CN1649622A

CN1649622A - 抗增殖的内皮细胞的dna疫苗及其使用方法

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Publication number: CN1649622A
Application number: CNA038099470A
Authority: CN
Inventors: R·A·赖斯费尔德; A·G·尼塔默; R·向
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 2002-03-02
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2005-08-03
Anticipated expiration: 2023-02-28
Also published as: RU2318019C2; AU2003228229B2; AU2003228229A1; CA2477406C; BRPI0308103B8; PT1487482E; PL213364B1; BRPI0308103B1; CN1293917C; US20070059323A1; WO2003073995A3; EP1487482A2; SI1487482T1; WO2003073995A2; KR100979898B1; MXPA04008468A; RU2004129332A; US20120039931A1; EP1487482B1; ZA200406988B

Abstract

本发明涉及一种可有效抑制内皮细胞增殖的DNA疫苗，所述疫苗包括可操作地编码血管内皮生长因子(VEGF)受体蛋白的DNA构建体。本发明提供了编码VEGF受体－2(KDR，SEQ ID NO：2)、VEGF受体－1(Flt－1(SEQ ID NO：4)或FlK－1(KDR的小鼠同系物，SEQ ID NO：6))的DNA疫苗，其DNA序列分别为SEQ ID NO：1，3和5，还提供了使用该DNA疫苗来抑制肿瘤微环境中血管内皮细胞增殖的方法。该DNA疫苗能够抑制血管发生、抑制肿瘤的生长和扩散。

Description

抗增殖的内皮细胞的DNA疫苗及其使用方法

政府支持

本发明得到政府资助，合同号为No.5-70373-COLON，与国立卫生研究院签订。政府具有本发明的一些权利。

发明领域

本发明涉及编码可有效引发抗增殖的内皮细胞的免疫应答的适宜分子的脱氧核糖核酸(DNA)疫苗。具体涉及编码血管内皮生长因子(VEGF)受体的DNA疫苗。本发明还涉及使用该DNA疫苗抑制血管内皮细胞增殖、肿瘤生长和血管发生的方法。

发明背景

通过服用非常有限的预防性制剂，疫苗己用于对多种疾病提供长期的保护，所述的制剂可刺激机体免疫系统在病原物增殖和引起病理反应之前而破坏病原物。用疫苗来预防疾病和使用疫苗的各种方法已有描述(Bernard R.Glick and Jack J.Pasternak，MolecularBiotechnology，Principles and Applications of Recombinant DNA，Second Edition，ASM Press pp.253-276，1998)。

接种疫苗是诱导机体自身的免疫系统在感染物引起病理反应之前发现并破坏该感染物。典型的疫苗是活的，减毒的感染物(病毒或细菌)或已杀死的感染物。包括活的细菌或病毒的疫苗必须是非病原性的。典型的细菌或病毒培养物是通过物理或化学方式处理而减毒的。虽然这些感染物是非毒性的，但用所述疫苗对患者进行处理后，它们仍能引发免疫应答。

抗原，如特异性的大分子或感染物可引发免疫应答。这些抗原通常是蛋白质、多糖、脂类或糖脂，它们作为“外源物”而被B淋巴细胞和T淋巴细胞所识别。将这两种类型的淋巴细胞与一种抗原接触，可迅速引发细胞间的识别反应，结果在接触部位形成多个淋巴细胞克隆。B淋巴细胞产生浆细胞，后者又产生成为抗体(Ab)的蛋白，它可选择性地与感染物中存在的抗原结合，从而中和或灭活病原物(体液免疫)。在有些情况下，B细胞应答需要CD4辅助T细胞的辅助。

针对抗原应答而形成的特异性的T细胞克隆是一种细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，它能够与病原物和存在抗原的组织结合而除去病原物或组织(细胞介导或细胞免疫)。在有些情况下，抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞将通过内吞作用包裹病原物或其他外源细胞，该APC然后就从这些细胞中拥有了抗原，并将这些抗原以组织相容性分子：肽复合体的形式呈递给CTL上的T细胞受体(TCR)，从而刺激免疫应答。

以形成特异性抗体为特征的体液免疫通常对急性细菌感染和病毒的反复感染有效，而细胞介导的免疫主要对病毒性感染、慢性细胞内细菌感染和真菌感染有效。细胞免疫也可抗癌和排斥器官移植。

针对抗原感染而产生的抗体在很长时间内在血液中都可以检测到，因而提供了一种在病原侵入前进行检测的可能性。在同一种病原再次侵入时，免疫系统可通过在该病原增殖和产生病理反应之前除去病原物而抑制其再感染。

有时，与病原物具有相同抗原的非病原物也可以和病原物一样引发同样的免疫应答。在这种情况下，患者在没有受到先前的感染的情况下也可以抵抗该病原物的再感染。

但是，并不是所有的感染物都如疫苗形成所需那样能够培养和灭活。目前，重组DNA技术使得克服上述局限而寻找新的疫苗成为可能。可以将感染物改造为缺失病原基因，这样，就可以将活的、非毒性形式的微生物作为疫苗。也可以将相对非病原性的微生物，如大肠杆菌设计为具有病原载体的细胞表面抗原的微生物。将这样的转基因载体施用给患者，患者的免疫系统就会形成针对这种病原物的抗体。将一种病原物的抗原性蛋白进行遗传改造，使其在非病原物中表达，分离和纯化出的抗原性蛋白可作为“亚单位疫苗”。亚单位疫苗具有稳定、安全、化学结构确定的特点，但其成本较高。

近年来出现了产生疫苗的新方法，广义地称为基因免疫。该方法是将编码病原物抗原的基因导入到要免疫的患者的细胞中。被处理的细胞经改造，可产生病原物的抗原性蛋白。体内产生的抗原就可以在宿主内引发所需的免疫应答。在基因疫苗中使用的遗传物质可以是DNA或RNA构建体。通常，将编码抗原的多核苷酸与其它启动子核苷酸序列结合以增强基因的插入、复制或表达。

编码抗原基因的DNA疫苗可通过各种表达系统导入到患者的宿主细胞中。这些表达系统包括原核、哺乳动物和酵母表达系统。例如，一种方法是用病毒性载体，如导入了新的遗传物质的疫苗病毒来接种宿主细胞。另一种方法是将遗传物质导入到载体中或作为“裸”多核苷酸(如纯化的DNA)直接导入到宿主细胞中。此外，DNA可稳定地转染到减毒的细菌，如鼠伤寒沙门氏杆菌中。如果患者用转化的沙门氏杆菌口服免疫，则细菌就转移到肠道的淋巴集结处(如次级淋巴组织)，然后刺激免疫应答。

DNA疫苗提供了对非传统的病原物所引起的疾病的免疫，如遗传疾病和癌症。对于遗传癌症疫苗，必须分离出针对肿瘤细胞特异类型的抗原，然后将其导入到疫苗中。要获得一种可有效地抗多种癌症的基因疫苗必需开发出多种能抗每种癌症细胞的单个疫苗。

治疗肿瘤的常规方法是给肿瘤患者服用抑制血管发生的化合物。血管发生是新的毛细管和血管发生的过程。血管发生在胚胎发育、组织生长、组织修复和组织再生中是非常重要的。除了这些正常的和必须的过程外，在许多异常的病理过程中也包含血管发生，如肿瘤生长、肿瘤转移和眼部血管疾病，例如糖尿病性视网膜病。

血管发生涉及各种相互依赖的过程，包括：(a)激活血管内皮细胞；(b)通过内皮细胞表达蛋白酶活性来分解细胞基质蛋白；(c)将内皮细胞转移到可能生长的位点；(d)增殖内皮细胞；(e)识别内皮细胞而形成血管。上述的每一步骤都受到各种启动物质的影响，如成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。血管内皮生长因子(VEGF)在内皮细胞的生长和识别中起至关重要的作用。VEGF通过与内皮细胞膜上的受体蛋白-酪氨酸激酶结合来启动刺激细胞生长的信号转换级联反应。

抑制病理性的血管发生已作为一种肿瘤治疗措施而提出来(Folkman et al.Science，221，719，1983)。该治疗措施的出发点在于：由于肿瘤需要血管生长，因此，通过服用抑制血管发生的组合物来抑制血管发生就可以通过切断肿瘤的血液供应来抑制肿瘤的生长。该方法的缺点在于，必须连续服用血管发生抑制剂来抑制肿瘤的生长，一旦停止供应抑制剂，则肿瘤将恢复生长。有效抑制血管发生的疫苗将是一种有吸引力的抑制肿瘤形成的抑制剂。

通常，一种有效的疫苗可连续引发抗血管发生的免疫，该疫苗不必针对特异的肿瘤抗原也能抑制各种肿瘤的生长。本发明即满足这种需要。

发明概述

本发明提供了一种能有效地抑制内皮细胞增殖的DNA疫苗，其包括可操作地编码VEGF受体蛋白的DNA构建体。所述DNA疫苗包括编码VEGF受体蛋白的多核苷酸，所述的VEGF受体蛋白如VEGFR-2(KDR；SEQ ID NO：2)，VEGFR-1(Flt-1；SEQ ID NO：4)，和Flk-1(SEQID NO：6，KDR的小鼠同系物)等，其DNA序列分别为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5。该疫苗包含线性核酸，如纯化的DNA构建体，或整合到质粒载体中的DNA构建体。本发明的DNA疫苗能刺激CTL的形成，后者能抑制过量表达VEGFR-2的增殖的内皮细胞。

内皮细胞形成哺乳动物血管组织的内层。内皮细胞的增殖是血管发生中的关键步骤。本发明的疫苗在用该疫苗处理的生物体内提供了一种产生长期抑制血管发生的方法，所述方法是通过引发抗内皮细胞增殖的免疫应答来实现的。非增殖的内皮细胞，如已形成血管的内层，由于不具有大量VEGF受体抗原而基本上不受到对疫苗应答而产生的CTL的影响。

本发明所涉及的方法的一个方面是，DNA疫苗在接受免疫的患者体内可长期抑制内皮细胞的增殖。一方面，包括编码VEGF受体蛋白的多核苷酸构建体的DNA疫苗经口服给予需要抑制内皮细胞增殖的患者，所述疫苗的量足以引发抗增殖的内皮细胞免疫应答。

本发明也提供了一种用DNA疫苗免疫患者来抑制血管发生的方法。所述的方法包括将包括编码VEGF受体蛋白的DNA构建体的疫苗给予患有与血管发生相关疾病的患者，所述疫苗的量足以引发免疫应答。

本发明还提供了另外一种方法，所述方法涉及用DNA疫苗免疫患者来抑制肿瘤生长。所述方法包括将编码VEGF受体蛋白的DNA构建体的疫苗给予患有肿瘤的患者，所述疫苗的量足以引发免疫应答，免疫的结果导致肿瘤生长被抑制。患者的免疫系统破坏了内皮细胞的增殖，阻止了肿瘤的血管化，从根本上导致肿瘤“饥饿”而死亡。

本发明方法的另一方面涉及所述的DNA疫苗可经肠道施用，如通过口服，或胃肠外，如通过注射或静脉输注。

本发明的疫苗可用于治疗和防治多种疾病，如患有癌症、糖尿病性视网膜病的患者可通过用本发明的疫苗进行免疫而受益。

附图简述

附图1描述了编码人KDR的DNA序列，SEQ ID NO：1；

附图2描述了人KDR的蛋白序列，SEQ ID NO：2；

附图3描述了编码人Flt-1的DNA序列，SEQ ID NO：3；

附图4描述了人Flt-1的蛋白序列，SEQ ID NO：4；

附图5描述了编码小鼠Flk-1的DNA序列，SEQ ID NO：5；

附图6描述了人Flk-1的蛋白序列，SEQ ID NO：6；

附图7显示了小鼠肺中肿瘤覆盖的变化，从＞50％(标注3)到＜10％(标注1)；

附图8显示了用本发明的DNA疫苗免疫的小鼠(黑粗实线)与两组对照小鼠相比，经静脉注射CT-26结肠癌细胞后，其死亡率明显降低(自然小鼠：细实线；疫苗对照：点划线)；

附图9显示用本发明的DNA疫苗免疫的小鼠中路易斯(Lewis)肺癌肿瘤的生长与两组对照相比受到抑制。

附图1 0显示用本发明的DNA疫苗免疫的小鼠(●)中黑色素瘤肿瘤的生长与对照组(○)相比受到抑制。

附图11显示用本发明的DNA疫苗免疫的小鼠中CD25，CD69和CD2阳性CD8+T细胞与对照组相比得到提高。

发明优选实施方案详述

本发明提供了一种能有效地抑制内皮细胞增殖的DNA疫苗，包括可操作地编码血管内皮生长因子(VEGF)受体蛋白的DNA构建体。术语“DNA构建体”在这里是指一种能够转录到靶细胞中的合成的DNA。该构建体可以包括一种线性核酸，如纯化的DNA，或整合到质粒载体中的DNA。该DNA也可以整合到病毒或细菌载体中，优选非病原性的减毒的病毒或细菌载体。适宜的DNA是能够编码VEGF受体蛋白的DNA，如VEGFR-2(KDR；SEQ ID NO：2)，VEGFR-1(Flt-1；SEQ ID NO：4)，Flk-1(SEQ ID NO：6)等，其DNA序列分别为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5。

目前已鉴定出5种VEGF亚型，包括VEGF-1(也称为VEGF-A)、VEGF-2(也称为VEGF-C)、VEGF-B、VEGF-D和VEGF-E(见Achen etal.的美国专利No.6,235,713及其引用的文献)。VEGF受体是内皮细胞特异性的蛋白-酪氨酸激酶。已报道了几种鉴定出的内皮细胞特异性的酪氨酸激酶，包括Flt-1(VEGF受体1；BEGFR-1)、KDR(VEGFR-2)、Flk-1(KDR的小鼠同系物)、Flt-4(VEGFR-3)、Tie、Tie-2和Tek，其中几种是VEGF受体。

本发明的DNA疫苗可刺激CTL的形成，CTL具有抗过量表达VEGFR-2的增殖内皮细胞的活性。由于VEGF受体基本上只在增殖的内皮细胞中表达，因此，针对疫苗的应答而产生的CTL基本上只在发生血管发生(如血管化)的组织中是有活性的。非增殖性的内皮细胞，如已形成血管的内层，基本上不存在VEGF受体抗原，因而不受疫苗所引发的CTL的影响。

在优选的实施方案中，DNA疫苗包括编码VEGF受体蛋白的多核苷酸。这种疫苗通过干预树突状细胞，直接或间接地能够提高内源T细胞的活性。

术语“免疫”在这里是指抗毒性感染物或肿瘤抗原的长期免疫保护。术语“免疫接种”是指预防性地接触非毒性的病原物抗原，从而使被治疗的患者产生对该病原物的免疫性。

本发明的DNA构建体优选包括可操作地与基因表达所需的调控元件相连的人编码VEGF受体蛋白的核苷酸序列。

优选使用的DNA构建体包括核苷酸表达所必须的调控元件。这些调控元件包括启动子、起始密码子、终止密码子和多聚腺苷酸信号。此外，编码免疫原性靶蛋白的序列的表达通常还要求有增强子存在。如现有技术中所述，这些调控元件可操作地与编码目的蛋白的序列相连接。调控元件优选地选自那些在其被施用的物种中是可操作的。

起始密码子和终止密码子优选是编码本发明的基因疫苗中的VEGF受体蛋白的核苷酸序列的一部分。起始密码子和终止密码子必须与编码序列框一致。

本发明的疫苗中所包括的启动子和多聚腺苷酸信号优选在被免疫的患者细胞中是有功能的。

本发明的疫苗中所使用的启动子，特别是在生产用于人的基因疫苗时，包括但并不局限于猿病毒40(SV 40)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(如HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼氏病毒启动子、巨细胞病毒(CMV)，如CMV立即早期启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)病毒启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子和来自人基因的启动子，如人肌动蛋白、人肌浆球蛋白、人血色素、人肌酸和人金属硫蛋白。

本发明的疫苗中所使用的多聚腺苷酸信号，特别是在生产用于人的基因疫苗时，包括但并不局限于SV 40多聚腺苷酸信号和LTR多聚腺苷酸信号。

除了DNA表达所需的调控元件外，还包括DNA分子中的其它序列，如增强子。增强子可以是人肌动蛋白、人肌浆球蛋白、人血色素、人肌酸和病毒增强子，如来自CMV、RSV和EBV病毒的增强子。

调控元件和密码子通常是与种属相关的，为了最大量地生产蛋白，调控元件和密码子优选在被免疫的种属中是有效的。制备出在目的种属中有功能的DNA构建体是本领域技术人员的常规技术。

本发明的疫苗中的DNA构建体可以是“裸”DNA(参见Restifo etal.Gene Therapy 7，89-92，2000及其引用文献)。另一方面，DNA也可以整合到载体中。可使用的载体包括生物能分解的微胶囊、免疫刺激复合体(ISCOMs)或脂质体、和经遗传改造的减毒的活载体，如病毒或细菌。

适宜的减毒的活细菌载体包括鼠伤寒沙门氏杆菌、伤寒沙门氏杆菌、志贺氏菌、芽孢杆菌、乳杆菌、卡介苗、大肠杆菌、霍乱弧菌、弯曲菌或本领域已知的任何细菌载体。用外源DNA构建体转化活细菌载体的方法是现有技术中已知的(Joseph Sambrook and David W.Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。

优选的病毒载体包括噬菌体、疱疹病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒和Avipox。用外源DNA构建体转化病毒载体的方法是现有技术中已知的(见上述Sambrook and Russell)。

脂质体载体是单层或多层囊泡，具有由亲脂性的物质所形成的膜部分和内部的水相部分。在本发明中，脂质体的水相部分包含有要转移到靶细胞中的多核苷酸。通常，优选脂质体形成物质具有一个阳离子基团，如四元铵基团，和一个或多个亲脂性基团，如饱和的或非饱和的，具有大约6-30个碳原子的烷基。公开号为No.0187702的欧洲专利描述了这样的物质，美国专利No.6,228,844及其相关的引用文献进行了进一步的讨论。文献中还描述了许多其它的脂质体形成阳离子脂质化合物(见L.Stamatatos，et al.，Biochemistry27：3917-3925，1988；H.Eibl，et al.，Biophysical Chemistry10：261-271，1979)。另一方面，也使用了微球体，如聚交酯-coglycolide生物可分解微球体。为将核酸转移到组织中而进行的核酸包装或与脂质体或微球体的复合是本领域技术人员所熟知的技术。

本发明的方法包括将DNA多核苷酸施用到哺乳动物，如人的组织中的步骤。优选，DAN多核苷酸是经口服、肌肉、鼻内、腹膜内、皮下、皮内或局部施用。

一方面，本发明的方法涉及使用DNA疫苗以在用疫苗治疗的患者体内可长期抑制内皮细胞的增殖。优选方法的实施方案是：将包括可操作地编码VEGF受体蛋白的多核苷酸构建体的DNA疫苗给予需要抑制内皮细胞增殖的哺乳动物，所述疫苗的量足以引发抗增殖的内皮细胞的免疫应答。

本发明也提供了一种用DNA疫苗免疫哺乳动物来抑制血管发生的方法。在方法的一个实施方案中，将包括可操作地编码VEGF受体蛋白的DNA构建体的疫苗给予患有与血管发生相关疾病的哺乳动物，所述疫苗的量足以引发抗增殖的内皮细胞的免疫应答。

本发明还提供了另外一种方法，所述方法涉及用DNA疫苗治疗哺乳动物来抑制肿瘤生长。所述方法涉及将包括可操作地编码VEGF受体蛋白的DNA构建体的疫苗给予患有正在增长的肿瘤的哺乳动物，疫苗治疗导致肿瘤生长停止，这是由于通过免疫哺乳动物而产生对增殖的内皮细胞的抗性。哺乳动物的免疫系统对增殖的内皮细胞的破坏防止或至少使肿瘤的血管化最小化。

本发明方法的另一方面涉及所述的DNA疫苗可经肠道施用，如通过口服，或肌肉注射。优选，接受疫苗治疗的哺乳动物是人。患有癌症，如肺癌或结肠癌、或前列腺肿瘤、糖尿病性视网膜病等的患者可通过用本发明的疫苗进行免疫而受益。

本发明的疫苗优选与药学上可接受的载体或赋形剂，如水、盐、葡萄糖、甘油等结合形成。该疫苗也可以含有助剂，如保湿剂、乳化剂、缓冲液等。

本发明的疫苗优选以药学上可接受载体中的溶液或悬浊液形式、经口服给予哺乳动物，如人，其中DNA的浓度为约1-10微克/毫升。疫苗的使用剂量因患者不同而不同，可根据医务人员的判断或疫苗的服用要求而定。

本发明的疫苗可以多剂量或单位剂量的形式包装在适宜的灭菌容器，包括安瓿、瓶或小瓶中。容器优选在装入疫苗制备物后密封。优选，将疫苗包装在附有标签的容器中，标签标注上疫苗的鉴定信息、附有政府部门，如美国食品和药品管理局所出具的注意事项，表明该疫苗得到了相关法律的许可、及剂量信息等。标签上还应注明该疫苗是用于治疗疾病，需经专业人员施用给患者。包装上还应包含有关疫苗的服用、用法说明、适应症及必须的警告等信息。

优选地，本发明的疫苗包括编码一种或多种VEGF受体蛋白，如内皮细胞特异的酪氨酸激酶的DNA构建体，例如包括Flt-1、KDR、Flk-1和其功能同系物。所述的功能同系物与前面提到的VEGF受体蛋白具有至少约80％的同源性。

VEGF受体蛋白的氨基酸序列及编码这些蛋白的核酸序列在现有技术中已有描述。编码KDR的核酸序列(图1，SEQ ID NO：1)和其相应的蛋白序列(图2，SEQ ID NO：2)已被公开(Yu，et al.In theEMBL database of the European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK(EMBLaccession number is EMBL：AF063658)，上述公开信息在这里作为参考文献而引用)；编码Flt-1的核酸序列(图3，SEQ ID NO：3)和其相应的蛋白序列(图4，SEQ ID NO：4)已被公开(Yu，et al.Inthe EMBL database of the European BioinformaticsInstitute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，CambridgeCB10 1SD，UK(EMBL accession number is EMBL：AF063657)，上述公开信息在这里作为参考文献而引用)；编码Flk-1的核酸序列和其相应的蛋白序列已被公开(Mathews et al.，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 1991，88：9026-9030，and the structures were corrected byQuinn et al.，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 1991，90：7533-7537，上述公开信息在这里作为参考文献而引用)。编码Flk-1的正确DNA序列见图5，SEQ ID NO：5，Flk-1的正确蛋白序列见图6，SEQ ID NO：6。

由于遗传密码的简并性，其它编码与VEGF受体蛋白，如KDR、Flk-1和Flt-1基本上相同或功能相同的氨基酸序列的DNA序列也可用于本发明。其中包括那些能与VEGF受体序列杂交的DNA序列。优选，编码VEGF受体蛋白功能等价物的DNA与前面提到的VEGF受体蛋白的DNA具有至少约80％的同源性。

根据本发明，所述的DNA序列还包括其不同核苷酸残基的缺失、取代或替换而形成的序列，该序列编码的基因产物与其具有相同功能或是其功能等价物。基因产物本身也可能含有在VEGF受体序列内发生的氨基酸残基的缺失、取代或替换，但这种变化是“沉默的”，因而其产物是VEGF受体蛋白的功能等价物。这些氨基酸残基的替换是根据残基之间具有相同的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两性来确定的。如，带有负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带有正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；不带电荷的极性氨基酸具有相似的疏水性，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。VEGF受体功能等价物在这里是指与VEGF或其片段结合的受体，它们不必与其对应的天然KDR、Flk-1或Flt-1具有相同的结合亲合力。

为使VEGF受体编码序列具有不同的末端，可对本发明的DNA序列进行改造，包括但不限于改变基因产物的加工和表达。例如，可采用本领域常规的突变技术，如点突变来插入新的限制性位点、改变糖基化、磷酸化等。

小鼠Flk-1(SEQ ID NO：6)与人KDR(SEQ ID NO：2)具有大约85％的同源性，其在小鼠体内具有与KDR在人体内相似的生理作用。事实上，VEGFR-2经常是指KDR/Flk-1，可见这两种VEGF受体之间是非常相似的。鉴于此，在用本发明的DNA疫苗治疗小鼠时，选择编码Flk-1(如，SEQ ID NO：5的DNA)的DNA作为编码KDR的人DNA疫苗的合适模型。

下面的实施例用于说明本发明的目的，而无任何限制意义。

材料、方法和实施例

材料：C57/BL/6J和Balb/C小鼠来自Scripps ResearchInstitute饲养场。用于评估的小鼠肿瘤细胞系，包括黑色素瘤细胞系B16和结肠癌细胞系CT26由I.J.Fidler博士提供(MD AnsersonCancer Center，Houston，TX.)。小鼠路易斯肺癌细胞系D121由LeaEisenbach博士提供(Weizmann Institute，Rehovot，Israel)。编码Flk-1的DNA由Lemischka博士提供(Princeton University，Princeton，NJ)，该DNA由限制性酶KpnI和Xbal酶切后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(由Invitrogen提供，Huntsville，Alabama)。减毒的鼠伤寒沙门氏杆菌菌株由B.A.D.Stocker(Stanford University，Stanford，CA)提供。抗体来自BD Biosciences，Bedford，MA，T-STIM培养补充物来自BDBiosciences，Bedford，MA。异硫氰酸荧光素(FITC)和R-藻红蛋白(R-Phycoerythrin，PE)来自Molecular Probes，Eugene，OR。FITC标记的抗体和PE标记的抗体根据厂家的说明来制备。

实施例1编码Flk-1的DNA疫苗的制备

将包含Flk-1DNA的载体pcDNA3.1通过电穿孔导入到新制备的减毒鼠伤寒沙门氏杆菌中，其中电穿孔是用Bio-Rad脉冲发生器在2.5kV、25μF和200ohm下，根据厂家的说明来进行。在含有氨苄青霉素的平板上选择含有载体的沙门氏杆菌。第二天挑出克隆并在含有氨苄青霉素的LB培养液(EM Science，Gibbstown，NJ)中培养过夜。分离细菌并在PBS缓冲液中漂洗。将漂洗过的细菌在PBS培养基中悬浮，使其浓度达到每毫升PBS中含约1×10⁹个重组沙门氏杆菌，以形成之后要使用的疫苗溶液。在使用前，疫苗需密封保存在安瓿瓶中。用同样的方法制备由只用pcDNA3.1载体转化的沙门氏杆菌(不含Flk-1DNA)所组成的“对照疫苗”。质粒DNA在转化沙门氏杆菌之前保存在约-80℃下。

实施例2用编码Flk-1的DNA疫苗接种小鼠

用实施例1的DNA疫苗通过口服(在约100μl PBS中含1×10⁸个重组沙门氏杆菌)接种Balb/C小鼠(每个处理组约6只小鼠)，每两周接种一次，共三次。用同样的方法用对照疫苗(由含空载体的减毒沙门氏杆菌组成)接种另一组小鼠。

实施例3评价接种疫苗的小鼠对肿瘤的抗性

第三次接种后约两周，用约1×10⁵个B16黑色素瘤细胞(皮下)、约1×10⁵个D121路易斯肺癌细胞(皮下)、或约7.5×10⁴个CT26结肠癌细胞(静脉内)攻击实施例2中的Balb/C小鼠(每个处理组约6只小鼠)。两周后，将皮下的路易斯肺癌细胞用外科手术的方法去除，在此期间，肿瘤己播散到肺。每隔一天测量皮下肿瘤的长度和宽度，并根据下面的公式计算每个肿瘤的体积：体积＝(宽度²)(长度/2)。去除皮下的原发肿瘤后约30天，评价转移到肺中的D121的数量。将小鼠杀死后解剖，根据肿瘤所覆盖的肺表面积的百分比来评价肺部患肿瘤的程度，其中无肿瘤记为“0”；肿瘤覆盖约小于20％记为“1”；肿瘤覆盖约20％-30％记为“2”；肿瘤覆盖约大于50％记为“3”。图7显示了接触D121路易斯肺癌细胞的3只小鼠的肺部图。最下面的肺记为1，而上面的两个肺记为3，其肺部的大部分被肿瘤所覆盖。在30天评价之前死亡的动物记为“+”。

表4-1和图8-10列出了评价结果，下面进行详细讨论。

表1 用D121路易斯肺癌细胞攻击的Balb/C小鼠中的肿瘤转移

接种疫苗小鼠转移评价

对照-用未转化的沙门氏杆菌接种 3，3，3，3，+，+

对照-用对照疫苗(含空载体)接种 3，3，3，3，+，+

用实施例1的DNA疫苗(含Flk-1)接种 0，0，1，1，1，2，2

经过静脉注射CT-26结肠癌细胞的Balb/C小鼠在约63天后(7周)对其死亡率进行评价。表2和图8列出了小鼠的死亡情况。

图8中，用本发明实施例1的疫苗治疗的小鼠的存活百分率用粗实线表示为100％。用C26细胞攻击的自然小鼠(未接种疫苗)的存活百分率用细实线表示，用对照疫苗(无Flk-1 DNA)处理的小鼠的存活百分率用点划线表示。

表2 用实施例1的疫苗免疫的小鼠在用CT26癌细胞攻击后其死亡率受到抑制

处理 30天的存活率 36天的存活率 63天的存活率

对照，无疫苗 50 0 0

对照疫苗 33 0 0

实施例1的疫苗 100 100 100

用D121细胞攻击后的Balb/C小鼠中原发(皮下)肿瘤的生长抑制是通过攻击14天后的原发肿瘤的体积来评价的。结果见表3和图9。

图9中，第一栏，用“PBS”标记表示未接种疫苗的小鼠(自然小鼠)，中间栏，用“空载体”标记表示用对照疫苗处理的小鼠，第三栏，用“pcDNA3.1-FLKl”标记表示用实施例1的疫苗免疫的小鼠。

表3 用实施例1的疫苗免疫的Balb/C小鼠中皮下D121肿瘤细胞受到抑制

处理肿瘤体积mm³ 标准差

无疫苗对照 665 227

对照疫苗 641 157

实施例1的疫苗 183 35

B16黑色素瘤细胞攻击后约17天监测皮下肿瘤的体积来评价皮下B16黑色素瘤细胞生长的抑制情况。表4和图10列出了监测结果。图10中，(●)表示用实施例1的疫苗免疫的小鼠中肿瘤的平均体积，(○)表示用对照疫苗处理的小鼠中肿瘤的平均体积。

表4.用实施例1的疫苗免疫的Balb/C小鼠中皮下B16黑色素瘤受到抑制

不同天数的肿瘤体积(mm³)

处理 0 9 14 17

对照疫苗 0 907 1273 4213

实施例1的疫 0 447 462 1063

苗

肿瘤抑制％ -- 51％ 64％ 75％

实施例4接种疫苗的小鼠脾细胞(CD8+T细胞)中CD25，CD69和CD2的活化标记的上调。

用实施例1中的DNA疫苗和实施例2中描述的对照疫苗(无Flk-1)接种C5/7BL/6J小鼠(每个处理组约4只小鼠)。第三次接种后约6周从免疫小鼠和对照小鼠中分离脾细胞。将脾细胞和来自经转导能表达Flk-1的B16黑色素瘤细胞系的细胞及未转化的B16细胞在含有体积比约4％的T-STIM培养补充物(Cat.#354115，BDBiosciences，Bedford，MA)的T细胞培养基(约5mL)中培养24小时。然后用FITC-偶联的CD8+抗体和PE-偶联的CD25、CD69和CD2的抗体对细胞进行染色。用Becton Dickenson FAC对细胞悬液进行扫描来确定每个脾细胞/B16黑色素瘤细胞组合中对CD25和CD69呈阳性的CD8+T细胞的百分比。表5和图11列出了结果。

表5接种疫苗的小鼠脾细胞中CD25，CD69和CD2的活化标记提高

处理％CD25 ％CD69 CD2阳性

阳性阳性平均荧光

对照疫苗+ 9 18 570mfu

B16-Flk-1细胞

DNA疫苗+ 12 29 550mfu

B16细胞

DNA疫苗+ 21 35 700mfu

B16-Flk-1细胞

Mfu＝平均荧光单位。

表1-5和图8-11的结果表明实施例1的疫苗可有效地免疫小鼠抗各种肿瘤形成癌细胞，该疫苗包含编码Flk-1的DNA，其中Flk-1是KDR在小鼠中的同系物。虽然从理论上还没有阐述，但可以相信该疫苗是通过抑制肿瘤中的血管发生而起作用的，即抑制新的血管发生从而能够有效地饥饿肿瘤。

表1的结果表明，实施例1的疫苗可阻止用D121路易斯肺癌细胞攻击的小鼠中肿瘤向肺部转移。用实施例1的疫苗免疫的小鼠均未死亡，而且肺中肿瘤的覆盖均小于50％(2只＜20％)。相反，每个对照组中均有2只小鼠死亡，并且剩余的小鼠肺中肿瘤覆盖均大于50％。

实施例1的疫苗也能明显地降低静脉注入CT-26结肠癌细胞的Balb-C小鼠的死亡率，其结果如表2和图8所示。用实施例1的疫苗免疫的小鼠在攻击后的63天观察期内均能存活。而在对照组中，所有的小鼠在攻击36天后均死亡。

如表3和图9所示，用实施例1的疫苗免疫的小鼠中皮下D121路易斯肺癌肿瘤的生长受到抑制，与无疫苗和对照疫苗处理的对照组小鼠相比，其抑制因子为约4.3-4.5。

同样，如表4和图10中所示，用实施例1的疫苗免疫的小鼠与对照组小鼠相比，其皮下B16黑色素肿瘤的生长受到抑制，其抑制因子为约4。

表5和图11的结果表明，分离自用实施例1的DNA疫苗免疫的C57/BL/6J小鼠的脾细胞与已用Flk-1抗原转化的B16黑色素瘤细胞共培养时，其CD2，CD25和CD69活化标记物相对于对照组小鼠有所提高。

在不偏离本发明范围的情况下，根据上面所描述的优选实施例进行多种变化和改变是显而易见的。应当理解，本发明的范围并不限于上述的优选实施例，当然，所有这样的变化和改变都在本发明权利要求书保护的范围内。

序列表

<110>The Scripps Reasearch Institute

Ralph A.Reisfeld

Andrew G.Niethammer

Rong Xiang

<120>抗增殖的内皮细胞的DNA疫苗及其使用方法

<130>TSRI-829.0

<160>6

<170>FastSEQ Windows 4.0 版

<210>1

<211>4071

<212>DNA

<213>人

<400>1

atggagagca aggtgctgct ggccgtcgcc ctgtggctct gcgtggagac ccgggccgcc 60

tctgtgggtt tgcctagtgt ttctcttgat ctgcccaggc tcagcataca aaaagacata 120

cttacaatta aggctaatac aactcttcaa attacttgca ggggacagag ggacttggac 180

tggctttggc ccaataatca gagtggcagt gagcaaaggg tggaggtgac tgagtgcagc 240

gatggcctct tctgtaagac actcacaatt ccaaaagtga tcggaaatga cactggagcc 300

tacaagtgct tctaccggga aactgacttg gcctcggtca tttatgtcta tgttcaagat 360

tacagatctc catttattgc ttctgttagt gaccaacatg gagtcgtgta cattactgag 420

aacaaaaaca aaactgtggt gattccatgt ctcgggtcca tttcaaatct caacgtgtca 480

ctttgtgcaa gatacccaga aaagagattt gttcctgatg gtaacagaat ttcctgggac 540

agcaagaagg gctttactat tcccagctac atgatcagct atgctggcat ggtcttctgt 600

gaagcaaaaa ttaatgatga aagttaccag tctattatgt acatagttgt cgttgtaggg 660

tataggattt atgatgtggt tctgagtccg tctcatggaa ttgaactatc tgttggagaa 720

aagcttgtct taaattgtac agcaagaact gaactaaatg tggggattga cttcaactgg 780

gaataccctt cttcgaagca tcagcataag aaacttgtaa accgagacct aaaaacccag 840

tctgggagtg agatgaagaa atttttgagc accttaacta tagatggtgt aacccggagt 900

gaccaaggat tgtacacctg tgcagcatcc agtgggctga tgaccaagaa gaacagcaca 960

tttgtcaggg tccatgaaaa accttttgtt gcttttggaa gtggcatgga atctctggtg 1020

gaagccacgg tgggggagcg tgtcagaatc cctgcgaagt accttggtta cccaccccca 1080

gaaataaaat ggtataaaaa tggaataccc cttgagtcca atcacacaat taaagcgggg 1140

catgtactga cgattatgga agtgagtgaa agagacacag gaaattacac tgtcatcctt 1200

accaatccca tttcaaagga gaagcagagc catgtggtct ctctggttgt gtatgtccca 1260

ccccagattg gtgagaaatc tctaatctct cctgtggatt cctaccagta cggcaccact 1320

caaacgctga catgtacggt ctatgccatt cctcccccgc atcacatcca ctggtattgg 1380

cagttggagg aagagtgcgc caacgagccc agccaagctg tctcagtgac aaacccatac 1440

ccttgtgaag aatggagaag tgtggaggac ttccagggag gaaataaaat tgaagttaat 1500

aaaaatcaat ttgctctaat tgaaggaaaa aacaaaactg taagtaccct tgttatccaa 1560

gcggcaaatg tgtcagcttt gtacaaatgt gaagcggtca acaaagtcgg gagaggagag 1620

agggtgatct ccttccacgt gaccaggggt cctgaaatta ctttgcaacc tgacatgcag 1680

cccactgagc aggagagcgt gtctttgtgg tgcactgcag acagatctac gtttgagaac 1740

ctcacatggt acaagcttgg cccacagcct ctgccaatcc atgtgggaga gttgcccaca 1800

cctgtttgca agaacttgga tactctttgg aaattgaatg ccaccatgtt ctctaatagc 1860

acaaatgaca ttttgatcat ggagcttaag aatgcatcct tgcaggacca aggagactat 1920

gtctgccttg ctcaagacag gaagaccaag aaaagacatt gcgtggtcag gcagctcaca 1980

gtcctagagc gtgtggcacc cacgatcaca ggaaacctgg agaatcagac gacaagtatt 2040

ggggaaagca tcgaagtctc atgcacggca tctgggaatc cccctccaca gatcatgtgg 2100

tttaaagata atgagaccct tgtagaagac tcaggcattg tattgaagga tgggaaccgg 2160

aacctcacta tccgcagagt gaggaaggag gacgaaggcc tctacacctg ccaggcatgc 2220

agtgttcttg gctgtgcaaa agtggaggca tttttcataa tagaaggtgc ccaggaaaag 2280

acgaacttgg aaatcattat tctagtaggc acggcggtga ttgccatgtt cttctggcta 2340

cttcttgtca tcatcctacg gaccgttaag cgggccaatg gaggggaact gaagacaggc 2400

tacttgtcca tcgtcatgga tccagatgaa ctcccattgg atgaacattg tgaacgactg 2460

ccttatgatg ccagcaaatg ggaattcccc agagaccggc tgaagctagg taagcctctt 2520

ggccgtggtg cctttggcca agtgattgaa gcagatgcct ttggaattga caagacagca 2580

acttgcagga cagtagcagt caaaatgttg aaagaaggag caacacacag tgagcatcga 2640

gctctcatgt ctgaactcaa gatcctcatt catattggtc accatctcaa tgtggtcaac 2700

cttctaggtg cctgtaccaa gccaggaggg ccactcatgg tgattgtgga attctgcaaa 2760

tttggaaacc tgtccactta cctgaggagc aagagaaatg aatttgtccc ctacaagacc 2820

aaaggggcac gattccgtca agggaaagac tacgttggag caatccctgt ggatctgaaa 2880

cggcgcttgg acagcatcac cagtagccag agctcagcca gctctggatt tgtggaggag 2940

aagtccctca gtgatgtaga agaagaggaa gctcctgaag atctgtataa ggacttcctg 3000

accttggagc atctcatctg ttacagcttc caagtggcta agggcatgga gttcttggca 3060

tcgcgaaagt gtatccacag ggacctggcg gcacgaaata tcctcttatc ggagaagaac 3120

gtggttaaaa tctgtgactt tggcttggcc cgggatattt ataaagatcc agattatgtc 3180

agaaaaggag atgctcgcct ccctttgaaa tggatggccc cagaaacaat ttttgacaga 3240

gtgtacacaa tccagagtga cgtctggtct tttggtgttt tgctgtggga aatattttcc 3300

ttaggtgctt ctccatatcc tggggtaaag attgatgaag aattttgtag gcgattgaaa 3360

gaaggaacta gaatgagggc ccctgattat actacaccag aaatgtacca gaccatgctg 3420

gactgctggc acggggagcc cagtcagaga cccacgtttt cagagttggt ggaacatttg 3480

ggaaatctct tgcaagctaa tgctcagcag gatggcaaag actacattgt tcttccgata 3540

tcagagactt tgagcatgga agaggattct ggactctctc tgcctacctc acctgtttcc 3600

tgtatggagg aggaggaagt atgtgacccc aaattccatt atgacaacac agcaggaatc 3660

agtcagtatc tgcagaacag taagcgaaag agccggcctg tgagtgtaaa aacatttgaa 3720

gatatcccgt tagaagaacc agaagtaaaa gtaatcccag atgacaacca gacggacagt 3780

ggtatggttc ttgcctcaga agagctgaaa actttggaag acagaaccaa attatctcca 3840

tcttttggtg gaatggtgcc cagcaaaagc agggagtctg tggcatctga aggctcaaac 3900

cagacaagcg gctaccagtc cggatatcac tccgatgaca cagacaccac cgtgtactcc 3960

agtgaggaag cagaactttt aaagctgata gagattggag tgcaaaccgg tagcacagcc 4020

cagattctcc agcctgactc ggggaccaca ctgagctctc ctcctgttta a 4071

<210>2

<211>1356

<212>蛋白质

<213>人

<400>2

Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu

1 5 10 15

Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro

20 25 30

Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr

35 40 45

Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro

50 55 60

Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser

65 70 75 80

Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn

85 90 95

Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser

100 105 110

Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser

115 120 125

Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys

130 135 140

Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser

145 150 155 160

Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg

165 170 175

Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile

180 185 190

Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser

195 200 205

Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr

210 215 220

Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu

225 230 235 240

Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile

245 250 255

Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu

260 265 270

Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe

275 280 285

Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu

290 295 300

Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr

305 310 315 320

Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met

325 330 335

Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala

340 345 350

Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly

355 360 365

Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr

370 375 380

Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu

385 390 395 400

Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val

405 410 415

Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val

420 425 430

Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr

435 440 445

Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu

450 455 460

Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr

465 470 475 480

Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys

485 490 495

Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys

500 505 510

Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr

515 520 525

Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser

530 535 540

Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln

545 550 555 560

Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser

565 570 575

Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro

580 585 590

Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr

595 600 605

Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile

610 615 620

Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr

625 630 635 640

Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val

645 650 655

Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn

660 665 670

Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys

675 680 685

Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn

690 695 700

Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg

705 710 715 720

Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr

725 730 735

Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe

740 745 750

Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu

755 760 765

Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile

770 775 780

Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly

785 790 795 800

Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His

805 810 815

Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp

820 825 830

Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val

835 840 845

Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr

850 855 860

Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg

865 870 875 880

Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu

885 890 895

Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu

900 905 910

Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu

915 920 925

Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg

930 935 940

Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys

945 950 955 960

Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly

965 970 975

Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro

980 985 990

Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr

995 1000 1005

Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys

1010 1015 1020

Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn

1025 1030 1035 1040

Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp

1045 1050 1055

Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met

1060 1065 1070

Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val

1075 1080 1085

Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser

1090 1095 1100

Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys

1105 1110 1115 1120

Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr

1125 1130 1135

Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr

1140 1145 1150

Phe Ser Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala

1155 1160 1165

Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu

1170 1175 1180

Ser Met Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser

1185 1190 1195 1200

Cys Met Glu Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn

1205 1210 1215

Thr Ala Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg

1220 1225 1230

Pro Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu

1235 1240 1245

Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu

1250 1255 1260

Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu Ser Pro

1265 1270 1275 1280

Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser

1285 1290 1295

Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly Tyr His Ser Asp

1300 1305 1310

Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu Ala Glu Leu Leu Lys

1315 1320 1325

Leu lle Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser Thr Ala Gln Ile Leu Gln

1330 1335 1340

Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser Pro Pro Val

1345 1350 1355

<210>3

<211>4017

<212>DNA

<213>人

<400>3

atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60

acaggatcta gttcaggttc aaaattaaaa gatcctgaac tgagtttaaa aggcacccag 120

cacatcatgc aagcaggcca gacactgcat ctccaatgca ggggggaagc agcccataaa 180

tggtctttgc ctgaaatggt gagtaaggaa agcgaaaggc tgagcataac taaatctgcc 240

tgtggaagaa atggcaaaca attctgcagt actttaacct tgaacacagc tcaagcaaac 300

cacactggct tctacagctg caaatatcta gctgtaccta cttcaaagaa gaaggaaaca 360

gaatctgcaa tctatatatt tattagtgat acaggtagac ctttcgtaga gatgtacagt 420

gaaatccccg aaattataca catgactgaa ggaagggagc tcgtcattcc ctgccgggtt 80

acgtcaccta acatcactgt tactttaaaa aagtttccac ttgacacttt gatccctgat 540

ggaaaacgca taatctggga cagtagaaag ggcttcatca tatcaaatgc aacgtacaaa 600

gaaatagggc ttctgacctg tgaagcaaca gtcaatgggc atttgtataa gacaaactat 660

ctcacacatc gacaaaccaa tacaatcata gatgtccaaa taagcacacc acgcccagtc 720

aaattactta gaggccatac tcttgtcctc aattgtactg ctaccactcc cttgaacacg 780

agagttcaaa tgacctggag ttaccctgat gaaaaaaata agagagcttc cgtaaggcga 840

cgaattgacc aaagcaattc ccatgccaac atattctaca gtgttcttac tattgacaaa 900

atgcagaaca aagacaaagg actttatact tgtcgtgtaa ggagtggacc atcattcaaa 960

tctgttaaca cctcagtgca tatatatgat aaagcattca tcactgtgaa acatcgaaaa 1020

cagcaggtgc ttgaaaccgt agctggcaag cggtcttacc ggctctctat gaaagtgaag 1080

gcatttccct cgccggaagt tgtatggtta aaagatgggt tacctgcgac tgagaaatct 1140

gctcgctatt tgactcgtgg ctactcgtta attatcaagg acgtaactga agaggatgca 1200

gggaattata caatcttgct gagcataaaa cagtcaaatg tgtttaaaaa cctcactgcc 1260

actctaattg tcaatgtgaa accccagatt tacgaaaagg ccgtgtcatc gtttccagac 1320

ccggctctct acccactggg cagcagacaa atcctgactt gtaccgcata tggtatccct 1380

caacctacaa tcaagtggtt ctggcacccc tgtaaccata atcattccga agcaaggtgt 1440

gacttttgtt ccaataatga agagtccttt atcctggatg ctgacagcaa catgggaaac 1500

agaattgaga gcatcactca gcgcatggca ataatagaag gaaagaataa gatggctagc 1560

accttggttg tggctgactc tagaatttct ggaatctaca tttgcatagc ttccaataaa 1620

gttgggactg tgggaagaaa cataagcttt tatatcacag atgtgccaaa tgggtttcat 1680

gttaacttgg aaaaaatgcc gacggaagga gaggacctga aactgtcttg cacagttaac 1740

aagttcttat acagagacgt tacttggatt ttactgcgga cagttaataa cagaacaatg 1800

cactacagta ttagcaagca aaaaatggcc atcactaagg agcactccat cactcttaat 1860

cttaccatca tgaatgtttc cctgcaagat tcaggcacct atgcctgcag agccaggaat 1920

gtatacacag gggaagaaat cctccagaag aaagaaatta caatcagaga tcaggaagca 1980

ccatacctcc tgcgaaacct cagtgatcac acagtggcca tcagcagttc caccacttta 2040

gactgtcatg ctaatggtgt ccccgagcct cagatcactt ggtttaaaaa caaccacaaa 2100

atacaacaag agcctggaat tattttagga ccaggaagca gcacgctgtt tattgaaaga 2160

gtcacagaag aggatgaagg tgtctatcac tgcaaagcca ccaaccagaa gggctctgtg 2220

gaaagttcag catacctcac tgttcaagga acctcggaca agtctaatct ggagctgatc 2280

actctaacat gcacctgtgt ggctgcgact ctcttctggc tcctattaac cctctttatc 2340

cgaaaaatga aaaggtcttc ttctgaaata aagactgact acctatcaat tataatggac 2400

ccagatgaag ttcctttgga tgagcagtgt gagcggctcc cttatgatgc cagcaagtgg 2460

gagtttgccc gggagagact taaactgggc aaatcacttg gaagaggggc ttttggaaaa 2520

gtggttcaag catcagcatt tggcattaag aaatcaccta cgtgccggac tgtggctgtg 2580

aaaatgctga aagagggggc cacggccagc gagtacaaag ctctgatgac tgagctaaaa 2640

atcttgaccc acattggcca ccatctgaac gtggttaacc tgctgggagc ctgcaccaag 2700

caaggagggc ctctgatggt gattgttgaa tactgcaaat atggaaatct ctccaactac 2760

ctcaagagca aacgtgactt attttttctc aacaaggatg cagcactaca catggagcct 2820

aagaaagaaa aaatggagcc aggcctggaa caaggcaaga aaccaagact agatagcgtc 2880

accagcagcg aaagctttgc gagctccggc tttcaggaag ataaaagtct gagtgatgtt 2940

gaggaagagg aggattctga cggtttctac aaggagccca tcactatgga agatctgatt 3000

tcttacagtt ttcaagtggc cagaggcatg gagttcctgt cttccagaaa gtgcattcat 3060

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ccgaagttta attcaggaag ctctgatgat gtcagatatg taaatgcttt caagttcatg 3660

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<210>4

<211>1338

<212>蛋白质

<213>人

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Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro

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Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr

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Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val

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Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

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Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

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Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

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Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

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Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

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Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val

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Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr

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Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys Leu Ser

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<211>5390

<212>DNA

<213>小鼠

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gaaggggaac tgaagacagg ctacttgtct attgtcatgg atccagatga attgcccttg 2640

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gatgacagcc agacagacag tgggatggtc cttgcatcag aagagctgaa aactctggaa 4020

gacaggaaca aattatctcc atcttttggt ggaatgatgc ccagtaaaag cagggagtct 4080

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gttgttcttt ccaccacccg gaagtagcca catttgattt tcatttttgg aggagggacc 4380

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<212>蛋白质

<213>小鼠

<400>6

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Lys Leu Asn Gly Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile Leu Ile

610 615 620

Val Ala Phe Gln Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr Val Cys

625 630 635 640

Ser Ala Gln Asp Lys Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Leu Val Lys Gln

645 650 655

Leu Ile Ile Leu Glu Arg Met Ala Pro Met Ile Thr Gly Asn Leu Glu

660 665 670

Asn Gln Thr Thr Thr Ile Gly Glu Thr Ile Glu Val Thr Cys Pro Ala

675 680 685

Ser Gly Asn Pro Thr Pro His Ile Thr Trp Phe Lys Asp Asn Glu Thr

690 695 700

Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Arg Asp Gly Asn Arg Asn Leu

705 710 715 720

Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Cys Gln

725 730 735

Ala Cys Asn Val Leu Gly Cys Ala Arg Ala Glu Thr Leu Phe Ile Ile

740 745 750

Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Val Ile Ile Leu Val Gly

755 760 765

Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile Val Leu

770 775 780

Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Glu Gly Glu Leu Lys Thr Gly Tyr Leu

785 790 795 800

Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu Arg Cys Glu

805 810 815

Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg Leu

820 825 830

Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val Ile Glu

835 840 845

Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Lys Thr Val Ala

850 855 860

Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg Ala Leu

865 870 875 880

Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu Asn Val

885 890 895

Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu Met Val

900 905 910

Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu Arg Gly

915 920 925

Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Ser Lys Gly Ala Arg Phe Arg

930 935 940

Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Glu Leu Ser Val Asp Leu Lys Arg Arg

945 950 955 960

Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly Phe Val

965 970 975

Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Ser Glu Glu

980 985 990

Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr Ser Phe

995 1000 1005

Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His

1010 1015 1020

Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn Val Val

1025 1030 1035 1040

Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp

1045 1050 1055

Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro

1060 1065 1070

Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser

1075 1080 1085

Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr

1090 1095 1100

Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly

1105 1110 1115 1120

Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr

1125 1130 1135

Met Leu Asp Cys Trp His Glu Asp Pro Asn Gln Arg Pro Ser Phe Ser

1140 1145 1150

Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln

1155 1160 1165

Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Val Leu Pro Met Ser Glu Thr Leu Ser Met

1170 1175 1180

Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser Cys Met

1185 1190 1195 1200

Glu Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala

1205 1210 1215

Gly Ile Ser His Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro Val

1220 1225 1230

Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu Val Lys

1235 1240 1245

Val Ile Pro Asp Asp Ser Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu Ala Ser

1250 1255 1260

Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Asn Lys Leu Ser Pro Ser Phe

1265 1270 1275 1280

Gly Gly Met Met Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser Glu Gly

1285 1290 1295

Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly Tyr His Ser Asp Asp Thr

1300 1305 1310

Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Asp Glu Ala Gly Leu Leu Lys Met Val

1315 1320 1325

Asp Ala Ala Val His Ala Asp Ser Gly Thr Thr Leu Arg Ser Pro Pro

1330 1335 1340

Val

1345

Claims

1.一种能有效地引发抗增殖的内皮细胞的免疫应答的DNA疫苗，其包括处于药学上可接受的载体中的可操作地编码VEGF受体蛋白的DNA构建体。

2.根据权利要求1的DNA疫苗，其中所述VEGF受体蛋白是VEGF-2受体蛋白。

3.根据权利要求1的DNA疫苗，其中所述VEGF受体蛋白选自VEGFR-2(KDR；SEQ ID NO：2)，VEGFR-1(Flt-1；SEQ ID NO：4)，Flk-1(SEQ ID NO：6)和与其具有至少约80％同源性的功能等价物。

4.根据权利要求1的DNA疫苗，其中所述的DNA构建体是裸的DNA构建体。

5.根据权利要求1的DNA疫苗，其中所述的DNA构建体可操作地整合到质粒载体。

6.根据权利要求1的DNA疫苗，其中所述的DNA构建体可操作地整合到减毒细菌载体。

7.根据权利要求6的DNA疫苗，其中所述的减毒细菌载体选自减毒鼠伤寒沙门氏杆菌、伤寒沙门氏杆菌、志贺氏菌、芽孢杆菌、乳杆菌、卡介苗、大肠杆菌、霍乱弧菌和弯曲菌。

8.根据权利要求6的DNA疫苗，其中所述的减毒细菌载体是减毒鼠伤寒沙门氏杆菌。

9.根据权利要求1的DNA疫苗，其中所述的DNA构建体是基本上纯化的DNA，所述DNA具有选自以下的多核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和与其具有至少约80％同源性的功能等价物。

10.根据权利要求9的DNA疫苗，其中所述的DNA构建体可操作地整合到减毒鼠伤寒沙门氏杆菌载体。

11.一种抑制哺乳动物内皮细胞增殖的方法，其包括给予哺乳动物有效免疫应答引发量的DNA疫苗的步骤，所述DNA疫苗包括可操作地编码VEGF受体蛋白的DNA构建体和药学上可接受的载体，藉此所述哺乳动物呈现由疫苗引发的和对增殖的内皮细胞特异的免疫应答。

12.根据权利要求11的方法，其中所述的哺乳动物是人类。

13.根据权利要求11的方法，其中所述的VEGF受体蛋白选自VEGFR-2(KDR；SEQ ID NO：2)，VEGFR-1(Flt-1；SEQ ID NO：4)，Flk-1(SEQ ID NO：6)和与其具有至少约80％同源性的功能等价物。

14.根据权利要求11的方法，其中所述的DNA构建体可操作地整合到减毒细菌载体。

15.根据权利要求14的方法，其中所述的减毒细菌载体选自减毒鼠伤寒沙门氏杆菌、伤寒沙门氏杆菌、志贺氏菌、芽孢杆菌、乳杆菌、卡介苗、大肠杆菌、霍乱弧菌和弯曲菌。

16.根据权利要求15的方法，其中所述的减毒细菌载体是减毒鼠伤寒沙门氏杆菌。

17.根据权利要求11的方法，其中所述疫苗经口服施用。

18.一种抑制哺乳动物血管发生的方法，其包括给予所述哺乳动物免疫学上有效量的DNA疫苗，所述DNA疫苗包括可操作地编码VEGF受体蛋白的DNA构建体和药学上可接受的载体，藉此所述哺乳动物呈现由疫苗引发的和对增殖的内皮细胞特异的免疫应答，从而抑制血管形成。

19.根据权利要求18的方法，其中所述的哺乳动物是人类。

20.根据权利要求18的方法，其中所述的VEGF受体蛋白选自VEGFR-2(KDR；SEQ ID NO：2)，VEGFR-1(Flt-1；SEQ ID NO：4)，Flk-1(SEQ ID NO：6)和与其具有至少约80％同源性的功能等价物。

21.根据权利要求18的方法，其中所述的DNA构建体可操作地整合到减毒细菌载体。

22.根据权利要求21的方法，其中所述的减毒细菌载体选自减毒鼠伤寒沙门氏杆菌、伤寒沙门氏杆菌、志贺氏菌、芽孢杆菌、乳杆菌、卡介苗、大肠杆菌、霍乱弧菌和弯曲菌。

23.根据权利要求21的方法，其中所述的减毒细菌载体是减毒鼠伤寒沙门氏杆菌。

24.根据权利要求18的方法，其中所述疫苗经口服施用。

25.一种抑制哺乳动物肿瘤生长的方法，其包括给予所述哺乳动物免疫学上有效量的DNA疫苗，所述DNA疫苗包括可操作地编码VEGF受体蛋白的DNA构建体和药学上可接受的载体，藉此所述哺乳动物呈现由疫苗引发的和对增殖的内皮细胞特异的免疫应答，导致肿瘤生长停止，肿瘤体积减小或肿瘤播散抑制。

26.根据权利要求25的方法，其中所述的哺乳动物是人类。

27.根据权利要求25的方法，其中所述的VEGF受体蛋白选自VEGFR-2(KDR；SEQ ID NO：2)，VEGFR-1(Flt-1；SEQ ID NO：4)，Flk-1(SEQ ID NO：6)和与其具有至少约80％同源性的功能等价物。

28.根据权利要求25的方法，其中所述的DNA构建体可操作地整合到减毒细菌载体。

29.根据权利要求28的方法，其中所述的减毒细菌载体选自减毒鼠伤寒沙门氏杆菌、伤寒沙门氏杆菌、志贺氏菌、芽孢杆菌、乳杆菌、卡介苗、大肠杆菌、霍乱弧菌和弯曲菌。

30.根据权利要求28的方法，其中所述的减毒细菌载体是减毒鼠伤寒沙门氏杆菌。

31.根据权利要求25的方法，其中所述疫苗经口服施用。

32.一种包括权利要求1的疫苗的加工制品，所述的疫苗包装在密封、无菌的容器中，所述容器上粘贴有标签，标签上印有疫苗鉴定材料和将所述疫苗单独给予患者的有用信息。