三、壳聚糖对幽门螺杆菌形态和超微结构的影响
1、透射电镜结果
(1)、对照组：细胞切面多呈杆状，细胞壁、细胞膜完整，胞质均匀，电子密度中等。
(2)、药物组：幽门螺杆菌形态多样，以球形体为主，并可见V形、U形和不规则形；幽门螺杆菌细胞壁变薄不完整，有的菌体细胞壁部分或全部脱落消失，细菌轮廓模糊，结构不清，且发生不同程度的凹陷变形，甚至穿孔和破碎；胞浆内容物稀疏，空隙明显扩大。细菌内部结构消失或分布异常，胞质不均匀或密度下降，出现高电子密度颗粒。各种壳聚糖溶液作用组均可见上述变化。
2、扫描电镜结果
(1)、对照组：细菌呈螺杆状，表面光滑。
(2)、药物组：幽门螺杆菌形态多样，以球形体为主，并可见U形和不规则形，细菌表面广泛改变，黏附有可折射物质，外观呈毛刺状，提示壳聚糖附着在细菌外膜上，并与其作用，各种壳聚糖溶液作用组均可见上述变化。
第二部分：壳聚糖体内抗幽门螺杆菌作用
虽然体外试验证实了壳聚糖及其衍生物具有抗幽门螺杆菌作用，但是由于胃内的特殊环境，许多物质在体外有抗幽门螺杆菌作用，在体内却无抗幽门螺杆菌作用，只有在体内外都具有抗幽门螺杆菌作用的物质才能够用于幽门螺杆菌感染的治疗与预防，因此进行了壳聚糖体内抗幽门螺杆菌的试验，从而完成本发明。
A、材料与方法
一、材料
1、主要仪器
湘仪-岛津200型电子分析天平(湘仪天平仪器厂进口组装)；
MDF-U281-80℃低温冰箱(日本三洋公司产品)；
YJ-1003A型超净工作台(苏州净化设备公司生品)；超声粉碎仪(日本)；
MCO-175M型三气培养箱(日本三洋公司产品)；病理显微图像分析仪；
2135型病理切片机(德国莱卡公司产品)；贝克曼低温超速离心机(美国)；
Olympus显微镜(日本Olympus公司产品)；450型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；
自动病理组织脱水机(湖北孝感电子仪器厂产品)
YB-6型生物组织包埋机(湖北孝感亚光医用电子技术研究所产品)
2、主要试剂
空肠弯曲菌琼脂基础(中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心产品)；
布氏肉汤培养基础(中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心产品)；
幽门螺杆菌国际标准菌株SS1(由中国幽门螺杆菌菌株库提供)；
羟氨苄青霉素(珠海联邦制药股份有限公司中山分公司生产)；邻苯二胺；
雌性清洁级BALB/c小鼠，6-8周龄，平均体重22.5克；小牛血清白蛋白；
胎牛血清(上海江南生物技术工程有限公司产品)；96孔聚乙稀酶标板；
洛赛克Mups(Astrazeneca公司生产)；CO2、N2(南昌气体厂产品)；
壳聚糖(上海其胜生物有限公司生产)；无菌绵羊血(上海畜牧养殖场产品)；
过氧化氢酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白A(IgA)抗体(ZYMEDLABORATORIES INC)；
过氧化氢酶标记的羊抗鼠血清免疫球蛋白G(IgG)(SIGMA-ALDRICH，INC.)、IgG1、IgG2a抗体(ZYMEDLABORATORIES INC)；
鼠白介素2、白介素4、白介素10(IL2、IL4、IL10)定量ELISA试剂盒(BenderMedSystems)；
二、方法
1、幽门螺杆菌的培养
将幽门螺杆菌标准菌株11637、11639、SS1接种在含7.5％无菌羊血的空肠弯曲菌选择性琼脂培养基础上，微需氧条件下(O25％、CO210％、N285％)，37℃培养2-3天后，用布氏肉汤洗脱收集细菌，并在660nm波长下测细胞密度，10D值为108CFU/ml。
2、BALB/c小鼠幽门螺杆菌感染动物模型的建立
采用6-8周龄的清洁级的BALB/c小鼠，给予含2×109/ml的SS1(sydneystrain)幽门螺杆菌液，0.5ml/只/次灌胃，隔日一次，共5次。末次灌胃12周后，取4只小鼠杀死后取胃粘膜进行病理检查和幽门螺杆菌培养，二者皆证实幽门螺杆菌感染模型建立。
3、实验分组
已确立幽门螺杆菌感染的小鼠，随机分为以下8组，每组12只。(1)、空白对照组：仅给予5％阿拉伯数胶溶液；、(2)、药物对照组1：洛赛克(PPI)；(3)药物对照组2：羟氨苄青霉素(AM)；(4)药物对照组3：羟氨苄青霉素加洛赛克；(5)实验1组：壳聚糖；(6)实验2组：壳聚糖加洛赛克；(7)实验3组：壳聚糖加羟氨苄青霉素；(8)实验4组：壳聚糖加羟氨苄青霉素加洛赛克。
4、给药量的计算
已建立幽门螺杆菌感染的小鼠，分别称重，算出平均重量，根据以下公式计算给药量：[(成人剂量×0.0026/20)×小鼠平均重量]，洛赛克0.06mg/次/只，羟氨苄青霉素2.9mg/次/只，壳聚糖12.5mg/次/只。
5、各组药物体内抗幽门螺杆菌实验
已建立幽门螺杆菌感染的小鼠在末次灌菌14周时，分别按上述分组的剂量，将药物混悬在药物赋形剂5％的阿拉伯树胶中，每次灌胃0.6ml，每日2次灌胃，共2周。停药后4周，取唾液，血液和胃黏膜测定有关指标。
6、胃粘膜内幽门螺杆菌的测定
采用定量幽门螺杆菌培养和病理改良吉姆萨(Giemsa)染色法测定。二者皆阴性表示Hp已被根除，两者之一阳性表示根除失败。
7、血清、唾液和胃黏膜内抗幽门螺杆菌抗体测定：采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定。
8、胃黏膜内辅助性T淋巴细胞1细胞因子(TH1)IL-2和辅助性T淋巴细胞2细胞因子(TH2)IL-4、IL-10检测：用鼠IL-2、IL-4、IL-10定量ELISA试剂盒测定。
9、胃粘膜病理学检测：胃粘膜常规石蜡包埋切片，伊红-苏木素(HE)染色。
10、胃黏膜内非特异性分泌型免疫球蛋白A(sIgA)测定：采用过氧化酶标记的链霉卵白素免疫组织化学染色法(SP免疫组化法)测定。
三、统计学处理
计数资料采用卡方检验(精确概率法)和等级相关秩和检验，计量资料采用F-q检验。应用公用的统计软件包SPSS11.0和SAS6.12处理，P值＜0.05为有统计学差异。
B、结果
一、幽门螺杆菌根除情况
表10 各组幽门螺杆菌根除率比较
| 分组 | N | HP+ | HP- | 根除率(％) |
| ①对照组②PPI③AM④AM+PPI⑤壳聚糖⑥壳聚糖+PPI⑦壳聚糖+AM⑧壳聚糖+AM+PPI | 1212121212121212 | 1212755421 | 0057781011 | 0041.7a58.3b58.3b66.7b83.3c91.7c，d |
| P＜0.001 | ||||
注：与①和②组比较，a为P＜0.05，b为P＜0.01，c为P＜0.001；d为与③组比较P＜0.05。
由表10可见，以上各组之间幽门螺杆菌根除率有显著差异(P＜0.001)。进一步进行两两比较，发现③～⑧组的HP根除率显著高于①和②组(P＜0.05～001)，⑧组的幽门螺杆菌根除率显著高于③组(P＜0.05)。
二、胃黏膜炎症情况
表11 各组胃黏膜炎症程度比较
| 分组 | N | 炎症程度 | |||
| 0 | 1 | 2 | 3 | ||
| ①对照组②PPI③AM④AM+PPIa，f，g⑤壳聚糖b，c，d⑥壳聚糖+PPIb，e，h⑦壳聚糖+AMb，e，d⑧壳聚糖+AM+PPIb，c，d | 1212121212121212 | 00001011 | 01247657 | 44634564 | 87450100 |
| H值＝37.6470，P＜0.001 | |||||
注：a为P＜0.05vs①组；b为P＜0.001vs①组；c为P＜0.001vs②组；d为P＜0.01vs③组；e为P＜0.05vs③组；f为P＜0.05vs⑦组；g为P＜0.01vs⑤、⑧组；h为P＜0.01vs②组。
由表11可见，各组之间炎症程度有显著差异(P＜0.001)，进一步进行两两比较，发现含壳聚糖组的炎症程度多低于不含壳聚糖组(P＜0.001～0.05)。
三、体液免疫反应结果
1、血清抗幽门螺杆菌IgG1、IgG2a，IgG结果
表12 各组血清抗幽门螺杆菌IgG1、IgG2a.IgG含量比较
| 组别 | N | X±SD | ||
| IgG1 | IgG2a | IgG | ||
| ①对照组②PPI③AM④AM+PPI⑤壳聚糖⑥壳聚糖+PPI⑦壳聚糖+AM⑧壳聚糖+AM+PPI | 1212121212111212 | 3.68±1.673.19±1.692.75±0.953.62±1.602.94±0.803.69±1.433.23±0.863.78±1.22 | 11.79±8.909.58±8.699.60±8.0111.47±9.7411.80±9.4213.22±8.1510.94±9.8013.54±9.59 | 6.56±3.505.86±3.637.59±4.157.60±5.608.38±5.946.27±2.748.47±5.049.37±5.32 |
| F值 | 1.021 | 0.305 | 0.812 | |
| P值 | 0.422 | 0.950 | 0.580 | |
由表12可见，各组之间血清中抗幽门螺杆菌IgG、IgG1和IgG2a含量无显著差异。
2、唾液和胃黏膜内抗幽门螺杆菌IgA结果
表13 各组唾液和胃黏膜内抗幽门螺杆菌IgA含量比较
| 组别 | N | X±SD | ||
| 唾液 | 胃黏膜 | 唾液IgA | 胃IgA | |
| ①对照组②PPI③AM④AM+PPI⑤壳聚糖⑥壳聚糖+PPI⑦壳聚糖+AM⑧壳聚糖+AM+PPI | 121291012111212 | 1212121212121212 | 1.03±0.350.99±0.181.06±0.261.11±0.331.06±0.661.30±0.841.02±0.451.05±0.39 | 15.56±6.2421.37±7.3023.17±7.3818.78±11.3033.64±18.54a，b，c，e24.65±12.3931.37±15.50a，b，d28.86±14.10a，d |
| F值 | 0.456 | 3.099 | ||
| P值 | 0.864 | 0.006 | ||
注：a为P＜0.01vs①组；b为P＜0.05vs②组；c为P＜0.05vs③组；d为P＜0.05vs④组；e为P＜0.01vs④组。
由表13可见，各组唾液抗HPIgA含量无统计学差异。胃黏膜内抗HPIgA含量各组间有显著差异(P＜0.01)。进一步分析发现含壳聚糖各组显著高于无壳聚糖组，以单纯壳聚糖和壳聚糖+AM组最为明显。
3、胃黏膜内非特异性sIgA结果
表14 各组胃黏膜内非特异性sIgA含量比较
| 组别 | N | X±SD |
| ①对照组②PPI③AM④AM+PPI⑤壳聚糖⑥壳聚糖+PPI⑦壳聚糖+AM⑧壳聚糖+AM+PPI | 1212121212121212 | 9.58±6.528.83±7.929.42±6.109.17±6.3418.50±10.12a，c，e20.08±13.43a，d，f21.25±11.89b，d，f19.67±14.40a，d，e |
| F值＝3.874，P值＜0.001 | ||
注：a为P＜0.05vs①和⑧组；b为P＜0.01vs①和③组；c为P＜0.05vs②组；d为P＜0.01vs②组；e为P＜0.05vs④组；f为P＜0.01vs④组。
由表14可见，各组胃黏膜内非特异性有显著差异(P＜0.001)，进一步分析含壳聚糖各组均显著高于无壳聚糖组(P＜0.01～0.05)。
五、胃黏膜内细胞因子结果
表15 各组胃黏膜内IL-2、IL-4和IL-10含量比较
| 组别 | N | X±SD(pg/mg胃组织) | ||||
| IL-2 | IL-4 | IL-10 | IL-2 | IL-4 | IL-10 | |
| ①对照组②PPI③AM④AM+PPI⑤壳聚糖⑥壳聚糖+PPI⑦壳聚糖+AM⑧壳聚糖+AM+PPI | 899991098 | 9911101011109 | 99999999 | 52.58±38.9492.66±68.1395.82±63.3380.40±57.4367.84±44.2857.36±48.5491.38±60.8781.17±40.58 | 7.61±6.8310.68±6.7010.25±8.7111.27±6.5720.43±7.19a，b，d20.62±14.42a，b，d23.17±12.60a，c，d26.51±13.72a，c，e | 174.63±133.76194.95±157.18186.82±161.59180.95±111.32375.03±96.95f362.23±212.33f353.30±151.52f423.59±227.20g |
| F值 | 0.824 | 4.691 | 3.847 | |||
| P值 | 0.571 | ＜0.001 | 0.002 | |||
注：a为P＜0.01vs①组；b为P＜0.05vs②、③组；c为P＜0.01vs②、③组；d为P＜0.05vs④组；e为P＜0.01vs④组；f为P＜0.05vs①～④组；g为P＜0.01vs①～④组。
由表15可见，各组IL-2含量无显著差异(P＞0.05)。各组间胃黏膜内IL-4和IL-10含量有显著差异(P＜0.001-0.002)。进一步分析发现含壳聚糖各组IL-4和IL-10含量均显著高于无壳聚糖组(P＜0.05-0.01)。
综上所述，本发明经体外实验证实，(1)、壳聚糖及其衍生物：羧甲基壳聚糖在体外对幽门螺杆菌有普遍的抑菌作用；(2)、壳聚糖及其衍生物的抗幽门螺杆菌作用受多种因素影响，其中pH值对壳聚糖抗菌作用的影响最为明显，在pH值6-4范围内，壳聚糖的抗菌活性随着pH值的下降而显著增强；(3)、壳聚糖的脱乙酰度、结构(化学修饰)及分子量也影响壳聚糖的抗菌活性，不同的细菌所要求的脱乙酰度、修饰基团和分子量有着明显的差异；(4)、壳聚糖及其衍生物在体外通过以下两种机制发挥抗幽门螺杆菌作用：①壳聚糖分子中的-NH+ 3基团与幽门螺杆菌外膜的带负电荷的物质相互作用，破坏其结构、功能和通透性，使细菌内容物渗出，细菌破裂；②壳聚糖通过破损的细胞外膜进入幽门螺杆菌内，与胞质作用，扰乱其代谢；体内实验证实，(1)壳聚糖在体内具有抗幽门螺杆菌作用，并且与羟氨苄青霉素具有协同作用；(2)、壳聚糖除了抗幽门螺杆菌作用外，还可减轻胃黏膜的炎症反应，促进胃黏膜局部的特异性抗幽门螺杆菌IgA和非特异性sIgA的分泌，说明壳聚糖对幽门螺杆菌感染胃黏膜局部的免疫调节作用；(3)、壳聚糖可上调TH2细胞因子IL-4和IL-10的表达，这在其抗幽门螺杆菌和减轻胃黏膜炎症反应中起一定作用。
具体实施方式
下面结合实施例作进一步详细说明本发明，但应理解本发明的范围并非仅限于这些实施例的范围。
实施例1：
用本技术领域公知的方法，以羧甲基壳聚糖为原料，制成壳聚糖药片。
实施例2：
用本技术领域公知的方法，以pH值为4或5、浓度为1.5％的70％脱乙酰度壳聚糖溶液为原料，制成壳聚糖口服液。
实施例3：
用本技术领域公知的方法，以pH值为4、浓度为2％的88.5％脱乙酰度壳聚糖溶液为原料，制成壳聚糖药片。
实施例4：
用本技术领域公知的方法，以88.5％脱乙酰度壳聚糖或羧甲基壳聚糖与其它抗幽门螺杆菌抗菌素(如：羟氨苄青霉素、克拉霉素)合用制成片剂。
实施例5：
用本技术领域公知的方法，以70％脱乙酰度壳聚糖或羧甲基壳聚糖为添加剂用于口腔卫生用品、食物或饮料。
Claims (9)
1、壳聚糖在制备抗幽门螺杆菌产品中的应用。
2、壳聚糖在制备幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的产品中的应用。
3、壳聚糖衍生物在制备抗幽门螺杆菌产品中的应用。
4、壳聚糖衍生物在制备幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的产品中的应用。
5、如权利要求1-4中任意一项所述的壳聚糖及其衍生物在制备抗幽门螺杆菌或幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的产品中的应用，其特征在于：所述产品为药品、保健品、添加剂或生物制剂。
6、如权利要求3或4中所述的壳聚糖及其衍生物在制备抗幽门螺杆菌或幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的产品中的应用，其特征在于：所述壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖。
7、壳聚糖对幽门螺杆菌感染胃黏膜局部的免疫调节作用。
8、如权利要求5所述的壳聚糖及其衍生物在制备抗幽门螺杆菌产品中的应用，其特征在于：壳聚糖及其衍生物作为添加剂加入到口腔卫生用品、食物或饮料用于防治幽门螺杆菌感染。
9 如权利要求5所述的壳聚糖及其衍生物在制备抗幽门螺杆菌产品中的应用，其特征在于：壳聚糖及其衍生物与一种附加的抗菌制剂结合在一起服用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |