CN1327741A - 溶葡萄球菌复合酶消毒剂 - Google Patents

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CN1327741A CN 00116397 CN00116397A CN1327741A CN 1327741 A CN1327741 A CN 1327741A CN 00116397 CN00116397 CN 00116397 CN 00116397 A CN00116397 A CN 00116397A CN 1327741 A CN1327741 A CN 1327741A
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Abstract

本发明提供了一种生物型的溶葡萄球菌复合酶消毒剂,该消毒剂对革兰氏阳性菌和阴性菌均有良好抑菌作用。对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、厌氧菌、淋球菌、溶血性链球菌等杀菌效果显著,杀菌率达99.9%。本发明提供了制备方法。

Description

溶葡萄球菌复合酶消毒剂
本发明涉及生物制剂，具体涉及溶葡萄球菌复合酶消毒剂。
目前常用的消毒剂主要为化学消毒剂，包括下列几类：
1、凝固蛋白类的消毒剂：
它是通过使蛋白变性达到消毒目的。如酚、来苏、酸类、醇类。上述试剂一般用于食品、水果、实验器材、医院、皮肤等的消毒。
2、溶解蛋白类的消毒剂
可使微生物溶解进而起到杀灭作用。如氢氧化钠、石灰等。
3、氧化蛋白类的消毒剂
是通过氧化剂的强氧化作用把病原体杀死。包括漂白粉、过氧乙酸等。一般用于外周环境、水、居室及物品的消毒。
4、阳离子表面活性消毒剂；
此类药物主要为季胺盐，此药物在高浓度时凝固蛋白，低浓度时抑制细菌的代谢，该类药物对革兰氏阳性菌和阴性菌均有效。
5、其它
福尔马林：可与蛋白的氨基结合，使蛋白变性，起到杀菌消毒的作用。常用于消毒毛皮制品。
戊二醛：其醛基可与微生物的蛋白反应，以达到消毒目的。对病毒、细菌的繁殖型、结核杆菌、真菌、芽孢均有较好的杀菌效果。
环氧乙烷：是一种穿透力很强、具有较强杀菌能力的杀菌剂。可对皮毛、纤维等进行消毒。
洗必泰，安尔碘：是国产消毒剂，具有消毒效果好，用法简便，是目前较好的消毒剂之一，它对革兰氏阳性菌有较强的杀菌作用。
但以上消毒剂均为化学消毒剂。化学类消毒剂对环境有一定的污染，临床消毒中会带来很大的毒副作用，如对皮肤粘膜刺激、对血流伤口及血污创面刺激等。这些都影响化学类消毒剂的杀菌消毒的应用。
本发明的目的在于克服上述不足之处，研制一种毒副作用小、杀菌效果好的消毒剂。
本发明提供了一种溶葡萄球菌复合酶消毒剂，它是对革兰氏阳性菌和阴性菌均有良好抑菌作用的广谱杀菌剂。对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、厌氧菌、淋球菌、溶血性链球菌等杀菌效果显著、杀菌率可达99.9％。
本发明的溶葡萄球菌复合酶消毒剂由下列配方组成(重量百分比)：主要成分：(1)溶葡萄球菌酶(lysostaphin)    10-20％
      (2)溶菌酶(lysozyme)             20-30％辅料：(3)海藻糖(mycose)              9-12％
  (4)磷酸钾(potassium phosphate) 7-10％
  (5)氯化钠(sodium chloride)     0.5-1％
  (6)抑菌肽(Bacitracin)          2-3％
  (7)蒸馏水(distilled water)     35-50％
本发明的溶葡萄球菌复合酶消毒剂的杀菌原理如下：
溶葡萄球菌酶是一种革兰氏阳性菌的溶菌素。组成该类革兰氏阳性菌(例如金黄色葡萄球菌)细胞壁肽聚糖的四肽侧链的氨基酸，依次为L—丙氨酸，D—谷氨酸，L—赖氨酸，D—丙氨酸；而首位的L—丙氨酸通过一个酰胺键与胞壁酸相连，该聚糖链四肽侧链第3位的L—赖氨酸，通过五肽(五个甘氨酸)交联桥联结到相邻聚糖链四肽侧链D—丙氨酸羧基上。由此纵横交叉，左右联结构成十分坚韧的三维立体多孔结构，并聚合成较厚的肽聚糖层。溶葡萄球菌酶可切断肽聚糖中的Gly-Gly键，而溶葡球菌复合酶中另一种生物酶可切断N—乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的键，从而使杀菌活性更强，达到溶解并杀死细菌的目的，并可避免细菌耐药性的产生。
由于溶葡萄球菌酶独特的杀菌机理，使其不同于一般的抗生素。耐药性金黄色葡萄球菌的耐药机制复杂，除产生β-内酰胺酶外，还存在其它耐药机制。据临床观察MRSA对常用抗菌药物，如青霉素、苯唑青霉素一、三代头孢类抗生素及某些新喹诺酮抗菌药物也有较多的耐药菌株。从上述情况看，虽然有新的抗生素不断研制和投入使用，但在很短时间内就会有新的耐药菌株产生，这是因为大多数抗菌素只抑制细菌生长，促使细菌产生新的耐药质粒或新酶来阻止抗菌素的作用。溶葡萄球菌酶的作用机理不同于一般抗生素，抗生素的作用仅是抑制细菌生长，而该酶则是裂解细菌杀死细菌，并对耐甲氧苯青霉素(MRSA)的金黄色葡萄球菌同样有较强的杀菌能力。
溶葡萄球菌酶能水解革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖产生溶菌现象，从而彻底杀死细菌，避免了细菌耐药性的产生。上海市华山医院抗生素研究所、第二军医大学长海医院检验科、上海市第六人民医院检验科、上海市第九人民医院检验科等单位曾将临床各科收集到的400多株细菌进行了溶葡萄球菌酶的抑杀菌实验。实验结果表明：溶葡萄球菌酶对革兰氏阳性菌，如临床上常见的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎双球菌、D群肠球菌、四联球菌、产单核李斯特菌、链球菌以及胃幽门螺旋杆菌等均有明显的抑杀作用。
实验还证明溶葡萄球菌酶对耐药性菌株，如目前医学临床上最感棘手的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐药性肺炎双球菌、嗜麦芽窄食单孢菌的效果更优于常用抗生素。
本发明的溶葡萄球菌复合酶消毒剂(FE复合酶消毒剂II)的杀菌效果经上海市疾病预防控制中心检验结果如下：样品名称：FE复合酶消毒剂(II)数量：1样品标记：无送验单位：上海高科生物工程有限公司检验技术依据：卫生部：消毒与灭菌实验技术规范(试行)1997检验结果与评价1、含量测定：2、对大肠杆菌(8099)的杀灭率浓度(％)    不同作用时间(min)杀灭率％
        2      5      10      20100       99.99   100     100     10010        99.99   99.99   100     1001         99.87   99.99   99.99   100注：对照菌数为2.0×106cfu/ml。3、对金黄色葡萄球菌(ATTC6538)的杀灭率浓度(％)    不同作用时间(min)杀灭率％
        2      5      10      20100      99.99    99.99   100     10010       99.97    99.99   100     1001        99.05    99.51   99.82   99.92注：对照菌数为3.0×106cfu/ml。4、对绿脓杆菌(ATCC2027)的杀灭率浓度(％)    不同作用时间(min)杀灭率％
        2      5      10      20100      99.99    100     100     10010       99.99    99.99   100     1001        99.63    99.79   99.90   99.97注：对照菌数为1.5×106cfu/ml。5、对白色念珠菌(ATCC10231)的杀灭率浓度(％)    不同作用时间(min)杀灭率％
        2      5      10      20100      99.99    99.99   100     10010       99.95    99.99   100     1001                  99.35    99.86    99.91    99.97注：对照菌数为2.7×106cfu/ml。6、有机物影响试验：在10％消毒剂浓度下
在25～50％小牛血清存在下对大肠杆菌的杀灭率小牛血清含量    不同作用时间(min)杀灭率％    对照菌数(％)         2      5      10      20      (cfu/ml)0              99.87  99.99   99.99   100     2.0×10625             99.18  99.84   99.90   99.92   1.6×10650             99.30  99.03   99.09   99.31   1.6×1067、稳定性试验：
样品经54℃水浴二周后，再次检测其对大肠杆菌的杀灭情况浓度(％)    不同作用时间(min)杀灭率％
           2       5      10      20100            99.99  99.99   100     10010             99.95  99.96   99.99   99.991              99.85  99.92   99.99   99.99注：对照菌数为3.0×106cfu/ml。中和剂试验：中和剂：0.5％硫代硫酸钠＋2％吐温－80＋0.5％卵磷脂样品有效浓度：100％菌种：大肠杆菌组别                      残留菌(cfu/ml)消毒剂＋菌液                 0(消毒剂＋菌液)＋中和剂    1.5×103(消毒剂＋中和剂)＋菌液    2.9×106PBS＋菌液                 2.9×106中和剂＋菌液              2.8×106试验用同批次PBS              0试验用同批次中和剂           0试验用同批次培养基           08、现场使用试验
选择10名志愿者，预先用灭菌棉拭子于志愿者右臂、手和下肢皮肤上用规格板采取25cm2样品，放入含1％蛋白胨中和剂中，摇匀后进行自然菌培养计数作为对照，试验时用洗液喷湿左臂、手和下肢邻近部位，2分钟后再用灭菌棉拭子按对照方法采样培养计数，计算对自然菌的杀灭率。样品数    洗液对皮肤表面    对照组皮肤表面平均
  自然菌平均杀灭率(％)  自然菌菌数(cfu/25cm2)30           95.62               1.8×103
      (90.00～100)9、评价：本品10％浓度情况下，作用2分钟，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌均在99.95％以上；在1％浓度情况下，以25％血清保护菌液，有机物存在对杀菌作用有轻度影响；样品经54℃水浴二周后对大肠杆菌杀灭能力基本不变；本品经志愿者现场使用试验，洗液对皮肤表面自然菌平均杀菌率为95.62％。
本发明的溶于葡萄球菌复合酶消毒剂(FE复合酶消毒剂II)的毒性经上海市化学品毒性检定所检验结果如下：样品名称：FE复合酶消毒剂(II)数量：1送检单位：上海高科生物工程有限公司检验技术依据：消毒技术规范(1997年10月版)一、急性经口毒试验：目的：观察受试样品一次经口给予动物引起不良反应和死亡情况并确定半数致死剂量。1、样品性状：无色液体2、受试样品处理：称取样品1、2、3、4、5g分别加蒸馏水至20ml，充分混匀后作为受试供试。3、受试动物：3.1来源：上海医科大学实验动物部，合格证号：02—22—13.2种属与品系：昆明种小鼠3.3性别：雌性和雄性3.4体重：18—224、测试依据：按消毒技术规范(97年10月版)5、试验方法：5.1试验前，动物禁食16小时5.2将动物随机分为5组，每组20只，雌雄各半，称重，按0.4ml/20g体重，采用灌胃法进行一次给样。5.3观察给样后两周内，动物的中毒症状及死亡情况。5.4计算LD50及95％可信限。6、结果：
表雌雄小鼠急性经口毒性试验结果动物性别       剂量    动物数    死亡数    死亡率
         (mg/kg)    (只)      (只)      (％)雌性小鼠       1000      10         0         0
           2000      10         0         0
           3000      10         0         0
           4000      10         0         0
           5000      10         0         0雄性小鼠       1000      10         0         0
           2000      10         0         0
           3000      10         0         0
           4000      10         0         0
           5000      10         0         06.1主要症状表现：试验期间各组动物活动正常，毛色光泽度好，
未见任何中毒症状和死亡。6.2半数致死量：雌性小鼠：LD50＞5000mg/kg。雄性小鼠：
LD50＞5000mg/kg。7、根据急性毒性半数致死剂量分级，属实际无毒级物质。二、粘膜刺激试验：目的：通过粘膜刺激试验，来提示当眼一旦接触该样品后可能出现的危害情况。1、样品性状：无色液体2、受试样品处理：样品直接测试3、受试动物：新西兰种家兔，4只，体重2.0-3.0kg，由上海医科大学实验动物部提供，合格证号：02—52—1.4、测试依据：消毒技术规范(97年10月版)5、试验方法：将动物左侧眼睑轻轻分开，将0.1ml受试样品滴入结膜囊中，将上下眼睑闭合10s，右侧眼作对照。滴眼后24h不进行冲洗。分别于滴眼后6、24、48、72h和4、7d，对动物眼睛进行检查，按消毒技术规范(97年10月版)进行刺激强度评价。6、试验结果：动物眼损伤积分数值表：动物编号    观察部位              观察时间
        6        24         48      72(h)      4d        7d
    样品/对照 样品/对照 样品/对照 样品/对照 样品/对照 样品/对照1   角膜 0    0    0    0     0    0    0    0    0    0    0    0
虹膜 0    0    0    0     0    0    0    0    0    0    0    0
结膜 2    0    0    0     0    0    0    0    0    0    0    0
总分 2    0    0    0     0    0    0    0    0    0    0    02   角膜 0    0    0    0     0    0    0    0    0    0    0    0
虹膜       0    0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    0
结膜       4    0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    0
总分       4    0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    03   角膜       0    0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    0
虹膜       0    0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    0
结膜       2    0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    0
总分       2    0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    04   角膜       0    0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    0
虹膜       0    0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    0
结膜       2    0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    0
总分       2    0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    0总积分      10   0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    0平均刺激指数   2.5  0    0    0    0    0    0    0    0     0    0    0(最高)眼刺激积 2.5分指数(I.A.O.I)(48)h后眼刺激  0平均指数(M.I.O.I)
刺激强度    无刺激件7、结论：本样品眼刺激积分指数为2.5，眼刺激平均指数48小时后为0，属无刺激性。三、多次皮肤刺激试验：目的：通过受试动物多次接触，来表示皮肤接触样品后，可能出现
的危害程度。1、样品性状：无色液体2、受试样品处理：样品直接测试3、受试动物：英国种豚鼠，体重350—450g共4只，雌雄各半，由上海医科大学动物部提供，合格证号：02—52—24、测试依据：消毒技术规范(1997年10月版)5、试验方法：试验前将动物背部脊柱两侧毛剪掉，去毛范围左右各约2.5×2.5cm2，取受试样品0.2ml均匀涂抹于左侧皮肤上，右侧作对照。每天涂抹一次，连续14d。每天观察皮肤反应并根据皮肤刺激反应评分，涂抹结束后，取涂抹部位皮肤和相应对照皮肤进行病理组织学检查并评分。分别计算总积分。刺激指数见表1和积分均值见表2，按消毒技术规范(1997年10月版)进行多次皮肤刺激强度评价。6、结果：
                 表1多次皮肤刺激试验结果
  动                     刺激反应积分涂抹  物              样品                    对照天数  数    红斑      水肿    总分    红斑    水肿    总分1     4      0         0       0       0        0       02     4      0         0       0       0        0       03     4      0         0       0       0        0       0
4    4    0    0    0    0    0    0
5    4    1    0    1    0    0    0
6    4    2    0    2    0    0    0
7    4    2    0    2    0    0    0
8    4    2    0    2    0    0    0
9    4    1    0    1    0    0    0
10   4    2    0    2    0    0    0
11   4    2    0    2    0    0    0
12   4    2    0    2    0    0    0
13   4    2    0    2    0    0    0
14   4    1    0    1    0    0    0总积分                  17             0刺激指数                4.25           0
         表2多次皮肤刺激试验皮肤病理组织学检查结果动物    受试物    棘层    颗粒层    角质层    其它表    真皮    总积分编号              境厚    增厚      增厚       皮改变   改变1       样品       0       0          1         0.5       1      2.5
    对照       0       0          0         0         0      02       样品       0       0          1         0.5       1      2.5
    对照       0       0          0         0         0      03       样品       0       0          1         0.5       1      2.5
    对照       0       0          0         0         0      04       样品       0       0          1         0.5       1      2.5
    对照       0       0          0         0         0      0积分    样品       0       0          1         0.5       1      2.5均值    对照       0       0          0         0         0      07、结论：本样品多次皮肤刺激试验指数为4.25，病理组织检查积
     分为2.5，故判定该受试物对皮肤无明显刺激性。四、微核试验：1、样品性状：无色液体2、样品的处理及配制：取样品2500、1000、250mg分别加蒸馏水至20ml，充分混匀后作为受试样品。3、实验动物：3.1来源：上海医科大学实验动物部合格证号：02—22—13.2种属与品系：昆明种小鼠3.3性别：雌性和雄性3.4体重：25—30克4、实验方法：4.1将动物随机分为6组，每组8只，雌雄各半，分别作为样品四个剂量组及蒸馏水阴性对照和环磷酰胺阳性对照组。4.2采用30小时两次灌胃法，动物称重，将配制的不同浓度样品按0.4ml/20g体重，分别对各组动物灌胃。4.3于第二次灌胃后6小时，颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓加小牛血清混匀，常规涂片、固定Giemsa染色制片。4.4镜检观察，每鼠计数1000个嗜多染红细胞的微核数，计算微核发生率，并进行统计分析。5、结果：
               表    动物骨髓嗜多染红细胞微核发生率剂量               性别     动物数    受检细胞数    微核细胞数    微核率    统计学(mg/kg)                      (只)        (个)          (个)        (‰)     检验*2500               雄性       4           4000         9           2.2      ＞0.052500               雌性       4           4000         7           1.8      ＞0.051000               雄性       4           4000         6           1.5      ＞0.051000               雌性       4           4000         5           1.2      ＞0.05500                雄性       4           4000         5           1.2      ＞0.05500                雌性       4           4000         2           0.5      ＞0.05250                雄性       4           4000         6           1.5      ＞0.05250                雌性       4           4000         4           1.0      ＞0.05阴性对照           雄性       4           4000         5           1.2(蒸馏水20000mg/kg) 雌性       4           4000         6           1.5阳性对照           雄性       4           4000         77          19.2     ＜0.01(环磷酰胺40mg/kg)  雌性       4           4000         78          19.5     ＜0.01*与阴性对照组相比(经卡方检验)6、结论：经统计学分析，样品骨髓嗜多染红细胞微核试验结果为阴
性。
本发明的溶葡萄球菌复合酶消毒剂无毒副作用，不易产生耐药性，是一种高效、广谱杀菌的生物型消毒剂。并且溶葡球菌复合酶消毒剂(II)扩大了原有的溶葡球菌复合酶消毒剂杀菌谱，在有效杀灭金黄色葡萄球菌的同时，还可迅速杀灭大肠杆菌、绿脓杆菌、真菌、溶血性链球菌、厌氧菌等细菌，杀灭率达99.9％，大大拓宽了生物消毒剂的应用范围。可广泛用于烧伤及灼伤皮肤消毒、手术消毒、器械消毒、冲洗创面、膀胱灌洗，还可用于口腔消毒、痤疮和手术中的腹腔及肠道粘膜消毒等，也可用于生活中的餐具、蔬菜水果、饮用水的消毒等。
本发明的另一目的是提供了上述溶葡萄球菌复合酶消毒剂的制备方法，该方法是在无菌室中，将溶葡萄球菌酶(从美国Sigma公司购买)，溶菌酶，海藻糖，磷酸钾，氯化钠，按比例依次加入洁净的玻璃或不锈钢盛具中，轻轻搅拌，充分混和均匀后，再加入所示比例的抑菌肽bacitracin和蒸馏水，充分混匀，灌装于塑料或玻璃瓶中，入库，室温保存即可。
实例：每制造100克溶葡萄球菌酶消毒剂(II)的配制方法
a.先分别将溶葡萄球菌酶15克，溶菌酶25克，磷酸钾9克，氯化钠1，海藻糖10克混匀，再加入抑菌肽bacitracin2克和蒸馏水38ml，混匀灌装。该配方对金黄色葡萄球菌杀菌率99.9％
b.先分别将溶葡萄球菌酶20克，溶菌酶20克，磷酸钾10克，氯化钠0.8，海藻糖12克混匀，再加入抑菌肽bacitracin3克和蒸馏水34.2ml，混匀灌装。该配方对金黄色葡萄球菌杀菌率99.3％
c.先分别将溶葡萄球菌酶10克，溶菌酶30克，磷酸钾7克，氯化钠0.5，海藻糖9克混匀，再加入抑菌肽bacitracin2.5克和蒸馏水41ml，混匀灌装。该配方对金黄色葡萄球菌杀菌率99.1％。

Claims (2)

1、一种溶葡萄球菌复合酶消毒剂，其特征在于该消毒剂由下列配方组成(重量百分比)：主要成分：(1)溶葡萄球菌酶(lysostaphin)     10-20％
      (2)溶菌酶(lysozyme)             20-30％辅料：    (3)海藻糖(mycose)               9-12％
      (4)磷酸钾(potassium phosphate)  7-10％
      (5)氯化钠(sodium chloride)      0.5-1％
      (6)抑菌肽(Bacitracin)           2-3％
      (7)蒸馏水(distilled water)      35-50％
2、一种如权利要求1所述的溶葡萄球菌复合酶消毒剂的制备方法，其特征在于该方法是在无菌室中，将溶葡萄球菌酶(从美国Sigma公司购买)，溶菌酶，海藻糖，磷酸钾，氯化钠，按比例依次加入洁净的玻璃或不锈钢盛具中，轻轻搅拌，充分混和均匀后，再加入所示比例的抑菌肽bacitracin和蒸馏水，充分混匀，灌装于塑料或玻璃瓶中，入库，室温保存即可。
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