CN1137979C - 溶葡萄球菌复合酶洗液及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种溶葡萄球菌复合酶洗液及制备方法。本发明的产品为消毒类生物制剂，该产品不仅有效杀灭白色念珠菌、淋病奈瑟菌、溶血性链球菌、厌氧菌、绿脓杆菌、大肠杆菌，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等耐药性细菌也可以高效杀灭。具有杀菌谱广、无毒副作用、无残留的特点。制备方法简单宜于规模型生产。

Description

溶葡萄球菌复合酶洗液及制备方法
本发明涉及消毒类生物制剂，具体涉及一种溶葡萄球菌复合酶洗液(高科复合酶洗液)及制备方法。
洗液是一类作用于皮肤粘膜及外阴的消毒保健洗涤用品，根据其配方的不同，其对引起感染或病原革兰氏阳性或阴性菌，真菌、酵母及病毒有不同程度的杀灭及抑制作用。现用的洗液有以下几类：(1)普通化学类洗液仅属于普通洗涤用品，pH值为弱酸性，能起到一定的清洁作用，但对病原菌无杀灭作用。(2)氧化蛋白类洗液是通过氧化剂的氧化作用把病原体杀死，如碘。但其对粘膜有一定程度的刺激和损伤。(3)中药类洗液其主要功能成分为传统中药，其作用机理为清热燥湿、杀虫止痒。如蛇床子、黄柏、苦参等。对粘膜无刺激，但见效较慢，疗程较长。
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种无毒副作用，无刺激，不易产生耐药性，高效的生物型洗液。
本发明公开了一种溶葡萄球菌复合酶洗液(高科复合酶洗液)，该洗液是由溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)0.001～0.002％和溶菌酶(Lysozyme)0.02～0.05％、洗必泰0.1-0.2％作为主要成份与甘油(glycerol)0.2～0.3％和蒸馏水作为辅料组成100％的组成。
由于溶葡萄球菌复合酶中的一种成分溶葡萄球菌酶是一种革兰氏阳性菌的溶菌素。组成该类革兰氏阳性菌(例如金黄色葡萄球菌)细胞壁肽聚糖的四肽侧链的氨基酸，依次为L-丙氨酸，D-谷氨酸，L-赖氨酸，D-丙氨酸，而首位的L-丙氨酸通过一个酰胺键与胞壁酸相连，该聚糖链四肽侧链第3位的L-赖氨酸，通过五肽(五个甘氨酸)交联桥联结到相邻聚糖链四肽侧链D-丙氨酸羧基上。由此纵横交叉，左右联结构成十分坚韧的三维立体多孔结构，并聚合成较厚的肽聚糖层。溶葡萄球菌酶可切断肽聚糖中的Gly-Gly键，而高科复合溶菌酶中另一种生物酶可切断N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的键，从而使杀菌活性更强，达到溶解并杀死细菌的目的，并可避免细菌耐药性的产生。
由于溶葡萄球菌复合酶的杀菌机理，使其不同于一般抗生素，常用抗生素是抑制细菌生长，而该酶则是裂解细菌杀死细菌。上海市华山医院抗生素研究所、第二军医大学长海医院检验科、上海市第六人民医院检验科、上海市第九人民医院检验科等单位曾将临床各科收集到的400多株细菌进行了高科复合溶菌酶的抑杀菌实验。实验结果表明：溶葡萄球菌复合酶对临床上常见的金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌、肺炎双球菌、D群肠球菌、四联球菌、产单核李斯特菌、链球菌以及胃幽门螺旋杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等均有明显的抑杀作用。
经上海市预防医学研究院实验证明溶葡萄球菌复合酶洗液对淋病奈瑟菌有很强的杀灭作用。又经上海市黄浦区疾病预防控制中心在复旦大学妇产科医院的60例现场试验的结果证明，溶葡萄球菌复合酶洗液对会阴部作用1分钟，对细菌的杀灭率达90％以上。
实验还证明溶葡萄球菌酶对耐药性菌株，如目前医学临床上最感棘手的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，耐药性肺炎双球菌、嗜麦芽窄食单孢菌的效果更优于常用抗生素。
本发明的另一目的是提供了上述溶葡萄球菌复合酶洗液的制备方法，该方法是在无菌室或超净工作台中，按处方量将溶葡萄球菌酶(从美国Sigma公司购买，)，溶菌酶，洗必泰按比例依次加入洁净的玻璃或不锈钢盛具中，轻轻搅拌，充分混和均匀后，再加入所示比例的甘油和蒸馏水，充分混匀，灌装于塑料或玻璃瓶中，入库，室温保存即可。
本发明的溶葡萄球菌复合酶洗液(高科复合酶洗液)经上海市预防医学研究院检测结果如下：I PH测定试验一、材料：
消毒剂：高科复合酶洗液
PH测定仪：PYS-3C型数字酸度计。二、方法：
用PHS-3C型数字酸度计测定该样品原液，测定三份样品，每份重复测定3次，取其平均值。三、结果：
                   PH值测定结果
     样品编号                          PH值
       1-1                             6.70
       1-2                             6.70
       1-3                             6.70
       2-1                             6.68
       2-2                             6.68
       2-3                             6.68
       3-1                             6.69
       3-2                             6.69
       3-3                             6.69
       平均值                          6.69四、结论：该样品的PH值平均为6.90。II醋酸洗必泰含量测定一、材料：1、消毒剂：高科复合酶洗液2、试剂：0.0956mol/L高氯本标准溶液
     丙酮
     冰醋酸
     甲基橙的饱和丙酮溶液二、方法：
取醋酸洗必泰30.0ml，于100ml碘量瓶中加丙酮30ml与冰醋酸2ml，振摇使溶解后，加甲基橙的饱和丙酮溶液1.0ml，用高氯酸标准液滴定。待溶液显橙色，记录高氯酸溶液用量。同时以不含醋酸洗必泰的丙酮与冰醋酸溶液重复上述操作(空白对照)。重复测三次，取其平均值进行以下计算。三、结果：
   样品编号                      醋酸洗必泰含量(％)
     1-1                               0.1047
     1-2                               0.1047
     1-3                               0.1047
     2-1                               0.1047
     2-2                               0.1047
     2-3                               0.1047
     3-1                               0.1047
     3-2                               0.1047
     3-3                               0.1047
     平均                              0.1047四、结论：
该样品的醋酸洗必泰含量为0.1047％。III稳定性试验(有效成份含量)一、材料：1、消毒剂：高科复合酶洗液2、试剂：0.0956mol/L高氯酸标准溶液
    丙酮
    冰醋酸
    甲基橙的饱和丙酮溶液二、方法：
取消毒剂三份置37℃温箱(相对湿度＞75％)三个月于放置前、后分别测定醋酸洗必泰含量。(方法同醋酸洗必泰含量测定)，每份样品重复3次，取其平均其，计算下降率。三、结果：
                   稳定性试验结果样品编号  放置前醋酸洗必泰含量(％)   放置后醋酸洗必泰含量(％)   下降率(％)1-1             0.1047                      0.0997                 4.781-2             0.1047                      0.0997                 4.781-3             0.1047                      0.0997                 4.782-1             0.1047                      0.0997                 4.782-2             0.1047                      0.0997                 4.782-3             0.1047                      0.0997                 4.783-1             0.1047                      0.0997                 4.783-2             0.1047                      0.0997                 4.783-3             0.1047                      0.0997                 4.78平均              /                           /                    4.78注：试验条件为37℃放置三个月。四、结论：本样品经37℃放置三个月，醋酸洗必泰含量平均下降率为4.78％。IV大肠杆菌载体浸泡定量杀菌试验一、材料1、菌株：大肠杆菌(8099)2、消毒剂：高科复合酶洗液3、中和剂：0.5％硫代硫酸钠、2％吐温-80、0.5％卵磷脂的PBS。二、方法1、大肠杆菌悬液制备
打开大肠杆菌(8099)冻干菌种管，经分离培养后，取4-14代经37℃培养24h的新鲜斜面培养物，用5mlPBS洗下菌苔，然后用含1％蛋白胨的PBS作适当稀释后备用。2、菌片制备：
经脱脂、清洗的1×1cm灭菌布片滴加0.02ml适当菌量的菌悬液，37℃干燥30min后备用。3、载体定量法中和剂鉴定试验：
试验用消毒液浓度为原液、中和剂为含0.5％硫代硫酸钠、2％吐温-80、0.5％卵磷脂的PBS，中和剂试验分8组进行。(1)5.0ml消毒液加1片染菌片，作用1min，取出菌片移入5.0mlPBS中。(2)5.0ml消毒液加1片染菌片作用1min，取出菌片移入5.0ml中和剂中，作用10mm。(3)5.0ml中和剂加1片染菌片，作用10min。取出菌片移入5.0ml中和剂中，用中和剂稀释后接种。(4)5.0ml中和产物溶液(将浸有消毒剂的载体置5.0ml中和剂内作用10min)加染菌片1片，作用10min。取出菌片移入5.0ml中和产物中，以中和产物溶液稀释后接种。(5)5.0mlPBS加入1片染菌片，作用10分钟，取出菌片移入5.0mlPBS中，以PBS稀释后接种。(6)(7)(8)组分别为PBS、中和剂、培养基阴性对照组。37℃培养48h观察结果。试验重复3次，试验温度20℃±2℃(试验前预温5min)。4、载体浸泡定量杀菌试验：
分别取三个不同浓度的消毒液，以每片5.0ml的量注入灭菌平皿中，于20℃±2℃)水浴5min后，加入大肠杆菌菌片，作用至规定时间时，分别取出菌片移入5.0ml中和剂中，作用10min后充分振摇洗下菌片上细菌，吸取0.5ml洗液进行活菌培养计数37℃培养48h观察结果，同时以PBS代替消毒剂作阳性对照组。接种中和剂、PBS并以同批培养基为阴性对照，试验重复3次，计算杀灭率与平均杀灭率。三、结果：1、载体定量法中和剂鉴定试验：
            表1  中和剂鉴定试验结果
组别                      存活菌数(cfu/片)
 1         0                   0              0
 2         1.75×104         2.05×104     2.50×104
 3         1.21×106         1.25×106     1.29×106
 4         1.15×106         1.21×106     1.25×106
 5         1.24×106         1.28×106     1.30×106
 6         0                  0               0
 7         0                  0               0
 8         0                  0               02、载体浸泡定量杀菌试验(布片载体)
              表2  对大肠杆菌的杀灭效果稀释浓度                作用不同时间(min)的平均杀灭率(％)(％)           2                5               10               20
         98.95            99.89            99.98            99.99原液     (98.76-99.07)    (99.87-99.90)    (99.98-99.98)    (99.99-99.99)
         89.94            91.89            93.29            99.7250       (88.76-91.30)    (91.30-92.53)    (92.92-93.69)    (99.68-99.76)
         55.76            65.76            82.69            97.4225       (53.84-56.92)    (63.84-68.07)    (78.84-86.53)    (97.15-97.69)注：阳性对照组平均菌数为1.30×106cfu/片(1.28-1.33×106cfu/片)
阴性对照组：中和剂、PBS、培养基无细胞生长。四、结论：1、经3次重复中和剂鉴定试验表明，含0.5％硫代硫酸钠、2％吐温-80、0.5％卵磷脂的PBS可中和试验浓度的消毒剂对对大肠杆菌的残余作用，且中和产物对受试菌的生长无影响。2、经3次重复试验，该样品原液的消毒液作用10分钟对大肠杆菌的杀灭率为99.98％。V金黄色葡萄球菌载体浸泡定量杀菌试验一、材料：1、菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)2、消毒剂：高科复合酶洗液3、中和剂0.5％硫代硫酸钠、2％吐温-80、0.5％卵磷脂的PBS。二、方法：1、金黄色葡萄球菌悬液制备：
打开金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)冻干菌种管，经分离培养后，取4-14代经37℃培养24h的新鲜斜面培养物，用5mlPBS洗下菌苔，然后用含1％蛋白胨的PBS作适当稀释后备用。2、菌片制备：
经脱脂、清洗的1×1cm灭菌布片滴加0.02ml适当菌量的菌悬液，37℃干燥30min后备用。3、载体浸泡定量杀菌试验：
分别取三个不同浓度的消毒液，以每片5.0ml的量注入灭菌平皿中，于20℃±2℃水浴5min后，加入金黄色葡萄球菌菌片，作用至规定时间分别取出菌片移入5.0ml中和剂中，作用10min后充分振摇洗下菌片上细菌，吸取0.5ml洗液进行活菌培养计数。37℃培养48h观察结果，同时以PBS代替消毒剂作阳性对照组，接种中和剂、PBS并以同批培养基为阴性对照。试验重复3次，计算杀灭率与平均杀灭率。三、结果：
对金黄色葡萄球菌的杀灭结果稀释浓度    作用不同时间(min)的平均杀灭率(％)(％)          2                5                10              20
        98.48            99.71             99.93           99.97原液    (98.25-99.70)    (99.66-99.75)    (99.93-99.94)    (99.99-99.99)
        87.19            89.36             91.71           99.5750      (86.83-87.63)    (88.92-89.73)    (91.25-92.00)    (99.52-99.62)
        55.76            65.76             82.69           97.4225      (48.66-54.46)    (58.03-65.17)    (77.67-86.16)    (96.83-97.36)注：阳性对照组平均菌数为1.12×106cfu/片(1.28-1.33×106cfu/片)
阴性对照组：中和剂、PBS、培养基无细胞生长。四、结论：1、经3次重复试验，该样品原液的消毒液作用10分钟对金黄色葡萄球菌的杀灭率为99.93％。VI白色念珠菌载体浸泡定量杀菌试验一、材料：1、菌株：白色念珠菌(ATCC 10231)2、消毒剂：高科复合酶洗液3、中和剂0.5％硫代硫酸钠、2％吐温-80、0.5％卵磷脂的PBS。二、方法：1、白色念珠菌悬液制备：
打开白色念珠菌(ATCC 10231)冻干菌种管，经分离培养后，取4-14代经37℃培养24h的新鲜斜面培养物，用5mlPBS洗下菌苔，然后用含1％蛋白胨的PBS作适当稀释后备用。2、菌片制备：
经脱脂、清洗的1×1cm灭菌布片滴加0.02ml适当菌量的菌悬液，37℃干燥30min后备用。3、载体定量法中和剂鉴定试验：
试验用消毒液浓度为原液、中和剂为含0.5％硫代硫酸钠、2％吐温-80、0.5％卵磷脂的PBS，中和剂试验分8组进行。(1)5.0ml消毒液加1片染菌片，作用1min，取出菌片移入5.0mlPBS中。(2)5.0ml消毒液加1片染菌片作用1min，取出菌片移入5.0ml中和剂中，作用10min。(3)5.0ml中和剂加1片染菌片，作用10min。取出菌片移入5.0ml中和剂中，用中和剂稀释后接种。(4)5.0ml中和产物溶液(将浸有消毒剂的载体置5.0ml中和剂内作用10min)加染菌片1片，作用10min。取出菌片移入5.0ml中和产物中，以中和产物溶液释后接种。(5)5.0mlPBS加入1片染菌片，作用10分钟，取出菌片移入5.0mlPBS中，以PBS稀释后接种。(6)(7)(8)组分别为PBS、中和剂、培养基阴性对照组。37℃培养72h观察结果。试验重复3次，试验温度20℃±2℃(试验前预温5min)。4、载体浸泡定量杀菌试验：
分别取三个不同浓度的消毒液，以每片5.0ml的量注入灭菌平皿中，于20℃±2℃)水浴5min后，加入大肠杆菌菌片，作用至规定时间时，分别取出菌片移入5.0ml中和剂中，作用10min后充分振摇洗下菌片上细菌，吸取0.5ml洗液进行活菌培养计数37℃培养72h观察结果，同时以PBS代替消毒剂作阳性对照组。接种中和剂、PBS并以同批培养基为阴性对照，试验重复3次，计算杀灭率与平均杀灭率。三、结果：1、载体定量法中和剂鉴定试验：
             表1  中和剂鉴定试验结果
组别                  存活菌数(cfu/片)
 1        0               0              0
 2        4.75×104     4.90×104     4.15×104
 3        7.95×105     8.40×105     7.60×105
 4        7.50×105     7.95×105     7.40×105
 5        8.15×105     8.50×105     7.80×105
 6        0              0               0
 7        0              0               0
 8        0              0               02、载体浸泡定量杀菌试验(布片载体)
       表2  对白色念珠菌的杀灭效果稀释浓度       作用不同时间(min)的平均杀灭率(％)(％)            2        5         10         20
          97.11    99.55      99.90      99.98原液    (95.37-98.58)    (99.33-99.81)    (99.90-99.91)    (99.97-99.98)
         82.48           84.93            89.44             99.4150      (81.79-82.96)    (84.50-85.61)    (88.64-90.00)    (99.33-99.46)
         50.00           56.68            78.61             94.5325      (45.29-53.08)    (53.70-59.25)    (72.22-79.62)    (94.07-94.87)注：阳性对照组平均菌数为8.10×105fu/片(7.80-1.33×105fu/片)
阴性对照组：中和剂、PBS、培养基无细胞生长。四、结论：1、经3次重复中和剂鉴定试验表明，含0.5％硫代硫酸钠、2％吐温-80、0.5％卵磷脂的PBS可中和试验浓度的消毒剂对白色念珠菌的残余作用，且中和产物对受试菌的生长无影响。2、经3次重复试验，该样品原液的消毒液作用10分钟对白色念珠菌的杀灭率为99.90％。
本发明的溶葡萄球菌复合酶(高科复合溶菌酶)洗液对会阴部细菌及淋病的杀菌试验经上海市预防医学研究院检验结果如下：检验情况样品名称：高科复合酶洗液样品编号：黄疾控2000-4345消现60/1-60送检单位：上海高科生物工程有限公司请验项目：杀菌率测试依据：GB15981-1995《消毒技术规范》-2000检验结果：试验对象及数量：会阴部，共60件。消毒用浓度(剂量)：原液，作用时间：1分钟中和剂名称浓度(或用量)0.5％硫代硫酸钠，2％吐温-80，0.5％卵磷脂PBS试验环境温度(℃)：22，相对湿度(％)：79。采样方法：将浸有上述中和剂采样液的无菌棉拭子均匀在会阴部左侧来回涂若干次，然后将棉拭子插回试管中作为消毒前采样。再将浸有高科复合酶洗液的棉拭子均匀在会阴部右侧来回涂若干次，1分钟后用上述方法再涂擦，作为消毒后采样。然后将棉花端插入度管内洗脱。消毒前后采样共60件。检验方法：洗液倾注琼脂平板37℃，培养48小时，活菌计数，计算杀菌率。试验对象名称    件数    检验项目   时间(分)  消毒前菌数(数)   消毒后菌数(数)     杀菌率(％)会阴部          1     细菌总数      1           2900             90              96.90会阴部      2    细菌总数    1      1100      10      99.09会阴部      3    细菌总数    1      2600      20      99.23会阴部      4    细菌总数    1      3400      50      98.53会阴部      5    细菌总数    1      4700      250     94.68会阴部      6    细菌总数    1      3400      210     93.82会阴部      7    细菌总数    1      8800      630     92.84会阴部      8    细菌总数    1      8700      490     94.37会阴部      9    细菌总数    1      2900      190     93.45会阴部      10   细菌总数    1      3700      290     92.16会阴部      11   细菌总数    1      6500      570     91.23会阴部      12   细菌总数    1      4200      170     95.95会阴部      13   细菌总数    1      1500      30      98.00会阴部      14   细菌总数    1      2400      40      98.33会阴部      15   细菌总数    1      4700      220     95.32会阴部      16   细菌总数    1      2700      200     95.59会阴部      17   细菌总数    1      3500      210     94.00会阴部      18   细菌总数    1      4600      200     95.65会阴部      19   细菌总数    1      3200      200     93.75会阴部      20   细菌总数    1      1700      60      96.47会阴部      21   细菌总数    1      3300      290     91.21会阴部      22   细菌总数    1      880       20      97.73会阴部      23   细菌总数    1      6900      520     92.46会阴部      24   细菌总数    1      2900      210     92.76会阴部      25   细菌总数    1      1100      70      93.64会阴部      26   细菌总数    1      2800      280     90.00会阴部      27   细菌总数    1      3700      370     90.00会阴部      28   细菌总数    1      4700      420     91.06会阴部      29   细菌总数    1      4900      290     94.08会阴部      30   细菌总数    1      4200      320     92.38
检验结果与评价：
高科复合酶洗液对淋病奈瑟菌的最小杀菌浓度为3.9×
10-5u/ml。
不同浓度(0.5u/ml、1u/ml、2u/ml)的高科复合酶洗液在不同作用温度(10℃、20℃、37℃)，不同作用时间(2’、5’、10’、15’、30’、45’)的条件下对淋病奈瑟菌均有杀灭作用。VII有机物影响试验一、材料：1、菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)2、消毒剂：高科复合酶洗液3、中和剂0.5％硫代硫酸钠、2％吐温-80、0.5％卵磷脂的PBS。二、方法：1、金黄色葡萄球菌悬液制备：
将金黄色葡萄球菌悬液与无菌小牛血清配成含50％小牛血清组、含25％小牛血清组和不含小牛血清三组，分别滴染灭菌布片制备染菌片，菌量达5×105-5×106cfu/片。37℃干燥30min后用原液浓度消毒液进行载体浸泡定量杀菌试验。试验重复3次，计算杀灭率与平均杀灭率。三、结果：
                                 有机物影响试验结果稀释浓度                  作用不同时间(min)的平均杀灭率(％)                  对照菌数(％)        10              20               30               40              (cfu/片)
      97.11            99.55            99.90            99.98            9.50×105原液  (95.37-98.58)    (99.33-99.81)    (99.90-99.91)    (99.97-99.98)    (9.10-9.90×105)
      82.48            84.93            89.44            99.41            1.50×10650    (81.79-82.96)    (84.50-85.61)    (88.64-90.00)    (99.33-99.46)    (1.03-1.08×106)
      50.00            56.68            78.61            94.53            1.25×10625    (45.29-53.08)    (53.70-59.25)    (72.22-79.62)    (94.07-94.87)    (1.22-1.28×106)四、结论：
经3次重复有机物影响试验，在菌悬液中含有50％小牛血清时，对该样品杀灭金黄色葡萄球菌的作用有中度影响；在菌悬液中含有25％小牛血清时，对该样品杀灭金黄色葡萄球菌的作用有轻度影响。结论：
高科复合酶洗液PH值为6.69。醋酸洗必泰含量为0.1047％。样品经37℃放置三个月，醋酸洗必泰含量下降率为4.78％。该样品原液作用10分钟对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的杀灭率分别为99.98％、99.93％和99.90％。在50％小牛血清存在时，对该样品杀灭金黄色葡萄球菌的作用有中度影响；在25％小牛血清存在时有轻度影响。
本发明的溶葡萄球菌洗液(高科复合酶洗液)经上海市预防医学研究院检测急性毒性等试验结果如下：I急性经口毒性试验一、试验目的：检测受试物在短时间经口染毒时的毒性，其结果可作为毒性分级和确定亚慢性毒性等试验剂量的依据。二、材料和动物
受试物
性状：送检样品为无色液体
配制方法：准确称取样品，加入蒸馏水配成0.25g，ml，供试。
实验动物：昆明种小鼠，清洁级，体重18-22克，由上海医科大学实验动物部提供，合格证号：02-22-1。
饲养室温度22±2℃，相对湿度50-80克，动物室合格号02-28。小鼠饲养料，由苏杭实验动物科技发展公司提供，合格证号：9905084。三、试验方法：1、检验依据：消毒技术规范(第三版)1999.11中3.4条。2、剂量和分组：动物禁食过夜后，按体重随机分雌雄二组，每组10只。剂量为5.0g/kg。3、试验步骤：采用一次经口灌胃染毒法，按0.2ml/10g体重，计算染毒量。观察期为二周。对到期处死动物进行解剖，肉眼观察动物大体病理改变。4、计算：用一次最大限度法计算LD50值，并根据急性毒性分级标准进行毒性分级。四、试验结果：
不同剂量组动物体重变化，死亡情况见表。
染毒后：未见明显中毒症状
大体解剖：
到期处死动物，各脏器未见异常。
                 小鼠急性经口毒性试验结果件     剂量组    动物数                  体重X±SD(g)             死亡动物   死亡别      g/kg      (只)          0             7          14(d)     数(只)   率(％)♂      5.0        10      20.0±1.3     24.1±1.2    27.5±1.4       0       00♀     5.0        10      19.5±1.4     23.7±1.1    26.9±1.2       0       0五、结论：
小鼠急性经口LD50：
雌性：＞5.0g/kg
雄性：＞5.0g/kgII皮肤刺激试验一、试验目的：检测受试物对动物皮肤接触后是否产生局部刺激反应及其程度。二、材料和动物：
受试物
性状：送检样品为无色液体
配制方法：原液直接测试。
实验动物：新西兰家兔，普通级，四只，体重2.4～2.8kg，由上海医科大学实验动物部提供，合格证号：05-52-1。饲养室温度20±2℃，相对湿度50-70％，动物房合格证号：02-28，家兔饲料由苏杭实验动物科技发展公司提供，合格证号：9905084。三、试验方法：1、检测依据：消毒技术规范(第三版)1999.11中3.6条。2、试验前24小时将动物背部脊柱两侧毛剪掉，去毛范围各约3×3cm2。3、第二天，在左侧完好去毛皮肤上划出2.5×2.5cm2试验区，将受试物0.2ml均匀涂在试验区皮肤上，并用一层玻璃覆盖，再用无刺激胶布固定，使受试物与皮肤直接接触4h，右侧去毛皮肤作对照。4、试验结束后除去覆盖物，并用温水清洗除去残留受试物后。分别于除去残留受试物后1、24和48h观察涂抹部位皮肤反应，按皮肤刺激反应强度的评分标准评分和对皮肤刺激反应强度分级。四、试验结果：
受试物与皮肤接触后局部皮肤未见红斑、水肿，未见其它毒性作用。家兔皮肤一次刺激反应评分见表。
                            对动物皮肤一次刺激反应评分表动   性   体                  1h                           24h                        48h物   别   重        样品         对照            样品           对照          样品        对照编       (kg)   红   水   总  红  水    总  红    水   总  红    水  总   红   水  总  红  水  总
            斑   肿   分  斑  肿    分  斑    肿   分  斑    肿  分   斑   肿  分  斑  肿  分1    雌   2.4   0    0    0   0   0     0   0     0    0    0    0   0    0    0   0   0   0   02    雌   2.4   0    0    0   0   0     0   0     0    0    0    0   0    0    0   0   0   0   03    雌   2.4   0    0    0   0   0     0   0     0    0    0    0   0    0    0   0   0   0   04    雌   2.4   0    0    0   0   0     0   0     0    0    0    0   0    0    0   0   0   0   0总积分均值                0             0              0             0             0           0五、结论：
受试物对家兔皮肤刺激(最高)总积分均值为0，属无刺激性。III小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验一、试验目的：检测受试物对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的影响，评价其体内遗传毒性。二、材料和动物：受试物性状：送检样品为无色液体配制方法：称取样品5.0、2.5、1.0g，分别加蒸馏水至20ml，充分混匀后作为受试样品。阳性对照物：环磷酰胺由上海华联制药有限公司生产。配制方法：称取环磷酰胺40mg加蒸馏水至20ml，充分混匀后备用。
实验动物：昆明种小鼠，普通级，体重25-30克，由上海医科大学实验动物部提供，合格证号：02-22-1。饲养室温度20±2℃，相对湿度50-70％，动物房合格证号：02-28，小鼠饲养料由苏杭实验动物科技发展公司提供，合格证号：9905084。三、试验方法：1、检测依据：消毒技术规范(第三版)1999.11中3.11.4条。2、将动物随机分为5组，每组10只，雌雄各半，分别为样品三个剂量组及阴性对照组和环磷酰胺阳性对照组。3、采用30h二次灌胃法，将配制的不同浓度样品0.4mg/20g体重，分别对各组动物灌胃，阳性对照组采用灌胃，阴性对照组采用灌胃。4、于第二次灌胃后6小时，颈椎脱臼处死动物，取股骨骨髓加小牛血清混匀，常规涂片、固定Giemsa染色制片。5、镜检观察，每鼠计数1000嗜多染红细胞(PCE)，并计算其中含微核细胞数，以千分率‰来表示。同时还观察PCE/NCE(成熟红细胞)之比例。6、各组微核细胞率与阴性对照组相比用泊松分布U检验进行统计处理。四、试验结果：
            小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率组别    剂量    动物数  受检PCE  含微核   微核细胞 PCE/    统计学
   (mg/kg)  (只)   数(个)    PCE(个)   率‰        NCE      检验受试     5000    10    10000      10       1.0     1.07    ＞0.05物组     2500    10    10000      9        0.9     1.06    ＞0.05
     1000    10    10000      8        0.8     1.08    ＞0.05阴性       蒸馏水
                   10     10000    9      0.9     1.06对照组     20000mg/kg阳性       环磷栈酰胺
                    10    10000    282    28.2    0.96    ＜0.01对照组    40mg/kg五、结论：
受试物对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果为阴性。IV阴道粘膜刺激试验一、试验目的：检测受试物对试验动物阴道粘膜的刺激作用和强度。二、材料和动物：受试物性状：关检样品为无色液体配制方法：取棉条0.01，用送检样品浸润后作为受试物。实验动物：SD大鼠，雌性，普通级，12只，体重240-260g，分二组，受试物组和对照组，每组6只。由上海医科大学实验动物部提供，合格证号：02-22-2。饲养室温度20±2℃，相对湿度50-70％，动物房合格证号：02-28，大鼠饲养料由苏杭实验动物科技发展公司提供，合格证号：9905084。三、试验方法：1、检测依据：消毒技术规范(第三版)1999.11中3.8条。2、将受试物置动物阴道内，与阴道粘膜接触4小时，对照组用棉条0.01g浸以灭菌生理盐水作同样的试验。3、于24h处死动物，取出局部阴道组织，观察有无充血、水钏等现象。4、参照消毒技术规范(第三版)1999.11中皮肤刺激反应强度的评分标准及皮肤刺激强度分级，进行对阴道粘膜刺激强度的评定。四、试验结果：
           动物阴道粘膜刺激反应评分组      动物      体重             刺激反应评分别      编号      (g)       红斑      水肿        总分
     1        240        0          0           0受       2        245        0          0           0试       3        252        0          0           0物       4        254        0          0           0组         5       260      0       0       0
       6       255      0       0       0总积分均值                                  0
       7       243      0       0       0
       8       245      0       0       0对         9       251      0       0       0照         10      260      0       0       0组         11      248      0       0       0
       12      250      0       0       0总积分均值                                  0五、结论：
受试物对大鼠阴道粘膜刺激反应最高总积分均值为0，属无刺激性。V皮肤变态反应试验一、试验目的：检测受试物重复接触后对动物产生的皮肤变态反应。二、材料和动物：受试物性状：送检样品为无色液体配制方法：原液直接测试。实验动物：英国种白色豚鼠，普通级，雌雄各半，体重200-240g，共48只，分为受试物组、阴性对照组、阳性对照组三组，每组16只，由上海医科大学实验动物部提供，合格证号：02-52-2。饲养室温度20±2℃，相对湿度50-70％，动物房合格证号：02-28，大鼠饲养料由苏杭实验动物科技发展公司提供，合格证号：9905084。三、试验方法：1、检测依据：消毒技术规范(第三版)1999.11中3.9条。2、试验前24h将豚鼠背部左侧毛剪掉，面积约3×3cm2。3、诱导接触：将诱导用受试物0.2ml在2×2cm2两层纱布上，并将其贴敷在受试组动物左侧去毛区皮肤上，用一层玻璃纸覆盖，再用无刺激胶布固定，使受试物在皮肤直接接触6h。于第7d和第14d以同样方法重复一次。4、激发接触：在末次诱导接触后14d，将激发用受试物0.2ml在2×2cm2两层纱布上，并将其贴敷在受试组和阴性对照组动物右侧去毛皮肤上，用一层玻璃纸覆盖，再用无刺激胶布固定，使直接接触6h。5、6h后将贴敷的受试物取掉。于24、48h后观察皮肤反应，按皮肤反应强度分级标准平分并计算致敏率和按致敏强度评定标准评价致敏强度。6、阳性对照组分别用5％喝2％2、4-二硝基氯代笨作同样的诱导接触和激发接触。四、试验结果：
                           豚鼠皮肤变态反应结果组   动物   诱导  激发  观察         红斑反应强度         水肿反应强度      致敏率(％)别    数    浓度  浓度  时间   0    1    2    3    4     0    1    2    3受试                    24h  16/16 0/16 0/16 0/16 0/16 16/16 0/16 0/16 0/16     0
  16    原液  原液物组                    48h  16/16 0/16 0/16 0/16 0/16 16/16 0/16 0/16 0/16     0阳性                    24h  16/16 0/16 0/16 0/16 0/16 16/16 0/16 0/16 0/16     0
  16     /    原液对照组                  48h  16/16 0/16 0/16 0/16 0/16 16/16 0/16 0/16 0/16     0阳性                    24h  6/16  8/16 2/16 0/16 0/16 14/16 2/16 0/16 0/16     0
  16    5％/  2％对照组                  48h  4/16  5/16 4/16 3/16 0/16 10/16 6/16 0/16 0/16     0注：皮肤红斑反应、水肿反应强度即在积分为0、1、2、3、4时的反应动物数与试验动物数之比。五、结论：
受试物对豚鼠皮肤变态反应试验结果，致敏率为0(％)，致敏强度属极轻。VI蓄积毒性试验——剂量递增蓄积系数法一、试验目的：检测受试物在试验动物体内蓄积毒性，并为亚慢性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参数。二、材料和动物：受试物性状：送检样品为无色液体配置方法：准确称取样品，加入蒸馏水，配成浓度分别为50、75、110、250mg/kg，作为各期受试物。实验动物：昆明种小鼠，清洁级，体重20-21g，由上海医科大学实验动物部提供，合格证号：02-22-1。饲养室温度20±2℃，相对湿度50-80％，动物房合格证号：02-28。小鼠饲养料，由苏杭实验动物科技发展公司提供，合格证号：9905084。三、试验方法：1、检测依据：消毒技术规范(第三版)1999.11中3.10.3条。2、根据急性经口毒性试验结果，该样品小鼠经口LD50以5.0g/kg计。3、将动物随机分为雌雄两组，每组10只，经口灌胃容量以0.1ml/10g体重。每天一次，每4天为一期。首期剂量用0.1 LD50即0.5g/kg，连续4天。以后每期剂量一次递增50％，在递增同时重称体重，按体重校正灌胃量。四、试验结果：
在蓄积毒性试验染毒期间未见明显中毒症状出现。受试物染毒剂量，累计剂量和动物死亡数见表。
                               累计剂量和动物死亡数表
 染毒天数(d)     染毒剂量(g/kg)      累计剂量(g/kg) 动物死亡数(只)     备注
    LD50×     G/kg     LD50×     g/kg     ♀    ♂
    1-4     0.10     0.50     0.40     2.00     0      0
    5-8     0.15     0.75     1.00     5.00     0      0
    9-12     0.22     1.10     1.88     9.40     0      0
    13-16     0.34     1.70     3.24     16.20     0      0
    17-20     0.50     2.50     5.24     26.20     0      0
    21-     0.75
小鼠连续染毒20天，未见死亡，累积剂量为26.20g/kg，蓄积系数＞5。五、结论：
受试物对小鼠蓄积毒性试验，其蓄积系数(K值)＞5，根据蓄积毒性分级属弱蓄积性。检验结果汇总：一、急性经口毒性试验
雌性小鼠LD50＞5.0g/kg
雄性小鼠LD50＞5.0g/kg
属实际无毒级二、皮肤刺激试验：属无刺激性。三、微核试验：阴性四、阴道粘膜刺激试验：属无刺激性五、皮肤变态反应：属极轻六、蓄积毒性试验：蓄积系数K＞5，属弱蓄积性。
本发明的主要成份-高科复合溶菌酶，本质上是蛋白质，不会对皮肤和粘膜产生刺激，不对机体产生任何形式的毒副作用，并可通过代谢彻底降解，没有残留，不会富集，所以该洗液在使用过程中无需过洗。
其基本特点为：
1)杀菌谱广。不仅能有效杀灭白色念珠菌、溶血性链球菌、厌氧菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等常见致病细菌，对淋病奈瑟菌也有很强的杀灭作用。此外对一些耐药性细菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等也显示出极强的杀菌效果。
2)杀菌活性和稳定性大大高于溶葡萄球菌酶。由于高科复合酶洗液是以溶葡萄球菌酶(lysostaphin)为主要成分，配以另一种溶菌酶及稳定剂、增效剂等成分复合而成，比纯的溶葡萄球菌酶具有更大的稳定性，经测试证明，该洗液在常温下可保存2年。
实例1、制造100毫升溶葡萄球菌复合酶洗液组分：溶葡葡球菌酶     0.001克
  溶菌酶           0.02克
  洗必泰           0.1克
  甘油             0.2毫升
  蒸馏水           99.7毫升方法：
分别将溶葡萄球菌酶0.001克，溶菌酶0.02克，洗必泰0.1克混匀，再加入甘油0.2ml蒸馏水99.7ml，混匀灌装。
实例2：制造100毫升溶葡萄球菌复合酶洗液组分：溶葡萄球菌酶         0.002克
  溶菌酶               0.02克
  洗必泰               0.1克
  甘  油               0.2毫升
  蒸馏水               99.7毫升方法：
分别将溶葡萄球菌酶0.002克，溶菌酶0.02克，洗必泰0.1克混匀，再加入甘油0.2ml蒸馏水99.7ml，混匀灌装。
实例3、制造100毫升溶葡萄球菌复合酶洗液组分：溶葡萄球菌酶       0.002克
  溶菌酶             0.02克
  洗必泰             0.15克
  甘  油             0.2毫升
  蒸馏水             99.6毫升方法：
分别将溶葡萄球菌酶0.002克，溶菌酶0.02克，洗必泰0.15克混匀，再加入甘油0.2ml蒸馏水99.6ml，混匀灌装。

Claims (2)

1、一种溶葡萄球菌复合酶洗液，其特征在于该洗液是由按重量％计溶葡萄球菌酶0.001～0.002％和溶菌酶0.02～0.05％、洗必泰0.1-0.2％作为主要成份与甘油0.2～0.3％和蒸馏水作为辅料构成100％的组合物。
2、一种如权利要求1所述的溶葡萄球菌复合酶洗液的制备方法，其特征在于该方法是在无菌室或超净工作台中，按处方量将溶葡萄球菌酶，溶菌酶，洗必泰按比例依次加入洁净的玻璃或不锈钢盛具中，轻轻搅拌，充分混和均匀后，再加入所示比例的甘油和蒸馏水，充分混匀，灌装于塑料或玻璃瓶中，入库，室温保存。
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